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1  Einleitung

1.1 Ischämie: Ätiologie und Pathogenese

In der Transplantationsmedizin führt der Ischämie-/ Reperfusionsschaden häufig zu einer frühen Funktionsbeeinträchtigung oder sogar zu primären Versagen des Transplantates. Bei Leberresektionen kann es in Folge einer Ischämie/ Reperfusion (I/R) zu einer Enzündung mit transienter oder permanenter Zellschädigung kommen [24, 32]. Die Erfolgsaussichten von Leberresektionen und Transplantationen haben sich durch Fortschritte in der Operationstechnik, der Organkonservierung und durch die Entwicklung neuer immunsuppressiverTherapeutika verbessert. Dennoch stellt die Ischämie in der Chirurgie der Leber weiterhin ein wichtiges klinisches Problem dar [24]. Die I/R wurde in vielen Studien sowohl unter den Bedingungen der warmen Ischämie, wie sie bei Leberresektionen auftritt, als auch unter der kalten Ischämie, wie bei orthotopen Lebertransplantationen, untersucht [80]. Eine Ischämie von mehr als 12 h führt bei der Lebertransplantation durch zentrolobuläre Nekrosen zu primären Organversagen und ist mit einer erhöhten Inzidenz einer akuten und chronischen Transplantatabstoßungsreaktion verbunden [5]. Dabei werden verschiedene Formen der Zellschädigung beobachtet [54]. Bei der kalten Ischämie wurde eine protrahierte ATP Depletion [50, 68], gesteigerte Glykolyse [21, 68] und Kupffer-Zellaktivierung [80] und bei der warmen Ischämie eine Schädigung der Mitochondrien [12] beschrieben. Es hat sich gezeigt, daß sinusoidale Endothelzellen empfindlicher auf die kalte Ischämie reagieren, während die warme Ischämie primär Hepatozyten schädigt [94, 95].

1.2 Sepsis

Der septische Schock ist eine gefürchtete Komplikation mit häufig letalem Ausgang. Er ist charakterisiert durch Hypotension, vaskuläre Hyporeaktivität durch die Freisetzungen vasoaktiver Substanzen, myokardiale Dysfunktion und Störung der Mikrozirkulation [100, 105]. Endotoxin, ein Kapselbestandteil gram negativer Bakterien, wurde hauptverantwortlich für die septischen Komplikationen gemacht [68, 85]. In den letzten Jahren hat es sich jedoch etabliert, dass auch gram positive Bakterien zu einer Sepsis führen können [113]. In der akuten Phase Reaktion, w.z.B. bei systemischer Entzündungsreaktion nach Gewebeschädigung wie Trauma und Infektionen, werden in der Leber spezifische Proteine [Seite 10↓]synthetisiert [97]. Die Leber gehört zu den entscheidenden Organen in der septischen Abwehrreaktion, da sie die meisten Makrophagen des Körpers (Kupffer Zellen) enthält [97]. Die Zytokine, wie Interleukin-1β (IL-1β) und Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α) gehören zu den bedeutendsten Mediatoren dieser Reaktion und werden von den Kupffer Zellen freigesetzt [96]. Ein Ausfall der Leberfunktion kann somit den Verlauf septischer Komplikationen dramatisch protrahieren.

1.3 Zytokine und Endotoxin

Die hepatische Schädigung bei der Ischämie oder Sepsis kann eine komplexe Kaskade inflammatorischer Mediatoren auslösen. Dabei haben Zytokine eine wichtige Rolle in der körpereigenen Abwehrreaktion. IFN-γ z.B. wird in Hepatozyten bei viralen und parasitären Infektionen synthetisiert und kontrolliert deren Proliferation [97]. Die Freisetzung von TNF-α aus den Makrophagen wird durch lebende oder tote gram negative Bakterien, Candida und durch Parasiten initiert [25, 88]. IL-1β hat dabei eine regulatorische Funktion auf Wachstum und Differenzierung von B-Lymphozyten [97]. Inflammatorische Zytokine und Endotoxin können nach exzessiver Freisetzung auch zu deletären Effekten führen. Die Aktivierung der Kupffer Zellen führt zu einer Überproduktion und Freisetzung proinflammatorischer Zytokine, einschließlich TNF-α und IL-1β [23, 25, 63]. Diese Zytokine induzieren die inflammatorische Antwort, einschließlich der Synthese Akuter Phase Proteine, verstärken die intra- und interzelluläre Permeabilität und steigern die Adhäsionsfähigkeit der neutrophilen Granulozyten an den Sinusoiden [68]. TNF-α triggert außerdem den programmierten Zelltod, die Apoptose [68]. Während des septischen Schocks bewirkt LPS die TNF-α Freisetzung aus Makrophagen. Dadurch kann eine Hypotension, durch eine NO/ CO vermittelte cGMP Stimulation, ausgelöst sowie eine dissemenierte intravasale Koagulation und ein multiples Organversagen hervorgerufen werden [88].

1.4 Signaltransduktion

Es hat sich gezeigt, daß während der I/R reaktive Sauerstoffspezies (ROS) gebildet werden und diese potentiell zwei Signaltransduktionswege über NF-κB und AP-1 regulieren können [124]. ROS sind an der unmittelbaren Reaktion der I/R Schädigung beteiligt [32, 63, 124] und haben eine große Bedeutung in der akuten Zellantwort auf die einsetzende Gewebeschädigung und die [Seite 11↓]Entzündungsreaktion [28, 124]. Die Konzentration und Typ der AP-1 Proteine sowie deren posttranslationaler Modifikationen können die Aktivität der DNA-Bindung und Aktivierung verschiedener Gene verändern [124]. AP-1 wird durch die Anwesenheit vonEndotoxin [16], Hyperoxie und freie Sauerstoffradikale [124] induziert. NF-κB kann durch verschiedene Einflüsse, w.z.B. Zytokine (IL-1β, TNF-α), Endotoxin (LPS), Aktivatoren der Proteinkinase C, durch Viren und Oxidanzien stimulert werden [9, 124]. Im Rahmen der Zellaktivierung werden die IκB Proteine phosphoryliert und dissoziieren vom NF-κB, so daß der freie NF-κB Komplex in den Nukleus gelangt, an die DNA bindet und die Transkription der entsprechenden Gene initiiert [61].

1.5 Oxidative und antioxidative Mechanismen

Bei der Reperfusion des postischämischen Gewebes nach warmer und kalter Ischämie werden ROS generiert. ROS entstehen z. B. in der mitochondrialen Elektronentransportkette [7], unter Beteiligung der Cycloxygenase sowie zellulärer Enzyme, w.z.B. der Zytochrom P450 Oxidase, der Xanthinoxidase und der NADPH Oxidase [26, 32, 68]. Die Xanthinoxidase wird hauptsächlich für die Entstehung der ROS in postischämischen Geweben verantwortlich gemacht [78, 91]. Sie ist in Peroxysomen lokalisiert und in den Hepatozyten am höchsten konzentriert [6]. Sie generiert O2 - . und H2O2 während des Metabolismus von Xanthin oder Hypoxanthin zu Harnsäure. Die Cyclo- und Lipoxygenase erzeugen ebenfalls O2 - . und Singlet Sauerstoff bei der Synthese von Prostaglandinen und Leukotrienen. Andererseits führt die Fenton Reaktion zur Entstehung von Hydroxyl-Radikalen (OH.) [51]. ROS, einschließlich Superoxidradikale (O2 - . ), Wasserstoffperoxid (H2O2) und Hydroxyradikale (OH.) können durch Lipidperoxidation, oxidative Modifikation von Proteinen und DNA zur Zellschädigung beitragen (siehe Abb. 1) [6, 51]. Zusätzlich schädigt die Akkumulation aktivierter neutrophiler Granulozyten im Leberparenchym das Gewebe durch Freisetzung von Oxidanzien und Proteasen [63]. Bei der Synthese der Oxidanzien in den Neutrophilen ist die NADPH Oxidase involviert. Neutrophile werden durch die Zytokin-induzierte Expression der Adhäsionsmoleküle von Endothelzellen und durch lebersynthetisierte Chemokine aktiviert [63]. Das aktive Enzym oxidiert NADPH wobei das freigesetzte Elektron molekularen Sauerstoff reduziert und O2 - . bildet, welches weiter zu Wasserstoffperoxid (H2O2) und Hydroxyradikalen (OH.) oder Hypochloridsäure (HOCl), also zu potenten [Seite 12↓]Oxidanzien reagiert [63]. Neben den oben erwähnten I/R und Entzündungsreaktionen, verursachen auch exogene Agenzien, w.z.B. Stickoxide und UV-Strahlung oxidativen Streß [49]. Daher spielt die Leber mit ihren antioxidativen Abwehrmechanismen eine bedeutende Rolle [47, 49]. Zu den antioxidativen, zellprotektiven Enzymsystemen gehören die Katalase, Glutathionperoxidase, Glutathionereduktase und Superoxiddismutase [49, 58].Die Superoxiddismutase baut das diffusible Radikal O2 - . zu H2O2 durch enzymatische Dismutation um. Glutathionperoxidase und Katalase hingegen bauen H2O2 zu Wasser ab. Es ist ferner bekannt, dass verschiedene Stressoren die Expression einer weiteren Gruppe von Proteinen, den sogenannten Hitze Schock Proteinen (HSPs) induzieren [55]. Ihre Expression wurde zuerst bei erhöhten Temperaturen nachgewiesen [55]. Hitze Schock ist jedoch nicht der einzige Stimulus für die Synthese von HSPs. Die Exposition von Zellen mit Aminosäurenanaloga, Schwermetallen, Proteinkinase C Stimulatoren, Ca2+-Konzentration erhöhende Agenzien, Ischämie, mikrobielle Infektionen, NO, Hormone und Antibiotika können die Expression von HSPs induzieren [34, 55, 76, 77].

1.6 Hämoxygenasen (HO)

Bis heute sind drei Isoformen der HO identifiziert worden, die den Abbau von toxischem Häm im biologischen System koordinieren. Dazu gehören die durch oxidativen Stress induzierbare HO-1 aus der Familie der Hitze Schock Proteine [19], die konstitutive HO-2 [72] und die erst kürzlich identifizierte HO-3 [79]. Diese membrangebundenen Proteine sind Produkte unterschiedlicher Gene und sind in den Organen unterschiedlich verteilt [71, 72]. So wurde z.B. die höchste Konzentration an HO-1 in der Milz und der Leber gemessen, während HO-2 im Gehirn und im Testis am höchsten konzentriert ist [72]. Wie kein anderes Enzym, reagiert die HO-1 extrem empfindlich auf verschiedene Stresssoren, w.z.B. I/R, Hypoxie, Hyperoxie [110], inflammatorische Zytokine [5, 59, 96, 112], Endotoxin [5, 16, 92], Häm [111, 116], Metalle [43], Hypothermie, Hyperthermie [102] sowie die portale Hypertension [33] [Abb. 1]. Der HO-1 wird eine bedeutende Rolle in der Stressantwort zugeschrieben, da Sequenzen von NF-κB, AP-1 und AP-2 Bindungen in der Promotorregion des humanen HO-1 Gens gefunden wurden [16, 42, 61, 74, 101] [Abb. 1]. Die Unterschiedlichkeit der HO-1 Induktoren legt verschiedene Regulationslemente für dieses Gen nahe. Zwei weitere regulatorische Elemente, NF-κB und AP-2 werden als wichtige regulierende [Seite 13↓]Faktoren der Antwort der HO-1 auf oxidativen Stress, Zellschaden, Wachstum und Differenzierungsprozess angesehen [61].Andere Proteine, die in der Enzündungsreaktion eine zentrale Rolle spielen, benutzen ebenfalls diese transkriptionellen Faktoren, NF-κB, AP-1 und HIF-1 w.z.B. NOS-2, welches eine bedeutende Rolle unter Stressbedingungen spielt [66, 117]. Es wird angenommen, dass HO-1 z.B. mit NOS-2 in der Stressantwort auf Hypoxie und Sepsis miteinander interagieren [10, 17, 72].

Abb. 1: Stimulatoren der HO-1

Häm, das Substrat der HO-1, ist ein Eisenkomplex aus Protoporphyrin IX [35]. HO-1 katalysiert die Oxidation des Häms durch α-meso-Hyroxylierung, Fragmentation des α-meso-Hydroxyhäms zu Verdohäm und seine Oxidation zu Biliverdin [67]. HO-1 verbraucht dabei drei Moleküle O2 und fünf Elektronen, die von der Zytochrom P450 Reduktase für diese Reaktion zur Verfügung gestellt werden, um Häm in drei biologisch aktive Produkte, das Biliverdin, Eisen und Kohlenmonoxid abzubauen (CO) [14, 40, 67, 73] [Abb. 2]. CO spielt eine bedeutende Rolle in der neuronalen Signaltransduktion [123], in der Modulation des Gefäßtonus (Vasodilatation) [36, 39, 107, 114] und des Tonus glatter Muskelzellen [103] [Abb. 2]. CO (ein potentieller Signalüberträger wie das NO) reguliert das cGMP durch Bindung an der prostethischen Gruppe der Guanylatcyclase hoch und kann die Zellfunktion nach hämorrhagischer und oxidativer Zellschädigung modulieren [81]. Ferner ist gezeigt worden, dass CO die vasokonstriktiven Effekte des Hämoglobins und des Häms kompensieren kann [2].


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Abb. 2: Enzymreaktion der HO-1

In Fibroblasten konnte die Überexpression der HO-1 die TNF-α induzierte und durch CO mediierte Apoptose verhindern [99]. CO besitzt aber auch einen anti-inflammatorischen Effekt durch die mitogen-aktivierte Proteinkinase [89]. Dabei wird die LPS-induzierte Expression pro-inflammatorischer Zytokine wie TNF-α, IL-1β, supprimiert und IL-10 stimuliert [89]. Biliverdin wird durch die Biliverdinreduktase weiter zu Bilirubin, einem weiteren potenten Antioxidanz, Antimutagen und Anti-Komplementagenz abgebaut [38, 67]. Es wurde gezeigt, dass Bilirubin effizient die Lipidperoxidation hemmt und seine antioxidative Wirkung wahrscheinlich auf einer Interaktion mit dem antioxidativen α-Tocopherol und Lipoprotein beruht [2, 22]. Der Zusatz von Bilirubin zum Kulturmedium konnte ebenfalls die Reduktion der Zytotoxizität durch verschiedene Oxidanzien hervorheben [22]. Aus geschädigten Erythrozyten freigesetztes Hämoglobin ist ein Proxidanz und eine potentielle Quelle freier Radikale. So wurde gezeigt, dass in Endothelzellen inkorporiertes Häm die zytotoxische Wirkung granulozytär freigesetzter Oxidanzien durch Freisetzung seines Eisens und Bildung freier Sauerstoffradikale verstärkt [8]. Es kann außerdem als Promotor für die LDL-Oxidation dienen [8]. Andererseits kann Häm nach längerer Exposition einen Abwehrmechanismus gegenüber oxidativem Stress mittels Induktion der HO bewirken [56]. Die damit verbundene Eisenfreisetzung wird mit einem Anstieg der Ferritinsynthese begleitet. Ferritin, das eine potentiell antioxidative Wirkung [Seite 15↓]besitzt, bindet Eisen. Es wird daher vermutet, dass die Resistenz gegenüber oxidativen Stress zunehmen kann [8]. Es wurde ebenfalls an Fibroblasten gezeigt, dass die Zytoprotektion durch die HO-1 zusätzlich zur Zunahme des Eisenefflux, die intrazelluläre Eisenkonzentration moduliert und die Vitalität der Zellen reguliert [30]. Es hat sich gezeigt, dass die HO-1 eine protektive Rolle in den verschiedenen Geweben spielt [4, 72]. Wie dieses Protein aber in der humanen Leber funktioniert und reguliert wird, ist bislang unbekannt.


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04.08.2004