Material und Methoden

Patientenkollektiv

Die immunhistochemische Analyse wurde retrospektiv an Tumormaterial der Routinediagnostik erstellt, für die das Einverständnis der Patientinnen für wissenschaftliche Nutzung des Restgewebes vorlag. Die Gewebeproben der dem Kollektiv zugrundeliegenden Patientinnen mit der Diagnose eines primären Mammakarzinoms zwischen Juni 1991 und Juni 1996 entstammen dem Archiv des Institutes für Pathologie der Charité Berlin. Fälle mit Fernmetastasen zum Diagnosezeitpunkt, bilaterale Karzinome oder ausschließlich nicht-invasive Karzinome wurden ausgeschlossen. Alle Patientinnen mit Wohnsitz in und außerhalb Berlins
(221 Patientinnen, 77% der Gewebeproben) wurden in die Studie einbezogen. Die Überlebensdaten wurden unter Einhaltung der Richtlinien des Datenschutzes am örtlichen Landeseinwohneramt erfragt. Die Summe verschiedener postoperativer Therapieverfahren und Kontrolluntersuchungen ergab die Nachbeobachtungszeit. Klinische Daten hinsichtlich des Auftretens von Rezidiven entstammen den Akten der Tumornachsorge der Charité und waren für 169 der 221 Patientinnen (76%) verfügbar. Das rezidivfreie Überleben wurde definiert als Zeit zwischen der Diagnosestellung und dem Auftreten von lokalen oder fernen Rezidiven, die klinisch oder histologisch diagnostiziert werden konnten. Das Gesamtüberleben wurde definiert als Zeit zwischen der Diagnose und dem Tod.

Das Patientenkollektiv (Tabelle 3) gliedert sich wie folgt auf: Das durchschnittliche Alter der Patientinnen zum Zeitpunkt der Diagnose betrug 60 Jahre (28-88 Jahre). Die Karzinome der vorliegenden Untersuchungsgruppe verteilen sich bezüglich der zugehörigen Histologie wie folgt: 179 (81%) duktale Karzinome, 28 (13%) lobuläre Karzinome, 14 (6%) Fälle anderer Histologie. Somit ist die Zusammensetzung dieses Kollektivs mit der in epidemiologischen Studien erfaßten Aufteilung der histologischen Subtypen (Kapitel 1.1.1) vergleichbar. Von den 221 Patientinnen wurden 164 (74%) von demselben Operateur in der Klinik für Allgemein-, Visceral-, Gefäß- und Thoraxchirurgie der Charité Berlin operiert. Informationen über adjuvante Therapien waren für 119 Patientinnen (53%) verfügbar. Von diesen erhielten 50 Frauen (42%) eine Hormontherapie. Zum Vergleich der Cyclooxygenaseexpression im gesunden Gewebe wurden 7 Fälle mit fibrozystischer Mastopathie untersucht, die nicht mit in die statistische Analyse eingeschlossen wurden.

Merkmal

Anzahl der Patientinnen

%

Gesamtkollektiv

221

100

histologischer Typ

duktales Karzinom

179

81,0

lobuläres Karzinom

28

12,7

andere Karzinome

14

6,3

Tumorgröße (mm)

≤20

142

64,3

>20

79

35,7

Lymphknotenstatus

pN0

104

47,1

pN1mic

10

4,5

pN1a

43

19,5

pN2a

31

14,0

pN3a

33

14,9

Differenzierungsgrad

G1

G2

G3

56

113

47

25,9

52,3

21,8

Gefäßinvasion

nicht erkennbar

positiv

183

38

82,8

17,2

Östrogenrezeptorstatus

negativ
positiv

58

100

36,7

63,3

c-erbB2 Status

-
+
++
+++

73

35

24

19

48,3

23,2

15,9

12,6

Tumorproliferation

MIB-1 <20%

MIB-1 ≥20%

110

32

77,5

22,5

Alter

<60 Jahre

>60 Jahre

109
112

49,3

50,7

Tabelle 3: Charakteristik des Patientenkollektivs

Material Zellinien

MCF7 (ATCC# HTB 22)

Cell Lines Service, Heidelberg

Adenokarzinom der Brustdrüse

SK-BR-3 (ATCC# HTB 30)

Cell Lines Service, Heidelberg

Adenokarzinom der Brustdrüse

Chemikalien und Enzyme

Acrylamid

Appligene oncor, Illkirch Graffenstaden, Frankreich

Alkaline phosphatase conjugated goat anti mouse antibody, cat #AC 32 ML

Tropix, Bedford, USA

Antibody diluent reagent solution

Zymed, San Francisco, USA

APS (Ammoniumperoxiddisulfat)

Merck, Darmstadt

Aquatex

Merck, Darmstadt

Bromphenolblau

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

CDP-Star Ready-to-use

Tropix, Bedford, USA

Coomassie Brillantblau

Fluka AG, Buchs, Schweiz

COX-2 Blocking peptide,

cat #36017

Cayman, Ann Arbor, USA

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

DTT

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM),

cat #BE12-707F

Bio Whittaker, Verviers, Niederlande

Essigsäure

Mallinckrodt Baker, Deventer, Niederlande

Ethanol

Mallinckrodt Baker, Deventer, Niederlande

Ethidiumbromid

ICN Biomedicals Inc, Aurora, USA

Ethylendiamintetraessigsäure-di-Natriumsalz (EDTA)

Merck, Darmstadt

Foetales Kälberserum (FCS),

cat #3402-P992203

PAN Biotech, Aidenbach

Glycin

Boehringer Ingelheim, Heidelberg

I-Block

Tropix, Bedford, USA

Interleukin-1ß (IL-1ß), rekombinant, human,

cat #201-LB

R&D Systems, Wiesbaden

Isopropanol

Merck, Darmstadt

L-Glutamin

Bio Whittaker, Verviers, Niederlande

Marker für Gele

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Methanol

Mallinckrodt Baker, Deventer, Niederlande

MgCl₂· 6 H₂O

Merck, Darmstadt

Monoklonaler COX-1 Antikörper, cat #160110

Cayman, Ann Arbor, USA

Monoklonaler COX-2 Antikörper, cat #160112

Cayman, Ann Arbor, USA

Ms X Actin

Chemicon International, Temecula, USA

Natriumchlorid

Merck, Darmstadt

Natriumdodecylsulfat (SDS)

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Nitro-Block II

Tropix, Bedford, USA

Protein Block serumfrei

DAKO, Carpinteria, USA

Salzsäure

Merck, Darmstadt

Sigma fast: Fast red TRI Naphthol AS-MX tablet sets

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

N,N,N’,N’-Tetramethyl-

ethylenediamine (TEMED)

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)

Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Tri-Natriumcitrat-Dihydrat

Merck, Darmstadt

Tris(Hydroxymethyl)-aminomethan (Tris-Base)

Merck, Darmstadt

Tris(Hydroxymethyl)-aminomethanhydrochlorid (Tris-HCl)

Merck, Darmstadt

Trypsin/EDTA–Lösung

0,5% / 0,2% (w/v) in PBS

(10-fach konzentriert)

Biochrom KG, Berlin

Tween 20

Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg

Xylol

MallinckrodtBaker, Deventer, Niederlande

Kits

BCA protein assay kit;

cat #23225

Pierce Rockford, Illinois, USA

Super Sensitive Detection Kit

Bio Genex, San Ramon, USA

Lösungen, Kulturmedien

10 x Elektrophorese-
puffer:

30,3

g

Tris-Base

144,0

g

Glycin

2,8

g

SDS

ad 1000,0

ml

H₂O

pH 8,3-8,4 einstellen

10 x Transferpuffer:

29,0

g

Glycin

58,0

g

TRIS- Base

3,7

g

SDS

ad 800,0

ml

H₂O

pH 8,3 einstellen

Blocking-Puffer:

0,6

g

I-Block

30,0

ml

10 x PBS oder TBS

PBS mit 270,0 ml Aqua Bidest auffüllen,

erhitzen (nicht kochen), abkühlen lassen

300,0

µl

Tween 20

Waschpuffer:

100,0

ml

10 x PBS oder TBS

1,0

ml

Tween 20

ad 1000,0

ml

H₂O

10 x Assaypuffer:

12,1

g

TRIS- Base

in 350,0 ml Aqua dest. lösen

pH 9,8 einstellen

1,0165

g

MgCl₂ · 6H₂0

ad 500,0

ml

H₂O

DMEM, serumhaltig:

500,0

ml

DMEM

10,0

ml

L-Glutamin

50,0

ml

FCS

DMEM, serumfrei:

500,0

ml

DMEM

10,0

ml

L-Glutamin

10 x Citratpuffer:

3,78

g

Citronensäure-Monohydrat

24,21

g

Tri-Natriumcitrat-Dihydrat

ad 1000,0

ml

H₂O

pH 6,0 einstellen

10 x TRIS-Puffer:

9,0

g

Tris-Base

68,5

g

Tris-HCl

87,8

g

NaCl

ad 1000,0

ml

H₂O

pH 7,4 einstellen

Proteinlysispuffer:

1,2

ml

0,5 M Tris-HCl (pH 6,8)

2,0

ml

10% SDS

1,0

ml

Glycerol

0,5

ml

DTT (1M)

5,3

ml

Aqua Bidest

Polyacrylamidgel 10%

2,5

ml

Acrylamid

2,5

ml

1,5M Tris-HCl (pH 8,8)

100,0

µl

10% SDS

50,0

µl

10% APS

5,0

µl

TEMED

4,8

ml

H₂O

Sammelgel 4%

0,5

ml

Acrylamid

1,25

ml

0,5M Tris-HCl (pH 6,8)

50,0

µl

10% SDS

50,0

µl

10% APS

10,0

µl

TEMED

3,2

ml

H₂O

Coomassie-Färbelösung

0,6

g

Coomassie-Blau

100,0

ml

Essigsäure

ad 1000,0

ml

H₂O

Färbefixierlösung für Coomassie

250,0

ml

Isopropanol

100,0

ml

Essigsäure

ad 1000,0

ml

H₂O

Verbrauchsmaterial

Chromatographiepapier

3MM CHR

Whatman, Maidstone, England

Deckgläser

24 x 60 mm/ 24 x 40 mm

Menzel-Gläser, Braunschweig

Filter

Schleicher & Schuell, Dassel

Hyperfilm

Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK

Insulinspritzen 1 ml

Terumo, Leuven, Belgien

Kanülen

B. Braun, Melsungen

Microtest Zellkulturplatte,

96 well

Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, USA

Objektträger (Super Frost Plus)

25 x 75 x 1,0 mm

Menzel-Gläser, Braunschweig

Pap Pen

The Binding Site, Birmingham, UK

Parafilm

American National Can, Menasha, USA

Petrischalen für Zellkultur

Falcon–Becton Dickinson, Le pont de Claix, Frankreich

Pipettenspitzen ohne Filter

Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg

Reaktionsgefäße 15 / 50 ml

Nunc, Wiesbaden

Reaktionsgefäße

0,5 / 1,5 / 2,0 ml

Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg

Skalpell

Bard-Parker–Becton Dickinson, Hancock, USA

Spritzen 5 / 10 / 20 ml

B. Braun, Melsungen

Zellkulturflaschen 75 cm²

Falcon–Becton Dickinson, Le pont de Claix, Frankreich

Zellschaber

Costar, Corning, USA

Zellstoff

Hartmann, Heidenheim

Geräte

Bio Kinetics Reader EL 340

BIO-TEK Instruments, Winooski, USA

Dampfsterilisator Varioclav

H+P Labortechnik, München

Einzelkochtafel

Rommelsbacher Elektrohausgeräte GmbH, Dinkelsbühl

Elektrophoresekammern Agagel Maxi und Mini

Biometra, Göttingen

Elektrophoresenetzgerät

Savant PS250

Savant Instruments, Holbrook, USA

Filmentwickler Hyperprocessor

Amersham Pharmacia Biotec, Buckinghamshire, England

Geldokumentationsanlage

MWG Biotech, Ebersberg

Heizblock 100°C

Roth, Karlsruhe

Magnetrührer Variomag

H+P Labortechnik, München

pH-Meter

Mettler, Schwerzenbach, Schweiz

Pipetboy

Integra Biosciences, Fernwald

Pipetten

Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg

Schnellkochtopf

Steinbach, Kerpen

Schüttelinkubator 3032

GFL Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel

Schüttler

Biometra, Göttingen

Thermocycler

Trio-Thermoblock

Biometra, Göttingen

Thermomixer

Eppendorf-Netheler-Hinz, Hamburg

Tischzentrifuge Biofuge Pico

Heraeus, Hanau

Vortexer Reax 2000

Heidolph, Schwabach

Wasserbad

GFL Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel

Zellkulturbrutschrank BB 16

Heraeus, Hanau

Zellkulturmikroskop IMT-2

Olympus Optical, Hamburg

Zellkulturwerkbank

Gelaire Flow Laboratories, Meckenheim

Methoden Histopathologische Untersuchung
Die Gewebeproben wurden in 4% Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und anschließend in 5 µm dünne Präparate geschnitten. Für die histopathologische Untersuchung wurden die Proben routinemäßig mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Der Differenzierungsgrad der vorliegenden Mammakarzinome wurde nach dem Bloom-Richardson Grading, modifiziert von Elston und Ellis [22], festgelegt. Bezüglich des Nodalstatus sind im Mittel 18 Lymphknoten beurteilt worden (Range 1-55). Bei den als pN0 diagnostizierten Fällen wurden mindestens 6 Lymphknoten untersucht (Median 17, Range 6-37). Bei 8 Fällen waren weniger als 10 Lymphknoten nachweisbar. Für diese Studie wurde der Nodalstatus nach der 6. TNM-Klassifizierung [23] eingeteilt.

Die folgenden Parameter wurden den pathologischen Diagnosen entnommen: Östrogenrezeptorstatus, c-erbB2 Status sowie MIB1-Index.

Die Gefäßinvasion wurde durch alleinige lichtmikroskopische Untersuchungen beurteilt, in fraglichen Fällen mittels CD34-Darstellung der Gefäßendothelien.
Immunhistochemie
Das Paraffin der Schnitte wurde durch dreimaliges Waschen zu je 5 min in Xylol sowie in absteigender Ethanolreihe (2 x 100%, 2 x 96%, 80%, 70% Ethanol für jeweils 5 min) entfernt. Anschließend sind die Proben in Aqua dest. gewässert worden. Daraufhin wurden sie im leicht sauren Milieu des Citratpuffers erhitzt und 5 min im Schnellkochtopf bei Überdruck gekocht, um die Epitope für den Antikörper besser zugänglich zu machen.

Bis zur Applikation dessen verweilten die Gewebsschnitte in TBS-Pufferlösung.
Bei Anfärbung der COX-1 wurde danach zusätzlich ein Proteinblocker verwendet.

Anschließend wurden die Proben über Nacht bei 4°C mit dem primären monoklonalen Antikörper in Verdünnung von 1:1000 (COX-2) bzw. 1:200 (COX-1) in der Antikörper-Verdünnungslösung inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit TBS/Tween erfolgte daraufhin die Inkubation mit dem Zweitantikörper und der alkalischen Phosphatase des Biotin Streptavidin Amplified Detection Systems für je 20 min bei Raumtemperatur. Die Färbung erfolgte mit Hilfe der naphtholhaltigen Färbetabletten unter jeweiligem Vergleich mit einer Positiv- und Negativkontrolle. Zur Kontrastierung der in einem positiven Fall vorliegenden roten Färbung des Zytoplasmas wurden die Zellkerne zuletzt für ca. 15 sec in Hämalaunlösung nach Mayer gegengefärbt und abschließend nochmals gewässert. Am Ende sind die Schnitte mit geringen Mengen Aquatex und entsprechenden Deckgläschen eingedeckt worden.

Die Spezifität des COX-2 Antikörpers wurde durch Verwendung eines COX-2 blocking peptids (Abb. 25) kontrolliert.
Quantifizierung der immunhistochemischen Färbung
Das für die vorliegende Studie verwandte Punktesystem basiert auf der Intensität der Anfärbung multipliziert mit der prozentualen Anzahl positiver Zellen und ergibt einen immunreaktiven Score (IRS) zwischen 0 und 12. Dieses System ist identisch mit dem für die Untersuchung des Hormonrezeptorstatus des Mammakarzinoms [24].

Prozentuale
Positivität

Punktzahl

Intensität

Punktzahl

keine

0

negativ

0

<10%

1

schwach

1

10-50%

2

mäßig

2

51-80%

3

stark

3

>80%

4

Tabelle 4: Quantifizierung der immunhistochemischen Färbung

Bei Betrachtung der univariaten Überlebensanalysen nach Kaplan-Meier zeigte sich, daß die Graphen der Tumoren mit einem COX-2 IRS von 0-6 sowie mit einem IRS von 7-12 in zwei getrennten Gruppen verliefen. Aus diesem Grund wurde in dieser Einteilung die Trennung zwischen Negativität (IRS 0-6) und Positivität (IRS 7-12) festgelegt, die so für die gesamte Auswertung verwendet wurde. Die Auswertung der COX-1 erfolgte analog, um eine möglichst objektive Vergleichbarkeit zwischen beiden Isoenzymen zu erhalten. Die hier angewandte Quantifizierung der immunhistochemischen Färbung der Cyclooxygenasen wurde in ähnlicher Art bereits in anderen Studien [25] [26] [27] [28] verwendet.
Angaben zur Statistik
Die Korrelation zwischen der Expression von COX-1 oder COX-2 und verschiedenen klinisch-pathologischen Parametern wurde definitionsgemäß mit Hilfe des zweiseitigen Fisher Tests oder des chi²Tests beurteilt. Das rezidivfreie Überleben und das Gesamtüberleben wurden in der univariaten Überlebensanalyse mittels der Kaplan-Meier Methode berechnet. Da das mittlere Gesamtüberleben nicht in allen Untergruppen erreicht wurde, ist weiterhin die rezidivfreie Überlebensrate innerhalb von 5 Jahren und die gesamte 5-Jahres-Überlebensrate angegeben worden. Der Vergleich verschiedener Überlebenskurven erfolgte mit dem log rank Test. Die multivariate Analyse wurde anhand des Cox proportional hazard regression Models erstellt, in welchem alle in der univariaten Analyse als signifikant mit dem Überleben korrelierenden Variablen berücksichtigt worden sind. In dieser Analyse wurde das Alter der Patientinnen als ein zusätzlicher Parameter einbezogen.

Als signifikant wurden p-Werte kleiner als 0,05 betrachtet. Für die statistische Analyse wurde die SPSS Software Version 10.0 verwendet.
Zellkultur
Die humanen Mammakarzinomzellinien MCF7 und SK-BR-3 wurden in 75 (25) cm²-Zellkulturflaschen in Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) mit 10% FCS und 2% L-Glutamin in wassergesättigter Atmosphäre bei 37°C und einem 5%igen Volumenanteil CO₂ ^kultiviert. Sämtliche Versuche wurden innerhalb von 10 Passagen durchgeführt. Die Zellkulturarbeiten liefen unter einer sterilen Werkbank sowie Verwendung steriler Materialien und Lösungen ab. Die Trypsin-Lösung wurde zusätzlich bei der Zugabe filtriert.

Der Austausch des Kulturmediums fand alle 3-4 Tage statt. Bei ca. 80%iger Konfluenz wurden die Zellen wie folgt passagiert: Zunächst wurde das verbrauchte Medium abgesaugt und die Zellen mit 2 ml Trypsin gespült. Nach erneutem Absaugen wurde
1 ml frisches Trypsin über den gesamten Flaschenboden verteilt. Im Anschluß erfolgte die Inkubation bei 37°C, bis sich unter mikroskopischer Kontrolle alle Zellen vom Untergrund gelöst und vereinzelt hatten. Die Trypsinwirkung wurde durch Zugabe von 9 ml Medium gestoppt. Von der resultierenden Zellsuspension wurden abhängig der Zellinie 0,25 ml bis 5 ml in der Kulturflasche belassen und diese mit Medium auf 10 ml aufgefüllt.
Versuchsanordnung
Die aus der Passagierung zur Verfügung stehende Zellsuspension wurde je nach Bedarf mit Medium verdünnt und gleichmäßig in 40 mm große Petrischalen ausgesät. Nach der Ergänzung von Medium auf ein Volumen von jeweils 4 ml folgte die Inkubation im Brutschrank für 2-3 Tage. Nach dem Erreichen von mind. 70%iger Konfluenz wurde das Medium durch 4 ml serumfreies Medium ausgetauscht.

Am folgenden Tag erfolgte die Stimulation mit 10ng/ml IL-1ß bzw. TPA. Hierbei wurde pro Versuchsreihe eine bis auf diese Zugabe gleich behandelte Kontrolle mitgeführt.
Proteinisolierung
Zu Beginn wurden je 2 ml Medium der Petrischalen abgenommen und 5 min bei
5000 U/min zentrifugiert. Von den dabei anfallenden Überständen sind danach je 1 ml für weitere Versuche in Eppendorfgefäße überführt und bei –20°C tiefgefroren worden. Im Anschluß daran sind die Schalen mit je 1 ml PBS gespült worden. Als nächstes wurden die subkonfluenten Zellinien auf Eis mit je 100 μl Proteinlysispuffer lysiert.
Das Lysat wurde durch mehrmaliges Aufziehen in eine Insulinspritze mechanisch degradiert und bei –20°C gelagert.
Proteinkonzentrationsbestimmung
Die Proteinkonzentrationsbestimmung wurde mit Hilfe des BCA-Kit nach Pierce durchgeführt. In diesem wird Cu²⁺ durch die Proteine reduziert, die reduzierten Cu⁺-Ionen bilden anschließend mit Bicinchoninsäure einen farbigen Komplex. Die als Maß des Reaktionsumfanges entstehende Farbintensität wird in einem ELISA-Reader bei 562 nm gemessen. Das Procedere erfolgte nach Anweisungen des Herstellers, wobei die Proben 1 h inkubiert wurden. Zusätzlich wurde eine Protein-Standardreihe unter gleichen Versuchsbedingungen mitgeführt, mit dessen Hilfe die Proteinkonzentrationen berechnet werden konnten.
Western Blot
Die Proteinproben wurden vor dem Auftragen mit Lysepuffer auf 20 μl aufgefüllt und für 10 min der heißen Lyse bei 95 °C unterzogen.

Daran schloß die Auftrennung der Proben und eines Längenmarkers in einem 10% Polyacrylamidgel mittels SDS-PAGE bei 100 V für 2 Stunden an. Daraufhin wurden die Proteine in einem Semi-Dry-System mit einer Stromstärke von 100 mA für 90 min auf eine Nitrozellulosemembran geblottet. Im folgenden sind unspezifische Bindungsstellen durch die Inkubation der Membran im Blockingpuffer für 30 min bei Raumtemperatur blockiert worden.

Die monoklonalen Primärantikörper banden, jeweils in einer Verdünnung von 1:1000 im Blockingpuffer, über Nacht bei 4 °C an die Proteine. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer erfolgte die Inkubation mit dem sekundären goat-anti-mouse Antikörper, gekoppelt mit alkalischer Phosphatase, in einer Verdünnung von 1:5000 im Blockingpuffer für 45 min bei Raumtemperatur. Nach erneutem dreifachen Waschen im Waschpuffer und 4minütigem Waschen in Assaypuffer reagierte das hinzugefügte CDP-Star RTU Lumineszenzsystem für 5 min mit den gebundenen Antikörpern und ein Hyperfilm konnte belichtet werden.