Der Tierversuch ist ein unverzichtbares Bindeglied zwischen molekular- bzw. zellbiologischen Untersuchungen und klinischen Studien. Tierexperimente ermöglichen es, unter reproduzierbaren Verhältnissen kausale Untersuchungen am Gesamtorganismus durchzuführen. Dadurch können Pathomechanismen besser aufgeklärt und eventuell effektive Therapieformen entwickelt werden.

Die Schwierigkeit, ein geeignetes tierexperimentelles Sepsismodell zu entwickeln liegt darin, dass sich das klinische Bild, welches simuliert werden soll, als sehr komplex und mannigfaltig darstellt. Die Problematik bei der Definition der Krankheitsentität hat zwangsläufig auch Auswirkungen auf die Validität von Tiermodellen. Dazu kommen die allgemeinen Limitationen von Tierversuchen. Hierzu gehören neben speziesspezifischen Differenzen in anatomischen und metabolischen Merkmalen unterschiedliche Reaktionen auf exogene Noxen. Damit wird eine Übertragung der Tierversuchsergebnisse auf den Menschen oftmals kompliziert (42, 197).

In der Literatur werden im Wesentlichen 4 Tiermodelle benutzt, um pathophysiologisch der Sepsis ähnliche Veränderungen zu induzieren. Dies sind die Implantation von Fäkalien bzw. lebenden Organismen in den Peritonealraum, die Erzeugung von Abszessen, das Cecal Ligation and Puncture-Modell (CLP-Modell) und die intravenöse Applikation von lebenden Organismen oder Endotoxin (197).

Durch die Implantation von Fäkalien oder lebenden Organismen in den Peritonealraum kann eine sehr häufige Sepsisursache, eine Peritonitis, induziert werden. Dieses Modell zeichnet sich durch einen verzögerten Krankheitsverlauf aus. Es beginnt oft, wie beim Menschen, mit einer hyperdynamen Phase (3, 42).

Eine weitere Möglichkeit ein septisches Erkrankungsbild hervorzurufen, ist die Erzeugung eines Hautabszesses durch die Implantation von lebenden Organismen (z.B. Pseudomonas aeruginosa) in das Weichteilgewebe. Dieses Modell ist gut geeignet, die hyperdynamen Sepsisabläufe zu untersuchen (197).

Bei dem CLP-Modell wird das Zökum unterhalb der Ileozökalklappe ligiert und mit einer Nadel punktiert. Die aus dem künstlich erschaffenen Leck austretenden Darmkeime erzeugen eine Peritonitis. Die Entstehung der Sepsis-Symptomatik benötigt einen längeren Zeitraum und ähnelt so stark dem klinischen Verlauf (197).

Eine Vielzahl von Sepsismodellen beinhaltet die Applikation von LPS (57, 67, 177). Die Versuchsanordnung wird korrekterweise als Endotoxinämie bezeichnet. Alternativ können auch andere Toxine verabreicht werden. Die intraperitoneale Gabe von LPS unterscheidet sich klinisch nicht wesentlich von den oben beschriebenen intraperitonealen Infektionsmodellen. Je nach Dosis und Dauer der Applikation können akute oder chronische sepsisähnliche Zustände induziert werden. In vielen klinischen Studien konnte die Bedeutung der Endotoxinämie in der Pathophysiologie der Sepsis bestätigt werden. In einer Studie von Danner et al. wurde an
110 kritisch kranken Patienten der Gehalt an LPS im Blut untersucht. Eine Patientengruppe (Gruppe 1) hatte eine bewiesene oder vermutete Sepsis, die andere (Gruppe 2) einen Schock nicht septischer Genese. In den Blutproben von 43% der Patienten der Gruppe 1 und nur von 10% der Gruppe 2 wurde LPS gefunden (52). Weitere Hinweise für die pathophysiologische Bedeutung von LPS stammen aus Studien freiwilliger Probanden. Ihnen wurde 4 ng/kg KG LPS verabreicht. Sie entwickelten hämodynamische, hämatologische und metabolische Veränderungen, die in qualitativer Hinsicht auch bei septischen Patienten zu finden sind, wie z.B. Tachykardie, Blutdruckabfall, Fieber, Leukozytose, Lymphozytopenie und erhöhtes Herzzeitvolumen (161).

Als Quintessenz kann man feststellen, dass LPS eine Vielzahl von Pathomechanismen in Gang setzen kann, die letztendlich klinische Symptome, biochemische Veränderungen und Organdysfunktionen auslösen, die auch bei Sepsis zu beobachten sind (43, 155).

Das CLP-Modell wird von vielen Autoren, die sich mit experimentellen Sepsismodellen befassen, bevorzugt (68, 197). Der Vorteil dieses Modells liegt darin, dass die Entstehung der Sepsis-Symptomatik einen längeren Zeitraum benötigt und somit am ehesten das klinische Bild der Sepsis repräsentieren kann. Dadurch ergibt sich aber nachteilig eine längere Versuchszeit.

Die Ergebnisse sind nicht gut reproduzierbar, da die Quantität und die Art der freigesetzten, sepsisauslösenden Keime relativ schlecht definierbar sind (68).

Beim Endotoxinmodell wird die Art des Toxins vom Untersucher festgelegt. Die exakte Festlegung der Sepsis auslösenden Endotoxindosis und der exakt reproduzierbare Symptom-Zeitverlauf sind von Vorteil. Dosisabhängige laborchemische Veränderungen können, neben pathophysiologischen und klinischen Symptomen, bereits 30-45 Minuten nach Applikation des LPS beobachtet werden (198). Aufgrund dieser Vorzüge wird dieses Modell häufig in der Literatur verwendet (114, 173). Als Nachteil des Endotoxinmodells gilt die Tatsache, dass im Gegensatz zum CLP-Modell kein vollwertiges Bakterium als Agens dient. Daneben sind Sensitivitätsunterschiede verschiedener Tierspezies gegenüber Endotoxin und verschiedene Versuchsdesigns zu beachten (58, 67, 177, 203). In unserer Studie ließen uns die oben genannten Vorteile das Endotoxinmodell wählen.

Zu beachten ist, dass zwischen einzelnen Chargen desselben Serotyps von LPS Wirkungsunterschiede auftreten können (54). Daher verwendeten wir in unserer Studie ausschließlich das LPS von E.coli O111:B4. Dabei handelt es sich um einen häufig in der Literatur eingesetzten Serotyp (1, 40, 73, 89, 136, 166). Von wesentlicher Bedeutung ist, ob die Applikation im Bolus oder kontinuierlich erfolgte (197). Fink et al. beschrieben ein Kaninchenmodell mit intraperitonealer Bolusgabe von LPS im Bolus. Je nach Höhe der Dosis konnte das Bild eines hypo- bzw. hyperdynamen Stadiums der Sepsis beobachtet werden. Dabei induzierten niedrige Dosierungen (1,3 µg/kg KG) ein hyperdynames, hohe Dosierungen
(5 mg/kg KG) dagegen eher ein hypodynames Bild (68).

Die intravenöse Dauerinfusion von Endotoxin eignet sich am besten, kurzfristig verschiedene Sepsis-Phasen zu induzieren. Daher wählten auch wir diese Applikationsform. In geringer Dosierung kontinuierlich verabreicht ruft Endotoxin bei Ratten ein hyperdynames Sepsisbild hervor (41). Höhere Dosierungen (40 mg/kg KG) lösen ein hypodynames Bild mit erhöhten peripheren Widerständen und erniedrigten Herzzeitvolumina aus (103). Xu et al. beschrieben ein Endotoxinmodell, welches unserer Versuchsanordnung sehr ähnlich ist. Sie behandelten Ratten mit 5 mg/kg KG Endotoxin von E.coli O55:B5 und konnten einen Anstieg der Herzfrequenz bei unveränderten MAP beobachten. Das erhöhte Herzminutenvolumen eine Stunde nach Induktion der Endotoxinämie ließ sie auf ein hyperdynames Modell der Endotoxinämie schließen. Auf Grund der Vergleichbarkeit unserer Versuchsanordnung mit der von Xu et al. kann auch bei unserem Modell von einem hyperdynamen Kreislaufverhalten ausgegangen werden (198).

Daneben sind Leukozytopenie und Tachykardie Merkmale, die per definitionem zur Diagnose des SIRS herangezogen werden (34).

Der Darm nimmt eine Schlüsselrolle während der Sepsis ein (82). Der Verlust der Darmbarriere und die dadurch mögliche systemische Expansion von Bakterien, bzw. ihrer Toxine ist als „bakterielle Translokation“ definiert (19). Das Konzept der bakteriellen Translokation konnte in mehreren Studien bestätigt werden. Experimentell wurde dies unter anderem in traumaassoziierten Tiermodellen, wie dem hämorrhagischen Schock (13), der Verbrennungsverletzung (127, 128), nach Gabe von Endotoxin (143) oder dem Weichteiltrauma (56) nachgewiesen. Translozierte Bakterien bzw. ihre Produkte können in der Darmwand durch phagozytierende Zellen festgehalten werden und zu einer Aktivierung des GALT führen. Neben der Freisetzung von Zytokinen aus immunkompetenten Zellen im Bereich des Darmes findet eine lokale Aktivierung des humoralen Kaskadensystems bzw. phagozytärer Zellsysteme statt (82). Durch dieses positive Feedback, zusammen mit der primären Aktivierung des Immunsystems und dem gegebenenfalls beeinträchtigten Regulationsmechanismus schwerverletzter Patienten, kann es zu einer so genannten „Mediatorexplosion“ im Rahmen einer überschießenden inflammatorischen Reaktion kommen (55). Im Vordergrund unserer Untersuchung standen die Veränderungen der mesenterialen Mikrozirkulation, vor allem der endotoxininduzierten vermehrten
Leukozyten-Endothel-Interaktion und Extravasation.

Von erheblicher Bedeutung für die Untersuchung septischer Veränderungen im Tiermodell ist auch die Wahl des Narkoseverfahrens. Fentanyl und Ketamin beeinflussen laut Studien die Leukozyten-Endothel-Interaktion, im Gegensatz zu Pentobarbital (100, 170). Etabliert hat sich das Pentobarbital zur Narkoseführung bei Untersuchungen der Mikrozirkulation im Tiermodell (136, 147), welches auch in unserer Versuchsanordnung gewählt wurde.

Der Einfluss der Markersubstanzen, wie Rhodamin-6G und der Fluoreszenzmikroskopie wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Bei langen Bestrahlungen mit fluoreszierendem Licht und bei Langzeitinkubination mit Rhodamin kann es ebenfalls zur Beeinflussung der
Leukozyten-Endothel-Interaktion kommen. Zur von uns angewendeten Methodik (Fluoreszenzmikroskopie mit Rhodamin-6G) werden in der Literatur keine signifikante Veränderung der Leukozyten-Endothel-Interaktion angegeben (118, 148, 200).

Die Erhöhung der mikrovaskulären Permeabilität („capillary-leak-Syndrome“) ist ein Kennzeichen der frühen Gewebeschädigung in der Sepsis. Sie wird durch inflammatorische Stimuli mediatorabhängig mehr oder weniger schnell und stark ausgelöst. Aus der erhöhten Wandpermeabilität des Endotheles resultieren eine Extravasation von Plasma und ein erhöhter Lymphabfluss in das Interstitium. Wenn die Transportkapazität der Lymphgefäße überschritten wird, kommt es zu einem Rückstau und konsekutiv zu einem Ödem. Dieses stellt einen frühen Indikator der Organdysfunktion dar und geht dem Organversagen voraus. Obwohl während Endotoxinämie die Extravasation in allen Geweben auftreten kann, wird der Gastrointestinaltrakt, hier vor allem der Dünndarm, als Hauptort dieses Prozesses angesehen (193). Das Ausmaß der Extravasation hängt dabei von der Gefäßoberfläche, der Wandpermeabilität und dem intravasalen Druck ab. Das Stromgebiet der postkapillären Venolen ist die Lokalisation mit der am stärksten ausgeprägten Permeabilität (181, 199).

Inwieweit eine gesteigerte Adhärenz der Leukozyten im Rahmen der Endotoxinämie einen Anstieg der Extravasation zu Folge haben kann, wird in der Literatur unterschiedlich beurteilt. Zum einen wurde berichtet, dass die Zunahme der Plasmaextravasation, wie sie z.B. nach Leukotrien-B4- oder LPS-Stimulation zu beobachten war, durch experimentelle Neutropenie vermieden werden konnte (199). Afors et al. beschrieben, dass monoklonale Antikörper gegen CD18 die Leukozytenadhärenz und damit die Extravasation reduzieren konnten (88). Zum anderen berichteten Kubes et al., dass unter dem Einfluss von LTB4 (Leukotrien B4) und PAF ein Anstieg der Leukozytenadhärenz stattfand, aber nur unter PAF auch eine Erhöhung der Extravasation nachweisbar war (113). Man vermutet, dass für die Erhöhung der Plasmaextravasation postkapillärer Venolen während Endotoxinämie sowohl leukozytenabhängige Mechanismen existieren, als auch Mediatoren, die direkt am Endothel eine erhöhte Permeabilität verursachen. Diese Annahme wird auch durch unsere Ergebnisse unterstützt, da der Einsatz von NAC und TM eine Leukozytenadhärenz wirksam verringern konnte, es aber dennoch zu einer tendenziell erhöhten Endotoxin-induzierten Extravasation kam.

Im Rahmen unserer Studie konnte das Ausmaß der Extravasation durch Zunahme der Fluoreszenzaktivität im Interstitium untersucht werden. In allen Versuchsgruppen kam es zu einer tendenziellen Erhöhung der Extravasation, also auch bei der Kontrollgruppe. Signifikante Erhöhungen lagen allerdings in keiner der Gruppen vor.

In der Literatur wurde von einigen Arbeitsgruppen an Ratten ein Anstieg der Extravasation durch intravenös oder topisch appliziertes Endotoxin beschrieben (181, 193, 199). Dies war bei uns nur tendenziell der Fall, allerdings ebenfalls in der NAC/TM- und der Kontrollgruppe. Schmidt et al. beschrieben in intravitalmikroskopischen Studien an Ratten, deren Methodik der unsrigen glichen, dass 150 mg/kg KG NAC die endotoxininduzierte Extravasation mesenterialer Venolen abschwächen kann (172, 176). Eine weitere Untersuchung an endotoxämischen Ratten von Schmidt et al. beschrieb, dass die Gabe von 10 mg/kg KG TM keinen Einfluss auf die endotoxininduzierte Plasmaextravasation hat (171). Allerdings erhielten die Tiere zur Induktion der Endotoxinämie nur 2 mg/kg/h KG LPS (172, 176).

In unserer Versuchsanordnung erhielten die Tiere die 5fache Endotoxindosis, was eventuell die abweichenden Ergebnisse erklären könnte. Um unsere tendenziellen Ergebnisse zu bestätigen, dass NAC in Kombination mit TM die Extravasation verringern kann, müssten weitere Untersuchungen, gegebenenfalls mit einer geringeren Endotoxindosis, folgen.

Beide von uns eingesetzte Substanzen sind Antioxidantien und wirken einer Gewebsschädigung durch Sauerstoffradikale entgegen. TM hemmt die Lipidoxidation und wirkt somit direkt membranstabilisierend am Endothel (46). Dadurch kann die Plasmaextravasation vermindert werden. NAC ist ein so genannter Radikalfänger, hebt den endogenen Antioxidantienstatus, verringert somit oxidative Gewebezerstörung und hemmt zusätzlich oxidierende Enzyme. Dadurch kann das Endothel ebenfalls vor Membranschädigung geschützt werden (172). Diese Eigenschaften könnten den Einsatz der beiden Substanzen zu einer sinnvollen Therapie der erhöhten Plasmaextravasation bei Sepsis machen.

Der Begriff der Leukozyten-Endothel-Interaktion fasst eine Sequenz von Vorgängen zusammen. Beginnend mit der Margination der Leukozyten aus der Blutstrommitte über das temporäre Interagieren der Leukozyten mit dem Endothel (Rolling) und die anschließende feste Adhärenz der Leukozyten am Endothel (Sticking) führen diese Interaktionen schließlich zur Diapedese der Leukozyten (122). Der erste Vorgang kommt durch den hämodynamischen Effekt zu Stande. Die weiteren Vorgänge sind mediatorabhängig, das heißt, aktiviertes Endothel und Leukozyten beeinflussen sich gegenseitig. Aktivierte neutrophile Granulozyten setzten eine Reihe von Mediatoren frei (z.B. Sauerstoffradikale, Elastase, Kollagenasen, Myeloperoxidasen), die das Endothel angreifen, die Gefäßpermeabilität erhöhen und weiter Kaskadensysteme aktivieren
(88, 190, 194).

Definitionsgemäß zählen die Leukozytopenie (<4000/ml) oder die Leukozytose (>12000/ml) zu den Markern der Sepsis. Bei experimentellen Modellen mit LPS-Applikation kommt es in der Regel zunächst zu einer ausgeprägten Leukozytopenie (10, 16, 81). Sie gilt als ein Indikator für die Sepsis-Induktion (169). Diesem initialen Leukozytensturz kann sich infolge der Freisetzung von Leukozyten aus dem Knochenmark bei längerer Beobachtungszeit eine reaktive Leukozytose anschließen. Als Ursache für die passagere Leukozytopenie wird die endotoxininduzierte Leukozytenadhärenz in der Endstrombahn verschiedener Organe angenommen. Die Anzahl der im peripheren Blut vorhandenen Leukozyten repräsentiert ein Gleichgewicht zwischen jeweils neu gebildeten und den in der Mikrozirkulation adhärenten Leukozyten (16).

In unserer Untersuchung nahm die Zahl der Leukozyten im peripheren Blut bei der Endotoxingruppe ab. Das korreliert mit unseren intravitalmikroskopischen Untersuchungen, in denen die Zahl der fest adhärenten Leukozyten zunahm. Auch Schmidt et al. untersuchten an Ratten den Einfluss von LPS auf die Leukozyten-Endothel-Interaktion und bestimmten die Anzahl der Leukozyten im Blut. Sie verzeichneten eine signifikante Abnahme der Leukozytenzahl im Blut und eine signifikante Zunahme der adhärenten Leukozyten (172, 174). In der NAC/TM-Gruppe kam es ebenfalls zu einem Abfall der Leukozytenzahl im Blut. Jedoch konnten wir in dieser Gruppe intravitalmikroskopisch keinen Anstieg der Anzahl der fest adhärenten Leukozyten beobachten. Eine Erklärung dafür wäre, dass die beobachtete Reduktion der festen Adhärenz der Leukozyten durch NAC/TM nur an mesenterialen Venolen untersucht wurde, so dass eine unvermindert gesteigerte Adhärenz, z.B. in den Gefäßen der Lungenstrombahn, nicht auszuschließen ist. Daneben könnte es sein, dass zu dem Zeitpunkt der Untersuchung die Leukozyten bereits extravasiert waren.

Der Anstieg der Leukozytenzahl in der Kontrollgruppe nach 90 Minuten Versuchsdauer findet seine Erklärung darin, dass bereits die Traumatisierung durch den operativen Eingriff das Immunsystem der Ratten aktiviert. Der Stress, der für den Organismus trotz supportiver Maßnahmen und Narkose entsteht, führt zu einer vermehrten Freisetzung von Leukozyten
z.B. aus den Lymphknoten, der Milz und dem Knochenmark. Jedoch ist diese Freisetzung aus den Leukozytenreservoiren begrenzt und führt nach längerer Versuchsdauer zunächst wieder zu einem Abfall der Leukozytenzahl im peripheren Blut, die Zellen migrieren für die Abwehrreaktion in das Gewebe.

TNF-α gilt als initialer Mediator im septischen Geschehen, da die TNF-α-Konzentrationen bereits wenige Minuten nach Beginn des Infektions- und Sepsisgeschehens dramatisch ansteigen. TNF-α triggert u.a. die Produktion und Ausschüttung der proinflammatorisch wirkenden Zytokine IL-1β, IL-6 und IL-8. Dies ist auch deutlich an unseren Ergebnissen der IL-1β- und der IL-6-Konzentrationen bei Endotoxinämie erkennbar.

TNF-α steigert außerdem die Adhärenz von PMNL an Endothelzellen durch granulozytäre und endotheliale Reaktionen und erhöht die Diapedese dieser Zellen durch das Endothel in umliegendes Gewebe. Eine Vielzahl von sekundär inflammatorischen Mediatoren, wie z.B. reaktive Sauerstoffspezies, werden durch TNF-α induziert (33, 75, 146). TNF-α hat eine relativ kurze Halbwertszeit und ist in seiner bioaktiven Form nur in einem kleinen diagnostischen Fenster nachweisbar (180). Für experimentelle Belange ist TNF-α jedoch ein idealer Indikator für die Sepsisinduktion und die Untersuchung einer antiinflammatorischen Therapie.

In unserem Versuchsmodell fanden wir nach 90 Minuten Endotoxinämie mit 10 mg/kg KG LPS TNF-α-Spitzenspiegel von ca. 1000 pg/ml in der Endotoxingruppe. Der Ausgangsspiegel von TNF-α lag in dieser Gruppe zum Messzeitpunkt 0 Stunden bei ca. 10 pg/ml. Das Ausmaß der TNF-α-Freisetzung nach LPS-Stimulation ist mit Ergebnissen anderer Autoren vergleichbar, die einen ca. 100fachen Anstieg der TNF-α-Konzentration beschrieben (12, 102). Boillot et al. beschrieben an Ratten in Folge einer Endotoxingabe von 50 mg/kg KG nach 60 Minuten einen Spitzenspiegel von 3000 pg/ml. Die Ausgangsspiegel lagen in dieser Untersuchung unter der Nachweisgrenze (28).

In der Kontrollgruppe war in unserem Versuch nur ein leichter Anstieg der
TNF-α-Konzentrationen auf ca. 80 pg/ml zu beobachten. Ähnliche Werte wurden bei gesunden menschlichen Versuchspersonen gefunden (153). Man kann davon ausgehen, dass unsere invasive Methodik (Gefäßpräparation, Laparotomie und Darmmanipulation) Einfluss auf die TNF-α-Spiegel im Sinne einer operativ induzierten Inflammationsreaktion hatte. Die endotoxinbedingte Sensibilität des TNF-α konnte jedoch trotzdem bestätigt werden.

Die Werte der NAC/TM-Gruppe lagen tendenziell unter denen der Endotoxingruppe bei
ca. 500 pg/ml. Zhang et al. beobachteten an Hunden unter Endotoxinämie von 2 mg/kg KG durch die Behandlung mit 150 mg/kg NAC signifikant erniedrigte TNF-α-Konzentrationen von 0,14 ng/ml vs. 1,21 ng/ml in der Kontrollgruppe (203). Auch für Tirilizad Mesylat wurde in verschieden Studien an Hunden und Kälbern eine Verringerung der TNF-α-Freisetzung beschrieben (182, 202). In klinischen Studien wurde dagegen berichtet, dass NAC und TM keinen Einfluss auf die sepsisbedingte Erhöhung der TNF-α-Konzentrationen der Patienten hatte. Eine klinische Studie von Spapen et al. an septischen Patienten konnte durch die Gabe von
150 mg/kg KG NAC keine signifikanten Verringerungen der erhöhten TNF-α-Konzentrationen nachweisen (185). In einer anderen klinischen Studie über den Einfluss von TM auf die
TNF-α-Spiegel nach koronarer Bypassoperation konnte ebenfalls keine Verringerung der inflammatorisch bedingten erhöhten TNF-α-Konzentrationen festgestellt werden (62).

Eventuell könnte sich auch klinisch die kombinierte Gabe der beiden Antioxidantien NAC und TM durch die unterschiedlichen Wirkmechanismen, die sich in ihrer kombinierten Gabe ergänzen, als protektiv in Bezug auf erhöhte TNF-α-Konzentrationen und deren Folgen herausstellen. NAC hat als Substrat der Gluthathionsynthese wichtige antioxidative Eigenschaften. Durch die Auffüllung intrazellulärer Gluthathionspiegel kommt es zu einer Radikalfängerwirkung. Freie Sauerstoffradikale und der Verbrauch der Glutathionvorräte führen zu einer erhöhten Freisetzung von TNF-α, welches wiederum die intrazellulären Gluthathionspiegel erniedrigt. Dieser circulus vitiosus kann durch NAC durchbrochen werden (14). Die Wirkung des TM kann ebenfalls auf seine Stellung als Radikalfänger zurückgeführt werden.

TNF-α induziert u.a. die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κb. Dieser Faktor bewirkt in Endothelzellen und Leukozyten eine Expression weiterer Zytokine, insbesondere auch von Adhäsionsmolekülen. Dies führt zur verstärkten Leukozytenadhärenz am Endothel (27). Wie bereits oben diskutiert, verringerte NAC in der Kombination mit TM in unserem Versuch die feste Leukozytenadhärenz signifikant im Vergleich zur Endotoxingruppe.

Die geringeren TNF-α-Spiegel in der NAC/TM-Gruppe könnten diesen Effekt direkt erklären. Weniger TNF-α induziert weniger NF-κb und somit kommt es zu einer geringeren Expression von Adhäsionsmolekülen und damit zu einer geringeren Leukozyten-Endothel-Interaktion. Daneben können die erhöhten Spiegel von IL-10 in unserer NAC/TM-Gruppe mit der verringerten Freisetzung von TNF-α in dieser Gruppe in Zusammenhang gebracht werden, da
IL-10 die Freisetzung von TNF-α hemmt (180).

Die nach 90 Minuten bis 180 Minuten wieder stark abfallenden TNF-α-Konzentrationen in den mit LPS behandelten Gruppen lässt sich durch die kurze Halbwertszeit des TNF-α erklären, da die LPS-Infusion nach 120 Minuten gestoppt wurde und somit die Induktion der
TNF-α-Produktion bzw. die Freisetzung durch den Endotoxin-Trigger wegfiel.

IL-1β gehört wie TNF-α zu den ersten Mediatoren, die während der Sepsis in erhöhten Konzentrationen auftreten. Gemeinsame Wirkungen sind z.B. eine Stimulierung der Lymphozytenproliferation, Fieber und die Produktion von IL-6 und IL-8 (25). Daneben fördern diese beiden Zytokine die Expression von Adhäsionsmolekülen auf Zelloberflächen. Im peripheren Gefäßbett wird durch IL-1β die Synthese sekundärer Mediatoren wie PAF, Prostaglandinderivate und Nitridoxid induziert (61). IL-1β kann beim Zelluntergang in erhöhter Konzentration im Serum gemessen werden und hat wie TNF-α nur eine kurze Halbwertszeit von 6-10 Minuten. An gesunden Probanden konnten nach Infusion von Endotoxin erhöhte Konzentrationen von IL-1β gemessen werden, die allerdings unter denen von TNF-α lagen (47). IL-1β spielt wie TNF-α eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der gestörten Mikrozirkulation während der Sepsis.

So konnten Yi et al. in einem Versuch an Ratten nachweisen, dass jeweils durch die Applikation von LPS, IL-1β und TNF-α in den Musculus abdominis rectus eine erhöhte Gefäßpermeabilität mit konsekutiver Ödembildung sowie eine erhöhte Diapedese von Neutrophilen in das Gewebe auftraten (199).

In unserer Untersuchung kam es zu einem signifikanten Anstieg der IL-1β-Konzentrationen in den mit LPS behandelten Gruppen, während in der Kontrolle keine Veränderungen der
IL-1β-Konzentrationen zu verzeichnen waren. Die Antioxidantien NAC und TM hatten keinen Einfluss auf die erhöhte IL-1β-Synthese bei Endotoxinämie. In der Literatur gibt es keine vergleichbaren Studien, allerdings konnte durch die Gabe von NAC in einer
In-vitro-Untersuchung von mononukleären Zellen die LPS induzierte Produktion von IL-1β signifikant verringert werden (158). Untersuchungen mit TM in Bezug auf LPS induzierte
IL-1β-Produktion liegen in der Literatur nicht vor.

Der Blutspiegel von IL-6 korreliert beim septischen Schock mit der Prognose der Patienten und eignet sich als Marker für den Schweregrad der Erkrankung (33, 163, 189). IL-6 ist durch seine proinflammatorische Wirkung für die klinischen Zeichen der SIRS mit verantwortlich (33). In unserer Studie zeigte sich nach 1,5 Stunden in allen LPS behandelten Gruppen ein signifikanter Anstieg der IL-6-Konzentrationen im Serum der Ratten. Dies wird in der Literatur bestätigt, nach der Endotoxin die Bildung von IL-6 in Monozyten, Endothelzellen, Fibroblasten stimuliert
(25, 180). Zum Messzeitpunkt 0 Stunden unseres Versuches lagen die IL-6-Spiegel bei allen Gruppen durchschnittlich bei 37 pg/ml. Im Laufe des Versuches stiegen die IL-6-Spiegel in der Kontrollgruppe auf bis zu 128 pg/ml an, während sich die IL-6-Spiegel in der Endotoxin- und der NAC/TM-Gruppe auf ca. 5500-7700 pg/ml erhöhten. Der IL-6-Anstieg in der Kontrollgruppe kann auf das Trauma durch die Präparation an Gefäßen und Darm zurückgeführt werden. Jedes Trauma kann zu einer vermehrten Ausschüttung von IL-6 führen, die mit dem Ausmaß des Gewebetraumas korreliert (51, 149). Der erheblichere Anstieg der IL-6-Konzentrationen in den mit LPS behandelten Gruppen ist somit durch die Endotoxinämie bedingt. Kuhns, Alvord und Gallin stellten nach i.v. Injektion von Endotoxin bei gesunden Probanden einen IL-6-Peak nach 4 Stunden fest, während der von TNF-α bereits nach 1,5-2 Stunden auftrat (115).

Auch in unserer Versuchsanordnung scheint der IL-6-Peak erst zum späteren Zeitpunkt aufzutreten, da am Messzeitpunkt 3 Stunden die TNF-α-Konzentrationen im Vergleich zu den
IL-6-Konzentrationen wieder deutlich abgefallen waren, während die IL-6-Spiegel am Messzeitpunkt 3 Stunden weiter deutlich erhöht blieben.

NAC und TM hatten in unserer Studie keinen Einfluss auf die vermehrte Produktion von IL-6. Unserer Versuchsanordnung ähnelnde Studien liegen in der Literatur nicht vor. Allerdings ergab eine klinische Studie von Spapen et al. an septischen Patienten, dass NAC keinen signifikanten Effekt auf die sepsisbedingte erhöhte Plasmakonzentration von IL-6 hatte (185). In einer anderen Untersuchung des Einflusses von TM auf die IL-6-Spiegel nach koronarer Bypassoperation konnte ebenfalls keine Verringerung der erhöhten Il-6-Konzentrationen festgestellt werden (62).

Auf der Oberfläche von PMNL verursacht IL-6 eine vermehrte Expression von Adhäsionsmolekülen, die zur Migration der Leukozyten in das entzündete Gewebe führen (183). Die Stimulation von Endothelzellen durch IL-6 induziert eine Expression von spezifischen endothelialen Adhäsionsmolekülen (132). In unserer Studie war die Anzahl der fest adhärenten Sticker in der NAC/TM-Gruppe im Vergleich zu der Endotoxingruppe signifikant geringer. Allerdings waren die IL-6-Spiegel in der NAC/TM-Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe signifikant erhöht. Somit schienen in der NAC/TM-Gruppe die beiden Antioxidantien trotz erhöhter IL-6-Spiegel die Leukozyten-Endothel-Interaktion verringern zu können. Ein ähnliches Ergebnis wurde bereits in 5.4.3 bezüglich IL-1β diskutiert.

IL-10 wirkt als antiinflammatorischer Mediator, indem es die Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine, vor allem von TNF-α und IL-1, aus Monozyten und Makrophagen hemmt (180). In unserer Untersuchung stieg die Konzentration von IL-10 in der Kontrollgruppe zwar signifikant an, lag aber im Vergleich zu den mit LPS behandelten Gruppen signifikant niedriger als diese. In der NAC/TM-Gruppe dagegen kam es nach 90 Minuten zu einem signifikanten Anstieg der IL-10-Spiegel von ca. 14 pg/ml auf 300 pg/ml. Auch in der Endotoxingruppe kam es nach 90 Minuten zu einem signifikanten Anstieg der IL-10-Spiegel von ca. 6 pg/ml auf ca. 223 pg/ml. Zum Messzeitpunkt 3 Stunden lagen in den mit LPS behandelten Gruppen signifikant höhere IL-10-Spiegel im Vergleich zur Kontrollgruppe vor.

In der Literatur existieren keine vergleichbaren Studien zu IL-10-Spiegeln während Endotoxinämie bei Ratten. IL-10 ist einer der ersten antiinflammatorischen Mediatoren, deren Spiegel während der Sepsis im Serum erhöht sind (180). Dies korreliert mit unserem Ergebnis. In der NAC/TM-Gruppe waren tendenziell höhere IL-10-Spiegel als in der Endotoxingruppe messbar, was mit der in 5.4.2 diskutierten, tendenziell verringerten TNF-α-Produktion in der NAC/TM-Gruppe gut korreliert.

Der septische Schock ist durch Hypotonie definiert, bei der trotz angemessener Volumensubstitution die hypotensive Kreislauflage nur durch vasokonstriktive Substanzen adäquat behandelt werden kann (34).

Die Veränderungen der Mikrozirkulation sind durch pathologische Vasodilatation in Kombination mit Gebieten unzureichender Vasokonstriktion charakterisiert.

Sepsismediatoren, wie z.B. TNF-α und IL-1 wirken dabei vasodilatorisch, während Substanzen wie Noradrenalin und Leukotriene vasokonstriktorische Funktionen einnehmen (74, 95).

In unserer Untersuchung kam es eine halbe Stunde nach Beginn der LPS-Applikation in den mit LPS behandelten Gruppen zu einem tendenziellen Abfall des mittleren arteriellen Blutdruckes. Allerdings fand sich in diesen beiden Gruppen auch ein niedrigerer Ausgangs-MAP im Vergleich zur Kontrollgruppe. Der MAP blieb in den mit Endotoxin behandelten Gruppen nach dem initialen Abfall konstant bei 110 mmHg. In der Kontrollgruppe lag der MAP bis zur 90. Minute tendenziell höher bei ca. 130 mmHg.

Ein Einfluss der von uns eingesetzten Antioxidantien auf Veränderungen der Hämodynamik war primär nicht zu erwarten. In der Literatur existieren unterschiedliche Beobachtungen hinsichtlich des Einflusses der Antioxidantien auf die Hämodynamik. Zhang et al. konnten an Hunden bei Endotoxinämie einen positiven Effekt von Tirilazad Mesylat auf den MAP feststellen (202), nicht aber für NAC (204). McKechnie et al. untersuchten an Ratten den Einfluss von
Alpha-Tocopherol, reduziertem Glutathion, Allopurinol und SOD auf die metabolischen und kardiovaskulären Reaktionen nach Endotoxingabe. Keine der eingesetzten Substanzen hatte einen signifikanten Einfluss auf die Hypotension (134).

Festzuhalten bleibt, dass sich die Gruppen in Bezug auf die Makrohämodynamik zum Zeitpunkt der Mikroskopie nicht signifikant voneinander unterschieden. Somit sind die Ergebnisse der Untersuchung der Leukozyten-Endothel-Interaktion nicht durch die Hämodynamik beeinflusst.

Ein Definitionskriterium für die SIRS bzw. Sepsis ist ein Anstieg der Herzfrequenz beim Menschen über 90 Schläge pro Minute (34). Veränderungen der Herzfrequenz, wie auch des mittleren arteriellen Blutdruckes, dienen in unserem Modell auch als Kontrolle der Induktion einer Endotoxinämie.

Wie auch diverse andere Untersuchungen unter Anwendung einer ähnlichen LPS-Dosis stellten auch wir einen Herzfrequenzanstieg nach dem Beginn der LPS-Applikation fest (16, 198). Alle mit LPS behandelten Gruppen zeigten 90 Minuten nach Beginn der Endotoxinämie einen Anstieg der Herzfrequenz auf ca. 390/min. Dabei hatte die NAC/TM-Gruppe zum Messzeitpunkt 0 Stunden einen niedrigeren Ausgangswert der Herzfrequenz gegenüber der Kontroll- und Endotoxingruppe. Nach 30 Minuten Endotoxinämie war ein starker Herzfrequenzanstieg von
ca. 330/min auf 370/min zu beobachten. Die Herzfrequenz der Kontrollgruppe blieb ab Versuchsbeginn stabil bei etwa 360/min, fiel allerdings nach 120 Minuten Versuchsdauer auf 330/min ab.

Xu et al. beschrieben an Ratten unter Endotoxinämie (5 mg/kg KG LPS) einen Anstieg der Herzfrequenz und ein erhöhtes Herzminutenvolumen und zeigten somit, dass eine hyperdyname Kreislauflage bestand (198). Bei der Applikation höherer Dosen von LPS - bis zu
40 mg/kg KG - in Bolusform kommt es in der Regel zu einer hypodynamen Kreislaufsituation (41, 170). Bei geringeren Bolusgaben stellt sich zunächst ein initial hyperdynames Kreislaufbild ein, welches erst nach mehr als 4 Stunden in eine hypodyname Phase übergeht (169).

Bezüglich unserer beiden eingesetzten Antioxidantien ließ sich keine Veränderung der Herzfrequenz im Vergleich zur Endotoxingruppe feststellen und war auch nicht in der Literatur beschrieben. Vielmehr diente auch dieser Parameter der Überprüfung der Sepsisinduktion durch Endotoxin.

Unter septischen Bedingungen kommt es häufig zu einer akuten respiratorischen Insuffizienz. Die Leukozyten-Endothel-Interaktion führt zu Veränderungen in der pulmonalen Mikrozirkulation. Perfusionsstörungen und Störungen im alveolar-kapillären Gasaustausch treten auf. Dadurch sinkt die Compliance der Lunge, und die zu leistende Atemarbeit steigt an (190).

Tachypnoe und Hypokapnie sind frühe klinische Zeichen weitere Kriterien für die Sepsisdefinition (38). Normalerweise wird der in der Sepsis anfallende Überschuss saurer Metabolite dadurch respiratorisch reguliert und ausgeglichen.

In dieser Arbeit wurde lediglich die Atemfrequenz untersucht, bei der sich weder in der
Kontroll- noch in den Medikamentengruppen signifikante Veränderungen der Atemfrequenz ergaben. Aufgrund starker Schwankungen der Atemfrequenz in allen Versuchsgruppen über den Versuchszeitraum lassen sich keine konkreten Aussagen formulieren. In der Literatur liegen keine vergleichbaren Untersuchungen vor.