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3  Material und Methoden

3.1 Verwendung humanen Gewebes

Zur Gewinnung humaner Leberzellen wurde Lebergewebe aus reseziertem Gewebe von Patienten mit primären oder sekundären Lebertumoren verwendet. Die Verwendung des Gewebes für Forschungszwecke wurde von der zuständigen Ethikkommission für die speziellen Fragestellungen dieses Antrags genehmigt und geschah mit Einverständnis der Patienten. Lebergewebe von Patienten mit HIV, Hepatitis B oder C Infektionen wurde von den Untersuchungen ausgeschlossen.

3.2 Isolation der humanen Hepatozyten

Die Isolation humaner Hepatozyten erfolgte nach der von Dorko et al. beschriebenen in situ Kollagenase Perfusionstechnik [29].

3.2.1  Humanes Lebergewebe

Das humane Lebergewebe wurde aus Leberteilresektaten primärer und sekundärer Lebertumoren gewonnen. Unmittelbar nach der Resektion wurde unter sterilen Bedingungen, ein mittelgroßes Stück (ca. 6cm x 6cm x 4cm) vom Rand des makroskopisch normal erscheinenden Resektates entnommen. Das Gewebe wurde in einem Inkubationsmedium für Hepatozyten (siehe unten) gekühlt in das Labor transportiert.

3.2.2  Leberperfusionstechnik

Der erste Schritt der Leberperfusionstechnik beinhaltet die Entfernung des Blutes aus dem Gewebe und die Auftrennung der interzellulären Matrix, um eine Kultur isolierter Hepatozyten zu erhalten.

Reagenzien:


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NaCl

#1.06404, Merck, Darmstadt, D

KCl

#4936, Merck, Darmstadt, D

CaCl 2H2O

#2382, Merck, Darmstadt, D

Hepes pKa 7,5

#H-3375, Sigma, Deisenhofen, D

Albumin, bovine (fettsäurenfrei) 0.5%

#A6003, Sigma, Deisenhofen, D

EGTA

#03780, Sigma, Deisenhofen, D

Kollagenase P

#1213873, Boehringer Mannheim, D

Trypan Blau Lösung - 0.5%

#L6323, Biochrom, Berlin, D

PBS Dulbecco's w/o NaHCO3 1x

#14200-059,LifeTech.,Karlsruhe, D

Rattenschwanz Kollagen

 

pH-Meter

#CG84, Schott, Hofheim, D

Filter-0,2 µm

Falcon , Becton Dickinson, NJ, USA

Zellschaber Costar

Corning, NY, USA

Zentrifugenröhrchen, 50 ml

#420702, Falcon, Becton Dickinson, NJ, USA

Perfusionsstammlösungen:

Perfusionslösung I (10 fach konzentriert) 1 Liter

NaCl

1,42 M

KCl

67 mM

Hepes pKa 7.5

100 mM

Es wurde in 1000 ml Aqua dest. gelöst, ein pH von 7,4 eingestellt, steril filtriert und bei 4oC aufbewahrt.

Perfusionslösung II

Perfusionslösung II.1

Albumin

0,5%

KCl

6,7 mM

NaCl

67 mM

Hepes pKa 7.5

100 mM

Es wurde in 800 ml Aqua dest. gelöst und ein pH von 7,4 eingestellt.

b.Perfusionslösung II.2

CaCl2 2H2O

4,8 mM

CaCl2 wurde in 100 ml Aqua dest. gelöst.

Perfusionslösung II.1 und II.2 wurden gemischt, auf einen Liter verdünnt, ein pH von 7,4 eingestellt, steril filtriert und bei 4°C aufbewahrt. Diese Lösung wird im folgenden nur noch Perfusionslösung II (Per II) genannt.


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Perfusionslösung :

Die Perfusionslösung wurde unmittelbar vor der Perfusion aus der Stammlösung hergestellt.

1.Perfusionslösung I (Per I) ohne EGTA für 500 ml

50 ml der Perfusionsstammlösung I wurden mit 450 ml Aqua dest. verdünnt und ein pH von 7,4 eingestellt. Diese Lösung wurde steril filtriert und bei 4oC aufbewahrt

2. Per I mit EGTA für 500 ml

50 ml der Perfusionsstammlösung I wurden mit 450 ml Aqua dest. verdünnt und mit 0,475 g EGTA, einem Calcium Komplexbildner, versetzt. Der pH Wert wurde auf 7,4 eingestellt, steril filtriert und bei 4oC aufbewahrt

3.Per II mit Kollagenase für 100 ml

In 100 ml der Perfusionsstammlösung II wurden ca. 25 mg Kollagenase P gelöst, steril filtriert und in einem Wasserbad bei 37oC bis zur aktuellen Perfusion aufbewahrt.

Geräte für die Leberperfusion:

Wasserbad

Memnert, D

Buchner Sieb

Bender & Hohlbein, D

Silikonschläuche

Tygon, S-50 HL, D

Peristaltikpumpe

Roth, D

Laminarbox, Typ HS 18/2

Heraeus, D

Leberperfusion:

Die Flasche der Per I Lösung mit EGTA wurde in das Wasserbad bei 37°C gestellt. Das Silikonschlauchsystem wurde mit der Peristaltikpumpe verbunden und mit Per I gefüllt. Das Sieb wurde in einem Stativ über einer leeren, sterilen Flasche plaziert und das Lebergewebe eingesetzt. Danach wurde die Silikonschlauchspitze mit einem Lebergefäß verbunden und das Gewebe mit 150-200 ml der Per I perfundiert, um das verbliebene Blut auszuwaschen. Danach [Seite 20↓]wurde das Gewebe auf die gleiche Weise mit Per II plus Kollagenase perfundiert, wobei die aufgefangene Perfusionslösung über das andere Ende des Schlauchsystems zirkulierte. Die Leber wurde ungefähr 30 min perfundiert, bis eine weiche Gewebekonsistenz und damit die Lösung der interzellulären Verbindungen erreicht war.

Isolation der Hepatozyten

Instrumente und Geräte

Sterile Schere und Pinzette

 

Trichter, Gaze

 

Petrischale, 90 mm

#135131, Falcon, Becton Dickinson, NJ, USA

Percoll-Lösung

#17-0891-01, Pharmacia Biotech AB, Uppsala Sweden

Phasenkontrastmikroskop CK2-TR

Olympus, Japan

Lichtmikroskop CHT

Olympus, Japan

Zentrifuge, Typ Labofuge 400R

Heraeus, D

Prozedur:

Nach der Perfusion wurde das Lebergewebe in eine Petrischale mit Per I ohne EGTA (4°C) gelegt und die Kapsel des Lebergewebes entfernt. Danach wurde die Zellsuspension über sterile Gaze in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen filtriert und mit 50 g für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in Per I ohne EGTA resuspendiert. Um die Hepatozyten von nichtparenchymatösen und toten Zellen zu trennen, wurde die Hepatozytensuspension mit 1:10 in 0,9% NaCl verdünnter Percoll Lösung auf eine Endkonzentration von 75% verdünnt und erneut mit 50 g für 20 min bei 4°C zentrifugiert. Danach wurde das Pellet zweimal mit Per I ohne EGTA bei 50 g für 5 min bei 4°C gewaschen und am Ende im Hepatozytenkulturmedium resuspendiert. Eine Probe der Zellen wurden nach Färbung mit Trypan Blau in der Neubauer Kammer gezählt und ihre Vitalität bestimmt.


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Trypan Blau Vitalfärbung:

Die Vitalität der Hepatozyten wurde mit dieser Färbung eingeschätzt [13]. Trypan Blau Lösung 0.5% wurde 1:4 mit PBS verdünnt. Davon wurden 900 µl mit 100 µl der Zellsuspension gemischt. Die Zellen wurden in vier Feldern der Neubauer Kammer gezählt und wie folgt berechnet:

Kulturmedium:

Williams' E Medium 500.00 ml

#32551-020, Life Technologies, Karlsruhe, D

Penicillin/Streptomycin

100 U/100 µg/ml

#15140-023, Life Technologies, Karlsruhe, D

Insulin 1 µM

#I-5500, Sigma, Deisenhofen, D

Hydrocortison 1,4 µM

#H-4001, Sigma, Deisenhofen, D

Hepes Puffer 15 mM

#15630-056, Life Technologies, Karlsruhe, D

Kälber Serum 10 %

#B15-004, PAA, Linz, Österreich

3.2.3  Primäre Kultur der humanen Hepatozyten

Die Petrischalen wurden mit 12 Anteilen PBS und 1 Anteil Vitrogen (Kollagen) beschichtet und der Überstand nach 30 Minuten entfernt. Die isolierten Hepatozyten wurden auf die Kollagen beschichteten Petrischalen mit einer Zelldichte von 5 x 106 ausgesät [29]. Die Zellen wurden bei 37°C unter 95% Luft und 5% CO2 inkubiert, bis sie an der Kollagenschicht adherierten. Das Medium wurde täglich gewechselt.


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3.3  Elektrophorese und Western Blot

3.3.1  Zytosol Isolation

Proteinlysate:

Reagenzien:

Protease Inhibitor-Lyse Puffer [70]:

 

TES

#T-0772, Sigma, Deisenhofen, D

DTT

#D-0623, Sigma, Deisenhofen, D

20 mM TES, 2mM DL-dithiothreitol und 10 % Glyzerol wurden mit Protease Inhibitoren gemischt.

Protease Inhibitoren:

Antipain (25 µg/ml)

#A-2671, Sigma, Deisenhofen, D

Aprotinin (25 µg/ml)

#10820, Fluka, Deisenhofen, D

Leupeptin (25 µg/ml)

#L2023, Sigma, Deisenhofen, D

Cymostatin (25 µg/ml)

#C-7268, Sigma, Deisenhofen, D

Phenanthroline (50 µM)

#131377, Sigma-Aldrich, Deisenhofen, D

Pepstatin (10 µg/ml)

#77170, Fluka, Deisenhofen, D

PMSF (100µM)

#P-7626Sigma, Deisenhofen, D

Die Zellen wurden mit einem Zellschaber vom Boden der Petrischalen getrennt und zusammen mit dem Medium in ein Reagenzglas überführt und bei 4°C mit 1500 g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, die Zellen zweimal mit PBS resuspendiert und wie oben beschrieben, zentrifugiert, bis der Überstand klar war. PMSF (Phenylmethyl-Sulfonylfluorid) wurde mit dem Proteaseinhibitor-Lyse Puffer unmittelbar vor dem Gebrauch gemischt und das Pellet darin resuspendiert. Dann wurde die Probe in einem Eppendorf Röhrchen dreimal in flüssigen Stickstoff eingefroren und im Wasserbad wieder aufgetaut. Es ist darauf zu achten, dass die Proteinproben nicht zu warm werden, um die Denaturierung des Proteins zu vermeiden. Die Proben wurden dann bei -20°C aufbewahrt.


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3.4  Messung der Proteinkonzentration

Reagenzien und Geräte:

Bovine Albumin

#A6003, Sigma, Deisenhofen, D

BCA Protein Assay Reagent A

#23223, Pierce, IL, USA

BCA Protein Assay Reagent B

#23223, Pierce, IL, USA

Fluostar Galaxy

BMG Labor Technologies, Offenburg, D

Der Proteingehalt der Proben wurde mit Hilfe der Lowry-Methode [60, 69] (Biuret-Reaktion) gemessen. Zur Erstellung einer Verdünnungsreihe wurde eine Proteinstandardlösung (Bovine Albumin) mit einer Konzentration von 2 mg/ml 1:2 mit Aqua dest. Verdünnt, um die höchste Standardkonzentration von 1 mg/ml zu erhalten. Danach wurde der Standardansatz schrittweise 1:2 bis auf eine Endkonzentration von 62,5 µg/ml verdünnt. Es wurden jeweils 20 µl in zwei Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert. Zur Messung der Proteinkonzentration der Proben wurden jeweils 20 µl in die Mikrotiterplatte pipettiert. BCA Protein Assay Reagenz A und B wurden 50:1 gemischt und jeweils 300 µl dieser Mischung zu jeder Probe sowie der Standardreihe pipettiert. Nachdem die Mikrotiterplatte 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurde, erfolgte die Extinktionbestimmung bei einer Wellenlänge von 544 nm.

3.4.1  Elektrophorese und Western Blot

Es wurden die Expression von Hämoxygenase 1 und ß-Aktin in der Zellkultur humaner Hepatozyten im Western Blot analysiert. Die SDS Page und Western Blot Analyse erfolgte nach einem standardisierten Protokoll [104].

SDS Page und Western Blot:

Reagenzien:


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Acrylamid Stammlösung 30% (Rotiphorese Gel 30)

#3029, Roth, Karlsruhe, D

Tris Puffer 0,5 M pH 6.8

#T1503, Sigma, Deisenhofen, D

Tris Puffer 1,5 M pH 8,8

#T1503, Sigma, Deisenhofen, D

SDS (sodium dodecyl sulfate)

#80-1128-74,Pharmacia,LKB,Upsala, Schweden

APS (ammonium peroxydisulfate)

#A-9164, Sigma, Deisenhofen, D

TEMED

#T-8133, Sigma, Deisenhofen, D

Bromphenol Blue

#B-6896, Sigma, Deisenhofen, D

Butanol

#59510, Merck, Darmstadt, D

Glycin

#G-7126, Sigma, Deisenhofen, D

Glyzerol

#G-7757, Sigma, Deisenhofen, D

Aminohexansäure

#800145, Merck, Darmstadt, D

Methanol

#1.06007, Merck, Darmstadt, D

2-Mercaptoethanol

#M-6250, Merck, Darmstadt, D

Na2HPO4

#6586, Merck, Darmstadt, D

NaH2PO4 .H2O

#6345, Merck, Darmstadt, D

NaCl

#1.06404, Merck, Darmstadt, D

Tween-20

#27,4348, Sigma, Deisenhofen, D

Laemli Puffer:

Tris Puffer 0,5 M pH 6.8

25 ml

SDS 20%

10 ml

Glyzerol

10 ml

Bromphenol Blau 10%

50 µl

Trenngel:

In Abhängigkeit des Molekulargewichtes der zu analysierenden Proteine, wurden Gele mit einer Acrylamidkonzentration von 12,5% [32 kDa (HO-1) und 42 kDa (ß-Actin)] verwendet.

 

12,5%

Aqua dest.

3,4 ml

Acrylamid Stamm 30%

4 ml

Tris Puffer 1,5M pH 8,8

2,5 ml

SDS 10%

0,1 ml

APS

50 µl

TEMED

5 µl

Butanol wurde verwendet, um eine glatte Oberfläche des Gels zu erhalten.


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Sammelgel:

Aqua dest

3,2 ml

Acrylamid Stamm 30%

0,5 ml

Tris Puffer 0,5 M pH 6,8

1,25 ml

SDS 10%

50 ml

APS

100 µl

TEMED

10 µl

Elektrophorese Puffer

(mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen)

Glycin

14,25 g

SDS 10%

1 g

Tris Puffer

3 g

Blot Puffer:

Katoden Puffer

 

Tris

25 mM

6-Aminohexansäure

40 mM

Methanol

20%

mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen

Anode-I Puffer

Tris

30 mM

Methanol

20%

mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen.

Anode-II Puffer

 

Tris

300 mM

Methanol

20%

mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen.


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Waschpuffer

Die Stammlösung wurde auf 1:10 vor dem Gebrauch verdünnt.

PBS-Stammlösung (10x):

 

Na2HPO4

0,58 M

NaH2PO4 .H2O

0,17 M

NaCl

0,68 M

Roti-PVDF Transfer Membran

Roth, Karlsruhe, D

Gel Blotting Paper GB002

Merck, Darmstadt, D

femtoLUCENT Chemiluminescence Detection System

Chemicon, Hofheim/TS, D

Geräte:

Hitze Block: Blockthermostat BT 200

Kleinfeld, D

Gel- Elektrophoresekammer,Mini-Trans-blot

Bio-Rad, München, D

Semi-Dry-Blotter Pegasus

Phase, Lübeck, D

Spanungsquelle: Bio Rad Power Pac 200

Bio-Rad, München, D

Kodak Scientific Imaging Film

Rochester, New York, USA

Detektion: Entwickler

Protec 45 Compact, D

Methode:

Nachdem das Trenngel polymerisierte, wurde das Sammelgel mit den Ladetaschen darüber gegossen. Es wurden Proteinproben gleicher Menge verwendet. Für HO-1 und ß-Aktin wurden jeweils 100 µg pro Gesamtprobe in ein Eppendorf Gefäß gegeben. Die Proteinproben wurden 1:1 mit Laemli Puffer verdünnt, das Protein 5 min. bei 90°C denaturiert und bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahrt. Die Gele wurden in den Elektrophoresepuffer plaziert und die Proben in die Geltaschen geladen. Die Elektrophorese erfolgte bei 140 Volt für ca. 70 min. Die getrennten Proteine imTrenngel wurden dann mittels der Semi-dry Transfertechnik auf eine PVDF Membran für 40 min bei 0,05 A transferiert. Um unspezifischen Bindungen zu blockieren, wurden die Membranen in 5%iger Blot-QuickBlocker Lösung (Chemikon Kit) in PBS-Tween-20 bei [Seite 27↓]Raumtempratur für 20-30 min. inkubiert. Danach wurden die Membranen mit PBS und Tween-20 für 30 min. gewaschen.

Primäre Antikörper Behandlung:

Die primären Antikörper wurden in femto/ TBST Puffer verdünnt. Es wurden folgende Antikörper in den entsprechenden Verdünnungen verwendet:

Hämoxygenase 1 Maus-monoklonaler Antikörper; Dilution: 1:2000

#H59320, Transduction Laboratories Becton Dickinson, Heidelberg, D

ß-Aktin Maus-monoklonaler Antikörper Dilution; 1:2000

#A-5441, Sigma, Saint Louis, Missouri, USA

Die Membranen wurden mit den primären Antikörpern für 90 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Membranen mit PBS und Tween-20 Lösung für 45 min gewaschen.

Sekundäre Antikörper (Ak) Behandlung:

Meerrettich-Peroxidase-konjugierte

anti-Maus Ak

#164015, Amersham, Freiburg, D

Meerrettich-Peroxidase-konjugierte

anti-Kanninchen Ak

#164014, Amersham, Freiburg, D

Diese anti-Maus oder anti-Kanninchen Antikörper sind mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert und binden an den Fc Teil der primären Antikörper. Die Membranen wurden mit den sekundären Antikörpern in einer Verdünnung von 1:2000 in femto/ TBST Puffer für 90 min bei Raumtemperatur inkubiert und danach für eine Stunde in femto/ TBST Puffer gewaschen. Die Membranen wurden mit einem Chemilumineszens-Detektionssystem entwickelt. 10 µl des Detektionsreagenz-1 und 1 µl des Detektionsreagenz-2 wurden in 10 ml Detektionspuffer gemischt und darin die Membranen für ca. 3 min bei Raumtemperatur inkubiert.


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Filmentwicklung:

In einer Entwicklungskassette wurde dann der Film mit den chemilumineszierenden Proben für unterschiedliche Zeiträume (0,5-30 min) in der Dunkelkammer exponiert und entwickelt.

Wiederverwendung der Membran:

Die Membranen wurden in dem Trennpuffer bei 50°C für 60 min inkubiert. Es wurde auf 50 ml mit Aqua dest aufgefüllt. Die Membranen wurden danach mit PBS-Tween-20 Lösung für 30 min gewaschen

Der Puffer enthält:

 

2-Mercaptoethanol

100 mM

SDS

2%

Tris-HCl (pH 6,8)

62,5 mM

3.5 Isolation der RNA, Reverse Transkription und Polymeraseketten-Reaktion

Es wurden die mRNA Expression von Hämoxygenase 1 und ß-Aktin in der Zellkultur humaner Hepatozyten nach einem standardisierten Protokoll analysiert [20].

Reagenzlösung:

Guanidin-Thiocyanat

4 M

#G-7028, Sigma, Deisenhofen, D

Na-Citrat dihydrat, pH 7

25 mM

#6586, Merck, Darmstadt, D

N-Lauroyl-Sarcosin

0,5%

#L-9150, Sigma, Deisenhofen, D

2-Mercaptoethanol

0,1M

#M-6250, Merck, Darmstadt, D

Vorbereitung der Stammlösung (100ml):

Guanidin-Thiocyanat (47,48 g) und Na-Citrat (0,73 g) wurden gemischt und ein pH Wert von 7.0 eingestellt. Dann wurde N-Laroyl-Sarcosin (10%) 5 ml dazugegeben. Unmittelbar vor dem Gebrauch wurde in diese Stammlösung 50 ml 2-Mercaptoethanol (0,36 ml) hinzugegeben.


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DEPC Wasser:

DEPC Konzentrat

#D5758, Sigma, Deisenhofen, D

1ml DEPC Konzentrat wurde mit 1000 ml aqua dest. versetzt, über Nacht gemischt und vor Gebrauch autoclaviert. Diese Lösung wurde verwendet, um die RNAase zu inaktivieren.

Ladepuffer:

Xylencyanol FF

0,25 g

#X4126, Sigma, Deisenhofen, D

Bromphenolblau

0,25 g

#E6896, Sigma, Deisenhofen, D

Glycerol

40%

#G2025, Sigma, Deisenhofen, D

Der Puffer wurde verwendet, um die Proben in die Probetaschen zu plazieren und zu markieren.

5* TBE Puffer :

Tris Puffer

54 g

#T1503, Sigma, Deisenhofen, D

Borsäure

37,5 g

#B6768, Sigma, Deisenhofen, D

EDTA-Lösung 0,5M (pH 8)

3,722 g

#E5134, Sigma, Deisenhofen, D

wurden in 1 Liter aqua dest. gemischt, auf 1:10 mit aqua dest. verdünnt und autoklaviert. Dieser Puffer dient als Dielektrikum bei der RNA-Auftrennung.

Basenpaarleiter:

100 Basepaarleiter

#27-4001-01, Amersham, Freiburg, D

20 µl wurden mit 162 µl 0,5x TBE Puffer und 18 µl Ladepuffer versetzt. Die Basenpaarleiter wurde verwendet, um die Basenlänge der Proben zu ermitteln.

Ethidiumbromid:

#E7637, Sigma, Deisenhofen, D

Ethidiumbromid wurde als Fluoreszenzfarbstoff für das Agarosegel verwendet. 1 g wurde in 100 ml H2O gelöst (Stammlösung 10 mg/ml) und lichtgeschützt bei 4°C aufbewahrt. 0,5 ml der Stammlösung wurde in 1 ml 0,5x TBE Puffer gelöst.


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dNTP´s:

100 mM dATP

100 mM dCTP

#10297-018, Life Technologies, Karlsruhe, D

100 mm dGTP, 100 mM dTTP

 

wurden gemischt und auf 25 mM verdünnt. Die Mischung wurde weiter mit DEPC Wasser 1:2,5 auf eine Stammkonzentration von 10 mM verdünnt.

Na-Acetat

#S2889, Sigma, Deisenhofen, D

Phenol

#P4682, Sigma, Deisenhofen, D

Chloroform

#C2432, Sigma, Deisenhofen, D

Isoamylalkohol

#I3643, Sigma, Deisenhofen, D

Isopropanol

#405-7, Sigma, Deisenhofen, D

Ethanol

#1.00986, Merck, Darmstadt, D

Oligo (dt)

#18418-012, Life Technologies, Karlsruhe, D

RNAase out, Rnasin (2500 U)

#N-2111, Promega, Mannheim, D

RNAase out, Rnasin (2500 U)

#N-2111, Promega, Mannheim, D

10xPCR Puffer ohne Mg

#Y02028, Life Technologies, Karlsruhe, D

MgCl2

#Y02016, Life Technologies, Karlsruhe, D

DTT

#Y0014, Life Technologies, Karlsruhe, D

Superscript II RT

#18064, Life Technologies, Karlsruhe, D

Primer antisense

INTERACTIVA, Ulm, D

Primer sense

INTERACTIVA, Ulm, D

Taq Polymerase

#10342-020, Life Technologies, Karlsruhe, D

Bromphenolblau

#E6896, Sigma, Deisenhofen, D

Zentrifugeröhrchen, 15 ml

#420956, Falcon, Becton Dickinson,NJ, USA

3.5.1  Isolation und Konzentrationsbestimmung der mRNA nach Chomczynski

Die Zellen wurden von den Petrischalen mit dem Zellschaber getrennt, in sterile 12 ml Röhrchen gefüllt, und mit 1500 g für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in 500 µl Reagenzlösung resuspendiert. Danach wurde die Lösung in sterile 2,2 ml Eppendorf Röhrchen pipettiert und folgende Reagenzien hinzugegeben:


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Na-Acetat

50 µl

Phenol

500 µl

Chloroform

2 µl

Isoamylalkohol

98 µl

Die Lösung wurde vorsichtig gemischt, für 15 min im Eisbehälter aufbewahrt und bei 10.000 g für 20 min bei 4°C zentrifugiert. Der klare oberflächliche, RNA enthaltene Überstand wurde in sterile 2,2 ml Eppendorf Röhrchen mit 1 ml Isopropanol (30%) pipettiert, erneut inkubiert und zentrifugiert. Das Pellet wurde dann in 300 µl Reagenzlösung und 300 µl Isopropanol (30%) resuspendiert und wie oben beschrieben zentrifugiert. Das Pellet wurde zunächst mit 1 ml Ethanol (75%) resuspendiert und zentrifugiert, um die Präzipitation der Proben zu ermöglichen. Zuletzt wurde das Pellet mit DEPC Wasser gelöst und die RNA bei -20° C gelagert.

3.5.2  Reverse Transkription

Die reverse Transkription der mRNA in cDNA wurde durchgeführt, um die Expression des HO-1 Genes und des ß-Aktin Genes im Rahmen der RNA-Synthese nachzuweisen. In 0,2 ml PCR-Röhrchen wurden 2 µg (2 µl) je Gesamt RNA-Proben eingesetzt und mit folgenden Reagenzien versetzt:

Oligo (dt)

1 µl

RNAase out, Rnasin (2500 U)

1 µl

und mit DEPC Wasser auf 12 µl aufgefüllt. Die Proben wurden im Thermocycler bei 70°C für 10 Minuten amplifiziert und dann bei 4°C für 10 Minuten aufbewahrt. Für den nächsten Schritt der reversen Transkription wurde zwischenzeitlich eine Lösung folgender Reagenzien vorbereitet und bei 4°C aufbewahrt.

für eine Probe:

10 x PCR Puffer ohne Mg

2 µl

MgCl2 25 mM

2 µl

dNTP 10 mM

1 µl

DTT0,1 M

2 µl

7 µl dieser Lösung wurde zu den Proben pipettiert. Die Proben wurden für weitere 5 min bei 42°C im Thermocycler inkubiert. Danach wurde jeweils 1 µl Superscript [Seite 32↓]II RT(10 000 U) zu den Proben gegeben. Daraufhin wurden die Proben für 50 min bei 42°C und dann für 15 min bei 70°C im Thermocycler inkubiert. Die umgeschriebene cDNA wurde bei -20°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.

3.5.3  Polymerasekettenreaktion

Es wurden 100 ng (2 µl) der cDNA-Probe mit den Reagenzien wie in der folgenden Tabelle angegeben gemischt, um HO-1 und ß-Aktin cDNA zu amplifizieren.

Tab. 1: Schrittfolge der Polymerasekettenreaktion

Reagenzien :

HO-1

ß-Actin

cDNA (100 ng)

2 µl

2 µl

10x PCR Puffer ohne Mg

  

dNTP (10 mM)

0,25

0,25

Primer-antisense (5 µM)

0,25

0,25

Primer-sense (5 µM)

0,25

0,25

Taq Polymerase (500 U)

1,25

1,25

MgCl2 (50 mM)

1

1,25

DEPC Wasser

bis auf 20 µl

PCR:

1. Denaturierung der DNA-Stränge

96°C, 3 min

94°C, 1 min

Amplifikationszyklen:

2. Denaturierung

96°C, 30 sec

96°C, 30 sec

3. Annealing

50°C, 30 sec

58°C, 1min

4. Extension

72°C, 90 sec

72°C, 2 min

Zyklen (2,3,4)

35

29

Letzte Inkubation

10 min

10 min

Im folgenden werden die Primer der verwendeten PCR dargestellt.

ß -Actin

ß-Aktin ist Bestandteil des Zytoskeletts und wird in jeder Zelle expremiert. Der Nachweis einer gleichmäßigen Expression des ß-Aktins bedeutet, dass die mRNA Proben in gleichen Mengen vorhanden waren.


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Antisense:

5’ ACC CAC ACT GTG CCC ATC TA 3’

Sense

5’ CGG AAC CGC TCA TTG CC 3’

Unter Verwendung dieser Primer wurde das ß-Aktin mit einer Größe von 289 Basenpaaren synthetisiert.

HO-1

Antisense:

5' TGC GGT GCA GCT CTT CTG 3'

Sense:

5’GCA ACC CGA CAG CAT GC 3'

Unter Verwendung dieser Primer wurde das HO-1 Amplifikationsprodukt mit einer Größe von 244 Basepaaren synthetisiert. Als Positivkontrolle der HO-1 wurden humane Hepatozyten mit CoPP stimuliert [44].

Agarosegel:

Agarose NEEO Ultra-quality

#2267.4, Roth, Karlsruhe, D

Die Agarose wurde in einem Meßbecher mit einer Verdünnung von 1:100 in 0,5x TBE Puffer gelöst und bei 360°C für 4 min in der Mikrowelle erhitzt. Danach wurde 3 µl vorbereitetes Ethidiumbromid in die Gellösung gemischt. Das Gel wurde in die Gelkammer gegossen und ein Kamm für die entsprechenden Taschen plaziert.

Einfüllen der Proben:

Current Supply, Bio Rad Power Pac 200

Bio-Rad, München, D

UV-Platte

Biozym, Oldendorf, D

Gel Caspase

Biometra T13, Göttingen, D

Das fertige Gel wurde in der Elektrophoresekammer plaziert und mit einem Laufpuffer (0,5x TBE Puffer) aufgefüllt. Dann wurde jede Probe (20 µl) mit 4 µl Ladepuffer (Bromphenolblau) gemischt. 3 µl von diesem Gemisch wurde in die entsprechenden Geltaschen pipettiert. Es wurden die Basepaarleiter in die erste und Positiv- und Negativkontrollen in die letzten Taschen pipettiert. Die Elektrophorese wurde bei 80 V für 1,5 h durchgeführt. Die Auswertung erfolgte unter der UV Lichtplatte.


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3.6  Lactat-Dehydrogenase (LDH) und Aspartat Aminotransferase (AST) Bestimmung:

LDH Messung:

LDH opt. EC 1.1.1.27 Test-UV

#DG1340-K, Sigma, Deisenhofen, D

Multi-enzym Lin-Trol

#M-2266, Sigma, Deisenhofen, D

Fluostar Galaxy,

BMG Labor Technologies Offenburg, D

Ein Anstieg der LDH Aktivität wird unter vielen pathologischen Bedingungen beobachtet. Die Freisetzung dieses intrazytoplasmatischen Enzyms in das Zellkulturmedium gibt Aufschluß über die Zellschädigung, insbesondere des LDH-5 Isoenzyms der Leber. Die LDH Aktivität wird photometrisch über den NADH-Extinktionsabfall mit Hilfe eines kinetischen UV-Test Kits bestimmt [48].

Bestimmungsmethode:

Pyruvat + NADH + H+

L-Lactat + NAD+

Die Methode wurde für den Einsatz in Mikrotiterplatten modifiziert. Reagenz A wurde in 20 ml aqua dest. und Reagenz B in 5 ml aqua dest. verdünnt. 0,8 ml von Reagenz B wurde mit 20 ml Reagenz A kombiniert. Multi-enzym Lin-Trol diente als Standardkontrollserum. Es wurde in 3 ml aqua dest. gelöst mit Endaktivität von 2000 U/l. Dann wurde es mit 0,9% NaCl (40 µl Standard + 600 µl 0,9% NaCl) verdünnt, um die höchste Standardkonzentration von 125 U/l zu erhalten. Der Ansatz für die Standardreihe (für die 96 Well-Mikrotiterplatte) wurde jeweils um 1:2 verdünnt mit einer niedrigsten Aktivität von 1,95 U/l. Als Leerwert diente 0,9% NaCl. 20 µl der Proben und Standardansätze wurden jeweils mit 200 µl der Mischung aus Reagenz A und B in der Mikrotiterplatte gemischt. Die Messung wurde schrittweise durchgeführt, die ersten Messungen 30 s nach dem Start und die zweiten nach 10 min bei einer Extinktion von 340 nm bei 25°C mit dem Platten-Lese-Programm von BGM (Fluostar Galaxy). Die Aktivität wurde aus der Differenz zwischen beiden Messungen ermittelt.

AST Messung:

GOT opt. EC 2.6.1.1 UV-Test

#DG158-K, Sigma, Deisenhofen, D

Multi-enzym Lin-Trol

#M-2266, Sigma, Deisenhofen, D

Anthos Spektrophotometer

#ht II, Salzburg, Au


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AST kommt in Hepatozyten in den Mitochondrien und im Zytoplasma vor. Die Freisetzung dieses intrazytoplasmatischen Enzyms in das Zellkulturmedium gibt Aufschluß über die Zellschädigung der Leber. Die Aktivität der AST wird ebenfalls über den NADH-Extinktionsabfall der gekoppelten Reaktion mit Malatdehydrogenase photometrisch mit einem kommerziell erhältlichen Sigma Test Kit gemessen [48].

Bestimmungsmethode

L-Aspartat + 2-Oxaloacetat

Oxaloacetat + L-Glutamat

Oxaloacetat + NADH

L-Malat + NAD

Diese Methode wurde ebenfalls für den Einsatz in Mikrotiterplatten modifiziert. Reagenz A wurde in einem Volumen von 20 ml aqua dest. und Reagenz B in 16 ml aqua dest. verdünnt. 0,8 ml von der verdünnten Reagenz B Lösung wurde mit 10 ml Reagenz A Lösung kombiniert. Multi-enzyme Lin-Trol diente als Standardkontrollserum. Es wurde in 3 ml aqua dest gelöst und hatte eine Aktivität von 1130 U/l. Dann wurde es mit 0,9% NaCl (40 µl Standard + 280 µl 0,9% NaCl) verdünnt, um die höchste Standardkonzentration von 141,25 U/l zu erhalten. Der Ansatz für die Standardreihe (für die 96 Well-Mikrotiterplatte) wurde jeweils um 1:2 verdünnt mit der niedrigsten Aktivität von 2,207 U/l. Als Leerwert diente 0,9% NaCl. 50 µl der Proben und Standardansätze wurden jeweils mit 200 µl der Mischung aus Reagenz A und B in der Mikrotiterplatte gemischt. Die Messung wurde schrittweise durchgeführt, die ersten Messungen 30 s nach dem Start und die zweiten nach 10 min bei einer Extinktion von 340 nm bei 25°C mit dem Platten-Lese-Programm von BGM (Fluostar Galaxy). Die Aktivität wurde aus der Differenz zwischen beiden Messungen ermittelt.

3.7 HO-1 Aktivität

Die HO-1 Enzymaktivität wurde mit zwei verschiedenen Methoden aus der Messung der Endprodukte des Hämabbaus, Eisen-II und Bilirubinbildung, bestimmt.


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3.7.1  Eisenbestimmung

Eisen ist ein Endprodukt des Hämabbaus, der durch die HO-1 katalysiert wird. Aus der Messung der Eisenkonzentration kann auf die Aktivität der HO-1 geschlossen werden [53].

Hepatozytenisolation für die Fe Messung:

Die Zellen wurden von den Petrischalen mit einem Zellschaber gelöst und mit dem Medium in ein Falcon Röhrchen transferiert und bei 3500 g für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Danach wurde das Sediment in flüssigen Stickstoff gefroren und bei -20°C bis zur Messung aufbewahrt.

Fe2+- und Gesamteisenbestimmung

Reagenzien :

Eisen(II)-sulfat (Hepthydrat)

#44970, Fluka, Deisenhofen, D

Na-Bathophenantholindisulfonat 510 µM

#1375, Sigma, Deisenhofen, D

L(+)-Ascorbinsäure 1,14 M

#127.0250, Merck, Darmstadt, D

TCA (Trichlorsäure, 20%) 1,23 M

#T4885, Sigma, Deisenhofen, D

HCl 1 N

#1.09057, Merck, Darmstadt, D

H2SO4 0,01 N

#K219577, Merck, Darmstadt, D

Na-Acetat Puffer 1,2 M

#1.01539, Merck, Darmstadt, D

Farbreagenz:

Natrium-Bathophenanthrolindisulfonsäure (510 µM) wurde in Na-Acetat Puffer (1,2 M) gelöst und der pH Wert auf 4,5 mit Essigsäure eingestellt.

Standards:

2,2 mg Fe2+-sulfat wurde in 10 ml H2SO4 auf eine Konzentration von 800 µM gelöst. Danach wurde der Ansatz mit H2O (100 µl Fe2+-sulfat/ H2SO4 + 900 µl H2O) verdünnt, um die höchste Standardkonzentration von 80 µM zu erhalten. Danach wurde der Standardansatz schrittweise 1:2 bis auf eine Endkonzentration von 1,25 µM verdünnt.


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Präparation der Standardkurve (Doppelbestimmung)

Fe2+-standard

300 µl

1N HCl

100 µl

H2O

100 µl

Die Reagenzien wurden gemischt und 200 µl davon in einen Mikrotiterplatte pipettiert. Das Farbreagenz wurde gemischt und mit dem Platten-Lese-Programm von Fluostar Galaxy bei 550 nm gemessen.

Mikrosomenpräparation der Zellen

Die Proben wurden bei 10000 g für 20 min zentrifugiert, der Überstand vollständig entfernt und mit 100 µl aqua dest. resuspendiert. 50 µl werden jeweils für die Fe2+ und für die Gesamteisenbestimmung in Eppendorfröhrchen pipettiert.

Fe2+/Gesamteisenmessung

Die 50 µl Probe wurde mit 50 µl HCl (1N) gemischt und bei Raumtemperatur für 20 min inkubiert. Danach wurden 50 µl H2O (für Fe2+) oder 50 µl Ascorbinsäure (für Gesamteisen) hinzugefügt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 50 µl TCA hinzugegeben und zentrifugiert. 200 µl des Überstandes wurden mit 125 µl Farbreagenz in einer Mikrotiterplatte versetzt und bei 550 nm gemessen.

Proteinmessung (siehe 3.3.2)

Die Proteinkonzentration wurde aus dem verbleibenden Pellet der zentrifugierten Proben bestimmt.nach der Gleichung: und der Eichgerade :

3.7.2  Bestimmung der HO-1 Aktivität: Bilirubin-Messung

Reagenzien:


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Hemin

#H-5533, Sigma, Deisenhofen, D

MgCl2

#M-8266, Sigma, Deisenhofen, D

Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase

#G-8404, Sigma, Deisenhofen, D

Glucose-6-Phosphat

#G-7879, Sigma, Deisenhofen, D

Nicotinadenin-dinukleotid Phosphat (NADP+)

#N-0505, Sigma, Deisenhofen, D

Kaliumphosphat Puffer (pH 7.4):

 

KH2PO4

0,2 M

#P-5379, Sigma, Deisenhofen, D

K2HPO4

0,2 M

#P-8281, Sigma, Deisenhofen, D

Um 0,1 M Kaliumphosphatpuffer zu erhalten, wurden 0,2 M KH 2 PO 4 und 0,2 M K 2 HPO 4 1:1 gemischt und ein pH Wert von 7,4 eingestellt. Die HO-1 Aktivität wurde nach der Methode von Juckett et al. durch Bildung von Bilirubin gemessen [52]. Um die HO-1 Aktivität zu messen, wurden 6 x 106 Hepatozyten in 90 mm Petrischalen kultiviert. Die Zellen wurden mit einem Zellschaber gelöst, zweimal mit PBS Puffer gewaschen und bei 1200 g für 5 min bei 4°C zentrifugiert. Danach wurden die Proben in 100 µl Pi-Puffer gelöst und bei 100 000 g für 60 min bei 4°C zentrifugiert, um die Mikrosomen zu erhalten. Der Überstand wurde nach Messung der Proteinkonzentration bis zur Verwendung bei -80°C aufbewahrt. Für den HO-1 Versuch wurden 100-300 µg des mikrosomalen Proteins mit folgenden Reagenzien inkubiert:

 

Volumen (total 0,5 ml)

Heme (Hemin) 50 µM

10 µl

humanes Leberzellzytosol (mikrosomale Fraktion des Überstands mit Biliverdin Reductase) 2 mg/ ml

 

MgCl21 mM

20 µl

Glucose-6-phosphat Dehydrogenase 3 U

0,9 µl

Glucose-6-phosphat 1 mM

20 µl

NADP+2 mM

50 µl

Diese Reagenzien wurden mit 0,1 M Kaliumphosphat Puffer (pH 7,4) aufgefüllt und für 30 min bei 37°C lichtgeschützt inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt, indem die Proben auf Eis plaziert wurden. Das Endprodukt dieser Reaktion, Bilirubin, wurde mit dem Scanning Spektrophotometer aus der Differenz der Extinktionen zwischen 450 nm und 530 nm bestimmt. Die Konzentration wurde aus dem Extinktionsquotienten für Bilirubin (40 M/ cm) errechnet. Die Wellenlänge des Bilirubins hat sein Maximum bei 467 nm. Das Ergebnis wurde in pmol Bilirubin/ mg Protein/ min angegeben.


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3.8  Experimentenübersicht:

Serumfreies Medium:

Vor jedem Experiment wurden die Zellen für 6 h mit serumfreiem Medium inkubiert. Zu Beginn des Experimentes wurde das Medium gegen serumfreies und mit den im Protokoll aufgeführten Reagenzien vorbereitetes Medium gewechselt. Dieses Medium wurde erwärmt, um eine Kältestimulation zu vermeiden.

Williams' E Medium 500 ml

#32551-020, Life Technologies, Karlsruhe, D

Penicillin/Streptomycin

100 U/ 100 µg/ml

#15140-023, Life Technologies, Karlsruhe, D

Insulin 1 µM

#I-5500, Sigma, Deisenhofen, D

Hepes Puffer 15 mM

#15630-056, Life Technologies, Karlsruhe, D

Reagenzien:

IFN-γ

100 U/ml

#I6507, Sigma, Deisenhofen, D

TNF-α

500 U/ml

#T1042, Sigma, Deisenhofen, D

IL-1β

10 U/ml

#I4638, Sigma, Deisenhofen, D

LPS5 µg/ml (E. coli 0111:B4)

#L-3012, Sigma, Deisenhofen, D

Hemin

10 µM

#H-5533, Sigma, Deisenhofen, D

CoPP

100 µM

#C-1900, Sigma, Deisenhofen, D

SNAP

0.5 mM

#A-2509, Sigma, Deisenhofen, D

H2O2

100-100 µM

#H1009, Sigma, Deisenhofen, D

Actinomycin D

1 µg/ml

#A1410, Sigma, Deisenhofen, D

Cycloheximid

10 µg/ml

#C7698, Sigma, Deisenhofen, D

Es wurden die folgende Experimente durchgeführt und zu den im Protokoll angegebenen Zeitpunkten die Proben aufbereitet.

3.8.1  Zytokin- und Endotoxinstimulation

Um die Regulation der HO-1 bei der Sepsis oder bei der Inflammation während der Leberoperationen zu verstehen, haben wir diese Schädigungsmuster simuliert, und humane Hepatozyten mit verschiedenen Kombinationen von Zytokinen, IL-1β, IFN-γ, TNF-α und/ oder Endotoxin (LPS) behandelt [84, 85].


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Tab. 2: Zytokin- und Endotoxinstimulation

Reagenzien:

Methode

Zeitabstände

Einzelstimulation:

IL-1β (10 U/ml)

IFN-γ (100 U/ml)

TNF-α (500 U/ml)

LPS (5 µg/ml)

HO-1 mRNA

0,5-1-3-6 h

HO-1 Proteinnachweis

0,5-1-3-6-12 h

LDH-AST

0,5-1-3-6-12 h

Kombinierte Stimulation

IL-1β + IFN-γ

IL-1β + TNF-α

IL-1β + LPS

IFN-γ + TNF-α

IFN-γ + LPS

TNF-α + LPS

IL-1β + IFN-γ + TNF-α

IL-1β + IFN-γ + LPS

IL-1β + TNF-α + LPS

IFN-γ + TNF-α + LPS

IL-1β + IFN-γ + TNF-α + LPS

HO-1 mRNA

HO-1 Proteinnachweis

LDH-AST

0,5-1-3-6 h

CM (Zytokinmix)

IL-1β + IFN-γ + TNF-α + LPS

HO-1 mRNA

0,5-1-3-6-12-24 h

HO-1 Proteinnachweis

LDH-AST

HO-1 Aktivität

4 h

3.8.2  Induktion von HO-1 durch warme und kalte Ischämie

In diesen Experimenten wurden die Bedingungen für zwei typische Leberoperationen, die Leberresektion (warme Ischämie) und die Lebertransplantation (kalte Ischämie) an der Zellkultur simuliert. Dazu wurden die Kulturschalen in einer abgeschlossenen, luftdichten Kammer bei 37°C, 4°C bei kontinuierlichem Einstrom von 100% N2 (1,5 bar) inkubiert [62, 94].


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Tab. 3: Induktion von HO-1 durch warme und kalte Ischämie

Experimentelle Bedingungen

Methode

Zeitabstände

37°C / 4°C

100% N2 (1,5 bar)

HO-1 mRNA

0,5-1-3-6-12-24 h

HO-1 Proteinnachweis

LDH-AST

Fe Messung

HO-1 Aktivität

4 h

Prästimulation 0,5 h Actinomycin D (1 µM)

+ 37°C / 4°C 100% N2 (1,5 bar)

HO-1 mRNA

0,5-1-3-6-12 h

Prästimulation 0,5 h Cycloheximide (10 µM) + 37°C / 4°C 100% N2 (1,5 bar)

HO-1 Proteinnachweis

0,5-1-3-6-12 h

3.8.3  Einfluß der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) auf die HO-1 Expression

Um den Einfluß der ROS während der Reperfusionsphase nach Leberoperationen und Transplantationen zu untersuchen, wurden die Hepatozyten mit unterschiedlichen Konzentrationen von H2O2 (100-1000 µM) behandelt [41, 56, 57, 95, 104].

Tab. 4: Einfluß reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) auf HO-1 Expression

Reagenzien:

Methode

Zeitabstände

H2O2 (100/ 200/ 500/ 1000 µM)

HO-1 mRNA

6 h

HO-1 Proteinnachweis

LDH-AST

3.8.4  Einfluß von NO auf die HO-1 Expression

Zahlreiche Arbeiten weisen daraufhin, dass NO (ein wichtiger Signalüberträger) und HO-1 sich gegenseitig beeinflussen [3, 52, 64, 115]. Deshalb wurden in einem weiteren Experiment Hepatozyten mit SNAP (0,5 mM), einem NO-Spender, behandelt, um zu untersuchen, in wie weit die Anwesenheit von NO die Expression von HO-1 beeinflußt.


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Tab. 5: Einfluß von NO auf die HO-1 Expression

Reagenzien:

Methode

Zeitabstände

SNAP (0,5 mM)

HO-1 mRNA

0,5-1-3-6-12-24 h

HO-1 Proteinnachweis

LDH-AST

3.8.5  Einfluß von CoPP und Hemin auf die HO-1 Expression

CoPP [65, 72, 101] und Hemin [75, 87, 119] wurden als Stimulatoren der HO-1 Genexpression und Enzymaktivität verwendet. Um den Effekt von CoPP auf den verschiedenen Regulationsebenen zu untersuchen, wurden die Zellen mit Actinomycin D, das die mRNA Synthese blockiert, und mit Cycloheximide, das die Proteinsynthese blockiert, behandelt. Weiterhin wurden die Zellen mit CoPP und Hemin stimuliert und die HO-1 mRNA und Proteinbestimmung zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt.

Tab. 6: Einfluß von CoPP und Hemin auf HO-1 Expression und Neusynthese der HO-1

Reagenzien:

Methode

Zeitabstände

CoPP (10 µM)

HO-1 mRNA

HO-1 Proteinnachweis

LDH-AST

0,5-1-3-6-12 h

Prästimulation 0,5 h

Actinomycin D (1 µM) +

CoPP (10 µM)

Prästimulation 0,5 h

Cycloheximide (10 µM) +

CoPP (10 µM)

Hemin (10 µM)

HO-1 mRNA

HO-1 Proteinnachweis

LDH-AST

Fe Messung

0,5-1-3-6-12-24 h


[Seite 43↓]

3.8.6  Pharmakologische Prästimulation der Hepatozyten zur Protektion des ischämischen Zellschadens

Um die HO-1 zum Zeitpunkt des Eintretens des ischämischen Zellschadens als Schutzmechanismus bereits aktiviert zu haben, wurden die Hepatozyten vor der warmen und kalten Ischämie mit CoPP oder mit Hemin für 9 h, welche als maximale Expressionszeit angegeben wurde, prästimuliert [15, 106].

Tab. 7: Pharmakologische Prästimulation der Hepatozyten zur Protektion des ischämischen Zellschadens

Reagenzien:

Methode

Zeitabstände

Prästimulation CoPP (1-10-50 µM) -9 h

+ 37°C / 4°C 100% N2 (1,5 bar)

LDH-AST

24 h

Prästimulation Hemin (1-10 µM) -9 h

+ 37°C / 4°C 100% N2 (1,5 bar)

LDH-AST

24 h

3.8.7  HO-1 Aktivität unter inflammatorischen und ischämischen Bedingungen

In diesem Experiment wurde untersucht, ob die HO-1 mRNA- und Proteinexpression mit der HO-1 Aktivität unter verschiedenen inflammatorischen und ischämischen Bedingungen korreliert.

Tab. 8: HO-1 Aktivität unter inflammatorischen und ischämischen Bedingungen

Reagenzien:

Methode

Zeitabstände

CM

HO-1 Aktivität

4 h

37°C 100% N2 (1,5 bar)

4°C 100% N2 (1,5 bar)

3.9 Statistische Analyse

Mit einer Varianzanalyze ( „analysis of variance“ – ANOVA) kann eine Aussage über den Effekt mehrerer unabhängiger Variablen gegenüber einer kontinuierlichen abhängigen Variablen getroffen werden, wenn es sich um nominale (nicht kontinuierliche) Variablen handelt. Die geringe Fallzahl von nAnalyse= 5 Experimenten pro Gruppe oder Zeitpunkt, machte in dieser Studie eine ANOVA-Varianz-Analyse, die zur Auswertung vieler Experimente herangezogen [Seite 44↓]wird, sinnvoll. In einem faktoriellen Experiment mit einer oder mehreren nominalen Variablen, w.z.B. LDH Freisetzung in verschiedenen Zeitintervallen, und eine einzelne kontinuierliche Variable, w.z.B. abhängige Variable-warme Ischämie, wurde eine Varianzanalyse durchgeführt. Sie wurde vorgenommen (ANOVA), um herauszufinden, ob sich die visuellen Beobachtungen mit Zahlen untermauern lassen. Die Nullhypothese war, daß es keinen signifikanten Unterschied in z.B. LDH Freisetzungen der verschiedenen Zeitintervallen eines Experimentes gab und die Ergebnisse deuteten an, daß diese Hypothese zurückgewiesen werden konnte. Die Veränderungen der LDH und AST Freisetzungen sowie die Bildungen von Fe-II and Bilirubin nach Exposition von warmer und kalter Ischämie, Zytokinmix, sowie durch NO- oder H2O2 Zufuhr oder nach Exposition mit CoPP und Hemin wurden mit der unbehandelten Kontrollgruppe oder positiven Kontrollgruppen verglichen. Bei einem p-Wert < 0,05 in der ANOVA-Analyse wurden anschließende faktorielle Tests zum nominellen Niveau von 5% (95% Konfidenzintervall) durchgeführt. Für den paarweisen Vergleich der einzelnen Versuchsgruppen untereinander wurde der t-Test verwendet.Die Grafiken im folgenden Ergebnisteil zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung der verschiedenen Gruppen. Signifikante Veränderungen, die sich im t-Test zeigten, wurden in den Diagrammen mit dem Symbol * für p < 0,05 gekennzeichnet. Alle statistischen Tests wurden mit den statistischen Auswertungsprogramm StatView gerechnet [1].


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HTML-Version erstellt am:
04.08.2004