MATERIAL UND METHODEN

Versuchstiere

Männliche pigmentierte Kaninchen mit einem Gewicht von 1,0-1,5 kg (4 - 6 Wochen alt) wurden von der Firma Charles River Deutschland GmbH (Kißlegg) erworben. Die Tierhaltung und Handhabung war standardisiert und richtete sich nach den Anforderungen des Deutschen Tierschutzgesetzes (12 Stunden Tag/Nacht-Rhythmus, freier Zugang zu Wasser und Futter, etc.). Die Durchführung der Versuche wurde von der zuständigen Behörde des Landes Berlin genehmigt.

Entnommene Gewebe und Flüssigkeiten

Kornea

Konjunktiva

Sklera

Retina

Iris-Ziliarkörper

Kammerwasser

Glaskörper

Plasma

Materialien, Chemikalien, Medikamente

Materialien:

Sterile Einmal-Insulin-Kanülen (Sterican®) 0,45 x 12mm

B.Braun, Melsungen AG

Sterile Einmal-Injektions-Kanülen (Sterican®) 0,90 x 40m

B.Braun, Melsungen AG

Sterile Feindosierungsspritze (Omnifix®) 1ml

B.Braun, Melsungen AG

Sterile Einmalspritzen 5ml

B.Braun, Melsungen AG

Reaktionsgefäße 1,5 ml

Eppendorf, Hamburg

Chemikalien und Medikamente zur Herstellung der Augentropfen:

Thalidomid Racemat

Firma Grünenthal GmbH, Stolberg

Medikamente und Chemikalien zur Behandlung der Versuchstiere:

Xylazinhydrochlorid (Rompun®) 2%

Bayer AG, Leverkusen

Chemikalien für die mobile Phase für HPLC:

Acetonitril (HPLC grade)

J.T. Baker, Deventer, Niederlande

Puffer: (20 ° C)

Phosphat-Pufferlösung pH 5,5 und ph 2,0

Ph.Eur.1997

Citrat-Pufferlösung pH 4,0

Caelo, Hilden

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Synopharma, Barsbüttel

Geräte

Analysenwaage

Nagema, VEB Großwaagen, Berlin

Herstellung der Augentropfen

Die verwendeten Augentropfen wurden vor der Anwendung frisch und unter aseptischen Arbeitsbedingungen hergestellt.

Thalidomid-Suspension (THA-SP)

g/100g

Medikament Thalidomid-Racemat

0,04

Stabilisator

Hydroxypropyl methylcellulose (Pharmacoat 606®)

0,50

Natriumchlorid

0,90

Salzsäure (0,01N) (→ pH 4,5)

q.s. (so viel wie nötig)

Konservierung

Benzalkoniumchlorid-Lösung 0,1%

10,0

Steriles Wasser für Injektion ad

100,00

Thalidomid-Cyclodextrin (THA-CD)

g/100g

Medikament Thalidomid-Racemat

0,04

Stabilisator

Hydroxypropyl-ß-cyclodextrin

12,50

Natriumchlorid

0,34

Salzsäure (0,01N) (→ pH 4,5)

q.s. (so viel wie nötig)

Konservierung

Benzalkoniumchlorid-Lösung 0,1%

10,0

Steriles Wasser für Injektion ad

100,00

12,50 g HP-ß-CD und 0,34 g NaCl wurden mit 10,00 g (0,1% BAC-Stammlösung) versetzt. Anschließend wurde 67,16 g Wasser für Injektionszwecke dazu gegeben und mittels Magnetrührer gerührt bis zur Lösung aller Feststoffe. Die Hälfte der Lösung (45g) wurden mit HCL (0,01 mmol⋅l-1) auf einen pH-Wert von ca. 4,5 eingestellt und mit 5,0 g Wasser aufgefüllt. Im Anschluß wurde die Lösung in eine Spritze aufgezogen und durch einen 0,2 μm Sterilfilter in sterile Augentropfenflaschen filtriert. (CD sine)

0,04 g THA wurde zur anderen Hälfte der CD Lösung dazugegeben und für 1,5 h mittels Magnetrührer gerührt. Der pH-Wert wurden mit HCL (0,01 mmol⋅l-1) auf einen pH-Wert von ca. 4,5 eingestellt. 4,96 g Wasser wurden zugesetzt und ungelöste THA Anteile wurden abfiltriert. Anschließend wurde die Lösung in sterile Endbehälter abgefüllt. (THA-CD)

0,50 g HPMC und 0,90 g NaCl wurden mit 10.00 g (0,1% BAC-Stammlösung) versetzt. 78,60 g Wasser wurden zugesetzt und die Lösung wurde bei 121°C bei 2 bar über 15 Minuten dampfsterilisiert. Die eine Hälfte der Lösung wurde mit HCL (0,01 mmol⋅l-1) auf einen pH-Wert von ca. 4,5 eingestellt und mit 5,0 g Wasser aufgefüllt. Jeweils 10 g der Lösung wurde in eine Augentropfenflasche abgefüllt. (SP sine).

0,04 g THA wurde gemeinsam mit der anderen Hälfte der Lösung auf einem Glasmörser in kleine Anteile verrieben und vorsichtig suspendiert. Der pH-Wert wurde mittels HCL (0,01 mmol⋅l-1) auf ca. 4,5 eingestellt. Anschließend wurde 4.98 g Wasser für Injektionszwecke zugesetzt und die Mischung in Augentropfenflaschen überführt. (THA-SP).

Behandlung der Versuchstiere

Es wurden insgesamt 21 Versuchstiere für das Experiment verwendet. Die Kaninchen wurden mit Rompun® sediert und mit den entsprechenden Augentropfen und Zeiträumen ( 30-, 60- und 240minütige Einwirkzeit) behandelt.

Tier

Einwirkungszeit

Behandlung

1

1Stunde

THA/HP-ß-CD

2

1Stunde

THA-Suspension

3

4Stunden

THA/HP-ß-CD

4

4Stunden

THA-Suspension

5

4Stunden

THA/HP-ß-CD

6

4Stunden

THA-Suspension

7

4Stunden

THA/HP-ß-CD

8

4Stunden

THA-Suspension

9

1Stunde

THA/HP-ß-CD

10

1Stunde

THA-Suspension

11

1/2 Stunde

THA/HP-ß-CD

12

1/2 Stunde

THA/HP-ß-CD

13

1/2 Stunde

THA/HP-ß-CD

14

1/2 Stunde

THA-Suspension

15

1/2 Stunde

THA-Suspension

16

1/2 Stunde

THA-Suspension

17

1Stunde

THA/HP-ß-CD EM Studie

18

1Stunde

THA-Suspension EM Studie

19

1Stunde

Suspension EM Studie

20

1Stunde

HP-ß-CD EM Studie

21

1Stunde

Ohne Behandlung

Tabelle 3: Versuchstiere

Die Applikation der Augentropfen erfolgte in einem Zeitraum von 5 Minuten, in dem insgesamt 5 Augentropfen à 50 μl im Intervall von je einer Minute eingebracht wurden. Zur Verbesserung der Aufnahme und Verteilung wurde das Unterlid während der Applikation vom Augapfel abgehoben und danach ein künstlicher Lidschlag induziert. Diese Vorgehensweise verhindert den Verlust überschüssigen Materials. Zusätzlich wurde ein leichter Druck gegen die Lider und die Nasalgegend ausgeübt, um den schnellen Abfluß über den Tränenkanal zu verhindern und systemische Wirkungen zu vermeiden. Die Kaninchen wurden noch einige Zeit nach der Applikation gehalten und beobachtet, um sicherzustellen, daß sie ihre Augen nicht mit den Pfoten reiben. Nach der entsprechenden Einwirkzeit wurden die Augen mit isotonischer Natrium-chloridlösung gespült, um restliche Augentropfen zu entfernen. Die Tiere wurden danach mit Natrium-Hexobarbital eingeschläfert. Nach Aussetzen der Herztätigkeit wurde mit einer Insulinspritze ca. 150-200 μl Kammerwasser und 5 ml Blut (nur bei 2 Tieren) entnommen. Die Augen wurden enukleiert und präpariert. Die okularen Gewebe: Konjunktiva, Kornea, Iris-Ziliarkörper, Glaskörper, Retina und Sklera wurden isoliert und in tarierte Behälter überführt und bei –84 °C tiefgefroren. Die Gewebeaufbereitung erfolgte wie unter Abschnitt 3.9 beschrieben, gefolgt von einer Gehaltsbestimmung mittels HPLC.

Einfrieren und Auftauen der Materialien

Die frisch entnommenen Proben wurden sofort nach der Enukleierung und Separierung in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß bei –84 Grad (GFL 6380, Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel) bis zur HPLC-Gehaltsbestimmung eingefroren.

HPLC- Gehaltsbestimmung von Thalidomid

Die quantitative Thalidomid-Gehaltsbestimmung in den unterschiedlichen Untersuchungsproben wurde mit der modifizierten Reverse-phase-HPLC-Methode durchgeführt (Erikson et al. 1992). Es wurden mit den jeweiligen Medien Kalibrierungsstandardlösungen (externer Standard) hergestellt.

Die verschiedenen Gewebe wurden bei einer Wellenlänge von 300 nm mit dem Merck Hitachi-HPLC system L 6200, ausgestattet mit einem UV/VIS-Detektor (Tokyo, Japan) und einem Injektionsvolumen von 20 μl gemessen. Die mobile Phase (Flußgeschwindigkeit 1,2 ml/min) bestand aus 30% Acetonitril und 70% Wasser. Die Separierung wurde mit einer Guard Column und einer analytischen LiChrospher column RP-18,5 μm, 125mm I.D., (beide von der Firma E. Merck, Darmstadt) durchgeführt. Die HPLC-Kalibrierung wurde mit 50, 100, und 400 ng Thalidomid/ml Kammerwasser durchgeführt. Die Detektion des Thalidomid-Gehaltes wurde bei einer Wellenlänge von 300 nm durchgeführt. Das Detektionslimit lag bei 50 ng/ml.

Pumpe

Pump L 6200 A, E. Merck – Hitachi (Tokio, J)

Detektor

UV - Detector L 4000, E. Merck - Hitachi (Tokio, J)

Interface

Interface D 6000, E. Merck – Hitachi (Tokio, J)

Software

D 6000 HPLC-Manager Version 2, Rev. 3, E. Merck (Darmstadt) & Hitachi Instr. Inc. (San Jose, CA, USA)

Injektionsvolumen

20 µl Rheodyne® 7161, (Cotati, CA, USA)

Stationäre Phase

LiChrospher® 100 RP-18, 5 µm, 125 x 4 mm (I. D.), (20°C), E.Merck (Darmstadt)

Mobile Phase

30% Acetonitril / 70% Wasser (20°C)

Externer Standard

THA

Flußrate

1.2 ml / min.

Wellenlänge

300 nm (220 nm)

Tabelle 4: HPLC – Gehaltsbestimmung (THA) (modifiziert nach 30)

Für die Thalidomid-Gehaltsbestimmung der entnommenen Materialien mußte zwischen den flüssigen und soliden Bestandteilen unterschieden werden. Die flüssigen Bestandteile des Kaninchenauges konnten direkt injiziert werden, wogegen die soliden Gewebe vor der Injektion eine Gewebeaufarbeitung benötigten.

Gewebeaufarbeitung

In Anbetracht der geringen Menge an unbehandelten okularen Geweben des Kaninchenauges wurden Wirkstoff-Wiederfindungsraten an isolierten Geweben des Rinderauges bzw. an Rattenplasma bestimmt (121). Das Gewebeaufarbeitungverfahren wurde in Vorversuchen, entsprechend der höchsten Wiederfindungsrate, ausgewählt. Die Aufarbeitung erfolgte entweder durch Homogenisierung oder saurer Digestion.

Das Rinderkornea-Permeationsmodell (120) und das in vitro-Modell (isolierte Schweinekornea) ermöglichte die Untersuchung der Wirkstoffaufnahme in Abhängigkeit von der Wirkstofflösung, ins Gewebe. Hierfür wurde das Gewebefeuchtgewicht bestimmt, Gewebeteile mit wirkstoffhaltiger Lösung über einen festgelegten Zeitpunkt unter konstanten Bedingungen geschüttelt, und nach Dekantierung der Inkubationslösung der Wirkstoffgehalt bestimmt. Die Differenz zwischen bekannter Wirkstoffmenge in der Ausgangslösung und gefundener Konzentration nach Inkubation, ermöglicht die Berechnung der im Gewebe vorliegenden Wirkstoffmenge pro Gewebe.

Kornea

Zur Ermittlung der Wiederfindungsrate des Wirkstoffs in der Kornea wurde von einer bestimmten Anzahl an zerkleinerten Rinderkorneae das jeweilige Kornea-Feuchtgewicht bestimmt. Diese Gewebeteile wurden mit jeweils 1.0 ml gesättigter THA/PP+ pH 4.5-Lösung versetzt und 3h bei 33°C geschüttelt (107rpm). Anschließend wurden sie mit 500 μl PP+ pH 4.5 abgespült, kurz in diesen Puffer eingetaucht und danach bei 84°C tiefgefroren. Mittels HPLC wurde bei einem Endvolumen von 1,5 ml der THA-Gehalt bestimmt und hieraus die penetrierte THA-Menge calculiert.

Die Kaninchenproben wurden aufgetaut, mit einer Präparationsschere (Aesculap BC 100) zerschnitten und in Plastik-Zentrifugengläser überführt. Jeder Kornea wurden 1.5 ml einem Gemisch aus PP pH 2.0 und DMSA (3+7) zugesetzt und 30 min stehengelassen. Anschließend wurden die Gewebeteile unter Eiskühlung mit einem hochtourigen Rührwerk (Ultra Turrax T 25, IKA-LabortechniK, Staufen i. Br.) 5 min lang homogenisiert und die Mischung im Anschluß bei 4°C 30 min bei 12.000 rpm zentrifugiert (Hermle ZK 380, Gosheim). Der klare Überstand wurde mit einer Pasteurpipette abgesaugt und darin der THA-Gehalt mittels HPLC bestimmt.

Konjunktiva

Zur Ermittlung der Wiederfindungsrate in der Konjunktiva wurde wie bei der Kornea beschrieben die Sättigung mit THA durchgeführt. Im Anschluß hierzu wurde dieses Gewebe jedoch nicht tiefgefroren, sondern über 15 h bei 4° C in 1.0 ml HCLO4(0.05 mol.l-1) stehengelassen. Im klaren Überstand wurde mittels HPLC der THA-Gehalt bestimmt.

Iris-Ziliarkörper

Die THA-Wiederfindungsrate sowie auch die Bestimmung des Wirkstoffgehaltes im Kaninchen-Iris-Ziliarkörper erfolgten analog den Ausführungen im Kapitel “Kornea”.

Glaskörper

Zur Ermittlung der Wiederfindungsrate von THA im Glaskörper des Rinderauges wurden 500 μl THA-gesättigter PP ph 4.5 mit demselben Volumen Glaskörper zersetzt. Der Mischung wurden anschließend 1000 μl MTBE zugesetzt und der Ansatz 30 min lang geschüttelt. Die organische Phase wurde mit einer feinen Pipette abgehoben und im Wasserbad zur Trochne eingeengt. Der Rückstand wurde schließlich in 1000 μl PP pH 4.5 aufgenommen und durch HPLC der Wirkstoffgehalt bestimmt. Die Bestimmung des THA-Gehalts in den Kaninchen-Glaskörperproben erfolgte in der eben beschriebenen Art und Weise.

Sklera

Auch für die Sklera wurde eine Wiederfindungsrate ermittelt. Hierbei wurde ebenfalls wie bei der Konjunktiva eine Sättigung mit THA durchgeführt und anschließend das Gewebe über 15 h bei 4° C in 3.0 ml HCLO 4(0.05 mol.l-1) stehengelassen. Der klare Überstand wurde im Anschluß mittels HPLC auf seinen THA-Gehalt überprüft.

Plasma

Zur Bestimmung der Wiederfindungsrate im Plasma wurde Rattenplasma verwendet. 400 μl wirkstofffreies Plasma wurde mit 600 μl THA-gesättigtem PP pH 4.5 versetzt und anschließend mit 3.0 ml MTBE überschichtet. Der Ansatz wurde bei 150 Rom 20 min lang geschüttelt und dann bei 4500 Rom 5 min zentrifugiert (Heraeus Medifuge 200S, Hanau). Die Etherphase wurde abgenommen und auf dem Wasserbad eingeengt. Der Rückstand wurde in PP pH 4.5 aufgenommen und abschließend der THA-Gehalt ermittelt. Die Aufarbeitung der Kaninchen-Plasmaproben erfolgte in derselben Art und Weise.

Gewebe

Wiederfindungsrate (%)

Kornea

74.5 (± 15.1)

Konjunktiva

73.3 (±11.2)

Iris-Ziliarkörper

37.0 (± 2.3)

Glaskörper

38.5 (± 9.5)

Sklera

61.1 (± 9.6)

Plasma

75.4 (± 14.3)

Tabelle 5: THA-Wiederfindungsraten bei okularen Geweben des Rinderauges bzw. Rattenplasma (120):

Statistik

Die angegebenen Daten sowie auch die dazugehörigen Symbole stellen die Mittelwerte da. Die Standardabweichung (SD) oder der Standardfehler des Mittelwerts (S.E.M.) spiegelt sich in den Fehlerbalken wieder. Zur Bestimmung signifikanter Unterschiede wurde ein zweiseitiger t-Test nach Student mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% (p<0.05) verwendet.