Ergebnisse

Expression von COX-2 und COX-1 im Normalgewebe

Die in den Tumorproben untersuchten Stromazellen und Kapillaren wiesen keine deutliche Expression der COX-2 auf.

Eine erhöhte Expression dieses Enzyms wurde in einigen Fällen in morphologisch nicht alteriertem Brustdrüsengewebe in der Umgebung invasiver Karzinome gefunden.

Zur Feststellung des Expressionsmusters im benignen Gewebe (Abb. 23) wurden
7 Proben mit fibrozystischer Mastopathie untersucht. Die COX-2 konnte in keinem dieser Fälle nachgewiesen werden.

Im Gegensatz dazu wiesen die untersuchten Mastopathien in 4 von 7 Proben eine positive Expression der Cyclooxygenase-1 auf.

Expression von COX-2 und COX-1 im Mammakarzinom

Eine deutliche COX-2 Expression (IRS 7-12) konnte in 36% der 221 untersuchten Mammakarzinome als perinukleäre, granuläre Reaktivität festgestellt werden (Abb. 24, Abb. 28, Abb. 29).

Im Gegensatz zur COX-2 wies die COX-1 immunhistochemisch ein cytoplasmatisch betontes Expressionsmuster auf (Abb. 27). Eine eindeutige Expression konnte in diesem Fall bei 45% der 218 untersuchten Proben festgestellt werden.

Eine Positivität für beide Isoformen der Cyclooxygenase zeigten 43 Tumoren (19,7%).

Merkmal

Anzahl der Patientinnen

%

Gesamtkollektiv

221

100

COX-2 Expression

negativ (IRS 0-6)
positiv (IRS 7-12)

141

80

63,8

36,2

COX-1 Expression

negativ (IRS 0-6)
positiv (IRS 7-12)

119

99

54,6

45,4

Tabelle 5: Expression der Cyclooxygenasen im Patientenkollektiv

Korrelation der COX mit klinisch-pathologischen Parametern

Die immunhistochemische Analyse der COX-1 und COX-2 im Mammakarzinom ergab ein unterschiedliches Expressionsmuster beider Isoenzyme in Korrelation mit mehreren
klinisch-pathologischen Parametern. So konnten, wie im folgenden aufgezählt, signifikant positive Korrelationen (^*) zwischen einer erhöhten COX-2 Expression
(Tabelle 6) mit verschiedenen prognostisch ungünstigen Parametern festgestellt werden. Die COX-1 korrelierte hingegen mit zwei dieser klinisch-pathologischen Parameter signifikant negativ (Tabelle 7).

Korrelation der COX-2 mit klinisch-pathologischen Parametern

Es exprimierten 41% der invasiv-duktalen Karzinome, 14% der lobulären und 21% der anderen Karzinome die COX-2 (Abb. 5). Invasiv-duktale Karzinome zeigen signifikant häufiger eine deutliche Expression der COX-2 als andere histologische Typen.

Eine vermehrte COX-2 Expression korrelierte signifikant mit einer Tumorgröße
>20 mm (58% der Fälle COX-2 positiv). Tumore ≤20 mm exprimierten in 76% dieses Isoenzym dagegen nicht (Abb. 6).

Weiterhin ergab sich eine signifikante Korrelation zwischen der Metastasierung in regionäre Lymphknoten und einer positiven COX-2 Expression. Nur 16,3% der nodal negativen Tumoren waren COX-2 positiv, jedoch 57,6% der pN3a-Tumore (Abb. 7).
Unter Berücksichtigung der jeweiligen Stichprobengröße innerhalb der einzelnen Untergruppen (Tabelle 3) korrelierte eine erhöhte COX-2 Expression mit zunehmender Lymphknotenmetastasierung.

Ferner wurde die Beziehung zwischen der histologischen Differenzierung und der COX-2 Expression untersucht. Auch hier ergab sich eine signifikante Korrelation zwischen einer geringen bis fehlenden Zelldifferenzierung und einer hohen Expression der COX-2 (Abb. 8).Von den Tumoren im G1-Stadium zeigten nur 10,7% eine positive Expression, dagegen waren es bei den G3-Tumoren 61,7%.

Eine erhöhte COX-2 Expression war signifikant mit einer positiven Gefäßinvasion (57,9%) korreliert. Dagegen waren die Tumore mit einer nicht erkennbaren Gefäßinvasion in der Mehrzahl COX-2 negativ (68,3%) (Abb. 9).

Als ein weiterer signifikant mit einer erhöhten COX-2 Expression korrelierender
klinisch-pathologischer Tumorparameter konnte der Östrogenrezeptorstatus identifiziert werden. Bei diesem wurde ein Zusammenhang zwischen einer positiven COX-2 Expression mit einem negativen Östrogenrezeptorstatus sowie andererseits eine Korrelation einer negativen COX-2 Expression mit einer Positivität dieses Rezeptors sichtbar (Abb. 10).

Die im folgenden genannten Parameter wiesen keine signifikant nachweisbaren Korrelationen auf: c-erbB2 Status (p=0,60; Chi ² Test), Tumorproliferation (p=1,00;
Fisher Test), Alter zum Zeitpunkt der Diagnose (p=0,21; Fisher Test).

Merkmal

Fallzahl

COX-2 negativ
(IRS 0-6)

COX-2 positiv
(IRS 7-12)

p-Wert
* Chi 2 Test,† Fisher Test

histologischer Typ

0,012^*

duktales Karzinom

lobuläres Karzinom

andere Karzinome

179 (100%)

28 (100%)

14 (100%)

106 (59,2%)

24 (85,7%)

11 (78,6%)

73 (40,8%)

4 (14,3%)

3 (21,4%)

Tumorgröße (mm)

<0,0005^†

≤20

>20

142 (100%)

79 (100%)

108 (76,1%)

33 (41,8%)

34 (23,9%)

46 (58,2%)

Lymphknotenstatus

<0,0005^*

pN0

pN1mic

pN1a

pN2a

pN3a

104 (100%)

10 (100%)

43 (100%)

31 (100%)

33 (100%)

87 (83,7%)

4 (40,0%)

21 (48,8%)

15 (48,4%)

14 (42,4%)

17 (16,3%)

6 (60,0%)

22 (51,2%)

16 (51,6%)

19 (57,6%)

Differenzierungsgrad

<0,0005^*

G1

G2

G3

56 (100%)

113 (100%)

47 (100%)

50 (89,3%)

70 (61,9%)

18 (38,3%)

6 (10,7%)

43 (38,1%)

29 (61,7%)

Gefäßinvasion

0,03^†

nicht erkennbar

positiv

183 (100%)

38 (100%)

125 (68,3%)

16 (42,1%)

58 (31,7%)

22 (57,9%)

Östrogenrezeptorstatus

0,04^†

negativ

positiv

58 (100%)

100 (100%)

31 (53,4%)

71 (71,0%)

27 (46,6%)

29 (29,0%)

c-erbB2 Status

0,60^*

-

+

++

+++

73 (100%)

35 (100%)

24 (100%)

19 (100%)

45 (61,6%)

23 (65,7%)

15 (62,5%)

9 (47,4%)

28 (38,4%)

12 (34,3%)

9 (37,5%)

10 (52,6%)

Tumorproliferation

1,00^†

MIB-1 <20%

MIB-1 ≥20%

110 (100%)

32 (100%)

75 (68,2%)

22 (68,8%)

35 (31,8%)

10 (31,3%)

Tabelle 6a: Korrelation der COX-2 Expression mit ausgewählten klinisch-pathologischen Parametern

Merkmal

Fallzahl

COX-2 negativ
(IRS 0-6)

COX-2 positiv
(IRS 7-12)

p-Wert
* Chi 2 Test,† Fisher Test

Alter

0,21^†

<60 Jahre

>60 Jahre

109 (100%)

112 (100%)

65 (59,6%)

76 (67,9%)

44 (40,4%)

36 (32,1%)

Tabelle 6b: Korrelation der COX-2 Expression mit ausgewählten klinisch-pathologischen Parametern

Korrelation der COX-1 mit klinisch-pathologischen Parametern

Da COX-1 und COX-2 ähnliche Funktionen haben, sind die im folgenden dargestellten Ergebnisse zur Gegenüberstellung beider Enzyme innerhalb ihrer jeweiligen Rolle im Mammakarzinom besonders interessant.

Zur Untersuchung der Rolle der COX-1 wurden auch bei diesem Isoenzym Korrelationen mit den o.g. klinisch-pathologischen Parametern aufgestellt. Es konnten bei zwei Parametern signifikant negative Korrelationen festgestellt werden
(Tabelle 7).

Bezüglich der Tumorgröße korreliert eine positive COX-1 Expression signifikant mit einer Tumorgröße ≤20 mm. Tumore mit einem Durchmesser >20 mm sind dagegen zum größten Teil (65,8%) COX-1 negativ (Abb. 11).

Weiterhin wurde eine Signifikanz zwischen einer positiven COX-1 Expression und einer fehlenden Lymphknotenmetastasierung festgestellt. Es liegt somit eine inverse Korrelation vor. Beachtet man auch hier wieder den jeweiligen Stichprobenumfang (Tabelle 3), so wird deutlich, daß die Anzahl der COX-1 positiven Proben am größten in den nicht metastasierten regionären Lymphknoten ist (pN0: 56,9%) und mit zunehmender Tumorabsiedelung in die Lymphknoten abnimmt (Abb. 12).

Die restlichen in der Studie untersuchten Parameter (Differenzierungsgrad, histologischer Typ, Gefäßinvasion, Östrogenrezeptorstatus, c-erbB2 Status, Tumorproliferation, Alter zum Diagnosezeitpunkt) zeigten keine signifikanten Zusammenhänge mit der COX-1 Expression.

Merkmal

Fallzahl

COX-1 negativ
(IRS 0-6)

COX-1 positiv
(IRS 7-12)

p-Wert
* Chi 2 Test
† Fisher Test

Tumorgröße (mm)

0,02^†

≤20
>20

139 (100%)

79 (100%)

67 (48,2%)

52 (65,8%)

72 (51,8%)

27 (34,2%)

Lymphknotenstatus

0,01^*

pN0
pN1mic
pN1a
pN2a
pN3a

102 (100%)

10 (100%)

42 (100%)

31 (100%)

33 (100%)

44 (43,1%)

8 (80,0%)

23 (54,8%)

22 (71,0%)

22 (66,7%)

58 (56,9%)

2 (20,0%)

19 (45,2%)

9 (29,0%)

11 (33,3%)

Differenzierungsgrad

0,93^*

G1
G2
G3

56 (100%)

110 (100%)

47 (100%)

31 (55,4%)

58 (52,7%)

26 (55,3%)

25 (44,6%)

52 (47,3%)

21 (44,7%)

Tabelle 7: Korrelation der COX-1 Expression mit ausgewählten klinisch-pathologischen Parametern

Abb. 3: Expression der COX-2 in 221 Tumorproben

Abb. 4: Expression der COX-1 in 218 Tumorproben

Abb. 5: Korrelation der COX-2 Expression mit verschiedenen histologischen Typen des Mammakarzinoms; p=0,012 (Chi ² Test)

Abb. 6: Korrelation der COX-2 Expression mit der Tumorgröße; p<0,0005
(Fisher Test)

Abb. 7: Korrelation der COX-2 Expression mit dem Lymphknotenstatus; p<0,0005 (Chi ² Test)

Abb. 8: Korrelation der COX-2 Expression mit dem Grading; p<0,0005 (Chi ² Test)

Abb. 9: Korrelation der COX-2 Expression mit der Gefäßinvasion; p=0,03
(Fisher Test)

Abb. 10: Korrelation der COX-2 Expression mit dem Östrogenrezeptorstatus; p=0,04 (Fisher Test)

Abb. 11: Korrelation der COX-1 Expression mit der Tumorgröße; p=0,02 (Fisher Test)

Abb. 12: Korrelation der COX-1 Expression mit dem Lymphknotenstatus; p=0,01 (Chi ² Test)

Univariate Überlebensanalyse

Von allen Patientinnen, die zum Zeitpunkt der Analyse noch am Leben waren, betrug die Nachbeobachtungszeit im Durchschnitt 87 Monate (2-132 Monate). Während dieser Zeit verstarben 67 Patientinnen (30%).

Bei 48 der 169 Patientinnen (28%) traten in der Nachbeobachtungszeit Rezidive auf. Die mittlere Nachbeobachtungszeit der Frauen ohne Rezidiv betrug 60 Monate
(1-120 Monate).

Alle Daten sind zusammenfassend in Tabelle 8 dargestellt.

Prognoserelevante klinisch-pathologische Parameter

Die folgenden Abbildungen stellen die für das rezidivfreie und Gesamtüberleben relevanten signifikanten Parameter dar. Darüber hinaus erreichten sowohl im rezidivfreien, als auch im Gesamtüberleben die Tumorgröße >20 mm (p=0,0063 bzw. p<0,0005) sowie die Stadien pT2-4 (p=0,0234 bzw. p=0,0001) statistische Signifikanz.
Die Gefäßinvasion (p=0,03) erwies sich ebenso wie die Tumorproliferation (p=0,0007) nur im rezidivfreien Überleben als signifikant.

Abb. 13: Einfluß der Lymphknotenmetastasierung auf das rezidivfreie Überleben

Abb. 14: Einfluß der Lymphknotenmetastasierung auf das Gesamtüberleben

Abb. 15: Einfluß der histologischen Entdifferenzierung auf das rezidivfreie Überleben

Abb. 16: Einfluß der histologischen Entdifferenzierung auf das Gesamtüberleben

Prognostische Bedeutung der COX-2 Expression

Die univariate Überlebensanalyse zeigte eine signifikante Korrelation zwischen einer positiven COX-2 Expression und einem verminderten rezidivfreien Überleben (p=0,0007).

Abb. 17: Einfluß der COX-2 Expression auf das rezidivfreie Überleben

Während die 5-Jahres-Überlebensrate im rezidivfreien Überleben bei Patientinnen mit COX-2 negativen Tumoren 82% betrug, war sie in der Gruppe der COX-2 positiven Tumoren auf 65% reduziert.

Ähnliche Unterschiede fanden sich beim Einfluß der COX-2 Expression auf das Gesamtüberleben. Auch hier korrelierte eine positive COX-2 Expression signifikant (p=0,02) mit einem verminderten Überleben innerhalb des dafür definierten Zeitraumes.

Abb. 18: Einfluß der COX-2 auf das Gesamtüberleben

Die 5-Jahres-Überlebensrate im Gesamtüberleben bei Patientinnen mit COX-2 negativen Tumoren betrug 78%. Im Gegensatz dazu ist sie bei der Gruppe der COX-2 positiven Patientinnen auf 65% gefallen.

Eine positive COX-2 Expression erwies sich auch innerhalb einer Subgruppe (n=50), welche adjuvant mit Tamoxifen therapiert worden ist, als signifikanter Prognoseparameter bezüglich des Gesamtüberlebens (p=0,04).

Prognostische Bedeutung der COX-1 Expression

Zwischen der COX-1 Expression und dem rezidivfreien Überleben (p=0,88) sowie dem Gesamtüberleben (p=0,53) konnten keine signifikanten Zusammenhänge erkannt werden (Abb. 19, Abb. 20).

Abb. 19: Einfluß der COX-1 Expression auf das rezidivfreie Überleben

Abb. 20: Einfluß der COX-1 auf das Gesamtüberleben

rezidivfreies Überleben

Gesamtüberleben

Merkmal

Fallzahl

Ereig-
nisse

5-Jahres-
Überlebens-
rate
(% ± SE)

Log
rank

Fallzahl

Ereig-
nisse

5-Jahres-
Überlebens-
rate
(% ± SE)

Log
rank

COX-2
Expression

0,0007

0,02

negativ
positiv

107

62

21

27

81,7 ± 4,1

64,9 ± 6,9

141

80

39

37

77,5 ± 3,7

64,5 ± 5,6

COX-1
Expression

0,88

0,53

negativ

positiv

93

74

27

20

76,4 ± 4,8

75,3 ± 5,7

119

99

39

37

75,1 ± 4,2

69,5 ± 4,8

histologischer
Typ

0,29

0,45

duktales Karzinom

lobuläres Karzinom

andere Karzinome

137

23

9

43

4

1

73,6 ± 4,1

84,4 ± 8,4

88,9 ± 10,5

179

28

14

66

7

3

70,3 ± 3,6

84,2 ± 7,2

84,6 ± 10,0

Tumorgröße (mm)

0,006

<0,00005

≤20

>20

107

62

23

25

80,3 ± 4,2

67,3 ± 6,6

142

79

35

41

79,0 ± 3,6

64,1 ± 5,8

Lymphknotenstatus

<0,00005

<0,00005

pN0 oder pN1mic

pN1a oder pN2a

pN3a

86

58

25

12

22

14

84,1 ± 4,5

72,7 ± 6,3

49,4 ± 11,4

114

74

33

28

26

22

78,2 ± 4,0

78,2 ± 4,0

37,3 ± 9,4

Tabelle 8a: Univariate Überlebensanalyse (Kaplan-Meier): Mittleres rezidivfreies Überleben sowie Gesamtüberleben bezogen auf klinisch-pathologische Faktoren und COX-1 oder COX-2 Expression

rezidivfreies Überleben

Gesamtüberleben

Merkmal

Fallzahl

Ereig-
nisse

5-Jahres-
Überlebens-
rate
(% ± SE)

Log
rank

Fallzahl

Ereig-
nisse

5-Jahres-
Überlebens-
rate
(% ± SE)

Log
rank

Differenzierungs-
grad

0,0002

0,0007

G1

G2

G3

39

89

39

3

27

17

96,1 ± 3,7

74,8 ± 4,9

57,9 ± 9,4

56

113

47

12

38

25

84,6 ± 5,0

76,1 ± 4,2

46,5 ± 8,2

Gefäßinvasion

0,03

0,08

nicht erkennbar

positiv

139

30

34

14

77,5 ± 4,0

65,9 ± 9,3

183

38

59

17

74,6 ± 3,4

63,7 ± 8,1

Östrogenrezeptor-
status

0,50

0,15

negativ

positiv

52

80

14

18

82,8 ± 6,1

79,5 ± 4,9

58

100

23

28

68,3 ± 6,4

73,8 ± 4,7

c-erbB2 Status

0,76

0,29

-

+

++

+++

60

31

22

18

19

7

4

5

75,4 ± 6,0

85,8 ± 6,6

76,9 ± 10,5

81,6 ± 9,6

73

35

24

19

27

9

7

9

73,3 ± 5,4

77,0 ± 7,7

65,2 ± 10,7

54,7 ± 12,2

Tumorproliferation

0,0007

0,63

MIB-1 <20%

MIB-1 ≥20%

93

26

16

10

88,6 ± 3,6

65,8 ± 11,0

110

32

35

10

72,3 ± 4,5

69,0 ± 8,6

Alter

0,08

0,34

<60 Jahre

>60 Jahre

84

85

31

17

72,8 ± 5,3

78,8 ± 5,0

109

112

35

41

79,0 ± 4,1

66,7 ± 4,7

Tabelle 8b: Univariate Überlebensanalyse (Kaplan-Meier): Mittleres rezidivfreies Überleben sowie Gesamtüberleben bezogen auf klinisch-pathologische Faktoren und COX-1 oder COX-2 Expression

Multivariate Überlebensanalyse

In die multivariate Überlebensanalyse wurden die Faktoren einbezogen, welche in der univariaten Analyse sowohl im rezidivfreien- als auch im Gesamtüberleben signifikante Korrelationen aufgewiesen hatten: die absolute Anzahl positiver Lymphknoten, die Tumorgröße und der histologische Differenzierungsgrad. Zusätzlich wurde das Alter der Patientinnen zum Zeitpunkt der Diagnosestellung in die Analyse aufgenommen.

In der Analyse des rezidivfreien Überlebens wurde deutlich, daß die Anzahl positiver Lymphknoten die größte prognostische Relevanz (p<0,0005; RR 1,09 {95%CI 1,05-1,14}) besitzt. Eine erhöhte COX-2 Expression erreichte in dieser Betrachtung grenzwertige Signifikanz (p=0,049; RR 1.90 {95%CI 1,004-3,59}).

Weiterhin stellten sich das Gesamtgrading und der G3-Status unabhängig betrachtet als signifikant heraus.

In der Betrachtung des Gesamtüberlebens erreichten folgende Faktoren als unabhängige Parameter statistische Signifikanz: Anzahl positiver Lymphknoten, Tumorgröße und Alter der Patientinnen (Tabelle 9).

rezidivfreies Überleben

Gesamtüberleben

Merkmal

RR

95% CI

p-Wert

RR

95% CI

p-Wert

COX-2 Expression

0,049

0,64

negativ

1,0

1,0

positiv

1,9

1,004 – 3,59

0,049

1,14

0,67 - 1,93

0,64

Anzahl positiver
Lymphknoten

1,09

1,05 – 1,14

<0,0005

1,05

1,01 – 1,08

0,0005

Tumorgröße (mm)

0,97

0,94 – 1,00

0,057

1,03

1,01 – 1,05

0,005

Differenzierungs-
grad

G1

1,0

1,0

G2

G3

2,86

5,38

0,84 – 9,78

1,48 – 19,56

0,09

0,01

1,23

2,13

0,62 – 2,43

0,96 – 4,76

0,55

0,06

Alter zum
Zeitpunkt der
Diagnose (Jahre)

0,99

0,96 – 1,01

0,33

1,02

1,003 – 1,05

0,03

Tabelle 9: Multivariate Überlebensanalyse (COX Regressionsmodell)

Zellinien

Ergänzend zu den immunhistochemischen Untersuchungen wurden 2 Mammakarzinomzellinien (MCF7; SK-BR-3) auf die Expression der COX-1 und -2 mit Hilfe des Western Blot untersucht. Es zeigte sich, daß beide Zellinien eine geringe basale Expression der COX-2 aufwiesen, die unter Zugabe von IL-1β und TPA stimulierbar gewesen ist (Abb. 21, Abb. 22).

Die COX-1 war in beiden Zellinien im Western Blot nicht darstellbar.

Abb. 21: Darstellung der COX-2 Expression in MCF7 mit Hilfe des Western Blot. Positivkontrolle: Expression von β-Aktin

Abb. 22: Darstellung der COX-2 Expression in SK-BR-3 mit Hilfe des Western Blot. Positivkontrolle: Expression von β-Aktin

Immunhistochemische Ergebnisse

Abb. 23: COX-2 negativ Normalgewebe

Abb. 24: COX-2 IRS 12

Abb. 25: COX-2 mit Peptid

Abb. 26: COX-2 negativ IRS 0

Abb. 27: COX-1 IRS 12

Abb. 28: COX-2 IRS 12

Abb. 29: COX-2 IRS 8

Abb. 30: COX-2 IRS 4

Abb. 31: COX-2 negativ IRS 0