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5  Diskussion

Die Unterbrechung der Blutzirkulation in einem Gewebe führt neben der ischämischen auch zu einer akuten inflammatorischen Reaktion, die eine signifikante Organfunktionsstörung hervorrufen kann [63]. Sie initiert eine komplexe Kaskade, die eine weitere Schädigung in verschiedenen Organen, w.z.B. in der Leber, in den Lungen und den Nieren, bewirkt [93]. Die Reaktionen der Zellen auf diese Schädigungsmuster werden gegenwärtig intensiv untersucht, wobei verschiedene Schutzmechanismen zur Zeit diskutiert werden [83, 118]. Dazu gehört eine Familie von Proteinen, die als Stress- oder Hitzeschockproteine (HSP) bezeichnet wird [55]. Es sind viele Studien über die Regulations- und Schutzmechanismen dieser HSP Familie an unterschiedlichen in vivo sowie in vitro Modellen durchgeführt worden [31, 45, 90]. In primären humanen Hepatozytenkulturen sind bisher keine Untersuchungen veröffentlicht worden. Primäre humane Hepatozytenkulturen können verwendet werden, um die in vivo Mechanismen der HSP Regulation besser zu studieren. In der vorliegenden Studie wurden die Induktion und Regulation der HO-1, einem Vertreter der Familie der Hitzeschockproteine, unter verschiedenen Stressbedingungen w.z.B. die Inflammation, warme und kalte Ischämie und die Exposition mit verschiedenen Radikalspezies untersucht. Außerdem wurden Möglichkeiten der Prästimulation des HO-1 Gens getestet, um die Zellen vor den o.g. stressbedingten Zellschädigungen zu schützen.

5.1 Entzündungsmodelle

Da Zytokine und Endotoxin zu den Hauptfaktoren der septischen und inflammatorischen Reaktionskaskade gehören, wurden in der vorliegenden Studie zuerst deren Effekte auf die HO-1 Expression in humanen Hepatozyten untersucht. Die Inkubation der Zellen mit den Zytokinen (IL-1, IFN-γ, TNF-α) und Endotoxin (LPS) sowie deren Kombinationen führten nach einer halben bis zu 3 h zu einer gesteigerten Expression der HO-1 mRNA. Ein Abfall der HO-1 mRNA erfolgte nach 6 h. Ähnliche Verhältnisse konnten an unterschiedlichen Tiermodellen beobachtet werden. An der Leber der Maus wurde nach Zytokin- (IL-1β und TNF) und LPS-Stimulation in vivo die Induktion der HO-1 mRNA nach 2 h beschrieben. Dieses Expressionsniveau war wie in unserem Experiment in humanen Hepatozyten bis zu 6 h vergleichbar und sank danach ab [96]. Im Gegensatz zu unseren Ergebnissen konnte jedoch eine Induktion der mRNA durch IFN-γ nicht nachgewiesen werden [96].In einer Studie an humanen [Seite 64↓]Endothelzellen wurde nach Exposition mit IL-1β und TNF-α eine Steigerung der HO-1 mRNA Expression beschrieben, die ihr Maximum nach 4 h erreichte und nach 6 h wieder absank [112]. In anderen Zellkulturmodellen oder Geweben, w.z.B. Pankreasinselzellen der Ratte [120], und in der Lunge der Ratte [16, 18], wurde die HO-1 mRNA durch die Gabe verschiedener Zytokine oder LPS nach unterschiedlichen Zeiten zwischen 4 und 12 h induziert. Die Induktion der HO-1 Proteinexpression in humanen Hepatozyten verlief parallel zur mRNA Expression zwischen 0,5 und 1 h. Nach Stimulation mit IFN-γ wurde die höchste Proteinexpressionsrate beobachtet, gefolgt von LPS, TNF-α und IL-1β. Während die Expression des Proteins bei der Einzelzytokinstimulation nach 3 h wieder sank, erreichte sie bei kombinierter Stimulation (CM) erst nach 6 h ihr Maximum. Unsere Ergebnisse unterscheiden sich von anderen Studien, bei denen die Expression erst nach längeren Inkubationszeiten beobachtet wurde [93, 112]. An humanen Endothelzellen wurde z. B. durch IL-1α und TNF-α eine maximale Proteinexpression nach 6 h gemessen, auf die ein Abfall folgte [112], während in murinen Makrophagen ein Anstieg der HO-1 Proteinexpression nach 24 h LPS Exposition beobachtet wurde [93]. In der vorliegenden Studie waren nach der Exposition der Hepatozyten mit den Einzelzytokinen und LPS oder deren Kombinationen keine signifikanten Unterschiede in den LDH- und AST-Aktivitäten im Vergleich zur Kontrollgruppe messbar. Inkubation der humanen Hepatozyten mit allen Zytokinen plus LPS führte nach 12 h zu einer signifikanten Zellschädigung.

5.2 Modelle der warmen und kalten Ischämie

Die klinische Organkonservierung für die Transplantation erfolgt bei 2-4°C [94]. Der Zeitraum zwischen der Organexplantation, des Transportes und der Implantation beträgt in der Regel 5 bis 24 h [94]. Dabei unterliegt das Organ sowohl hypothermen als auch ischämischen Einflüssen, die zu einer Gewebeschädigung beitragen [91, 95]. Im Gegensatz dazu treten während der Leberoperation Ischämien unter normothermen Bedingungen auf. Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde beobachtet, dass unmittelbar nach Beginn (0,5 h bis 1 h) der warmen und kalten Ischämie in humanen Hepatozytenkulturen die HO-1 mRNA exprimiert wurde. Gleichzeitig konnte ein Anstieg der HO-1 Proteinexpression über den gesamten Zeitraum nachgewiesen werden. Der Einfluss hypoxischer Bedingungen (7% O2) für 0-2 h auf die HO-1 mRNA Expression wurde bereits an verschiedenen Geweben der Ratte untersucht [62]. [Seite 65↓]Ein Anstieg der HO-1 mRNA Expression wurde dabei an der Lunge, der Leber, am Herzen und an der Aorta nach 30 bis zu 60 min der Ischämie nachgewiesen. Die Leber und die Lunge waren die Organe mit der höchsten Induktionsrate. Die Induktion der HO-1 mRNA in der glatten Gefässmuskulatur wurde erst nach 4 h Exposition unter hypoxischen Bedingungen (1% O2) beschrieben. Das Maximum wurde nach 8 h erreicht und fiel nach 24 bis 48 h wieder ab. Die HO-1 Proteinexpression in diesen Zellen war nach 24 h Hypoxie ebenfalls höher als in der Kontrollgruppe [62]. In bovinen Endothelzellen der Aorta wurde auch ein Anstieg der HO-1 Aktivität, mRNA und Proteinexpression nach Hypoxie beobachtet [82, 98]. Diese Ergebnisse zeigen, ähnlich der vorliegenden Studie, dass Hypoxie zu einem zeitabhängigen Anstieg der HO-1 mRNA- und Proteinexpression führt. Der Zeitraum bis zum Anstieg und die Dauer der Expression der HO-1 mRNA und des Proteins gegenüber der Hypoxie sind in den verschiedenen Zelltypen und Geweben jedoch unterschiedlich. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass warme und kalte Ischämie zu einer Schädigung der zellulären Integrität führt. Das Ausmaß der Ischämie-bedingten Zellschädigung wurde durch die AST- und LDH-Freisetzung aus den Zellen verifiziert. Während die AST Freisetzung über den gesamten Zeitraum der warmen als auch der kalten Ischämie kontinuierlich anstieg, wurde ein signifikanter Anstieg der LDH Freisetzung erst nach 6 bis 12 h beobachtet. Ein ähnlicher Verlauf war nach Hypothermie und Hypoxie an Rattenhepatozyten ebenfalls beschrieben worden, um das Auftreten der Apoptose zu untersuchen [94]. Dieser Verlauf wurde als kälteinduzierter Konservierungsschaden der Zellen interpretiert [94]. Die Änderung des intrazellulären Fe2+ Gehaltes könnte mit der HO-1 Aktivität, d.h. des Abbaus des Häms erklärt werden [67]. Der Fe2+ Gehalt der humanen Hepatozyten stieg nach warmer Ischämie bis zu 12 h langsam an. Bei der kalten Ischämie wurde ein Maximum nach 1 h und ein Abfall unter das Ausgangsniveau nach 6 h beobachtet. Die Reduktion der Fe2+ Konzentration unter das Ausgangsniveau könnte durch die Bindung an Ferritin erklärt werden. Es wird auch diskutiert, dass die HO-1 assozierte Eisenfreisetzung die intrazelluläre Ferritinsynthese moduliert[30, 37, 121].


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5.3  Wirkung von S- nitrosoacetylpenicillamin (SNAP) als NO-Derivat und H2O2 als reaktiver Sauerstoffmetabolit

Reaktive Sauerstoffmetabolite (ROI) und Stickstoffmonoxid (NO) spielen im Verlauf von vielen Entzündungsprozessen eine entscheidende Rolle [51, 100].

5.3.1  Wirkung von SNAP

In der vorliegenden Studie wurde die Induktion der HO-1 mRNA und Proteinexpression nach der Exposition mit SNAP für 3-12 h beobachtet. Nach 24 h folgte ein Abfall dieser Expression. Eine signifikante Zellschädigung wurde dabei nicht festgestellt. In einer Studie an Endothelzellen wurde nach SNAP Exposition ein 5 bis 9-facher Anstieg der HO-1 mRNA Expression über einen Zeitraum von 4-10 h beobachtet. Nach 24 h fiel die Expressionsrate wieder auf das Ausgangsniveau zurück [121]. Von einer anderen Arbeitsgruppe wurde in renalen Tubulusepithelzellen ein direkter dosisabhängiger Anstieg der HO-1 Aktivität durch SNAP (0.1-1 µM) beschrieben [64]. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass SNAP, ein NO-Donor, die HO-1 induzieren kann. Dieses Ergebnis stimmt mit den Ergebnissen einer anderen Arbeitsgruppe über ein [27] und scheint beim Menschen nicht unterschiedlich von anderen Spezies zu sein.

5.3.2  Wirkung von H2O2

Um oxidativen Stress zu simulieren, wurden Hepatozyten mit H2O2,einem Sauerstoffderivat behandelt. HO-1 mRNA- und Proteinexpressionen wurden nach 6 stündiger Inkubation mit H2O2 (100-1000 µM) induziert. Ein signifikanter Zellschaden konnte nicht nachgewiesen werden, obgleich eine relativ hohe Konzentration benutzt wurde. Die Induktion der HO-1 mRNA wurde ebenfalls in humanen Hautfibroblasten beschrieben [27]. So wurde auch gezeigt, dass H2O2 die HO-1 mRNA in anderen Säugetierzelllinien induziert [109]. H2O2 bewirkte in Rattenhepatozyten nach 15-30 minütiger Inkubation keine zytotoxischen Effekte, während nach 1-24 h Inkubation die Hepatozyten eine dosisabhängige Schädigung aufwiesen (10-1000 µM) [41]. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass H2O2 die HO-1 mRNA und Protein in humanen Hepatozyten ohne nachweisbare Zellschäden induziert.


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5.4  Pharmakologische Induktion der HO-1

Cobalt gehört zu den potenten Induktoren der HO-1 [71]. In der vorliegenden Studie induzierte CoPP den Anstieg der HO-1 mRNA und Proteinexpression. Es wurde keine signifikante Zellschädigung durch LDH und AST Freisetzung gemessen. Dass es sich hierbei um eine Neusynthese der mRNA und des Proteins handelt, konnte durch die selektive Blockade der mRNA Synthese mit Actinomycin D und der Proteinsynthese mit Cycloheximid bewiesen werden. CoCl2 und CoPP induzierten die HO-1 Aktivität und CoCl2 ebenfalls die Proteinexpressionin Pankreasinselzellen [120]. In in vivo Experimenten der Maus wurde durch CoPP-Injektion ein Anstieg der HO-1 Proteinexpression nach 24 h in der Milz, in der Leber und in der Niere nachgewiesen [118]. Da die HO-1 durch CoPP mit einer Latenz induziert wurde, könnten auch andere Mechanismen bei diesem Effekt eine Rolle spielen [27]. So könnte CoPP über die Verschiebung des oxidativen Gleichgewichtes durch Reduktion der intrazellulären GSH Konzentration mit konsekutivem Anstieg der freien Peroxidkonzentration die HO-1 mRNA Expression induzieren [27]. Während einer leichten Induktion der HO-1 protektive Effekte zugerechnet werden, kann eine starke Induktion durch CoPP auch toxisch wirken [27]. Hemin, ein anderer Induktor der HO-1 Synthese, stimulierte in der vorliegenden Studie die HO-1 mRNA Expression nach 3 h und die Proteinexpression nach 6 h. Es war jedoch nach 24 h nicht mehr nachweisbar. Eine ähnliche Wirkung auf die HO-1 mRNA und Aktivität wurde an humanen Makrophagen und an humanen sowie an Rattengliomzellen beschrieben [122]. Dass Häm (10-20 µM) die HO-1 mRNA induzieren kann, wurde erst vor kurzem an Primärkulturen von Hepatozyten von Hühnerembryonen nach einer Expositionsdauer von 5-8 h gezeigt [15, 106]. Ähnlich zu der vorliegenden Studie, folgte ebenfalls ein Abfall der mRNA Expressionsrate nach 15 h [106]. Ein Anstieg des HO-1 Proteins wurde ebenfalls beobachtet [106]. An humanen Epithelzellen der Trachea bewirkte die Heminexposition eine maximale Expression der mRNA und des Proteins nach 8 h, die mit einem Anstieg der HO-1 Aktivität verbunden war [119]. An ko-kultuvierten humanen Endothel- und glatten Muskelzellen der Aorta war ebenfalls eine durch Häm stimulierbare HO-1 mRNA und Aktivität gefunden worden [46]. In diesen Studien konnte man von einem protektiven Effekt des Hemins durch Vorbehandlung der Zellen gegenüber verschiedenen Zellschädigungsmechanismen ausgehen [46, 87, 119]. In der hier vorliegenden Studie wurden erhöhte LDH und AST Konzentrationen gemessen, so dass [Seite 68↓]toxische Effekte nicht auszuschliessen sind, ähnlich wie es an glatten Muskelzellen berichtet wurde [75].

5.5 Der Einfluß der Vorbehandlung von HO-1 Induktoren auf die ischämische Zellschädigung

Um die HO-1 wegen ihrer potentiell antioxidativen Wirkung zum Zeitpunkt des Eintretens des ischämischen Zellschadens bereits aktiviert zu haben, wurden humane Hepatozyten vor der warmen und kalten Ischämie mit verschiedenen Konzentrationen von CoPP 9 h vorstimuliert. Dabei wurde ein protektiver Effekt beobachtet. Der Einfluß der CoPP induzierten HO-1 Expression auf die zell-mediierte Immunreaktion wurde an Mäusen bereits untersucht [118]. Unter anderem wurde eine ausgeprägte Suppression der Aktivität von T-Zellen und zytotoxischen Killerzellen beschrieben [118]. In vivo verlängerte CoPP das Überleben allogener, heterotoper Herztransplantate bei der Maus [118]. Die Hochregulation der HO-1 durch CoPP in der adipösen Zucker-Rattenleber hat zu einem Schutz vor dem kalten Ischämie-/ Reperfusionsschaden geführt [5]. Die AST Konzentrationen waren sowohl in der Reperfusionsphase als auch im weiteren Verlauf niedriger als in der Kontrollgruppe und mit einer höheren Überlebensrate der transplantierten Ratten verbunden. Dieser Effekt wurde auf die immunsupprimierende Wirkung von HO-1 zurückgeführt [5]. Nutter et al [86] hat dagegen in seinen Untersuchungen keinen protektiven Effekt an humanen Zellen nachweisen können. Dennoch kann man aus den Ergebnissen der vorliegenden Untersuchung ableiten, daß die Prästimulation der HO-1 zu einem gewissen Grad humane Hepatozyten gegenüber ischämischebedingter Zellschädigung bei 24 h schützen kann. In der vorliegenden Studie wurde die Prästimulation der HO-1 auch mit Hemin über 9 h erreicht. Eine ähnliche Wirkung auf die HO-1 Aktivität wurde an humanen Makrophagen und an humanen sowie an Rattengliomzellen beschrieben [122]. An humanen Epithelzellen der Trachea bewirkte die Heminexposition eine maximale Expression der mRNA und des Proteins nach 8 h, die mit einem Anstieg der HO-1 Aktivität verbunden war [119]. An ko-kultuvierten humanen Endothel- und glatten Muskelzellen der Aorta war ebenfalls eine durch Häm stimulierbare HO-1 mRNA und Aktivität gefunden worden [46].


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5.6  HO-1 Aktivität unter inflammatorischen Bedingungen

Die HO-1 Aktivität, bestimmt durch Bilirubinmessung, war nach Exposition der Zellen mit warmer, kalter Ischämie und CM für 4 h verglichen mit der Aktivität in der Kontrollgruppe bei allen Versuchsgruppen erhöht. Sie war ebenfalls durch LPS und IFN-γ Exposition für 6 h an Endothelzellen des Schweins induzierbar [83]. In bovinen Endothelzellen der Aorta wurde ebenfalls ein Anstieg der HO-1 Aktivität nach Hypoxie von 10-24 h beobachtet [82, 98].

5.7 Zusammenfassende Bewertung

Die Unterschiede in der Induktion der HO-1 mRNA oder des Proteins in den verschiedenen Geweben in vivo oder in vitro können von den Bedingungen des Experimentes und der Zellkultur abhängen. In einigen hier durchgeführten Experimenten konnte eine hohe konstitutive HO-1 Expression nachgewiesen werden. Die HO-1 Synthese in Zellen könnte durch verschiedene Manipulationen während der Operation, w.z.B. beim Abklemmen der Gefäße, oder während der Zellgewinnung durch die oben beschriebene Perfusionstechnik aktiviert werden. In der vorliegenden Studie wurde die Induktion der HO-1 mRNA und des Proteins in verschiedenen Schädigungsmodellen beobachtet. Die warme und kalte Ischämie und die Enzündungsreaktion führen während der Leberoperationen und -transplantationen zu Gewebeschäden. Gleichzeitig wird ein hochkonserviertes zytoprotektives Enzymsystem, die HO-1, aktiviert. Es wurde gezeigt, dass dieses Enzymsystem eine protektive Rolle in humanen Hepatozyten durch eine pharmakologische Prästimulation, d.h. Aktivierung vor Einsetzen der Schädigung, spielen kann. Die pharmakologische Induktion der HO-1 Synthese und Aktivität könnte während der oben genannten ischämischen oder inflammatorischen Situationen von therapeutischer Bedeutung sein.


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04.08.2004