3 Material und Methoden

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3.1  Tiere und Tierhaltung

In dieser Studie wurden 30 männliche Wistar-Ratten im Alter von 6-7 Wochen untersucht. Das Gewicht der Versuchstiere betrug 200-260g. Die Versuchsreihen unterlagen der Richtlinien für die Durchführung von Tierversuchen nach §2, sowie §8 des Tierschutzgesetzes und wurden von der zuständigen Senatsbehörde für Gesundheit des Landes Berlin genehmigt (G 0133/00). Die Versuche wurden von September bis Dezember 2002 durchgeführt. Die Tierhaltung erfolgte in einem klimatisierten Raum (Raumtemperatur 27°C, Luftfeuchtigkeit ca. 60%) in Standardkäfigen auf entstaubter Holzgranulateinstreu unter 12-stündigem Hell/Dunkel Rhythmus. Die Tiere erhielten Wasser ad libitum und Standardnahrung (Altromin® Pellets, Firma, Lage, Deutschland). Die Tiere wurden eine Woche nach Anlieferung im Versuch eingesetzt. 12 Stunden vor Versuchsbeginn wurden die Tiere nüchtern gesetzt, Wasser wurde weiter ad libitum gewährt.

3.2 Gruppeneinteilungen

Es erfolgte ein randomisierte Einteilung in 3 Untersuchungsgruppen à 10 Tiere pro Gruppe:

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1. Kontrollgruppe

2. Endotoxingruppe:

LPS 10 mg/kg Körpergewicht (KG)

3. NAC/TM-Gruppe:

LPS 10 mg/kg KG

NAC 150 mg/kg KG und TM 10 mg/kg KG

3.3 Versuchsablauf

Der allgemeine Versuchsablauf wurde für alle Gruppen nach einem einheitlichen Versuchsprotokoll durchgeführt. Die gesamte Präparationsdauer betrug ca. 30 Minuten. Sie beinhaltete die Tracheotomie, das Einlegen der intravasalen Katheter in die Vena jugularis interna und Arteria carotis communis sowie die mediane Laparotomie. Danach wurde den Tieren eine Erholungsphase von 15 Minuten gewährt. Anschließend erfolgte die erste Intravitalmikroskopie mit Videoaufzeichnung. Danach wurde die Endotoxinämie durch Dauerinfusion von LPS über 2 h induziert. Weitere intravitalmikroskopische Untersuchungen folgten nach 60 und 120 Minuten. Die Applikation der Medikamente wurde nach 30 Minuten Endotoxinämie als Bolusinjektion vorgenommen. Die Zeitpunkte der Blutabnahmen sind aus der Abbildung 1 ersichtlich. Nach der letzten Blutabnahme wurde die Tiere mit einer intravenösen Gabe einer Überdosis Chloralhydrat (ca. 25 mg/kg KG) getötet.

Abbildung 2: Versuchsablauf

3.4 Narkoseführung und Monitoring

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Die Narkose wurde durch die intraperitoneale Applikation von Pentobarbital in einer Dosis von 60 mg/kg KG eingeleitet (Pentobarbital Natrium, Synopharm GmbH, Barsbüttel, Deutschland). Sie galt in Anlehnung an Ammons et al. und van Lambalgen et al. als adäquat, wenn weder ein Cornealreflex noch Beugereflexe auslösbar waren (4, 192). Überprüft wurde dies durch Betupfen der Cornea mit einem Wattestäbchen bzw. durch Kneifen in die Pfoten und den Schwanz. Bei Erreichen der gewünschten Narkosetiefe (ca. 10 Minuten nach Pentobarbitalapplikation) wurden die Tiere mittels Klebestreifen in Rückenlage an den Pfoten auf einer Wärmeplatte fixiert. Die Körpertemperatur wurde rektal kontinuierlich gemessen (Thermosonde, W 233, RFT, Strassfurt, Deutschland) und durch die Wärmeplatte bei 37,0 ± 0,5°C aufrechterhalten. Anschließend wurden die Tiere tracheotomiert und die Trachea mit einem Plastikröhrchen intubiert
(14G Braunüle, Braun, Melsungen, Deutschland), um Verlegungen der oberen Atemwege auszuschließen. Die Tiere atmeten weiter spontan Raumluft. Sowohl in die rechte Vena jugularis interna als auch in die rechte Arteria carotis communis wurden Polyethylenkatheter
(PE 50, ID 0,58 mm, OD 0,96 mm, Portex, Hythe, Kent, GB) eingebracht. Über den arteriellen Katheter erfolgte das kontinuierliche Monitoring des mittleren arteriellen Blutdruckes (MAP) und der Herzfrequenz (HF). Die Atemfrequenz (AF) wurde über den Monitor überwacht
(BMT Biomonitor 5231, Druckmesswandler W 112, RFT, Strassfurt, Deutschland). Über den zentralvenösen Zugang erhielten die Tiere eine an den Bedarf adaptierte Narkoseerhaltungsdosis von etwa 20 mg/kg KG/h Pentobarbital.

3.5 Operative Techniken

Alle Tiere jeder Gruppe wurden demselben Prozedere unterworfen. Die gesamte Präparationsdauer beginnend mit der Tracheotomie und endend mit der Katheterisierung dauerte ca. 30-40 Minuten.

Nach Rasur und Desinfektion im Bereich des Halses und des Abdomens wurde die Haut am Hals in der Mittellinie über 2 cm von kranial nach kaudal mit einem Elektrokauter (BCH 50, TUR, Dresden, Deutschland) inzidiert. Danach wurde die proximale Trachea dargestellt, mit einer Mikroschere ein ca. 2-3 mm großer Querschnitt unterhalb des 6.-8. Ringknorpels gesetzt und die Trachea wurde mit einem Kunststofftubus intubiert. Anschließend wurde zuerst die rechte
Vena jugularis interna dargestellt. Nach distaler Ligatur und proximaler Abklemmung des Gefäßes mittels Microclip erfolgte die Kathetereinlage in Venae-sectio-Technik, die Fixierung des Katheters mit Haltefäden und die Entfernung des Mikroclips. Danach wurde analog mit der rechten Arteria carotis communis verfahren. Abschließend wurde die Halswunde mit einer fortlaufenden Naht (Ethibond®, 3,5 metric, Ethicon, Norderstedt, Deutschland) verschlossen.

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Über den zentralvenösen Zugang erfolgten die Aufrechterhaltung der Narkose (mittlere Erhaltungsdosis von 6 mg/h Pentobarbital), sowie eine Volumensubstitution mit Vollelektrolytlösung (Thomaejonin®, Thomae, Biberach, Deutschland). Des Weiteren wurden sowohl die Kontrastmittel Fluoresceinisothiocyanat-(FITC) Albumin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland) und Rhodamin-6G (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland), als auch die Pharmaka N-Acetylcystein (Fluimucil Antidot®, Zambon GmbH, Kerpen, Deutschland) und Tirilazad Mesylat (Freedox®, Pharmacia & Upjohn AG, Dübendorf, Deutschland) über den zentralvenösen Zugang appliziert.

Für das Auslagern des Darmes wurde entlang der Linea alba ca. 1 cm substernal bis maximal zur Symphyse eine Längslaparotomie vorgenommen. Das Tier wurde in Seitenlage umgelagert und in no-touch-Technik ein ca. 4 cm langes Segment des präterminalen Ileums aufgesucht und auf eine spezielle Haltevorrichtung (Stage) ausgelagert. Zum Mikroskopieren diente ein Deckgläschen als transparente und plane Abdeckung (21x26 mm, Menzel-Gläser, Braunschweig, Deutschland). Nicht untersuchte ausgelagerte Darmabschnitte wurden mit einer befeuchteten Gaze abgedeckt und alle freiliegenden Mesenterium- und Darmabschnitte kontinuierlich mit einer auf 37°C aufgewärmten Thomaejonin®-Lösung superfundiert, um eine Exposition gegenüber Raumluft sowie eine Austrocknung zu vermeiden.

3.6 Endotoxinmodell

Die Endotoxinämie wurde mit 10 mg/kg KG LPS (E.coli, Serotyp O55:B5; Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland) per Dauerinfusion über den zentralnervösen Zugang induziert. Die Dauerinfusion erfolgte über 120 Minuten, beginnend nach der ersten
IVM-Untersuchung. Die Kontrollgruppe erhielt dementsprechend eine Volumensubstitution mit Vollelektrolytlösung (Thomaejonin®). 30 Minuten nach der ersten IVM erfolgte die Applikation der Medikamente bzw. des Placebos (physiologische Kochsalzlösung) in einem Bolus.

3.7 Intravitalmikroskopie

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Für die intravitalmikroskopische Untersuchung wurden folgende technische Hilfsmittel verwendet:

Mikroskopie:

Epifluoreszenzmikroskop Axiotech Vario, Carl-Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland

Lichtquelle:

HBO 50, Osram, Berlin, Deutschland

Okulare:

10x, Zeiss

Objektive:

40x/0,5, Achroplan, Zeiss

Filter:

Filtersatz Nr. 20, Zeiss, (Anregung: BP 546/12; Frequenzteiler: 560;

Emission: BP 575-640) für Beobachtung im Rhodamin-6G-Kontrast;

Filtersatz Nr. 10, Zeiss (Anregung: BP 450-490; Frequenzteiler: 510;

Emission: BP 515-565) für Beobachtung im FITC-Albumin-Kontrast

Videokamera:

Panasonic S-VHS, AG-7355 E, Matsushita Electric Ind. Co. Ltd., Tokio Japan

Videorecorder:

Panasonic S-VHS, AG-7355 E, Matsushita Electric Ind. Co. Ltd., Tokio Japan

Monitor:

TM-122EG, JVC, Tokyo, Japan

Video Timer:

For-A-Company, Tokyo, Japan, finale Monitorvergrößerung
250-500fach

Abbildung 3: Versuchsaufbau

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Nach dem Auffinden und der Fokussierung eines geeigneten Gefäßes im Mesenterium, das heißt einer Venole mit einem Durchmesser von 25-40 µm, wurden über den zentralvenösen Zugang einmalig 50 mg/kg KG 2,5% FITC-Albumin appliziert, um durch den resultierenden Helligkeitsunterschied zwischen dem Plasma und dem das Gefäß umgebenden Gewebe die mesenteriale Plasmaextravasation beurteilen zu können. Sofort nach der Gabe des
FITC-Albumins wurde ein Bolus von 0,1 ml Rhodamin-6G 0,05% ebenfalls über den zentralvenösen Zugang appliziert (0,1 ml vor der ersten IVM, 0,05 ml vor der zweiten und dritten IVM). Hiermit wurden die Leukozyten optimal markiert. Mit Hilfe des FITC-Filters wurde nach einer 10 minütigen Ruhe- und Einwirkpause von FITC-Albumin und Rhodamin-6G eine Videoaufzeichnung über 30 Sekunden vorgenommen. Ebenso erfolgte eine Videoaufzeichnung des entsprechenden Gefäßes mit Hilfe des Rhodamin-6G-Filters über
30 Sekunden. Die effektive Mirkroskopierzeit betrug für beide Aufnahmen insgesamt
ca. 15 Minuten. Es wurden für den Versuch insgesamt drei Videoaufzeichnungen mit beiden Filtern durchgeführt. Zur Überprüfung des kontinuierlichen Blutflusses im beobachteten Gefäß wurde während des gesamten Versuches das Gefäß jede halbe Stunde auf Thrombosierungen untersucht. Die Auswertung aller Videosequenzen erfolgte verblindet „off-line“ am Videomonitor und Computerarbeitsplatz.

3.7.1  Extravasation

Mit Hilfe von FITC-Albumin wurde das Plasma markiert. Dadurch stellte sich unter Blauanregung ein optimaler Helligkeitsunterschied zwischen dem Interstitium (dunkel) und den plasmadurchströmten Venolen (hell) dar und es konnten Rückschlüsse auf die Verschiebung des Plasmas in den Extravasalraum gezogen werden. Die auf videomikroskopisch aufgezeichneten Fluoreszenz-Bilder wurden digitalisiert und mittels computerunterstützter Analyse (CAPIMAGE, Ingeneurbüro Dr. Zeintl GmbH, Heidelberg, Deutschland) ausgewertet. Dabei wurde der Fluoreszenzintensität in den Venole und in den angrenzenden Gewebe vom Computer Grauwerte von 1 (schwarz, keine Fluoreszenz) bis 255 (weiß, maximale Fluoreszenz) zugeordnet. Es wurden zu jedem Messzeitpunkt 3 Messungen jeweils innerhalb der Venole (Iiv) und außerhalb im direkt angrenzenden Interstitium (Iev) vorgenommen. Die Werte wurden gemittelt und die Plasmaextravasation wurde definiert durch die Ratio Iev/Iiv.

3.7.2 Leukozyten-Endothel-Interaktion

Die Leukozyten wurden mit Rhodamin-6G markiert, und es wurden folgende Stadien der Leukozytenadhäsion ausgewertet:

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  1. Anzahl der temporär adhärenten Leukozyten, das heißt Leukozyten, die in einem vorgegebenen Zeitraum (30 Sekunden) den untersuchten Gefäßabschnitt mit einer typischen Geschwindigkeit von 50 µm/s passierten und somit aufgrund ihrer temporären Interaktion am Gefäßendothel entlang „rollten“ (Roller). Ermittelt wurde die Anzahl pro Minute, ausgedrückt als Roller-Flow (n/min).
  2. Anzahl der fest adhärente Leukozyten (Sticker), die, bezogen auf eine bestimmte Fläche, für mindestens 30 Sekunden am Gefäßendothel hafteten.

Für die Berechnung der Gefäßinnenfläche wurde von einer Zylinderstruktur des Gefäßes ausgegangen:

Zylinderfläche:

A = l*U (l= Länge des Gefäßes)

Zylinderumfang:

U = π*d (d= Durchmesser des Gefäßes)

Sticker pro Fläche:

= n/mm²

3.8 Laborparameter

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Alle Blutabnahmen erfolgten über den arteriellen Zugang. Für die Verlaufsbeurteilungen wurde Blut für unten aufgeführte Parameter zu folgenden Messzeitpunkten abgenommen:

3.8.1  Leukozytenzahl

Für die Bestimmung der Anzahl der Leukozyten wurde eine EDTA behandelte
Kunstoff-Kapillarpipette (Kabe, Labortechnik, Nümbrecht-Elsenroth, Deutschland) mit 50 µl Blut gefüllt und am Zellcounter ausgewertet (Zell-Counter: Technicon H*1, Bayer AG, Leverkusen, Deutschland). Die Eichung dieses Gerätes erfolgte gegen Standards von Paratech (Streck Laboratories, Inc., Omaha, USA). Die Messung erfolgte spätestens 12 Stunden nach Gewinnen der Probe und Aufbewahrung im Kühlschrank bei 4°C.

3.8.2 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10

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Für die Bestimmung der Plasmakonzentrationen von TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-10 wurde eine EDTA-Microvette (500KE, Ka-EDTA, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland) mit 500 µl Blut gefüllt, anschließend bei 6000 Umdrehungen/min 15 Minuten lang zentrifugiert (Tischzentrifuge, Janetzki TH 12, Janetzki, Ilmenau, Deutschland), der Plasmaüberstand (200 µl) abpipettiert und 1:1 mit 200 µl NaCl verdünnt. Die Proben wurden gleichmäßig auf
6 Eppendorfgefäße zu je 60 µl verteilt und bei -80°C bis zur weiteren Aufarbeitung eingefroren. Die Konzentrationsermittlung der oben angegebenen Parameter erfolgte mit Hilfe von standardisierten rattenspezifischen ELISA („Enzyme Linked Immuno Sorbent Assays“)- Kits (Quantikine Rat, R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstedt, Germany). Die Konzentrationswerte wurden auf Grund der Verdünnung (s.o) mit 2 multipliziert.

3.9 Statistische Methoden

Da kleine Fallzahlen, eine unregelmäßige Verteilung und Ausreißer vorlagen, wurden nichtparametrische Maßzahlen und Methoden zur Darstellung und Auswertung benutzt.

Das Signifikanzniveau wurde bei p<0,05 angesetzt. Da die p-Werte explorativ betrachtet wurden, war eine α-Adjustierung nicht notwendig.

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Um die Unterschiede zwischen den Gruppen und um Zeiteffekte zu untersuchen, wurde eine
2-faktorielle nichtparametrische Varianzanalyse für Daten mit Messwiederholung nach Brunner durchgeführt (Statistikprogramm SAS 8.2).

Gruppenvergleiche an bestimmten Zeitpunkten wurden mittels des Mann-Whitney-U-Testes, Unterschiede zwischen zwei Zeitpunkten innerhalb einer Gruppe mit dem Wilcoxon Test untersucht (Statistikpaket SPSS 10.0, SPSS Inc., Chicago, USA).

Die Darstellung der Daten erfolgte mit Hilfe der Statistikpakete SPSS 10.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) und SigmaPlot 5.0 (Systat Software Inc., Point Richmond, USA). Die Plasmaextravasation, die Leukozytenadhärenz und die Mediatoren sind in Form von Boxplots als Median mit der 25. und 75. Perzentile, Minimum und Maximum, Ausreißern (o), sowie Extremwerten (*) dargestellt. Die Vitalparameter (MAP, HF, AF) sind im Verlauf an sieben Messzeitpunkten als Median mit 25. und 75. Perzentile dargestellt.


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24.01.2007