Aus der Klinik für Allgemein-, Visceral-,
und Transplantationschirurgie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation



Induktion und Regulation
der Hämoxygenase-1
in humanen Hepatozyten



Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)


vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin





von
Eda Müller , geb. Tüzüner
aus Denizli, Türkei

Dekan: Prof. Dr. med. J. W. Dudenhausen

Gutachter:
1. PD Dr. Andreas Nüssler
2. Univ. Prof. Dr. Friedrich C. Luft
3. Prof. Dr. Dr. M. G. Bachem

Datum der Promotion:20. Sept. 2002


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Zusammenfassung

Der nach Leberoperation und -transplantation auftretende Ischämie-/ Reperfusionsschaden (I/R) und die konsekutive Inflammation des Lebergewebes stellen ein bedeutendes klinisches Problem dar. In der vorliegenden Arbeit wurden Einflüsse der warmen und kalten Ischämie (100% N2 bei 37°C bzw. 4°C) sowie der Exposition inflammatorischer Zytokine und Endotoxin (IL-1β, 10 U/ml; IFN-γ, 100 U/ml; TNF-α, 500 U/ml; LPS, 5 µg/ml) auf die Expression der Hämoxygenase-1 (HO-1) mRNA und seines Proteins, einem Vertreter der Hitze-Schock-Proteine mit potentiell antioxidativer Wirkung, in humanen Hepatozytenprimärkulturen untersucht. Warme und kalte Ischämie stimulierten die HO-1 mRNA Expression in humanen Hepatozyten nach 0,5 bis 1h. Das HO-1 Protein wurde über 0,5-6h maximal exprimiert. Der Zellschaden, gemessen an der AST und LDH Freisetzung unter ischämischen Bedingungen wurde insbesondere nach 24 h beobachtet. Nach Zytokinexposition wurde die höchste Expressionsrate der mRNA durch IFN-γ hervorgerufen, gefolgt von TNF-α, LPS und IL-1β. Jedes einzelne Zytokin stimulierte die HO-1 mRNA Expression nach 0,5 h, erreichte ein Maximum nach 3 h und fiel nach 6 h ab. Nach Stimulation mit einem Zytokinmix (CM; IFN-γ, TNF-α, IL-1β, LPS) trat ein Maximum der HO-1 mRNA Expression erst nach 6 h ein, wobei ein signifikanter Zellschaden nach 12 h beobachtet wurde. Die HO-1 mRNA und Proteinexpression war nach Exposition von 6 h des Sauerstoffperoxides (H2O2, 200-1000 µM) erhöht. Die HO-1 mRNA und Proteinexpression war nach S-nitrosoacetylpenicillamin (0.5 mM) Exposition, einem NO Donator, für 3-12 h verstärkt. Nach Cobalt-protoporphyrin (CoPP, 1µM) Exposition, einem potenten HO-1 Induktor, wurde eine erhöhte mRNA- und Proteinexpression beobachtet. Dass CoPP die HO-1 mRNA- und Proteinneusynthese induziert, konnte durch die selektive Blockade mit Actinomycin D und Cycloheximide bewiesen werden. Die Neusynthese konnte ebenfalls unter warmer und kalter Ischämie gezeigt werden. Hemin (10 µM), ein weiterer Induktor der HO-1, induzierte die HO-1 mRNA nach 3 h und das Protein nach 6 h. Die HO-1 Enzymaktivität wurde mittels Bilirubinbildung und Messung des Fe 2+ Gehalts der Zellen bestimmt. Bei der Bilirubinbildung wurde die höchste Aktivität nach warmer Ischämie gemessen, gefolgt von kalter Ischämie, CM und der Kontrollgruppe. Die intrazelluläre Fe 2+ Messung ergab ebenfalls die höchste Enzymaktivität nach warmer Ischämie. Die Vorbehandlung humaner Hepatozyten mit CoPP (1-50 µM) für 8 h, schützte die Zellen teilweise [Seite 5↓]vor einer warmen und kalten Ischämie. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die pharmakologische Induktion der HO-1 somit bei großen allgemeinchirurgischen Eingriffen, wie der Leberteilresektion oder der Transplantation, einen protektiven Effekt entfalten könnte.

Eigene Schlagworte: Hämoxygenase 1, vInflammation, Ischämie, humane Hepatozyten, Leberresektion, Lebertransplantation


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Induction and Regulation of Heme Oxygenase-1 in Human Hepatocytes

Hepatic injury induced by ischemia/ reperfusion (I/R) and inflammation following surgeries or transplantations creates important clinical problems. In this study, the effect of inflammatory conditions such as cytokine/ endotoxin exposure (IL-1β, IFN-γ, TNF-α, LPS), warm and cold ischemia on HO-1 mRNA and protein, a member of heat shock proteins, was investigated. It was observed that IFN-γ caused the highest HO-1 mRNA expression, followed by TNF-α, LPS and IL-1β. Each stimuli increased HO-1 mRNA expression after 0.5 h, peaked at 3 h and decreased after 6 h. Highest HO-1 protein expression was observed after 0.5 to 1 h of stimulation with IFN-γ, which was followed by LPS, TNF-α and IL-1β. The peak of HO-1 expression using all four stimuli (CM) was after 6 h. CM caused a significant increase in LDH and AST after 12 h. Warm and cold ischemia stimulated HO-1 mRNA expression in human hepatocytes at 0.5-1 h. HO-1 protein expression had its maximum between 0.5-6 h. Cellular damage measured as the release of LDH and AST was significant after 24 h. Mimicking oxydative stress, hepatocytes were exposed to 200-1000 µM H2O2 for 6 h which also showed an increased HO-1 mRNA and protein expression. HO-1 mRNA and protein expression revealed an increase after SNAP exposure at 3-12 h. Results with CoPP (10 µM), a potent inducer of HO-1, displayed an increase in HO-1 mRNA and protein expression. It was proved, that CoPP induced new synthesis of mRNA and protein by its blocking agents such as actinomycin D and cycloheximide, respectively. Hemin (10 µM), another inducer of HO-1, triggered HO-1 mRNA expression after 3 h and protein expression after 6 h. The HO-1 enzyme activity was measured by bilirubin production after exposure to CM, as well as warm and cold ischemia. The highest enzyme activity was found after warm ischemia, followed by cold ischemia, CM and then by the control group. Fe 2+ content of the cells, used as another method to judge HO-1 activity, confirmed our findings. Pre-treatment of human hepatocytes with different concentrations of CoPP (1-50 µM) protect cells against warm or cold ischemia. Therefore, we conclude that pharmacological induction of HO-1 may have therapeutic potential under inflammatory conditions such as seen during liver resection or liver transplantation.

Keywords: Heme oxygenase 1, inflammation, ischemia , human hepatocytes, liver resection, liver transplantation


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04.08.2004