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2  Material und Methoden

2.1 Patientenkollektiv

Alle Probandinnen wurden aus dem Patientengut der Abteilung für Reproduktionsmedizin und Endokrinologie der Charité-Frauenklinik rekrutiert.

Für alle Gruppen gemeinsam gilt, dass nur geschlechtsreife Frauen in die Studie eingeschlossen wurden. Eine weitere Einschlussvoraussetzung war das Vorliegen einer Einverständniserklärung zur Teilnahme an der Studie. Als allgemeine Ausschlusskriterien galten schwerwiegende chronische Erkrankungen, die Einfluss auf die hormonelle Situation der Patientin haben könnten, hormonelle Substitutionstherapie oder eine bestehende Schwangerschaft. Die in die Studie eingeschlossenen Patientinnen wurden einer der drei folgenden Gruppen zugeordnet.

Kontrollgruppe (n= 23)

In diese Gruppe wurden Patientinnen eingegliedert, bei denen als Sterilitätsursache endokrinologische Ursachen weitgehend ausgeschlossen werden konnten, d.h. Patientinnen mit tubarer Sterilität oder andrologisch bedingter Kinderlosigkeit. Bei diesen Patientinnen durften im Ultraschall keine polyzystischen Ovarien darstellbar sein und es sollte höchstens eines der klinischen Merkmale Akne, Hirsutismus oder unregelmäßiger Zyklus bestehen.

Patientinnen mit PCOS (n= 22)

Einschlussvoraussetzung für diese Gruppe waren ultrasonografisch nachgewiesene polyzystisch veränderte Ovarien in Verbindung mit mindestens zwei der weiteren klinischen Merkmale Oligo- oder Amenorrhoe, Akne, Hirsutismus, primäre oder sekundäre Sterilität.

Patientinnen mit PCOS und OHSS (n= 17)

Voraussetzung für die Zuordnung zu dieser Gruppe waren ein nach den oben aufgeführten Kriterien diagnostiziertes PCOS zusammen mit mindestens einer Episode eines Ovariellen Überstimulationssyndroms (OHSS) in der Anamnese. Ein OHSS wurde diagnostiziert, wenn

folgende Bedingungen erfüllt waren. Die Patientin litt unter abdominellem Spannungsgefühl und Unwohlsein, in der vaginalen Ultraschalluntersuchung waren beidseits zystisch vergrößerte Ovarien von mindestens 50 x 50 mm Größe und freie Flüssigkeit im Bauchraum [Seite 24↓]darstellbar. Zusätzlich waren Plasmaprogesteronspiegel von mindestens 20 pg/ ml und Estradiolspiegel von mindestens 3000 pg/ ml Voraussetzung für die Diagnose Ovarielles Überstimulationssyndrom.

2.2 Untersuchungsablauf

Um die Vergleichbarkeit der erhobenen Befunde zu gewährleisten und den Einfluss der zyklischen Veränderung der Hormonspiegel auf unsere Untersuchungsergebnisse möglichst gering zu halten, entschieden wir uns, die Untersuchungen für alle Patientinnen zu standardisieren.

Die Ultraschalluntersuchung wurde im Rahmen der Zyklusdiagnostik am 21. Zyklustag durchgeführt. Sie ist Bestandteil der Routineuntersuchungen bei unseren Kinderwunschpatientinnen. Dabei erhoben wir auch die Befunde im Hinblick auf klinische Merkmale wie Akne und Hirsutismus.

Für die Erhebung der endokrinologischen Daten wurde jede Patientin für den dritten (ausnahmsweise auch den zweiten oder vierten) Tag ihres nächsten Zyklus einbestellt.

Die Patientin kam im nüchternen Zustand (letzte Nahrungsaufnahme am vorhergehenden Abend). Am Morgen des Testes durfte die Patientin nur ungesüßte Getränke zu sich nehmen.

Der Patientin wurden die Durchführung und die Bedeutung der Hormontests sowie die möglichen Risiken und Nebenwirkungen erläutert. Unter diesen ist vor allem die allergische Reaktion auf synthetisch hergestelltes LHRH oder ACTH zu nennen. Der Patientin wurden mögliche Symptome erläutert und sie wurde darauf hingewiesen, bei jeglicher Form von Unwohlsein das Pflegepersonal zu informieren. Abschließend wurde die Zustimmung der Patientin für die Durchführung der Hormontests und der genetischen Untersuchungen eingeholt.


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Im Zusammenhang mit der Aufklärung über den Ablauf der endokrinologischen Untersuchungen führten wir ein längeres Gespräch mit der Patientin. Dabei wurde die Zyklusanamnese erhoben, der Blutdruck gemessen sowie Körpergröße und Körpergewicht der Patientin ermittelt.

Danach erfolgten im analytischen Grundprogramm der Medizinischen Poliklinik alle Blutentnahmen für endokrinologische und genetische Untersuchungen. Die Proben wurden an die entsprechenden Speziallaboratorien weitergeleitet.

Die erhobenen Befunde wurden beim nächsten Sprechstundentermin, den die Patientin in unserer Poliklinik hatte, besprochen.

2.3 Klinische Untersuchungen

Die Vaginalsonografie wurde im Rahmen der Zyklusdiagnostik am 21. Zyklustag durchgeführt. Sie ist Bestandteil der Routineuntersuchungen bei unseren Kinderwunschpatientinnen.

Für die ultrasonografische Diagnose polyzystischer Ovarien galten die im folgenden beschriebenen Kriterien. Die Ovarien mussten einen maximalen Durchmesser von mindestens 30 mm (Ovaromegalie) in Kombination mit einer zentralen Hyperfibrose aufweisen. Ein weiteres wichtiges Kriterium war die Darstellbarkeit von zahlreichen (mindestens 10) kleinen subkapsulär gelegenen Follikeln.

Auch die Zyklusanamnese sowie die körperliche Untersuchung im Hinblick auf Akne, die chronische Entzündung der Haar-Talgdrüsen-Einheit, und Hirsutismus, die verstärkte Sexual-, Körper- und Gesichtsbehaarung vom männlichen Verteilungsmuster bei der Frau, wurden in Zusammenhang mit der Zyklusdiagnostik vorgenommen.

Des weiteren wurden Körpergewicht (in kg) und Körpergröße (in m) der Patientin ermittelt. Daraus wurde dann der Body Mass Index nach folgender Formel errechnet:

BMI = Gewicht in kg / (Größe in m)2


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Der Blutdruck der Patientin wurde im Sitzen nach der Methode von Riva und Rocci (RR) gemessen. Diese Untersuchung erfolgte am dritten Zyklustag in Zusammenhang mit der Erhebung der hormonellen Befunde.

2.4 Endokrinologische Untersuchungen

Die Ermittlung der Serumspiegel für Estradiol, Progesteron und Prolaktin wurden ebenso wie die Bestimmung des VEGF im hormonanalytischen Labor der Frauenklinik der Charité

durchgeführt.

Zur Testung der Hypophysenvorderlappenfunktion unterzogen wir unsere Patientinnen einem LHRH-Test, zur Testung der Nebennierenrindenfunktion einem Corticotropinkurztest. Beide Tests wurden am 3. Zyklustag morgens zwischen 7.00 und 9.00 Uhr durchgeführt. Sie beinhalteten jeweils die basale (nicht stimulierte) Blutentnahme aus einer Armvene sowie die intravenöse Injektion von LHRH-Ferring bzw. von 0,25 mg synthetisch hergestelltem ACTH (Synacten der Firma Ciba Geigy). Anschließend erfolgten weitere Blutentnahmen 30 und 60 min (LHRH-Test) bzw. 60 min (ACTH-Test) nach Injektion des entsprechenden Medikamentes. Dabei wurden jeweils 20 ml Armvenenblut in heparinisierte Monovetten der Firma Sarstedt entnommen.

Die Bestimmung der Hormonwerte im Zusammenhang mit dem LHRH-Test bzw. ACTH-Test (LH, FSH, Cortisol, freies und Gesamttestosteron, SHBG, DHEA, DHEA-S, Androstendion, 17α-OHP und 21-DOF) sowie der Parameter Insulin, IGF-1 und Leptin erfolgte in den Laboratorien des Institutes für Experimentelle Endokrinologie der Charité.

2.4.1 LHRH-Test

Zur Ermittlung der Werte für LH und FSH wurde ein enzymimmunometrischer Assay der Firma Biochem Immunosystems GmbH (Freiburg) eingesetzt. Er beinhaltet zwei [Seite 27↓]monoklonale Antikörper, von denen einer mit Fluoreszein markiert und gegen die α-Untereinheit des Glukoproteohormons gerichtet, der andere mit Alkalischer Phosphatase gekoppelt und gegen die ß-Untereinheit gerichtet ist. Die Konzentration wurde in mIU/ ml angegeben. Die Intraassayvarianz beträgt 4,8 bis 7,5% für LH und 5,2 bis 7,5% für FSH.

Die Interassayvarianz liegt für die LH-Werte zwischen 4,0 und 8,4%, für die FSH-Werte zwischen 5,3 und 6,4%.

2.4.2 ACTH-Test

Die Bestimmung der Plasmawerte für Cortisol erfolgte mittels Radioimmunoassay (RIA) der Firma Immunotech Coulter Comp. (Marseille, France). Die Intraassayvarianz reicht von 3,1 bis 5,8%, die Interassayvarianz von 5,3 bis 9,2%.

Die Plasmawerte für Testosteron wurden mittels Enzymimmunoassay der Firma Biochem Immunosystems GmbH (Freiburg) erhoben (Intraassayvarianzkoeffizient 6,2-10,0%, Interassayvarianzkoeffizient 11,0-12,0%.

Freies Testosteron (a) ebenso wie Androstendion (b) wurden mittels Festphasen-RIA unter Verwendung von Kits der Firma Diagnostic Systems Laboratories GmbH (Sinsheim) ermittelt. Dabei beträgt die Intraassayvarianz zwischen 3,7 und 6,2% (a) bzw. 2,8 und 5,6% (b), die Interassayvarianz zwischen 7,3% und 9,7% (a) bzw. 6,0 und 9,8% (b).

Zur Bestimmung des DHEA-S wurde ein Enzymimmunoassay der Firma Biochem Immunosystems GmbH (Freiburg) verwendet (Intraassayvarianz 6,4-7,0%, Interassayvarianz 10,8-16,6%).

DHEA wurde mit einem Festphasen-Radioimmunoassay von Immuno Tech Coulter Comp. (Marseille, France) bestimmt (Intraassay-Varianzkoeffizient 6,9 bis 7,9%, Interassay-Varianzkoeffizient zwischen 10,5 und 11,9%).

Die Werte für 17 α -OHP wurden mit Hilfe eines RIA der Firma ICN Biomedicals GmbH gemessen (Intraassayvarianz 7,8-12,3%, Interassayvarianz 9,8-12,9%).


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Die Ermittlung der Werte für 21-Deoxycortisol erfolgte nach der von Fiet et al. etablierten Methode (61). Dazu führten wir einen RIA unter Nutzung eines Tracers der Firma Amersham-Buchler GmbH, Braunschweig und eines Antikörpers gegen 21-DOF, der uns freundlicherweise von Dr. Paul Vecsei, Heidelberg, zur Verfügung gestellt wurde, durch. Der Koeffizient der Intraassayvarianz betrug dabei 12%, der Koeffizient der Interassayvarianz 16%.

2.4.3 Metabolische Parameter

Für die Bestimmung des Gesamt-Serum-Leptins nutzten wir den Human-Leptin-RIA der Firma mediagnost, Tübingen, (Intraassayvarianz unter 5%, Interassayvarianz 7,6%).

Die Serumwerte für sowohl Insulin als auch IGF-1 wurden mittels der entsprechenden Radioimmunoassays der Firma Biochem Immunosystems, Freiburg ermittelt. Für den Insulin-RIA lag die Intraassayvariation zwischen 4,2 und 7,4%, die Interassayvariation zwischen 4,1 und 8,0 %. Die Intraassayvarianz für den IGF-1-RIA lag bei 2,9 bis 5,4 %, die Interassayvarianz bei 4,3 bis 7,1 %.

2.5 Genetische Untersuchungen

2.5.1 Präparation genomischer DNA

Die Präparation der genomischen DNA erfolgte aus etwa 10 ml gefrorenem EDTA-Blut nach der von Miller et al. publizierten Vorschrift (62).Dazu wurde das Blut bei 37° Celsius aufgetaut, mit dem vierfachen Volumen an KCl versetzt und vorsichtig gemischt. Zur Sedimentation der Zellen wurde das Gemisch 10 min lang bei 4° C und 5000 rpm zentrifugiert, danach wurde der Überstand abgegossen und das Zellpellet homogenisiert. Dieser Schritt wurde dreimal wiederholt. Nach dem letzten Sedimentationsschritt wurde das Zellpellet in 3 ml Lysepuffer, 200 µl 10%igem SDS und 50 µl Proteinase K resuspendiert und für 2 h bei 55° C oder über Nacht bei 37° C inkubiert. Anschließend erfolgte die Extraktion mit Phenol, Phenol-Chloroform bzw. Chloroform jeweils durch Abheben der Oberphase nach 10 minütiger Zentrifugation bei 5000 rpm. Dann wurde die DNA mit dem zweifachen [Seite 29↓]Volumen an absolutem Alkohol gefällt, auf einen vorher sterilisierten Glasstab gewickelt und mit 70%igem Alkohol nachgewaschen. Die DNA wurde für ca. 10 min luftgetrocknet und danach in 500 bis 1000 µl TE-Puffer gelöst. Die Konzentration und Reinheit der DNA bestimmten wir durch Ermittlung der Absorptionskoeffizienten bei einer Wellenlänge von 269 bzw. 280 nm. War der Quotient aus beiden Koeffizienten größer als 1,8 , so musste die Chloroformextraktion wiederholt werden, weil der Eiweißgehalt der entsprechenden Proben zu hoch war.

2.5.2 Untersuchung der DNA

Zur effektiven Darstellung großer Deletionen oder Genkonversionen im CYP21-Gen sowie durch „anequal crossing over“ entstandener 30 kb großer Deletionen bzw. Duplikationen untersuchten wir die genomische DNA unserer Patientinnen zuerst mit der Southern-Blot-Analyse. Zum Nachweis von Punktmutationen nutzten wir die PCR zur spezifischen Amplifikation des CYP21A2-Gens und die Methoden der manuellen bzw. der automatischen Sequenzierung zur Darstellung der exakten Basenfolge des gesamten Gens.

2.5.2.1 Southern-Blot-Analyse

Zur getrennten Darstellung beider Genbereiche (A1- und A2-Gen) wurde die genomische DNA der Patientinnen mittels zweier spezieller Restriktionsenzyme gespalten und anschließend mittels Elektrophorese aufgetrennt und auf eine Membran überführt. Bei den eingesetzten Enzymen handelt es sich um die beiden Restriktionsendonukleasen Taq I und Bgl II. Wir erhielten auf diese Weise 3,2 kb bzw. 12 kb große Fragmente für das CYP21A1-Gen und 3,7 bzw. 10 kb große Fragmente für das CYP21A2-Gen, die durch die Hybridisierung mit der Plasmidsonde p21c/3c sichtbar gemacht werden konnten (63).


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Restriktionsspaltung

Für die Taq I -Spaltung wurden jeweils 6 µg DNA zusammen mit 5 µl eines Taq-spezifischen Puffers (10fach Buffer E der Firma Promega) und 30 U Enzym (Taq I der Firma Promega) in einem 50 µl-Ansatz gemischt und für 3 h bei 65°C inkubiert.

Für die Bgl II-Spaltung wurde ein Ansatz von 6 µg DNA, 5 µl Puffer (10fach Buffer D der Firma Promega) und 30 U Enzym (Bgl II der Firma Promega) für 4 h bei 37° C inkubiert.

Um die vollständige Spaltung aller eingesetzten DNA-Proben sicherzustellen, versetzten wir eine 5 µl-Probe der Restriktionsfragmente mit 5 µl eines 0,01 %igen Bromphenolblau-Probenpuffers und ließen sie für ca. 45 min bei einer Spannung von 60 V in einem 0,8%igen Agarose-Kontrollgel laufen. Wenn unter UV-Exposition keine umfassende Auftrennung nachgewiesen werden konnte, wurden die betroffenen Proben für eine weitere Stunde zusätzlich mit 10 U des Enzyms gespalten.

Elektrophorese

Die entstandenen Restriktionsfragmente wurden nun durch Agarose-Gelelektrophorese nach ihrer Größe getrennt. Dazu versetzten wir die gesamte Probe mit 5 µl eines 0,06 %igen Bromphenolblau-Probenpuffers und brachten sie auf ein 0,8 %iges Agarosegel auf, in dem Ethidiumbromid (EtBr) in einer Konzentration von 0,05 ng/ ml enthalten war. Das Agarosegel befand sich in einer mit 1x TAE-Puffer gefüllten Kammer. Bei einer Spannung von 65 V ließen wir die mit Taq I gespalteten Proben ca. 24 h, die mit Bgl II gespalteten Proben ca. 30 h im Gel laufen. Als Längenstandard führten wir 1 µg des Markers λ HIND III mit, der uns über den Grad der Auftrennung Auskunft gab.

Anschließend wurden die aufgetrennten Restriktionsfragmente mit Hilfe des im DNA-Doppelstrang interkalierenden und unter UV-Strahlung fluoreszierenden EtBr auf einem Transluminator der Firma Stratagene bei einer Wellenlänge von 320 nm sichtbar gemacht und durch ein Photo dokumentiert.


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Transfer und Fixierung der DNA-Moleküle auf der Membran

Um die Transfereffizienz dieser großen DNA-Spaltprodukte zu erhöhen, wurden diese durch eine Behandlung mit 0,25 M HCl und alkalischer Denaturierungslösung in situ fragmentiert. Die Einwirkung der HCl bewirkt dabei eine partielle Depurinisierung der DNA-Fragmente.

Durch die anschließende Alkali-Behandlung kommt es zu einer Fragmentierung der DNA an den Stellen, an denen vorher die Purinbasen herausgelöst worden sind. Die zusätzliche Spaltung von Wasserstoffbrückenbindungen führt zur Umwandlung der dsDNA in ssDNA, die eine Voraussetzung für die Bindung an die Membran ist. Es folgte ein letzter Waschgang in einer Neutralisierungslösung. Zwischen den Waschschritten wurde das Gel in Aqua bidest. gespült.

Anschließend übertrugen wir die denaturierten DNA-Fragmente auf eine 0,2 µm dicke Nylonmembran (Biodyne A Transfer Membrane der Firma Pall Europe Limited). Dazu brachten wir die zugeschnittene Nylonmembran direkt auf das Agarosegel, überschichteten sie mit mehreren Lagen saugfähigen Filterpapiers und beschwerten sie mit Gewichten. Durch Kapillarkräfte wurde die DNA im Laufe mehrerer Stunden auf die Membran transferiert und anschließend durch eine zweiminütige UV-Exposition fixiert. Die einzelnen DNA-Fragmente spiegeln bei ihrer Fixierung auf der Membran die Größenverhältnisse nach der Gelelektrophorese exakt wider.

Hybridisierung der Membran mit der Sonde

Im folgenden Arbeitsschritt hybridisierten wir die auf der Membran fixierte DNA mit der radioaktiv markierten Plasmidsonde p21c/3c.

Prähybridisierung und Hybridisierung wurden in speziellen Hybridisierflaschen durchgeführt.

Zuerst wurden die Filter mit der DNA-Seite nach innen in die Flaschen eingebracht und mit 10 ml einer Vorhybridisierungslösung für mindestens 3h bei 65°C inkubiert. Die in der Vorhybridisierungslösung enthaltene DNA aus Heringssperma verhindert später eine unspezifische Bindung der radioaktiv markierten DNA-Sonde durch Blockade der entsprechenden Bindungsstellen.


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Während der Inkubation führten wir die radioaktive Markierung der Plasmidsonde p21/3c durch. Dafür wurde die Sonden-DNA 5 min bei 100° C denaturiert, anschließend auf Eis abgekühlt und danach für 20 min mit dem radioaktiven αP32-dCTP markiert. Dazu verwendeten wir den High Prime DNA Labeling Kit der Firma Boehringer Mannheim.

Die Hybridisierung der Filter erfolgte über Nacht bei 65°C im Hybridisierungsofen unter ständiger Rotation der Flaschen. Am nächsten Morgen wurden die Filter mit 2x bzw. 1x SSC-Lösung gewaschen, bevor sie luftblasenfrei in Plastikfolie verpackt wurden.

Darstellung der Hybrid-Moleküle

Zur sichtbaren Darstellung der radioaktiv markierten Hybrid-Moleküle exponierten wir einen Röntgenfilm (Kodak XAR 5) zusammen mit einer Verstärkerfolie gegen den so behandelten Filter und lagerten ihn bei -70°C. Die Expositionszeit variierte je nach Signalstärke zwischen 1 und 14 Tagen. Die Entwicklung der belichteten Filme wurde in einer automatischen Entwicklermaschine (Sakura Film, Japan) durchgeführt. Parallel dazu wurden die Daten mit einem Phospho-Imager-System der Firma Fuji ausgewertet.

2.5.2.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)

Nach dem Ausschluss großer Veränderungen innerhalb der CYP21 gingen wir dazu über, das Gen auf Punktmutationen zu untersuchen. Dazu war zuerst die exponentielle Vervielfältigung des von uns untersuchten Genabschnittes nötig. Wir setzten dafür die Polymerase-Kettenreaktion ein.

Das Gen wurde in drei verschiedene Fragmente von jeweils 1000, 1100 bzw. 2100 Basenpaaren gegliedert und mittels drei verschiedener PCR-Varianten amplifiziert.

Für die PCR wurden jeweils 100 bis 500 ng genomischer DNA in einem Ansatz von 50 µl zusammen mit einer Pufferlösung, einer MgCl2-Lösung, dNTP's, den entsprechenden Primern sowie der jeweils geeigneten Polymerase eingesetzt. Dieser Ansatz wurde gemischt und zentrifugiert, mit ca. 30 µl Mineralöl überschichtet und anschließend in einem Thermocycler der Firma Perkin-Elmer amplifiziert.


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Für jedes der Amplifikate erfolgte die Auswahl spezifischer Primer sowie eine Optimierung der PCR-Bedingungen, wie im folgenden erläutert wird.

PCR-Bedingungen

Bei dem Reaktionsansatz zur Amplifikation von Fragment 1 stammten der Reaktionspuffer mit MgCl2, die dNTP´s, Q-Solution sowie die Polymerase aus dem Taq PCR Core Kit der Firma Qiagen. Beim Reaktionsansatz für Fragment 2 und 3 setzten wir Reaktionspuffer, MgCl2-Lösung sowie die Polymerase aus dem Expand High Fidelity Kit der Firma Boehringer Mannheim, die dNTP´s der Firma Promega und Perfect Match der Firma Stratagene ein.

Primerliste

Die Auswahl der Primerpaare erfolgte mit Hilfe des Programms “Oligo“ (Version 4.0, MedProbe A.S.)

Dabei wurden die Primerpaare so gewählt, dass jeweils mindestens einer der Primer spezifisch für das A2-Gen ist. Das heißt mindestens einer der PCR-Primer enthielt eine Sequenz des A2-Gens, die sich an dieser Stelle von der des Pseudogens unterscheidet.

Des weiteren achteten wir darauf, dass die Schmelzpunkte beider Primer sich nicht wesentlich unterschieden und die interne Stabilität ausreichend war. Wir versuchten, Dimerbildung zwischen beiden Primern v.a. am 3‘-Terminus sowie Haarnadelbildung innerhalb der Primer auszuschließen. In Tabelle 2.1 bis 2.3 sind die Sequenzen der PCR-Primer-Paare, die Thermoprofile der Cyclerprogramme und die Zusammensetzung der Ansätze zur Amplifikation der drei PCR-Produkte aufgezeigt.


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Tab. 2.1: Sequenzen der PCR-Primerpaare zur Amplifikation von Fragment 1-3; r= reverse primer. Jeweils ein Primer enthält eine für das CYP21A2-Gen spezifische Sequenz.

Fragment

Primername

Sequenz (5‘-3‘)

1 (1396-2373)

5‘1

GGA CAC TAT TGC CTG CAG A

 

110r

AGT AGT CTC CCA AGG ACA

2 (1997-3052)

71

GTG GTG CTG AAC TCC AA

 

237r

GCA TCT CCA CGA TGT GA

3 (2394-4477)

110m

CCT GTC CTT GGG AGA CTA CT

 

4564r

TCT CGC ACC CCA GTA TGA CT


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Tab. 2.2: Thermoprofile der Cyclerprogramme

Fragment

 

1

2

3

Vordenaturierung

Temp

Zeit

95° C

8 min

95° C

8 min

95° C

8 min

Denaturierung

Temp

Zeit

94° C

1 min

94° C

1 min

94° C

1 min

Annealing

Temp

Zeit

58° C

1 min

60° C

2 min

64° C

2 min

Elongation

Temp

Zeit

72° C

2 min

72° C

2 min plus

20 sek je Zyklus

72° C

2 min plus

20 sek je Zyklus

Zyklenanzahl

 

40

30

35

Endelongation

Temp

Zeit

72° C

10 min

72° C

10 min

72° C

10 min

Tab. 2.3: Zusammensetzung der PCR-Ansätze

Fragment

1

2

3

Ansatz

50 µl

50 µl

100 µl

DNA

500 ng

500 ng

500 ng

D NTP’s

1,0 µl (10mM)

0,5 µl (20 mM)

1,0 µl (20 mM)

Puffer

5,0 µl (10x mit MgCl2)

5,0 µl (10x mit MgCl2)

10,0 µl (10x mit MgCl2)

Primer

0,3 µl 5‘1 (100 mM)

0,3 µl 110r (100 mM)

0,5 µl 71 (50 mM)

1,1 µl 237r (130 mM)

2 µl 110m (120 mM)

2 µl 4564 r (120 mM)

Enzym

0,25 µl Taq DNA Polym.

(5,0 U/ µl)

0,35 µl Expand High Fid.

(3,5 U/ µl)

1,0 µl Expand High Fid.

(3,5 U/ µl)

Zusätze

5,0 µl Q-Solution

0,6 µl Perfect Match

 

Um mögliche Verunreinigungen zu erkennen, wurde in jedem PCR-Ansatz eine Negativkontrolle mitgeführt, d.h. eine Wasserprobe, die keine DNA enthielt.


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Kontrolle der PCR-Produkte

Die Kontrolle der amplifizierten Fragmente erfolgte je nach Amplifikatgröße auf einem 0,8% bzw. 2,4%igem Agarosegel, in dem Ethidiumbromid (EtBr) in einer Konzentration von

0,05 µg/ ml enthalten war. Dazu wurden jeweils 5 µl einer Probe mit 5 µl 0,01%igem Bromphenolblau-Probenpuffer versetzt und anschließend auf das Agarosegel aufgetragen, das sich in einer mit 1x TAE-Puffer gefüllten Elektrophoresekammer befand. Zusätzlich zu den Proben wurde immer auch 5 µl eines DNA-Längenstandards auf das Gel gegeben. Bei einer Spannung von 70 V ließen wir die Proben solange im Gel laufen, bis der Längenstandard genügend weit aufgetrennt war, damit ihm die Größe der Fragmente zugeordnet werden konnte.

Schließlich wurden die Amplifikate mit Hilfe des im Gel enthaltenen fluoreszierenden Farbstoffes EtBr auf einem Transluminator der Firma Stratagene bei einer Wellenlänge von 320 nm sichtbar gemacht und photografisch dokumentiert.

In den Abb. 2.1 bis 2.3 ist die gelelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte 1 bis 3 zu sehen.


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Abb. 2.1: Gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkt 1 (ca. 1000 bp) und Längenstandard.

Abb. 2.2: Gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkt 2 (ca. 1000 bp) und Längenstandard.

Abb. 2.3: Gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkt 3 (ca. 2000 bp) und Längenstandard.


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2.5.2.3 Sequenzierung

Um Aufschluss über die genaue Aminosäuresequenz des gesamten Gens bei unseren Patientinnen zu gewinnen, wurden die Proben nach der enzymatischen Kettenabbruchmethode nach Sanger sequenziert. Das wurde zum Teil manuell in unserem Labor und zum Teil automatisch im Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik (MPI) durchgeführt.

Manuelle Sequenzierung

In unserem Labor wurde die manuelle Sequenzierung mit dem T7 Sequenase v 2.0 Kit von Amersham Life Science (Product number US70170) durchgeführt, die Fragmente mit dem Isotop αP33 -dATPradioaktiv markiert und auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht.

Vorbehandlung: Zur Reinigung der amplifizierten DNA wurden jeweils 7 µl PCR-Produkt mit 1 µl (10 U) Exonuklease und 1 µl (2 U) Alkalischer Phosphatase versetzt und für 15 min bei 37°C inkubiert. Die nachfolgende 15 minütige Inkubation bei 80° C diente der Inaktivierung der Enzyme.

Annealing: Den gereinigten Proben wurden 5-10 pmol des jeweiligen Sequenzierprimers zugefügt, bevor die Denaturierung bei 100°C für 2 bis 3 Minuten erfolgte. Zur Anlagerung der Primer wurde die Probe sofort für mindestens 5 min auf Eis gekühlt.

Markierungsreaktion: Zu der auf Eis gelagerten Probe fügten wir 2 µl Reaktionspuffer, 1 µl DTT, 2 µl Labeling Mix in einer Verdünnung von 1:5, 2 µl Sequenase (3,25 U) und 0,5 µl 33Pα-dATP hinzu. Wir mischten und zentrifugierten den Ansatz, inkubierten ihn 5 min bei Raumtemperatur und versetzten ihn anschließend mit 1 µl Manganlösung.

Kettenabbruchreaktion: Bei der Polymerisationsreaktion dienen sowohl 2´-Desoxy-Nukleotide als auch 2´-3´-Didesoxy-Nukleotide, das heißt Nukleotide, die nicht nur an der 2´-Position sondern auch an der 3´-Position der Ribose desoxygeniert sind, als Substrat für die DNA-Polymerase. Diese können an ihrem 5´-Phosphatrest in eine wachsende DNA-Kette [Seite 39↓]eingebaut werden, führen aber zum Kettenabbruch, weil ihnen die 3´-OH-Gruppe als Bindeglied zum Phosphat des nächsten Nukleotids fehlt.

Dementsprechend wurden für die Sequenzierung einer Probe vier verschiedene Reaktionen mit jeweils einem anderen ddNTP durchgeführt. Für jede Probe wurden vier Eppendorfgefäße mit jeweils 2,5 µl des entsprechenden Terminationsmixes bereitgestellt. Zu jedem dieser vier Ansätze gaben wir 3,5 µl der radioaktiv markierten Probe in gleichen Zeitabständen. Nach einer Inkubationszeit von 7 min bei 37°C wurde durch Zugabe von 4 µl Stop-Lösung ein Abbruch der Reaktion herbeigeführt.

Im Reaktionsgemisch eines Nukleotids entstehen auf diese Weise radioaktiv markierte DNA-Abschnitte unterschiedlicher Länge, deren Synthese stets beim Einbau des jeweiligen ddNTP abgebrochen wurde. Mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese der in den vier Reaktionen entstandenen DNA-Ketten kann man nach Autoradiographie über die unterschiedliche Kettenlänge die relative Position der Nukleotide zueinander und damit ihre Sequenz bestimmen.

Sequenziergel: Für die elektrophoretische Auftrennung der entstandenen Fragmente wurde 6%iges Polyacrylamidgel mit 800 µl 10% APS und 20 µl TE-MED versetzt und anschließend zwischen zwei vorbehandelte Glasplatten gegossen, die durch 0,35 mm dicke Spacer und einen Haifischkamm voneinander getrennt waren. Die Vorbehandlung der Platten beinhaltete eine gründliche Reinigung mit Spülmittel, Aqua bidestilata und Ethanol. Eine der beiden Platten wurde zusätzlich mit Haftsilan (Merck) benetzt. Das ausgehärtete Gel wurde in eine Elektrophoresekammer (Gibco BRL) eingespannt und bei 70 W und maximal 3000 V auf ca. 54°C vorgeheizt. Als Puffer diente eine 1x TBE-Pufferlösung. Dann wurden jeweils 2,5 µl der Nukleotidgemische nach 5-minütiger Denaturierung bei 95 °C in die nebeneinander liegenden Taschen in der Reihenfolge ACGT aufgetragen. Der Elektrophoreselauf fand bei ca. 70 W statt. Anhand des in der Stop-Lösung enthaltenen Farbstoffes konnte man abschätzen, wie weit die Proben im Gel gelaufen waren.

Nach ausreichender Auftrennung trennten wir die Platten voneinander, fixierten das Gel auf einem Filterpapier und trockneten es bei 75°C für 1h. Dann wurde der das Gel enthaltende Filter zusammen mit einem Film in einer Röntgenkassette gelegt. Nach mindestens 12- stündiger Exposition wurde der Film mit Hilfe der automatischen Entwicklermaschine Sakura-Film Japan entwickelt, und die Sequenz des Gens konnte direkt abgelesen werden.


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Automatische Sequenzierung

Unser Ziel war es, nicht nur bestimmte bereits bekannte Mutationen im CYP21-Gen bei unseren Patientinnen aufzudecken, sondern die gesamte Nukleotidsequenz des Gens im Hinblick auf Veränderungen und Polymorphismen zu untersuchen. Es wurden 13 verschiedene Sequenzierprimer eingesetzt, davon waren 7 Vorwärtsprimer und 6 Rückwärtsprimer. Diese Untersuchungen wurden am Max-Planck-Institut für Molekulare Genetik mit dem automatischen Kapillarsequenziergerät ABI Prism 3700 DNA Analyzer durchgeführt.

Im Gegensatz zur konventionellen Markierung mit radioaktiven Isotopen wird bei der automatischen Sequenzierung die DNA durch das Einbringen von Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Dabei können gleichzeitig verschiedene Farbstoffe angeregt und detektiert werden, was bedeutet, dass in der Sequenzierung für jede Base eine eigene Farbe verwendet werden kann. Das Einbringen der Farbstoffe in die DNA erfolgt dabei nach der Sanger-Methode unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden. Für die Markierungsreaktion wurde der ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit der Firma Applied Biosystems eingesetzt.

Nach der Markierung folgt die Auftrennung der DNA-Fragmente in einem Elektrophoresesystem mit Polymer-gefüllten Glaskapillaren. Zur Anregung der Fluoreszenzfarbstoffe passieren die Fragmente dabei einen bestimmten Bereich, in dem ein Laserstrahl fokussiert ist. Das von den Farbstoffen emittierte Licht wird dann über Spiegelsysteme zur Detektionseinheit zurückgestrahlt und dabei in seine Spektralfarben zerlegt. Die Detektion der Spektralfarben erfolgt mit Hilfe des hochauflösenden Pixelfeldes einer CCD-Kamera. Die entsprechend ermittelten Farbimpulse werden dann aufgezeichnet und der jeweils stärkste Impuls an einer bestimmten Position in der Sequenz gibt Auskunft über die an dieser Stelle gelesene Base.

Zur Auswertung der auf diese Weise ermittelten Sequenzen nutzten wir ein speziell dafür erstelltes Unix-Programm.


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Sequenzierprimer

In Tabelle 2.4 sind die Basensequenzen der eingesetzten Sequenzierprimer aufgelistet.

Tab. 2.4: Sequenzen der eingesetzten Sequenzierprimer, r= reverse primer

Fragment

Primer-Nr.

Primer-Name

Sequenz (5‘-3‘)

1

1

CYP21A2 1458

TCC TTG CTT CTT GAT GGG TGA T

1

X

CYP21A2 1845

GGC CCA TCT ACA GGC TCC AC

2

2

CYP21A2 2168

TCC TCC CAC CTC AGC CTC AA

3

3

CYP21A2 2665

CCT GCA GCA TCA TCT GTT ACC

3

4

CYP21A2 3149

ATT GCT ATG AGG CGG GTT CTT T

3

5

CYP21A2 3396

CAC TGA GAC CAC AGC AAA CAC

3

6

CYP21A2 4005

CAC ATG AGT TCT GGC CTG GTA

1

7

CYP21A2 2167r

TGA GGC TGA GGT GGG AGG AT

2

8

CYP21A2 2672r

GAA GGT GAG GTA ACA GAT GAT G

2

9

CYP21A2 2997r

ACC TGG ATT GGG GAA GAA CTG

3

10

CYP21A2 3402r

GAG AGG GTG TTT GCT GTG GTC

3

11

CYP21A2 3900r

TGA TGA AGG GGG CTG GAG TTA

3

12

CYP21A2 4415r

GGG AGC AAT AAA GGA GAA ACT G

2.6 Statistische Auswertung

Die bei der klinischen und endokrinologischen Untersuchung erhobenen Daten wurden mit Hilfe des Statistikprogramms SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) Version 7.5 ausgewertet. Dabei untersuchten wir zunächst die interessanten Daten auf Normalverteilung innerhalb der zu vergleichenden Gruppen. Je nach Verteilung der Daten verwendeten wir den Kruskal-Wallis-Test für Rangreihenvergleiche bei nicht normal verteilten Stichproben oder den T-Test für Mittelwertvergleiche bei normal verteilten Werten, um Unterschiede zwischen den Gruppen festzustellen. Zusammenhänge zwischen ordinalskalierten Variablen wurden mit Hilfe von Kontingenztafeln untersucht.


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Zur Darstellung der Zusammenhänge zwischen metrischen Variablen wurden bei Normalverteilung der Korrelationskoeffizient nach Pearson, bei nicht normal verteilten Werten der Korrelationskoeffizient nach Spearman bestimmt.


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11.02.2004