2 MATERIALIEN UND METHODEN

2.1 Probandenrekrutierung und Studiendurchführung

2.1.1 Studiendesign

↓19

Dieser Arbeit liegt eine kontrollierte offene prospektive Studie an 42 gesunden Probanden zugrunde, die in Abhängigkeit ihres CYP2D6-, CYP2C19- bzw. CYP2C9- Genotyps in 6 Gruppen eingeteilt werden und bezüglich pharmakokinetischer Unterschiede nach oraler Einnahme einer Einmaldosis Doxepin und Trimipramin mit der Gruppe der Wildtyp-Träger dieser Polymorphismen verglichen werden. Die Studie wurde nach Zustimmung der lokalen Ethikkommission gemäß den Richtlinien der Good Clinical Practice am Institut für klinische Pharmakologie der Charité durchgeführt. Die teilnehmenden Probanden wurden durch die die Studien betreuenden Ärzte und Doktoranden schriftlich und mündlich aufgeklärt und gaben ihre schriftliche Einwilligung zur Teilnahme an der Studie.

2.1.2 Probandenauswahl und Einschlusskriterien

Es wurden 9 Frauen und 33 Männer nach ihrem CYP2D6-, CYP2C9- und CYP2C19-Genotyp aus einem Kollektiv von 516 genotypisierten Individuen ausgesucht und in 6 Gruppen nach folgendem Schema eingeteilt: jeweils 8 bzw. 7 Träger eines inaktiven Allels (intermediäre Metabolisierer) und 8 bzw. 7 Träger von zwei inaktiven Allelen (langsame Metabolisierer) der Gene CYP2D6 bzw. CYP2C19 und 4 Probanden, die den langsam metabolisierenden Genotyp *3/*3 für CYP2C9 aufwiesen. Als Kontrolle diente eine Gruppe aus 8 Probanden, die Träger zweier aktiver (Wildtyp) Allele jedes der drei untersuchten Gene waren. Das Durchschnittsalter betrug 37 Jahre (22 -66 Jahre), das durchschnittliche Gewicht 76 kg (55 – 110 kg) und der Body-Mass-Index 23. Die demografischen Daten und die Genotypen der Studienteilnehmer sind in Tabelle 5 aufgelistet. Alle Probanden waren Nichtraucher. Da genetische Untersuchungen zum Arzneimittelstoffwechsel durchgeführt wurden, sollten alle Studienteilnehmer aus einer einheitlichen Population, in diesem Falle kaukasischer Abstammung, sein, um das Risiko systematischer Fehler zu verringern. Es wurde eine Anamnese, eine allgemeinärztliche Untersuchung sowie ein Routinelaborscreening durchgeführt. Im Rahmen dieser Laboruntersuchung wurde ein kleines Blutbild mit Bestimmung von Hb, Hämatokrit, Erythrozyten- und Leukozytenzahl durchgeführt sowie Gerinnungsparameter, Elektrolyte, GOT, GPT, γ-GT, AP, Quick-Wert, Albumin, gesamtes Bilirubin, Harnstoff und Kreatinin ermittelt. Zum Ausschluss einer Hepatitis A oder B wurden HbsAg und Anti-HCV bestimmt. Darüber hinaus wurde ein HIV-Test durchgeführt und bei Frauen Beta-HCG zum Ausschluss einer Schwangerschaft gemessen. Die Probanden erhielten schriftliche und mündliche Erläuterungen zu Studieneinschränkungen und Ernährungshinweisen.

Tabelle 5: Genotyp und demografische Daten der Studienteilnehmer

$ : Ein EM von CYP2D6 wies eine Genduplikatur in Kombination mit einem defizienten CYP2D6-Allel auf. Diesen Genotyp betrachteten wir als äquivalent zu zwei aktiven Allelen.

2.1.3 Ausschlusskriterien

↓20

Als Ausschlusskriterien galten alle körperlichen und seelischen Erkrankungen und jegliche Medikamenteneinnahme. Insbesondere Erkrankungen oder vorausgegangene Operationen des Magen-Darm-Trakts, der Niere und der Leber waren strenge Ausschlusskriterien, da sie Einfluss auf die Pharmakokinetik der Medikamente nehmen können. Aufgrund der erhöhten Gefahr kardialer und zentralnervöser Nebenwirkungen wurden Probanden mit neurologischen, insbesondere epileptischen, Erkrankungen sowie Erkrankungen des Reizleitungssystems des Herzens von der Studie ausgeschlossen. Da Ethanol, Tabakrauch und begleitende Medikamenteneinnahme die Aktivität von Cytochrom-Enzymen beeinflussen, galten diese Faktoren als Ausschlusskriterien. Einen Überblick gibt Tabelle 6.

Tabelle 6: Körperliche Erkrankungen und weitere Ausschlusskriterien

Frauen, die orale Kontrazeptiva einnahmen oder schwanger waren, wurden von der Teilnahme ausgeschlossen. Darüber hinaus konnten keine Probanden in die Studie eingeschlossen werden, die innerhalb der zurückliegenden zwei Monate vor Studienantritt an einer anderen Arzneimittelstudie teilgenommen oder aber Blut gespendet hatten, bei denen anamnestisch eine Arzneimittelallergie bekannt war oder die ganz allgemein klinische Befunde aufwiesen, die eine Teilnahme an der Studie hätten beeinträchtigen können.

2.1.4 Art und Dosis der verwendeten Arzneimittel

↓21

Die zu untersuchenden Substanzen wurden als orale Einmaldosen verabreicht. Die Probanden erhielten zu den jeweiligen Terminen 75 mg Doxepin (Aponal® 75, Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland) oder 75 mg Trimipramin (Stangyl® 75, Aventis, Frankfurt, Deutschland), was einer üblichen Einstiegsdosis bei Behandlungsbeginn entspricht.

2.1.5 Diätetische Maßnahmen

Jeweils 3 Tage vor der Applikation des Medikaments bis nach der letzten Blutentnahme sollten die Patienten den Genuss Xanthin-haltiger Speisen und Getränke wie Schokolade, Bananen, Tee, Kaffee oder Coca Cola auf ein Minimum reduzieren, da Xanthine eine induzierende Wirkung auf Cytochrom-Enzyme ausüben. Die Einnahme von Drogen und Alkohol sowie der Verzehr von Grapefruitsaft oder –früchten war in diesem Zeitraum komplett untersagt. Am Einnahmetag sollten die Probanden von 22 Uhr des Vortages bis 4 h nach Medikamentenapplikation nüchtern bleiben. In diesem Zeitraum war Mineralwasser nach Belieben erlaubt und bei Hypoglykämiesymptomen Traubenzucker nach Absprache mit den die Studien begleitenden Ärzten.

2.1.6 Überprüfung der Probandencompliance und Vorsichtsmaßnahmen

Die Studienteilnehmer verpflichteten sich nach ausführlicher Aufklärung schriftlich, die Studieneinschränkungen einzuhalten. Unmittelbar vor der Einnahme der Testsubstanzen wurden die Probanden zu ihrem aktuellen gesundheitlichen Zustand sowie zu den diätetischen Maßnahmen befragt. Sie wurden darauf hingewiesen, dass im Verdachtsfall Blut- und Urinkontrollen zur Überprüfung ihrer Angaben durchgeführt und sie im Falle eines positiven Testergebnisses mit sofortiger Wirkung aus der Studie ausgeschlossen werden würden. Die Medikamentenapplikation erfolgte im Beisein eines Arztes.

↓22

Alle Probanden waren vor Studienbeginn über die häufigsten Nebenwirkungen ausführlich aufgeklärt und schriftlich informiert worden, ebenso wurde ihnen mitgeteilt unter welcher Telefonnummer der Studienarzt und Studienleiter während der gesamten Untersuchung erreichbar sei.

2.1.7 Studienablauf

Die Kinetikmessung erstreckte sich über jeweils 72 Stunden. In diesem Zeitraum erfolgten insgesamt 13 Blutentnahmen. Am ersten Kinetiktag wurden die Probanden stationär aufgenommen, während an den weiteren 3 Tagen die Blutentnahmen ambulant geschahen. Vor der Medikation am ersten Tag erhielten die Studienteilnehmer eine venöse Verweilkanüle, mit der nach 0, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8 und 10 Stunden jeweils 8 ml EDTA-Blut zur Bestimmung des Medikamentenspiegels und seiner Metaboliten gewonnen wurde. 4 Stunden nach der Medikamenteneinnahme war es den Probanden erlaubt, erstmals eine Mahlzeit zu sich zu nehmen. Nach der letzten Blutentnahme wurde der venöse Zugang entfernt, woraufhin die Probanden das Institut verlassen konnten. Die folgenden 4 Blutentnahmen waren auf 24, 36, 48 und 72 Stunden nach der Medikation angesetzt, bei denen jeweils noch eine 8ml-EDTA-Monovette durch Punktion einer Armvene entnommen wurde. Das Gesamtvolumen des entnommenen Bluts betrug folglich rund 104 ml pro Medikament. Der Abstand zwischen zwei Medikamentenverabreichungen betrug mindestens 21 Tage, was mehr als 5 Halbwertszeiten der Substanzen und ihrer Metaboliten entspricht.

2.1.8 Erfassung von Nebenwirkungen

Während der Kinetikmessungen aufgetretene Nebenwirkungen wurden insgesamt 4-mal je Medikament erhoben. Um kardiale Begleiterscheinungen zu erfassen, wurden vor der Medikation sowie 3 h, 10 h und 72 h danach ein EKG geschrieben und der Blutdruck gemessen. Zur Erfassung weiterer unerwünschter Medikamenteneffekte sollten die Probanden zu den gleichen Zeitpunkten Fragebögen zur Selbstbeurteilung bezüglich Vigilanz, Nervosität, Akkomodationsvermögen, Schüttelfrost, Schwitzen, Zittern, Kopfschmerzen, Schwindel, Herzklopfen, Übelkeit und Mundtrockenheit ausfüllen. Alle Nebenwirkungen wurden in offenen Fragebögen, die keine Rückschlüsse auf das verabreichte Medikament zuließen, schriftlich dokumentiert.

2.1.9 Dokumentation der Studie

↓23

Die erhobenen Daten (Anamnese, Laborergebnisse, unerwünschte Arzneimittelnebenwirkungen, Blutentnahme- und Laborprotokolle) wurden in Case Report Forms (CRFs) eingetragen, die zusammenhängend für 15 Jahre im Institut für Klinische Pharmakologie der Charité aufbewahrt werden. Eine Entnahme einzelner Blätter ist nicht gestattet.

2.1.10 Datenschutz und Vertraulichkeit der Daten

Die Probandendaten wurden in anonymisierter Form erhoben. Jeder Proband erhielt eine individuelle Code-Nummer. Die Zuordnung von Proband und Code ist nur den an der Studie mitarbeitenden Doktoranden und Ärzten bekannt und wird nicht an Dritte weitergegeben. Die Daten sind computergesteuert verwaltet und gespeichert. Ein Datenzugriff anderer auf die personenbezogenen Daten ist nur nach Genehmigung durch die Probanden selbst möglich.

2.1.11 Fehlerminimierung

Die in der Studie verwendeten Medikamente wurden bei den einzelnen Probanden in unterschiedlicher Reihenfolge gegeben, um systematische Fehler wie Ermüdung oder Gewöhnung im Verlauf der Gesamtstudie zu verringern. Eine Blindung wurde nicht vollzogen, da die Hauptzielgröße der Studie, der Plasmamedikamentenspiegel, nicht von der subjektiven Wahrnehmung der Probanden oder Studienärzte abhängig ist. Subjektiv erhobene Daten wie die offenen Fragebögen zu den Medikamentennebenwirkungen wurden dokumentiert, besitzen jedoch keine Beweiskraft. Hinsichtlich wesentlicher Einflussgrößen wie Körpergewicht, Geschlecht oder Alter erfolgte eine Adjustierung, so dass die Gruppe der Langsammetabolisierer jeweils vergleichbare Eigenschaften wie die Kontrollgruppe aufwies.

2.1.12 Versicherungsschutz

↓24

Gemäß den Vorschriften des Arzneimittelgesetzes waren die Probanden über 500000 € gegen die bei Blutabnahmen potenziell auftretenden Schäden sowie gegen die nicht therapeutisch indizierte Einnahme der Testsubstanzen versichert.

2.1.13 Weiterverarbeitung und Aufarbeitung der Proben zur Messung der Medikamentenplasmakonzentration

Die Blutproben wurden unmittelbar nach der Entnahme zehn Minuten bei 5000 U/min zentrifugiert und das so gewonnene Blutplasma wurde bis zur Weiterverarbeitung bei -20° C in Eppendorf-Cups gelagert.

2.2 Genotypisierung

Zur DNA-Extraktion wurden pro Proband etwa 5 ml venöses Blut einer aufgetauten EDTA-Monovette benötigt. Die zu untersuchende DNA konnte dann aus den kernhaltigen Leukozyten gewonnen werden.

2.2.1 Erythrozytenlyse

↓25

Zu mindestens 3 ml aufgetautem Vollblut wurden 35 ml Ery-Lyse-Puffer dazugegeben und kurz gemischt. Durch diesen Vorgang werden die kern- und DNA-losen Erythrozyten zerstört, während kernhaltige Blutbestandteile aufgrund ihrer höheren Membranstabilität intakt bleiben. Um das DNA-haltige Zellsediment zu isolieren und für die DNA-Extraktion vorzubereiten, wurden die Proben anschließend für 30 min bei 2000 U/min zentrifugiert, der Überstand verworfen und nach Zugabe von 1,5 ml TEN-Puffer (bestehend aus Tris/HCl, EDTA und NaCl) bei -20° C eingefroren.

2.2.2 DNA-Extraktion

In einem zweiten Schritt konnte die in den Leukozyten enthaltene DNA mithilfe des Phenol-Chloroform Verfahrens extrahiert werden. Hierzu mussten zuerst die Zellsedimente mit 1,5 ml Lyse-Puffer und 100 μl Proteinase-K-Lösung bei 37° C für 12 h verdaut werden. Zur Ausfällung der Proteine versetzte man das Reagens mit 1,5 ml einer Phenol-/ Chloroform-Lösung und zentrifugierte es. Zur Eliminierung verbliebener Lipidbestandteile wurde im Rahmen der Chloroform-Nachextraktion die obere wässrige Phase abpipettiert und nochmals mit 1,5 ml Chloroform versetzt und zentrifugiert. Danach folgte die DNA-Präzipitation. 2 ml des Überstands wurden mit 6 ml 96%-igem Ethanol und 100 μl 3M Natriumacetat (pH 5,5) überpipettiert und zentrifugiert, woraufhin die ausgefällte DNA schließlich am Boden der Gefäße haftete. Der Überstand wurde abgegossen, die DNA durch Zugabe von 3 ml 70%-igem Ethanol gewaschen und wiederum zentrifugiert. Nachdem der dabei entstehende Überstand abgegossen worden war, wurden die Proben für 30 min auf dem Kopf stehend auf Zellstoffpapier gestellt, so dass der verbliebene Alkohol abtropfen und verdunsten konnte. Abschließend wurde die DNA in TEN-Puffer (10 mM Tris-Puffer / 1 mM EDTA, pH 8) aufgelöst bei 4° C bis zur PCR in sterilen Reaktionsgefäßen aufbewahrt.

2.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Bei der PCR handelt es sich um eine In-vitro-Technik, die eine milliardenfache Vervielfältigung von spezifischen DNA-Sequenzen in zellfreiem Milieu ermöglicht und diese somit für weitere Analyseverfahren zugänglich macht. Zur Durchführung einer PCR wird in einem Thermocycler, der die vollautomatische Steuerung von Temperaturzyklen gewährleistet, eine Reaktionspufferlösung mit folgenden Stoffen gegeben: eine geringe Menge doppelsträngige DNA, eine hitzestabile DNA-Polymerase (sog. Taq-Polymerase), die bei Temperaturen von 90 - 95° C nicht denaturiert, Desoxyribonukleosidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sowie zwei synthetische Oligonucleotid-Primer, die zu Sequenzen beiderseits des DNA-Abschnittes, den man vervielfältigen möchte, komplementär sind. Das Prinzip lässt sich vereinfacht in 3 Schritte einteilen (siehe Abbildung 6). Im ersten Schritt werden beide Stränge der DNA durch Temperaturerhöhung auf 94° C getrennt (Denaturierung). Nach Abkühlung auf 57 - 60° C binden die Primer im zweiten Schritt an die entsprechenden Stellen der einsträngigen DNA-Matrize (Hybridisierung). Im dritten Schritt erfolgt bei einer für die Funktion der DNA-Polymerase optimalen Reaktionstemperatur die Verlängerung der Primer und die Synthese komplementärer DNA-Sequenzen (DNA-Synthese). Am Ende dieses Zyklus, der etwa 5 min dauert, liegen 2 neu synthetisierte Doppelstränge vor, die zunächst noch keine definierte Länge haben. Da sie aber im nächsten Zyklus selbst als Matrizen verwendet werden und an ihren Enden die Oligonukleotidsequenz der Primer tragen, entstehen ab dem dritten Durchlauf nur noch Produkte gewünschter Länge. Ab dem vierten Durchlauf erfolgt eine exponentielle Amplifizierung der Zielsequenz. Nach über 30 Durchläufen liegt die DNA theoretisch 230-mal vor. Der Vorteil an dieser Synthesemethode ist, dass die Taq-Polymerase hitzestabil ist und somit die aufeinander folgenden Denaturierungs- und Hybridisierungsschritte einander abwechseln können, ohne dass zwischendurch neues Enzym beigefügt werden muss.

↓26

Abbildung 6: Amplifizierung einer spezifischen DNA-Sequenz durch die Polymerase-Kettenreaktion

2.2.4 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLP)

Die so entstandenen amplifizierten DNA-Stücke werden zum Zweck der RFLP-Analyse mit Restriktionsendonukleasen verdaut. Dies sind Enzyme, die die DNA sequenzspezifisch schneiden und somit in der Regel DNA-Fragmente ähnlicher Länge produzieren. Jedoch können individuelle Unterschiede in der Nucleotid-Sequenz Schnittstellen von Restriktionsendonukleasen betreffen, so dass allele Genombereiche in unterschiedliche Fragmente zerlegt werden. Das Vorliegen unterschiedlich langer DNA-Fragmente nach Verdau durch Restriktionsenzyme wird als Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus bezeichnet. Die vervielfältigte und geschnittene DNA kann im nächsten Schritt durch eine Agarosegelelektrophorese untersucht werden. Die Fragmente wandern abhängig von ihrer Größe unterschiedlich schnell durch die netzähnlichen Polysaccharidstrukturen des Agarosegels und werden schließlich durch intercalierende Farbstoffe wie Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Dieses Verfahren dient der gezielten Suche bekannter Mutationen mithilfe spezifischer Enzyme, wie beispielsweise der dieser Arbeit zugrunde liegenden CYP2D6-, CYP2C9- und CYP2C19- Polymorphismen.

2.2.5 Bestimmung des Cyp2D6-Allels durch PCR-RFLP-Tests

Die Bestimmung der CYP2D6-Allele erfolgte mittels PCR-RFLP-Tests, wie sie von Sachse et al. beschrieben worden sind. Hierbei reichen 5 PCR-RFLP-Reaktionen aus, um die Allele *3, *4, *5, *6, *8, *12, *14 und *15 sowie die Genduplikationen CYP2D6*2xN zu ermitteln (Sachse et al., 1997; Johansson et al., 1996). Um mögliche Fehlerquellen durch Koamplifikationen der beiden benachbarten homologen Pseudogene CYP2D7 und CYP2D8 zu vermeiden, wird zuerst das gesamte CYP2D6-Gen mit einer Länge von 4681 bp amplifiziert. Hierbei verwendete man das Expand Long Template PCR System (Fa. Boehringer, Mannheim, Deutschland), das mit einem Gemisch der DNA-Polymerasen Taq und Pwo arbeitet und in der Lage ist, Fragmente bis zu einer Länge von 20kb zu vervielfältigen. Im zweiten Schritt werden mittels der nested PCR-Technik die 3 DNA-Abschnitte, auf denen sich die Punktmutationen für die Allelvarianten *3, *4, *6, *8, *12, *14 und *15 befinden, spezifisch amplifiziert. Einen Überblick über die Durchführung der beiden PCR-Techniken gibt Tabelle 8. Zur Kontrolle weist man die entstandenen DNA-Fragmente gelelektrophoretisch auf 1%-Agarosegel nach und dokumentiert sie mit einem digitalen Videosystem (Eagleeye™, Fa. Stratagene). Im letzten Schritt werden die vervielfältigten Genabschnitte mittels Restriktionsendonukleasen (Fa. Biolabs New England) verdaut und die DNA-Fragmentlängen auf einem 3% Agarosegel elektrophoretisch analysiert und fotografisch dokumentiert (siehe Tabelle7).

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Zur Detektion einer Gen-Duplikation wurde eine Methode angewandt, die Johansson et al. beschrieben. Prinzipiell wird hierbei ein DNA-Segment spezifisch amplifiziert, was zwischen dem Exon 9 von CYP2D6*2B und Intron 2 von CYP2D6*2A gelegen und somit nur bei Probanden mit dieser Duplikation vorhanden ist. Fällt die PCR positiv aus, entsteht also ein vervielfältigtes DNA-Fragment, kann man von einer Probe mit einer CYP2D6-Duplikation ausgehen.

Tabelle 7: Zusammensetzung der Mastermixe für die einzelnen PCR-RFLP-Reaktionen (nach Sachse et al., 1997)

Tabelle 8: Design der PCR-RFLP-Tests für CYP2D6-Mutationen (nach Sachse et al., 1997)

2.2.6 Bestimmung des CYP2C9-Allels durch PCR-RFLP-Tests

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Die Bestimmung der Allele *2 und *3 sowie des Wildtypallels erfolgte nach der von Sullivan-Klose et al. beschriebenen Methode. Hierzu wird 1 µl genomischer DNA jeweils 25 µl des in Tabelle 9 beschriebenen Mastermix zugesetzt, um eine gezielte Amplifizierung der 2 DNA-Segmente, die die beiden Punktmutationen enthalten, zu erhalten. Ebenso wie bei der CYP2D6-Genotypisierung wird das PCR-Produkt kontrolliert, indem es, mit Bromphenolblaupuffer gemischt, auf 1% Agarosegel aufgetragen wird, woraufhin nach Elektrophorese in einer Protrans-Kammer für 30 min bei 120 Volt im Fall von Cyp2C9*2 eine 372 bp-Bande, im Fall von Cyp 2C9*3 eine 137 bp-Bande entstehen sollte. Im Erfolgsfall werden die entstandenen 2 Typen von DNA-Fragmenten mit einem Enzymmastermix versetzt und über Nacht bei 37°C schüttelnd inkubiert. Zur Auswertung in der Elektrophorese wird die Probe nach Zugabe von 10 μl Bromphenolblaupuffer auf 3,5% Agarosegel aufgetragen und für 60 min. bei 100 Volt aufgetrennt (Sullivan-Klose et al., 1996). Die entstehenden Restriktionsmuster für die unterschiedlichen Genotypen können dann abgelesen und zu Dokumentationszwecken fotografiert werden. Sie sind in Tabelle 9 im Detail dargestellt.

Tabelle 9: Durchführung und Ergebnisse von PCR-RFLP und Gelelektrophorese

2.2.7 Bestimmung des CYP2C19-Allels durch PCR-RFLP-Tests

Aufgrund der kaukasischen Abstammung der Probanden führten wir bei der Genotypisierung nur einen PCR-RFLP-Test zur Ermittlung des *2-Allels durch. Hierzu wird 1 µl DNA zu 25 µl des Mastermix gegeben, wie er in Tabelle 10 beschrieben ist. Zur Kontrolle wird das PCR-Produkt mit der gleichen Methode wie bei CYP2C9 einer Elektrophorese unterzogen, bei der es im Erfolgsfall eine 190bp-Bande abbildet. Im anschließenden Verdau wird das Restriktionsenzym SmaI benutzt, welches exakt bei dem Basenpaar des Wildtyps spaltet, welches bei der inaktiven Allelvariante ausgetauscht ist. Das DNA-Fragment des Wildtyps wird somit in zwei Teile von 120 und 49 Basenpaaren gespalten, während die Mutation als ein 169 bp langes DNA-Stück unverdaut bleibt. Während der abschließenden Elektrophorese auf 3%-Agarosegel lassen sich diese Banden wie in Tabelle 10 dargestellt sichtbar machen.

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Tabelle 10: Durchführung und Ergebnisse von PCR-RFLP und Gelelektrophorese von CYP2C19

2.3 Bestimmung von Medikamentenkonzentrationen mittels HPLC-Analyse

2.3.1 Prinzip der Bestimmung von Medikamentenkonzentrationen mittels HPLC-Analyse

2.3.1.1 Extraktion

Der eigentlichen Konzentrationsbestimmung wird die Extraktion der Substanz aus den Plasmaproben vorangestellt. Diese dient einer gewissen Vorreinigung und Anreicherung, womit ihre Detektion in der folgenden Chromatographie vereinfacht wird. Der Probe wird im Regelfall ein Interner Standard (IS) zugesetzt. Es handelt sich hierbei um eine bekannte Menge einer Substanz, die dem zu untersuchenden Stoff chemisch verwandt ist und mit deren Hilfe die Vollständigkeit der Extraktion beurteilt werden kann.

2.3.1.2 Konzentrationsbestimmung

Die Konzentrationsbestimmung ist stark abhängig von äußeren Einflüssen, weswegen im vorhinein eine Kalibrierkurve mithilfe von Kalibrierstandards erstellt wird. Hierzu werden bei jeder Messung die Konzentrationen, die den aufgrund der gängigen Literaturdaten zu erwartenden Konzentrationsbereich umfassen sollten, einer ausreichenden Anzahl von Eichproben bestimmt. Unter Berücksichtigung eventueller Verluste bei der vorausgegangenen Extraktion werden die Quotienten der Peakhöhen des Analyten und des Internen Standards gebildet (Analyt / IS). Die Berechnung der Kalibrierkurve erfolgt dann mittels linearer Regression der Peakflächenquotienten der Kalibrierstandards gegen die Konzentration.

2.3.1.3 Durchführung der HPLC

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Zur Bestimmung der Plasmamedikamentenkonzentrationen wurde die Methode der Hochleistungs-Fflüssigkeits-Chromatographie (High Performance Liquid Chromatography = HPLC) angewandt, welche sich durch besonders hohe Trennschärfe und EMpfindlichkeit, hohe Kapazität und vergleichsweise schnelle Durchführbarkeit auszeichnet. Das ihr zugrunde liegende Prinzip ist die Verteilungschromatographie, bei der sich Stoffe aufgrund unterschiedlicher Affinität zu zwei nicht miteinander mischbaren flüssigen Phasen zwischen diesen verteilen. Eine der Phasen, die stationäre Phase, ist an einen festen Träger gebunden, an dem die andere mobile Phase entlangfließt. Im Fall der so genannten RPLC (Reversed Phase Liquid Chromatography) besteht die stationäre Phase aus Kieselgelteilchen, an die hydro phobeSubstanzen kovalent gebunden sind, und die mobile Phase aus einer pufferhaltigen wässrigen Lösung, die mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel gemischt ist. Die Trennung eines Stoffgemischs durch die HPLC kommt dadurch zustande, dass die verschiedenen in der mobilen Phase gelösten Komponenten je nach ihrer Affinität zur stationären Phase langsamer als das Lösungsmittel durch die Säule wandern und sich somit abhängig von ihren hydrophoben Eigenschaften auftrennen.

Die einzelnen Stoffe werden abschließend mittels eines nach dem Prinzip der Absorptionsfotometrie messenden UV-Durchflussdetektors bestimmt. Hierbei wird die Intensitätsabschwächung (Extinktion) eines eine Probe durchlaufenden Lichtstrahls gemessen, woraus ihre molare Konzentration bestimmt werden kann. Bei diesem Schritt wird auf die oben beschriebene Kalibrierkurve zurückgegriffen. Aus den normierten Messwerten der zu bestimmenden Proben lassen sich nun anhand der erhaltenen Regressionsparameter die unbekannten Konzentrationen ermitteln.

2.3.1.4 Statistische Qualitätskontrolle der Analyseergebnisse

Mithilfe der statistischen Qualitätskontrolle kann bei quantitativen Bestimmungen die Präzision (Erfassung zufälliger Fehler) systematisch kontrolliert und überwacht werden. Künstliche Qualitätskontrollproben mit bekannten Konzentrationen werden in eine Analysenserie eingefügt und unter den gleichen Bedingungen wie Patientenproben analysiert. Das Prinzip der statistischen Qualitätskontrolle besteht darin, dass vom Analyseergebnis der Kontrollproben auf die Zuverlässigkeit der Probandenwerte geschlossen wird.

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Bestimmungsgrenze. Die Bestimmungsgrenze lässt sich beschreiben als die kleinste messbare Konzentration eines Analyten, die noch mit einer definierten Richtigkeit und Präzision bestimmt werden kann (± 20 %). Sie wird mithilfe von Kalibrierstandards festgelegt

2.3.2 HPLC von Doxepin und N-Desmethyldoxepin

2.3.2.1 Durchführung der HPLC von Doxepin und N-Desmethyldoxepin

Die Bestimmung der Plasmakonzentrationen von Gesamtdoxepin, also die Summe beider Isomere, und seinem Metaboliten N-Desmethyldoxepin wurde mittels einer validierten HPLC-Methode mit UV-Detektion durchgeführt (Meyer-Barner et al., 2002). Extraktion. 1 ml des aufgetauten Blutplasmas wurde mit 200 µl Natriumkarbonat (1,0 M) und 150 ng eines Internen Imipraminstandards (IS) versetzt. Der Mischung wurden 6 ml eines Lösungsmittels, bestehend aus N-Hexan und Acetonitril (98:2), zugegeben und 10 min. im Überkopfschüttler extrahiert. Nach 5 min Zentrifugation bei 4000 U/min. konnte die organische Phase entfernt und das Lösungsmittel bei Raumtemperatur mit Stickstoff verdampft werden. Durchführung. Der so gewonnene Rückstand wurde im nächsten Schritt in 200 µl der mobilen Phase gelöst. Diese bestand aus einer wässrigen Mischung aus 5 mM Phosphatpuffer (pH 6), Methanol und Acetonitril im Volumenverhältnis von 19:32:49. Die Chromatographie erfolgte bei Raumtemperatur mit einer Flussrate von 1,5 ml/min auf einer LiChrospher™ reversed phase Trennsäule (125 x 4 mm, 5 µm Partikelgröße, Merck, Darmstadt). Unter diesen Voraussetzungen wiesen Doxepin, IS und N-Desmethyldoxepin Retentionszeiten von 4, 5 und 6 min auf. Die Konzentrationen der Substanzen wurden mithilfe eines UV-Durchflussdetektors (LiChroGraph 7485, Merck, Darmstadt) bei einer Wellenlänge von 210 nm gemessen und der Quotient der Peakflächen des Analyten und des internen Standards berechnet.

2.3.2.2 Kalibrierstandards und statistische Qualitätskontrolle für Doxepin und N-Desmethyldoxepin

Bei jeder Messreihe wurden Kalibrierstandards im Konzentrationsbereich von 7,9 nmol/l bis 158 nmol/l bestimmt. Zusätzlich wurden täglich Qualitätskontrollproben gemessen, deren Konzentrationen mit 63 nmol/l oder 95 nmol/l definiert waren. Bei 17 Konzentrationsbestimmungen wurden durchschnittlich 61,8 nmol/l (Standardabweichung 6,3) und 89,6 nmol/l (6,3) gemessen. Die Nachweisbarkeitsgrenze lag bei 3,167 nmol/l und der Variationskoeffizient unter 6,5 % für beide Doxepinkonzentrationen (63 und 95 nmol/l) und unter 10,5 % für beide N-Desmethyldoxepinkonzentrationen (66 und 99 nmol/l). Nach einer Analyse der Kalibrierstandards betrug der Variationskoeffizient aller gemessenen Konzentrationen weniger als 10 %, wobei er zwischen 7,9 und 317 nmol/l konzentrationsunabhängig schien.

2.3.3 HPLC der E- und Z-Isomere von Doxepin

2.3.3.1 Durchführung der HPLC der E- und Z-Isomere von Doxepin

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Extraktion. Die Extraktion erfolgte wie in Kapitel 2.3.2.1 beschrieben. Jedoch wurden für die Bestimmung 2 ml Plasma verwendet sowie eine Mischung aus Hexan, Ethanol und Methanol (98:1:1, v/v/v) als Lösungsmittel. Durchführung. Für die Trennung der E- und Z-Isomere von Doxepin benötigte man einen Chromatographie-Apparat mit unterschiedlicher Selektivität. Als stationäre Phase wählte man Silica (LiChrospher Si60™, Merck, Darmstadt) und als mobile Phase eine wässrige Lösung bestehend aus N-Hexan, Ethanol, Methanol und Diethylamin (89:8:3:0,0005; v/v/v/v). Unter diesen Bedingungen betrugen die Retentionszeiten 8,9 min für E-Doxepin und 8 min für Z-Doxepin. Die Retentionszeiten der Metaboliten lagen bei über 70 min. Abschließend wurden die Isomere mit einer UV-Fotometrie bei einer Wellenlänge von 220 nm gemessen.

2.3.3.2 Kalibrierstandards und statistische Qualitätskontrolle der E- und Z-Isomere von Doxepin

Es wurden Kalibrierstandards mit Doxepinkonzentrationen zwischen 7,9 nmol/l und 143 nmol/l verwendet. Die Messungen wurden überwacht, indem Qualitätskontrollproben mitbestimmt wurden, deren Konzentrationen bei 32 nmol/l oder 127 nmol/l lagen. Die Durchschnittswerte wurden hierbei mit 33,6 nmol/l (SA: 5,4) bzw. 124,5 nmol/l (SA: 13,9) angegeben. Danach wurden die Quotienten E-Doxepin / (E-Doxepin + Z-Doxepin) sowie Z-Doxepin / (E-Doxepin + Z-Doxepin) berechnet. Unter Zuhilfenahme der Gesamtdoxepinkonzentration der Probe ließen sich hieraus die Isomerkonzentrationen bestimmen. Bei der Messung der Isomere lag die Bestimmungsgrenze bei 3,1 nmol/l für E-Doxepin und bei 0,6 nmol/l für Z-Doxepin.

2.3.4 HPLC von razemischen Trimipramin

2.3.4.1 Durchführung der HPLC von razemischen Trimipramin und N-Desmethyltrimipramin

Extraktion. Zur Vorbereitung wurden 1 ml der aufgetauten Plasmaprobe 25 µl des Internen Standards und 500 µl einer 1-molaren Natriumkarbonatlösung, deren pH-Wert zwischen 10 und 11 betrug, hinzugefügt. Als Internen Standard verwendete man 500 ng in Methanol gelöstes Imipramin. Diese Mischung wurde mit 5 ml einer Lösung aus N-Hexan und Acetonitril (98:2) versetzt und 10 min im Überkopfschüttler extrahiert. Nach Zentrifugierung wurde der organische Überstand mithilfe von Stickstoff verdampft und der Rückstand für die weitere Analyse verwendet. Durchführung. Im weiteren Schritt wurden zuerst 4,5 ml des Extrakts in 100 µl der mobilen Phase gelöst, welche sich aus 5 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6), Methanol und Acetonitril im Volumenverhältnis 22:32:46 zusammensetzte. Zur Bestimmung von Trimipramin und seines Hauptmetaboliten N-Desmethyltrimipramin verwendete man ebenfalls eine reversed phase HPLC mit UV-Detektion. Die Chromatographie von 50µl-Proben erfolgte auf einer LiChrospher 100 CN™-Säule (Merck, Darmstadt) mit einer Flussrate von 1,5 ml/min bei Raumtemperatur. Abschließend wurde die Konzentration mittels UV-Detektion bei einer Wellenlänge von 250 nm gemessen.

2.3.4.2 Kalibrierstandards und statistische Qualitätskontrolle von Trimipramin und N-Desmethyltrimipramin

↓33

Es wurden Kalibrierstandards für Trimipraminmaleat und Desmethyl-Trimipraminmaleat im Konzentrationsbereich von 2,5 µl bis 100 µl verwendet. Bei jeder Messreihe, die aus 22 Einzelmessungen bestand, wurden zwei Kontrollproben bestimmt, welche eine Konzentration von 10 µg/l oder 50 µg/l aufwiesen. Die Variationskoeffizienten lagen bei 8,7 % und 9,2 % bei den 10µg/l-Trimipramin- und Desmethyltrimipraminproben bzw. bei 5,2 % und 10,5 % bei den 50µg/l-Proben. Die Bestimmungsgrenze wurde mit 1 µg/l sowohl für Trimipramin als auch seinen Metaboliten angegeben.

2.4 Analyse der Messdaten und Statistik

2.4.1 Pharmakokinetische Begriffe und Parameter

Folgende pharmakokinetische Parameter wurden als Haupt- und Nebenzielgrößen verwendet. Ihre Berechnung und Bedeutung soll zum besseren Verständnis des Nachfolgenden kurz erläutert werden.

AUC (area under the curve = Fläche unter der Kurve). Die AUC dient als Messgröße für das Ausmaß der Bioverfügbarkeit im zentralen Kompartiment. Trägt man nach Medikamentenapplikation gemessene Plasmakonzentrationen gegen die Zeit auf, so bezeichnet man die Fläche unter der resultierenden Kurve als AUC. Anders ausgedrückt stellt die AUC das Integral der Konzentrationen über die Zeit dar. Am besten wird sie näherungsweise nach der Trapezregel bestimmt, wobei vom letzten Messzeitpunkt die Restfläche im Regelfall gegen unendlich extrapoliert wird. Dies setzt jedoch voraus, dass die Plasmakonzentrationen ausreichend lang verfolgt wurden, so dass mit hinreichender Präzision extrapoliert werden kann. Während sich in der AUC ausschließlich der Umfang der Bioverfügbarkeit niederschlägt, werden zur Quantifizierung ihrer Geschwindigkeit zwei weitere Zielgrößen gemessen, die Spitzenkonzentration C maxnach Einmalapplikation sowie der Zeitpunkt t max des Erreichens dieser Spitzenkonzentration. Die Höhe von Cmax ist von Bedeutung im Zusammenhang mit der erreichbaren therapeutischen Wirkung, möglicherweise aber auch mit der Häufigkeit unerwünschter Nebenwirkungen. Von geringerer Bedeutung ist tmax anzusehen, da die Größe ausschließlich von der Resorptionsgeschwindigkeit abhängt.

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Totale orale Clearance. Die totale orale Clearance ist der am meisten geeignete Parameter zur Charakterisierung und Quantifizierung aller Eliminationsprozesse. Sie beschreibt die Möglichkeit des Körpers und seiner Eliminationsorgane ein bestimmtes Volumen Blut pro Zeiteinheit von einem Arzneistoff zu klären, d.h. durch Metabolismus und/oder Exkretion eine verabreichte Substanz aus dem Körper zu eliminieren. Sie berechnet sich wie folgt: Cli.v. = Dosisi.v. / AUC. Bei oraler Medikamentengabe kann nur die orale Clearance Clo berechnet werden, welche neben der systemischen Clearance auch mögliche präsystemische Clearanceanteile einschließt und die von der häufig unbekannten Resorptionsquote abhängt. Die Clearance ist additiv, d.h. sie setzt sich aus den Clearanceanteilen der jeweils an der Elimination beteiligten Organe oder Enzyme zusammen.

2.4.2 Analyse der Messdaten

Die Ergebnisse der Plasmakonzentrationsmessungen wurden durch nonparametrische pharmakokinetische Methoden analysiert mittels des Programms WinNonlin™ Version 1,5., 1997 (Scientific Consulting Inc., NC, USA). Die AUCs wurden nach der Trapezregel mit Extrapolierung gegen unendlich bestimmt und die Clo nach oben beschriebener Formel aus der oralen Dosis und den AUCs berechnet. Die orale Clearance errechnet sich somit als der Quotient aus der Clearance und der Bioverfügbarkeit. Die AUCs für N-Desmethyldoxepin wurden nicht gegen unendlich extrapoliert, da die Schätzung der für die AUC-Berechnung erforderlichen Eliminationskonstante aufgrund der zu langen Eliminationszeiten des Metaboliten zu ungenau gewesen wäre. Die AUCs für N-Desmethyltrimipramin wurden ebenfalls nicht gegen unendlich extrapoliert, da zu viele Plasmaproben unter der Bestimmungsgrenze lagen. Die Gesamt-AUCs der aktiven Substanzen Doxepin und N-Desmethyldoxepin bzw. Trimipramin und N-Desmethyltrimipramin wurden durch Addition der einzelnen AUCs berechnet. Als die jeweilige Cmax wurde die höchste gemessene Plasmakonzentration einer einzelnen Kinetik gewertet. Bei der enantioselektiven Analyse von Doxepin wurde die orale Dosis der Zis- und Trans-Isomere aufgrund deren Mischungsverhältnisses mit 0,15 bzw. 0,85 der Doxepindosis errechnet.

2.4.3  Statistik

Zur Feststellung signifikanter Unterschiede hinsichtlich pharmakokinetischer Eigenschaften in Bezug auf die einzelnen Genotypen wurde der Trendtest nach Jonckheere-Terpstra verwendet. Die Reihenfolge zur statistischen Testung von AUC, Cmax und der Halbwertszeit t1/2 wurde entsprechend der Anzahl aktiver Allele wie folgt festgelegt: CYP2D6: PM > IM > EM > UM; CYP2C9: *3/*3 > *1/*1; CYP2C19: *2/*2 > *2/*1 > *1/*1. Zur Testung der Clearance wurde entsprechend die umgekehrte Reihenfolge zugrunde gelegt. Statistische Berechnungen und Grafiken wurden mit der Software SPSS, Version 10 (SPSS Inc., Chicago, Il, USA) und S-Plus 2000 (Math Soft Inc., Cambridge, MA, USA) durchgeführt.


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13.04.2006