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In allen Kontrollgruppen war die HO-1 mRNA Expression auf basale Aktivität nachweisbar, die als Basisexpression angesehen wurde. Die Exposition der humanen Hepatozyten mit IFN-γ, TNF-α, IL-1β und LPS induzierte einen Anstieg der HO-1 mRNA Expression. Nach Einzelzytokin- und Endotoxinexposition war ein Anstieg bereits nach 0,5 h nachweisbar, erreichte nach 3 h ein Maximum und sank nach 6 h wieder ab. IFN-γ rief die stärkste HO-1 mRNA Expression hervor und wurde von TNF-α, LPS und IL-1β gefolgt (Abb. 3). Bei unterschiedlichen Zytokinkombinationen (Abb. 4) wurde ein Expressionsmaximum der HO-1 mRNA bereits nach 0,5 h beobachtet, das bis zu 6 h anhielt. Ein Anstieg der HO-1 mRNA Expression nach der Stimulation mit Zytokinen plus Endotoxin (Zytokinmix, CM) war auch nach 0,5 h nachweisbar mit einem Maximum nach 3-6 h und einem Abfall nach 24 h auf das Ausgangsniveau (Abb. 5). In allen Kontrollkulturen konnten wir eine basale HO-1 Protein Expression nachweisen. Nach Stimulation der humanen Hepatozyten mit den einzelnen Zytokinen (IFN-γ, TNF-α, IL-1β) oder LPS wurde nach 0,5 bis 1 h ein Anstieg der HO-1 Proteinexpression beobachtet, der bis zu 6 h anhielt (Abb. 3). CM induzierte einen Anstieg des HO-1 Proteins ebenfalls nach 1 h und hielt bis zu 24 h an (Abb. 5). Über den gesamten Zeitverlauf bestanden keine signifikanten Unterschiede der LDH und AST Konzentrationen zwischen den mit den einzelnen Zytokinen stimulierten Gruppen und der Kontrollgruppe. Im Gegensatz dazu führte CM zu einem signifikanten Anstieg der LDH und AST Konzentrationen im Kulturmedium nach 12 h (Abb. 5).

	Abb. 3: Die Expression der HO-1 mRNA (oben) und des HO-1 Proteins (unten) nach Stimulation mit einzelnen Zytokinen (IL-1b, TNF-a, IFN-g) und Endotoxin über 6 h. (CT, Kontrolle; PC, Positivkontrolle)

	Abb. 4: Die Expression der HO-1 mRNA nach Stimulation mit verschiedenen Zytokin- (IL-1β, TNF-α, IFN-γ) und Endotoxinkombinationen über 6 h. (CT, Kontrolle; PC, Positivkontrolle)

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	Abb. 5: Die Expression der HO-1 mRNA (oben), des HO-1 Proteins (mitte) und LDH und AST Freisetzungen (unten) nach Stimulation mit Zytokinmix (IL-1β, TNF-α, IFN-γ und LPS) über 24 h. (CT, Kontrolle; PC, Positivkontrolle, Signifikanter Unterschied gegenüber CT *p<0,05)

Die humanen Hepatozyten wurden über 24 h einer warmen Ischämie ausgesetzt. Dabei wurde bereits nach 0,5 h ein signifikanter Anstieg der HO-1 mRNA Expression im Vergleich zur niedrigen Basisexpression in der Kontrollgruppe beobachtet (Abb. 6). Dieses Expressionsniveau blieb bis zu 12 h konstant, konnte aber nach 24 h nicht mehr nachgewiesen werden. Die HO-1 Proteinexpression stieg ebenfalls nach 0,5 h an und war bis zu 24 h konstant nachweisbar (Abb. 6). Die AST Konzentration stieg kontinuierlich bis zu einem Maximum nach 24 h (115,0±4,35 U/l vs. 53,5±2,5 U/l Kontrollgruppe) signifikant an. Eine signifikante LDH Freisetzung wurde jedoch erst nach 6 h warmer Ischämie beobachtet; mit einem Maximum nach 24 h (58,7±9.1 U/l vs.13,3±2,6 U/l Kontrollgruppe).

Die humanen Hepatozyten wurden über 24 h einer kalten Ischämie ausgesetzt. Sie induzierte die HO-1 mRNA Expression nach 1 h, die bis zu 24 h konstant nachweisbar war (Abb. 7). Das HO-1 Protein war über den gesamten Versuchsverlauf einschließlich in der Kontrollgruppe nachweisbar. Es wurde zwischen 0,5-3 h intensiver exprimiert (Abb. 7). Die kalte Ischämie führte zu einem Anstieg der AST Freisetzung aus den Hepatozyten mit einem Maximum nach 24 h (107,2±17,5 U/l vs. 53,5±2,5 U/l Kontrollgruppe). Die LDH Freisetzung stieg ebenfalls bei der kalten Ischämie an und erreichte ihr Maximum nach 24 h (47.2±8.9 U/l).

	Abb. 6: Zeitabhängige Expression der HO-1 mRNA (oben) und des Proteins (mitte) sowie der LDH und AST Freisetzungen (unten) nach warmer Ischämie über 24 h. (Signifikanter Unterschied gegenüber CT *p<0,05)

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	Abb. 7: Zeitabhängige Expression der HO-1 mRNA (oben) und des Proteins (mitte) sowie der LDH und AST Freisetzungen (unten) nach kalter Ischämie über 24 h. (Signifikanter Unterschied gegenüber CT *p<0,05)

Warme und kalte Ischämie führten nach 0,5 h bzw. 1 h zu einem Anstieg der HO-1 mRNA- und Proteinsynthese. Daß es sich hierbei um eine Neusynthese des Enzyms handelte und nicht um die Aktivierung bereits intrazellulär vorhandener mRNA bzw. Proteine, konnte durch die Blockade der mRNA Synthese mittels Actinomycin D sowie die Blockade der Proteinsynthese nach Cycloheximidgabe bewiesen werden (Abb. 8).

Eine Entzündungsreaktion sowie warme und kalte Ischämie über 4 h steigerten die HO-1 Aktivität im Vergleich zur basalen HO-1 Aktivität der Kontrollgruppe. Die höchste Aktivität wurde bei der warmen Ischämie (18.9 pmol Bilirubin/ mg Protein/ min) beobachtet, gefolgt von der kalten Ischämie und der Induktion durch inflammatorische Zytokine (Abb. 9).

Die Eisen-II-Konzentration im Zytosol von Hepatozyten nach warmer Ischämie stieg von der Ausgangskonzentration in der Kontrollgruppe (41.7±16.2 µmol/ mg Protein) langsam an und erreichte ihr Maximum nach 12 h (155.1±51,7 µmol/ mg Protein)

Die Eisen-II-Konzentrationen der Hepatozyten nach kalter Ischämie änderten sich nicht signifikant ( Abb. 9 ).

	Abb. 8: Induktion der Neusynthese der HO-1 mRNA (oben links) und des HO-1 Proteins (unten links) während warmer (37°C N2) und kalter (4°C N2) Ischämie an humanen Hepatozyten, Blockade der mRNA Synthese mit Actinomycin D (oben rechts) und der Proteinsynthese mit Cycloheximid (unten rechts) während warmer und kalter Ischämie.

	Abb. 9: HO-1 Aktivität: Bildung der durch HO-1 katalysierten Reaktionsprodukte, Bilirubin und Eisen-II nach Zytokinmix (CM, oben) und nach kalter (4°C N2) und warmer Ischämie (37°C N2, oben und unten) (Signifikanter Unterschied gegenüber CT *p<0,05).

Hepatozyten wurden 6 h lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von H₂O₂ (100-1000 µM) behandelt. Dabei konnte ab einer Konzentration von 500 µM H₂O₂ ein Anstieg der HO-1 mRNA Expression beobachtet werden. Ein Anstieg der HO-1 Proteinexpression konnte parallel zu mRNA Expression ab einer Konzentration von 500 µM H₂O₂ nachgewiesen werden. Die Behandlung mit H₂O₂ über 6 h bewirkte einen signifikanten Anstieg der LDH Freisetzung gegenüber der Kontrollgruppe. Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied in der AST Freisetzung im Vergleich zur Kontrollgruppe beobachtet (Abb. 10).

	Abb. 10: Die Expression der HO-1 mRNA (oben), des HO-1 Proteins (mitte) und LDH und AST Freisetzungen (unten) nach H2O2 Exposition in aufsteigenden Konzentrationen über 6 h. (Signifikanter Unterschied gegenüber CT *p<0,05)

SNAP (0.5 mM) induzierte einen Anstieg der HO-1 mRNA Expression nach 3 h, der bis zu 12 h anhielt. Gleichzeitig war ein Anstieg des HO-1 Proteins nach 3 h mit einem Maximum nach 6 bis 12 h nachweisbar. Im Verlauf war ein langsamer aber nicht signifikanter Anstieg der AST Aktivität über 24 h (65,3±6,4 U/l vs. 53,5±2,5 U/l Kontrollgruppe) zu beobachten. Die LDH Aktivität unterschied sich jedoch nicht signifikant (Abb. 11).

	Abb. 11: Die Expression der HO-1 mRNA (oben), des HO-1 Proteins (mitte) und LDH und AST Freisetzungen (unten) nach SNAP Exposition über 24 h (Signifikanter Unterschied gegenüber CT *p<0,05).

Die CoPP (10 µM) induzierte HO-1 mRNA Synthese setzte bereits nach 1 h ein. Das Expressionsmaximum wurde zwischen 3 h und 12 h erreicht. Die Induktion der HO-1 mRNA Synthese durch CoPP konnte in der gleichen Versuchsreihe durch Prästimulation mit Actinomycin D blockiert werden. Die HO-1 Proteinexpression nach der CoPP Stimulation war erst mit einer Verzögerung von 3 h nachweisbar und nahm nach 12 h an Intensität zu. Auch hier wurde die CoPP-induzierte Neusynthese des Proteins durch Prästimulation der Hepatozyten mit Cycloheximid vollständig gehemmt. Durch die Hemmung der mRNA Synthese mit Actinomycin D und der Proteinbiosynthese mit Cycloheximid konnte der Nachweis für die de novo mRNA und Proteinsynthese der HO-1 erbracht werden. Die LDH und AST Konzentrationen unterschieden sich nicht signifikant in diesen Gruppen. Eine Zellschädigung durch CoPP wurde nicht beobachtet (Abb. 12).

	Abb. 12: Nachweis der Neusynthese der HO-1 mRNA (oben links) und des HO-1 Proteins (unten links) durch CoPP an humanen Hepatozyten, sowie deren Blockade mit Actinomycin D (oben rechts) und Cycloheximid (unten rechts).

Hemin, ein bekanntes Substrat der HO-1, bewirkte ebenfalls einen Anstieg der HO-1 mRNA Synthese nach 3 h bis zu 12 h. Nach 24 h war das Ausgangsniveau wieder erreicht. Die HO-1 Proteinsynthese setzte erst nach 6 h ein und erreichte das Maximum nach 24 h. Die LDH Freisetzungen der kultivierten Hepatozyten unterschieden sich erst 24 h nach Hemin Exposition signifikant von der Kontrollgruppe. Die AST Konzentrationen unterschieden sich bei 6-24 h jedoch nicht signifikant. Um die Enzymaktivität der HO-1 einzuschätzen, wurde die Bildung von Fe ²⁺ aus dem Fe ³⁺ haltigen Hemin gemessen. Der Fe²⁺ Gehalt nahm bis zu 3 h zu(111.4±18.8 µmol/ mg vs. 49.1±23.5 µmol/ mg Protein Protein Kontrollgruppe) und fiel danach auf das Ausgangsniveau zurück (Abb. 14).

	Abb. 13: Die Expression der HO-1 mRNA (oben), des HO-1 Proteins (unten) nach Heminexposition über 24 h.

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	Abb. 14: Die LDH, AST, Eisen-II Freisetzungen nach Heminexposition über 24 h (Signifikanter Unterschied gegenüber CT *p<0,05).

Die warme und kalte Ischämie führen zu einer signifikanten Zellschädigung. Die HO-1 kann durch CoPP und Hemin pharmakologisch induziert werden, ohne daß eine signifikante Zellschädigung auftritt. Um die HO-1 zum Zeitpunkt des Eintretens des ischämischen Zellschadens bereits aktiviert zu haben, wurden die Hepatozyten vor der warmen und kalten Ischämie in einer Serie mit CoPP und in einer weiteren mit Hemin für 9 h stimuliert. 1 µM und 50 µM CoPP zeigte einen protektiven Effekt nach 24 h warmer und kalter Ischämie bedingter Zellschädigung gemessen als LDH und AST Freisetzung (Abb. 15). Im Gegensatz dazu konnte nach Heminprästimulation ein protektiver Effekt nur bei warmer Ischämie beobachtet werden (Abb. 16).

	Abb. 15: Dosis-Wirkungsbeziehung: LDH und AST Freisetzungen nach 9 h Prästimulation mit CoPP in verschiedenen Konzentrationen mit anschliessender 24 h warmer und kalter Ischämie.(signifikanter Unterschied in der Enzymfreisetzung zwischen prästimulierten und nichtprästimulierten Gruppen (schwarze Balken): * Signifikanz p<0,05 bei der kalten Ischämie, ** Signifikanz p<0,05 bei der warmen Ischämie)

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	Abb. 16: LDH und AST Freisetzungen nach 9 h Prästimulation mit Hemin in verschiedenen Konzentrationen und anschliessender 24 h warmer und kalter Ischämie. (signifikanter Unterschied p<0,05 in der Enzymfreisetzung zwischen prästimulierten und nichtprästimulierten Gruppen (schwarze Balken): ** Signifikanz p< 0,05 bei der warmen Ischämie)

In diesem Experiment wurde untersucht, ob die HO-1 mRNA- und Proteinexpression mit der HO-1 Aktivität unter verschiedenen inflammatorischen und ischämischen Bedingungen korreliert ist. Die HO-1 Aktivität, bestimmt durch Bilirubinmessung, war nach Exposition der Zellen mit warmer, kalter Ischämie und CM über 4 h verglichen mit der Aktivität in der Kontrollgruppe bei allen Versuchsgruppen erhöht (Abb. 17).

	Abb. 17: HO-1 Aktivität nach 4 h Stimulation von warmer und kalter Ischämie sowie Zytokinmix (CM)