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3  Ergebnisse

3.1 Ergebnisse der klinischen und biochemischen Untersuchungen

3.1.1 Statistische Grundlagen

Nach Erhebung der Messergebnisse prüften wir die Daten zunächst auf Normalverteilung. Dazu nutzten wir die Möglichkeit der grafischen Darstellung der Datenverteilung in Form eines Histogramms sowie die zusätzliche objektive Überprüfung mittels Kolmogorov-Smirnov-Test. Es zeigte sich, dass die erhobenen Daten nicht der Normalverteilung entsprachen. Deshalb wandten wir zur Darstellung der Ergebnisse den Vergleich der Medianwerte bzw. den H-Test nach Kruskal und Wallis sowie die Berechnung der Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman als Tests für nicht normal verteilte Stichproben an.

Es wurden jeweils die Kontrollpatientinnen mit der Gruppe aller PCOS-Patientinnen bzw. die PCOS-Patientinnen mit und ohne anamnestisches Überstimulationssyndrom miteinander verglichen.

3.1.2 Klinische Befunde

Für alle erhobenen klinischen Merkmale ergaben sich erwartungsgemäß signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen. So litten nur 17,4% der Kontrollpatientinnen unter einer Akne, bei den PCOS-Patientinnen waren es 36%. Bei 13% der Kontrollpersonen war ein Hirsutismus nachweisbar, während PCOS-Patientinnen in insgesamt 64,1% betroffen waren.

Für den BMI fanden wir beim Vergleich der Medianwerte mit p= 0,009 einen signifikanten Unterschied zwischen der PCOS- und der Kontrollgruppe. Der Median des BMI lag für die Kontrollgruppe bei 22, bei den Patientinnen mit PCOS bei 26 (Abb 3.1). Zwischen den PCOS-Patientinnen mit bzw. ohne vorangegangenes Überstimulationssyndrom ergab sich kein signifikanter Unterschied.


[Seite 44↓]

Der Vergleich der Medianwerte des Blutdrucks erbrachte für die Gruppe aller PCOS-Patientinnen gegenüber der Kontrollgruppe mit p= 0,01 signifikant höhere Werte sowohl für den systolischen (medPCOS = 130 mmHg; medK = 120 mmHg ) als auch für den diastolischen Druck (medPCOS = 90 mmHg; medK = 75 mmHg) (Abb 3.2). Dabei lag die Zahl der Fälle mit Grenzwerthypertonie (RR zwischen 140/90 und 160/95 mmHg) in der Kontrollgruppe bei 1 (4,5%), in der gesamten PCOS-Gruppe dagegen bei 11 (29%). Hinweise auf eine bestehende manifeste Hypertonie (RR> 160/95 mmHg) fanden wir in der Kontrollgruppe nicht, in der PCOS-Gruppe hingegen bei 4 Patientinnen (3 x PCOS und 1x PCOS/ OHSS).

Abb. 3.1: Verteilung der Body Mass Indices in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe aller PCOS-Patientinnen.

Abb. 3.2: Verteilung der diastolischen und systolischen Blutdruckwerte in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe aller PCOS-Patientinnen.


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3.1.3  Biochemische Befunde

3.1.3.1 LHRH-Test

Die Basalspiegel an Luteinisierendem Hormon waren bei den PCOS-Patientinnen und besonders bei denen mit anamnestischem OHSS im Vergleich zur Kontrollgruppe tendenziell erhöht. Allerdings konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden (Abb. 3.3). Gleiches gilt für die Serumspiegel 30 und 60 min nach Stimulation durch LHRH. Der Quotient der LH-Spiegel 30 min nach Stimulation im Vergleich zu den Werten vor der Stimulation (LH 30‘ / LH 0‘ ) war jedoch in der Gruppe der Patientinnen mit OHSS signifikant niedriger als in der Gruppe derer ohne OHSS (p = 0,028) (Abb. 3.4.).

Bei der Messung der Werte für das Follikelstimulierende Hormon ergaben sich signifikant niedrigere Basalwerte in der Gruppe der PCOS-Patientinnen gegenüber den Kontrollen (p=0,045), wobei die Spiegel bei den Frauen mit vorausgegangenem OHSS deutlich höher lagen als bei den restlichen PCOS-Patientinnen (p=0,023; Abb. 3.5). Für die Werte 30 und 60 min nach Stimulation war eine ähnliche Tendenz erkennbar, allerdings waren die Unterschiede hier nicht signifikant.

Die Quotienten LH/FSH zwischen sowohl den Basalwerten für LH und FSH als auch den 30 min-Werten waren bei den PCOS-Patientinnen signifikant gegenüber der Kontrollgruppe erhöht (p = 0,003 bzw. p = 0,017). Zwischen den PCOS-Patientinnen mit bzw. ohne OHSS zeigte sich keine signifikante Differenz (Abb. 3.6).

Abb. 3.3: Verteilung der LH-Basalwerte der drei Gruppen.


[Seite 46↓]

Abb. 3.4: Darstellung der Quotienten aus LH30 und LH0 als Ausdruck des Anstiegs der LH-Werte p. stim. der drei Gruppen.

Abb. 3.5: Verteilung der FSH-Basalwerte in den drei verschiedenen Gruppen.

Abb. 3.6: Darstellung der Quotienten aus LH und FSH jeweils basal bzw. 30 min p.stim. in den drei verschiedenen Gruppen.


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3.1.3.2 ACTH-Test

Die Werte für freies Testosteron und Gesamttestosteron waren in der PCOS-Gruppe signifikant höher als in der Kontrollgruppe (p = 0,004 bzw. p = 0,024). Bezüglich des Gesamttestosterons wurden gegenüber der PCOS-Gruppe signifikant niedrigere Werte für die Untergruppe der OHSS-Patientinnen registriert (p = 0,023), was für freies Testosteron nicht nachweisbar war (Abb. 3.7 und 3.8).

Abb. 3.7: Verteilung der Serumwerte für freies Testosteron in den drei Gruppen

Abb. 3.8: Verteilung der Serumwerte für Gesamttestosteron in den drei Gruppen

Auch für das Transsportprotein der Sexualsteroide, das SHBG, zeigten sich eindeutige Differenzen zwischen PCOS- und Kontrollgruppe. Dabei war der Median der PCO-Gesamtgruppe mit 30,1 nmol/l signifikant niedriger (p = 0,003) als der Median in der [Seite 48↓]Kontrollgruppe mit 44,8 nmol/l (Abb. 3.9). Zwischen den PCOS-Patientinnen mit und ohne OHSS war kein Unterschied feststellbar.

Abb. 3.9: Verteilung der Serumwerte für SHBG in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe aller PCOS-Patientinnen.

Bei der Untersuchung der DHEA-Spiegel erreichte nur der Vergleich zwischen den 60 Minuten-Werten der PCOS- bzw. Kontrollgruppe statistische Signifikanz (p = 0,035), wobei zusätzlich in der OHSS-Gruppe tendenziell niedrigere Werte vorherrschten als in der Gruppe mit PCOS ohne OHSS. Der Unterschied zwischen den beiden PCOS-Untergruppen bestätigte sich signifikant auch in Bezug auf DHEAS (p = 0,021) (Abb. 3.10).

Abb. 3.10: Verteilung der Basalwerte für DHEAS im Serum in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe der PCOS-Patientinnen ohne bzw. mit anamnestischem OHSS.

Im Hinblick auf 17α-OHP war für basale und stimulierte Werte ebenfalls eine Tendenz zu erhöhten Werten in der PCOS-Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe sichtbar. Dabei schienen [Seite 49↓]die Werte in der OHSS-Gruppe in noch stärkerem Maße erhöht zu sein (Abb. 3.11). Diese Unterschiede erreichen jedoch keine statistische Signifikanz.

Für Androstendion ergaben sich sowohl bei den basalen als auch bei den durch ACTH-Gabe stimulierten Spiegeln signifikant höhere Werte für die PCOS-Gesamtgruppe beim Vergleich mit der Kontrollgruppe (p = 0,015 bzw. p = 0,001). Zwischen PCOS-Patientinnen mit bzw. ohne OHSS war kein Unterschied feststellbar (Abb. 3.12).

Abb. 3.11: Verteilung der basalen bzw. stimulierten Serumwerte für 17α-Hydroxyprogesteron in den drei Gruppen.

Abb. 3.12: Verteilung der Androstendionwerte basal bzw. 60 min p. stim. in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe aller PCOS-Patientinnen.

Für das 21-DOF ergaben sich sowohl hinsichtlich der Basal- wie auch der stimulierten Werte kein signifikanter Unterschied zwischen den Medianwerten (21-DOF 0‘ : medK = 0,18 nmol/ l; [Seite 50↓]medPCOS = 0,16 nmol/ l; p = 0,4; 21-DOF 60‘ : medK = 0,83 nmol/ l; medPCOS = 0,68 nmol/ l, p = 0,1).

Um Hinweise auf eine partielle 21-Hydroxylase-Defizienz zu erhalten, betrachteten wir die Werte für 21-DOF, 17α-OHP bzw. die Quotienten aus 21-DOF und Cortisol sowie 17α-OHP und Cortisol jeweils vor und 60 min nach der ACTH-Stimulation. Die Verteilung der Werte unterschied sich nicht zwischen den Gruppen. Als auffällig galten diejenigen Werte, die über der 90. Perzentile der für die Kontrollgruppe ermittelten Werte liegen. Für 21-DOF 0 lag die 90. Perzentile bei 1,08 mmol/l; für 21-DOF 60 bei 1,98 mmol/l; für 17 α -OHP 0 bei 3,88 nmol/ l, für 17 α -OHP 60 bei 10,58 nmol/ l. Als Grenzwert für den Quotienten 21-DOF 0 / F 0 galt 0,63; für 21-DOF 60 / F 60 0,42, für 17 α -OHP 0 / F 0 1,59; für 17 α -OHP 60 / F 60 lag er bei 1,94.

Auffällige biochemische Befunde im Sinne einer überschießenden 17α-OHP bzw. 21-DOF-Antwort gegenüber einem mäßigen Cortisol-Anstieg nach Stimulation durch ACTH zeigten nur 4 der PCOS-Patientinnen, davon 3 mit OHSS. Einen über die 90. Perzentile erhöhten Quotienten aus den Basalwerten aus 17α-OHP bzw. 21-DOF und Cortisol fanden wir bei weiteren 4 PCOS-Patientinnen. Bei diesen insgesamt 8 PCOS- Patientinnen stellten wir in 4 Fällen heterozygote Mutationen im CYP21A2-Gen fest.

Bei 7 weiteren PCOS-Patientinnen (4 davon mit OHSS) fanden wir oberhalb der 90- Perzentile liegende Werte für 17α-OHP bzw. 21-DOF als möglichen Hinweis auf eine partielle 21-Hydroxylase-Defizienz. Die Quotienten aus beiden Werten und Cortisol sind jedoch bei diesen Patientinnen nicht erhöht. 2 dieser Patientinnen waren Trägerinnen heterozygoter Mutationen im CYP21A2-Gen.

Außerdem wiesen 2 Kontrollpatientinnen auffällige biochemische Befunde auf. Beide waren Trägerinnen heterozygoter Mutationen.

3.1.3.3 Metabolische Parameter

Die Serumleptinspiegel der PCOS-Patientinnen waren mit p = 0,004 signifikant höher als die der Kontrollpatientinnen. Zwischen den PCOS-Patientinnen mit und ohne OHSS in der [Seite 51↓]Anamnese war die Tendenz zu höheren Werten bei Patientinnen mit Überstimulationssyndrom zu erkennen. Dieser Unterschied war jedoch nicht statistisch signifikant. Dabei lag der Median der Leptinwerte in der Kontrollgruppe bei 9,5 ng/ml, in der PCOS-Gruppe bei 11,9 ng/ml und in der OHSS-Gruppe bei 17,0 ng/ml (Abb. 3.13).

Darüber hinaus war ein Zusammenhang zwischen den Leptinwerten und dem Grad der Zyklusstörung erkennbar. Der Median für Leptin lag bei den amenorrhoischen Frauen bei 15,3 ng/ml, bei den oligomenorrhoischen bei 12,0 ng/ml und bei den Frauen mit regelmäßigem Zyklus bei 9,3 ng/ml (Abb. 3.14).

Abb. 3.13: Verteilung der Serumleptinspiegel in den drei verschiedenen Gruppen.

Abb. 3.14: Verteilung der Serumleptinspiegel bei verschieden stark ausgeprägter Zyklusstörung.

Die Nüchternblutzuckerwerte sowie die Insulin- und IGF-1-Spiegel unterschieden sich nicht zwischen den verschiedenen Patientengruppen (BZ: medK = 95 mg/ dl; medPCOS = 99,5 [Seite 52↓]mg/ dl p = 0,2; Insulin: medK = 9 µU/ ml; medPCOS = 9,6 µU/ ml; p = 0,2; IGF-I: medK = 169 ng/ ml, medPCOS = 164,5 ng/ ml; p = 0,7).

3.1.4 Korrelationsanalyse

Zyklusstörungen

Der Grad der Zyklusstörung korrelierte bei unseren Patientinnen sehr stark mit den Spiegeln an Gesamttestosteron (r = 0,419; p = 0,001), freiem Testosteron (r = 0,364; p = 0,004) und SHBG (r = -0,34; p = 0,012). Außerdem bestand ein Zusammenhang mit den basalen DHEA-, DHEAS- und Androstendionwerten, nicht dagegen mit den Spiegeln an 17α-OHP (rDHEA = 0,32, p = 0,012; rDHEAS = 0,344, p = 0,007; rAndrost = 0,362; p = 0,004).

Bei der Korrelation zwischen dem Grad der Zyklusstörungen und dem BMI wurde zwar keine Signifikanz erreicht, aber es war die Tendenz erkennbar, dass ein höherer BMI auch mit einer Zunahme der Zyklusstörungen einhergeht. So lag der Median für den BMI in der Gruppe der amenorrhoischen Frauen bei 26,3, bei den oligomenorrhoischen Frauen bei 24,5 und bei den Patientinnen mit regelmäßiger Menstruation bei 22,6.

Blutdruck

Sowohl der systolischeals auch der diastolische Blutdruck korrelierten auf hohem Niveau mit den Spiegeln an freiem Testosteron (für RRsys: r = 0,363 ; p = 0,005 und für RRdiast: r = 0,424; p = 0,001). Darüber hinaus bestand ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem diastolischen Druck und Insulin (r = 0,402; p = 0,002) bzw. SHBG (r = -0,295; p = 0,034). Auch für den Body Mass Index deutete sich ein Einfluss auf den diastolischen Druck an, dieser war allerdings nicht signifikant (p = 0,062).

Hirsutismus

Der Grad des Hirsutismus korrelierte auf signifikantem Niveau mit den Serumspiegeln für freies Teststeron (r = 0,347; p = 0,007), für SHBG (r = -0,281; p = 0,04), für Androstendion (r = 0,365; p = 0,004) und 17α-Hydroxyprogesteron (r = 0,337; p = 0,009).

Sexualsteroide

Innerhalb der Sexualsteroide korrelierten die Spiegel für freies Testosteron gleichermaßen mit DHEA (r = 0,534; p < 0,0005) und DHEAS (r = 0,394; p = 0,002) wie auch mit Androstendion (r = 0,711; p < 0,0005) und 17α-OHP (r = 0,447, p < 0,0005). Abbildung 3.15 [Seite 53↓]zeigt diesen Zusammenhang beispielhaft für17α-OHP. Zwischen Androstendion und 17α-OHP bestand sowohl bei den basalen als auch bei den stimulierten Werten ein enger Zusammenhang (r = 0,594; p < 0,0005 bzw. r = 0,44; p < 0,0005) (Abb 3.16). Zwischen den Spiegeln an DHEA und seinem Sulfat, dem DHEAS, fanden wir bei unseren Probandinnen eine enge Beziehung (r = 0,6; p < 0,0005).

Die Werte für Testosteron und 17α-OHP korrelierten in der Kontrollgruppe nicht. In der Gruppe der PCOS-Patientinnen bestand dagegen ein enger Zusammenhang zwischen freiem Testosteron und den Basalwerten für 17α OHP (r = 0,526; p = 0,001) sowie dem Anstieg des 17α-OHP nach ACTH-Stimulation (r = -0,568; p < 0,0005). Dieser Zusammenhang war in der Gruppe der Patientinnen mit anamnestischen OHSS besonders stark ausgeprägt (r = 0,7; p = 0,002 bzw. r = -0,59; p = 0,012).

Abb. 3.15: Zusammenhang zwischen den basalen Serumwerten für17α-OH Progesteron und freiem Testosteron.


[Seite 54↓]

Abb. 3.16: Zusammenhang zwischen den basalen Serumwerten für 17α-OH Progesteron und Androstendion.

Metabolische Parameter

Zwischen dem Body Mass Index, den Serumleptin- und Insulinspiegeln sowie dem SHBG existierte ein enger Zusammenhang.

So korrelierte Leptin auf hohem Niveau mit dem BMI (r = 0,661; p < 0,005) (Abb. 3.17), bei etwa gleichem BMI unterschieden sich die Medianwerte für Leptin zwischen PCOS-Gruppe und Kontrollen kaum (Abb. 3.18). Außerdem bestand eine Korrelation zwischen Leptin und Insulin (r = 0,534; p < 0,0005) und dem SHBG (r = -0,466; p = 0,001) (Abb. 3.19). Die Werte für den BMI korrelierten ebenso mit Insulin (r = 0,421; p = 0,002) wie mit freiem Testosteron bzw. DHEAS (r = 0,311; p = 0,018 bzw. r = 0,31; p = 0,02). Des Weiteren fanden wir eine umgekehrte Proportionalität zwischen dem SHBG und dem BMI (r = -0,491; p < 0,0005) bzw. den Insulinspiegeln ( r =-0,395; p = 0,003).


[Seite 55↓]

Abb. 3.17: Zusammenhang von Serumleptinspiegeln und Body Mass Indices.

Abb. 3.18: Medianwerte der Serumleptinspiegel bei verschiedenen Body Mass Indices, Vergleich zwischen Kontroll- und PCOS-Patientinnen.


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Abb. 3.19: Zusammenhang von Serumleptin- und SHBG-Spiegeln.

Ein direkter Zusammenhang zwischen den Werten für die oben beschriebenen Parameter mit den Basalspiegeln an LH und FSH oder dem Quotienten aus LH und FSH konnte nur für 17α-OHP nachgewiesen werden. Dabei korrelierte das 17α-OHP mit dem Quotienten aus LH und FSH (r = 0,308; p = 0,018).

3.2 Ergebnisse der molekulargenetischen Untersuchungen

3.2.1 Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse

Vor der Untersuchung des CYP21A2-Gens auf Punktmutationen stand die Untersuchung hinsichtlich großer Deletionen oder Genkonversionen. Dafür nutzten wir die Techniken der Southern-Blot-Analyse.

Die Trennung von A1- und A2-Gen gelang durch den Einsatz der Restriktionsenzyme Taq I und Bgl II. Sie ermöglichen die getrennte Darstellung beider Genbereiche durch spezifische Spaltung, die mittels anschließender Hybridisierung mit der Plasmidsonde p21c/3c sichtbar gemacht werden konnten. Unter Einsatz der Endonuklease Taq I wurde ein 3,2 kb großes Fragment für das CYP21A1-Gen und ein 3,7 kb großes Fragment für das CYP21A2-Gen dargestellt. Bei der Spaltung mit Bgl II erhielten wir ein 12 kb großes Fragment für das CYP21A1-Gen und ein 10 kb großes Fragment für das CYP21A2-Gen.

Produkte des unequal crossing over sind 30 kb-Deletionen oder 30 kb-Duplikationen.


[Seite 57↓]

Die 30 kb große Deletion reicht vom 3'-Ende des CYP21A1-Gens bis zum 5'-Ende des CYP21A2-Gens und erzeugt im homozygoten Fall ein nicht funktionsfähiges, im heterozygoten Fall ein eingeschränkt funktionsfähiges CYP21A1/ CYP21A2-Hybridgen.

Homozygote 30 kb-Deletionen stellen sich in der Southern Blot Analyse als fehlende Banden und heterozygote 30 kb-Deletionen als vom Wildtyp abweichendes Verhältnis der Bandenstärken dar.

Homozygote Deletionen des CYP21A1-Gens stellen sich als fehlende Banden des 3,2 bzw.12kb großen Fragmentes dar, homozygote A2-Gen-Deletionen als fehlende 3,7 bzw. 10kb große Fragmente.

Bei heterozygoten Deletionen sind die Banden der entsprechenden Fragmente mit abgeschwächter Intensität sichtbar.

Für die Auswertung der Southern-Blot-Analyse mit Hilfe des Phospho-Imager-Systems nutzten wir für die Entwicklung der Phospho-Imager-Platte das Gerät FUJIX BAS 2000 der Firma Fuji. Die Auswertung der Daten erfolgte über das Programm TINA (Raytest), Version 2.09. Die Autoradiogramme der Southern-Blot-Analyse einer heterozygoten bzw. einer homozygoten A1-Deletion im Vergleich zu einer Kontrolle zeigen die Abbildungen 3.20 und 3.21.

Abb. 3.20: Autoradiogramm der 3,2 bzw. 3,7 kb grossen Fragmente. An Position 2 Nachweis einer homozygoten CYP21A1-Deletion (fehlende 3,2kb- Bande); in Position 5 Nachweis einer heterozygoten CYP21A1- Deletion (abgeschwächte 3,2kb-Bande).


[Seite 58↓]

Abb. 3.21: Autoradiogramm der 10 bzw. 12kb großen Fragmente. An Position 2 Nachweis einer homozygoten CYP21A1-Deletion (fehlende 12kb- Bande); in Position 5 Nachweis einer heterozygoten CYP21A1- Deletion (abgeschwächte 12kb-Bande).

Wir fanden bei insgesamt 15 Patientinnen heterologe CYP21A1- Deletionen, davon stammten 4 Patientinnen aus der Kontrollgruppe und bei 11 Patientinnen war ein PCOS nachgewiesen. Das entspricht einer Frequenz von 17% für die Kontrollgruppe und 28% für die Gruppe der Patientinnen mit polyzystischen Ovarien.

Die Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse für die einzelnen Patientinnen sind in Tabelle 3.1 dargestellt.


[Seiten 59 - 60↓]

Tab. 3.1: Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse.
Gruppe 1: Kontrollpatientinnen
Gruppe 2: Patientinnen mit PCOS
Gruppe 3: Patientinnen mit PCOS und OHSS

Pat.-Nr.

Pat.-Gruppe

Bgl II

12 kb : 10 kb

(Verhältnis der Intensität der Banden)

Taq I

3,2 kb : 3,7 kb

(Verhältnis der Intensität der Banden)

Interpretation

1

1

1 : 1

1 : 1

 

2

1

1 : 1

1 : 1

 

3

1

1 : 1

1 : 1

 

4

1

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

5

1

1 : 1

1 : 1

 

6

1

1 : 1

1 : 1

 

7

1

1 : 1

1 : 1

 

8

1

1 : 1

1 : 1

 

10

1

1 : 1

1 : 1

 

11

3

1 : 1

1 : 1

 

12

3

1 : 1

1 : 1

 

13

3

1 : 1

1 : 1

 

14

3

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

15

3

1 : 1

1 : 1

 

16

3

1 : 1

1 : 1

 

17

3

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

18

2

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

19

2

1 : 1

1 : 1

 

20

2

1 : 1

1 : 1

 

21

2

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

22

2

1 : 1

1 : 1

 

23

2

1 : 1

1 : 1

 

24

2

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

25

2

1 : 1

1 : 1

 

26

2

1 : 1

1 : 1

 

27

2

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

28

2

1 : 1

1 : 1

 

29

2

1 : 1

1 : 1

 

30

2

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

31

2

1 : 1

1 : 1

 

32

2

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

33

2

1 : 1

1 : 1

 

34

2

1 : 1

1 : 1

 

35

3

1 : 1

1 : 1

 

37

3

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

38

1

1 : 1

1 : 1

 

39

1

1 : 1

1 : 1

 

40

1

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

41

2

1 : 1

1 : 1

 

42

2

0 : 1

0 : 1

homozyg. A1-Deletion

43

3

1 : 1

1 : 1

 

45

1

1 : 1

1 : 1

 

46

3

1 : 1

1 : 1

 

47

3

1 : 1

1 : 1

 

48

1

1 : 1

1 : 1

 

49

1

1 : 1

1 : 1

 

50

1

1 : 1

1 : 1

 

51

2

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

52

1

1 : 1

1 : 1

 

53

1

1 : 1

1 : 1

 

54

1

1 : 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

55

2

1 : 1

1 : 1

 

57

1

1 : 1

1 : 1

 

58

3

1 : 1

1 : 1

 

59

3

1 : 1

1 : 1

 

60

1

1: 2

1 : 2

heterozyg. A1-Deletion

61

1

1 : 1

1 : 1

 

62

3

1 : 1

1 : 1

 

63

1

1 : 1

1 : 1

 

64

3

1 : 1

1 : 1

 

65

2

1 : 1

1 : 1

 

69

3

1 : 1

1 : 1

 

3.2.2 Ergebnisse des Mutationsscreenings

Nach spezifischer Amplifikation des CYP21A2-Gens mit 3 Primerpaaren wurden 14 Sequenzierprimer mit dem Computerprogramm OLIGO ausgewählt und anschließend für die automatische Sequenzierung eingesetzt. Auf diese Weise konnte die gesamte Sequenz des CYP21A2-Gens erfasst und auf Mutationen und Polymorphismen untersucht werden. Die Auswertung der Sequenzen erfolgte mit einem speziell dafür erstellten Unix-Programm.

Die Tabellen 3.2. bis 3.6. zeigen die Ergebnisse der molekulargenetischen Untersuchungen.

In dem von uns untersuchten Kollektiv fanden wir in insgesamt 11 Fällen heterozygote Mutationen, die bekanntermaßen im homozygoten Zustand ein AGS unterschiedlicher Ausprägung verursachen. Dabei handelt es sich in 9 Fällen um PCOS- Patientinnen, das [Seite 61↓]entspricht einer Frequenz an heterozygoten Mutationen in dieser Gruppe von 23,1%. Ein nennenswerter Unterschied zwischen beiden Gruppen der PCOS- Patientinnen ist nicht nachweisbar. 18% der PCOS- Patientinnen ohne OHSS und 29% derjenigen mit anamnestischem OHSS weisen heterozygote Mutationen auf. Demgegenüber stehen nur 2 Trägerinnen heterozygoter Mutationen in der Kontrollgruppe, entsprechend 8,7% der Kontrollpatientinnen.

Pathologische biochemische Befunde im Sinne eines oberhalb der 90. Perzentile der Kontrollgruppe liegenden Quotienten aus 17α-OHP bzw. 21-DOF und Cortisol fanden wir nur bei 5 der heterozygoten Mutationsträgerinnen, wobei eine dieser Patientinnen der Kontrollgruppe angehört. Zwei weitere PCOS- Patientinnen (davon eine mit OHSS) mit nachgewiesener Mutation fallen lediglich durch einen erhöhten Basalwert für 21-DOF bzw. einen erhöhten 17α-OHP-Wert nach ACTH-Stimulation auf. Eine Kontrollpatientin mit heterozygoter Mutation weist sowohl erhöhte Werte für 17α-OHP und 21-DOF nach ACTH- Stimulation wie auch einen erhöhten 17α-OHP- Basalwert auf.

Die folgenden beiden Tabellen (Tab 3.2. und 3.3.) geben Auskunft über molekulargenetische Details der detektierten Mutationen und ihre Verteilung in dem von uns untersuchten Kollektiv.

Tab. 3.2: Mutationen, die in unserem Patientenkollektiv in heterozygotem Zustand auftraten und deren klinische Auswirkung bei homozygotem Auftreten

Nr.

Name

Position

Intron/ Exon

Basen-austausch

Aminosäure-austausch

klinische Manifestation bei Homozygotie

Quelle

1

 

1675

vor

Exon 1

C–>T

 

LO AGS

64

2

P30L

1767

Exon 1

C–>T

Pro–>Leu

NC AGS

64

3

I2 Splice

2331

Intron 2

A/C–>G

 

abnormal splicing

SW/ SV AGS

64,65,66

4

V281L

3362

Exon 7

G–>T

Val–>Leu

NC AGS

65,66

5

Q318X

3673

Exon 8

C–>T

 

Nonsense mutation SW AGS

64,65,66


[Seite 62↓]

Tab. 3.3: Heterozygote Mutationen des CYP21A2-Gens und wichtige biochemische Parameter.
Q1: 17αOHP0/F0 : Quotient aus 17αOHP und Cortisol vor Stimulation durch ACTH
Q2: 17αOHP60/ F60 : Quotient aus 17αOHP und Cortisol 60 min nach Stimulation durch ACTH
Q3: 21 DOF0 x 100/ F0 :Quotient aus 21 DOF und Cortisol vor Stimulation durch ACTH
Q4: 21 DOF60x 100/ F60 : Quotient aus 21 DOF und Cortisol 60 min nach Stimulation durch ACTH
*Werte oberhalb der 90. Perzentile der Kontrollgruppe

Pat.-Nr.

Gruppe

Mutation

Allele

17αOHP0

17αOHP60

21 DOF0

21 DOF60

Q1

Q2

Q3

Q4

12

3

1767

C/T

0,60

7,40

0,10

0,61

0,23

0,53

0,04

0,04

25

2

1767

C/T

1,20

5,00

0,07

0,14

0,26

0,46

0,02

0,01

31

2

1675

C/T

2,40

9,80

0,12

0,51

1,30

2,50*

0,06

0,13

32

2

1767

C/T

4,90*

9,40

0,17

0,86

1,60*

1,70

0,06

0,16

33

3

1767

C/T

5,50

9,10

1,36*

1,13

2,25*

0,85

0,56

0,11

37

3

1767

C/T

1,20

4,20

0,74

1,11

0,21

0,42

0,13

0,11

41

2

1767

C/T

2,80

4,80

1,19*

0,72

0,69

0,64

0,29

0,10

46

3

2331

C/G

9,60*

9,60

0,25

3,54*

3,65*

1,24

0,1

0,46*

61

1

3673

C/T

6,00*

15,7*

0,33

2,79*

0,87

1,13

0,05

0,20

63

1

1767

C/T

4,60*

10,7*

0,10

0,62

1,68*

1,31

0,04

0,08

64

3

3362

G/T

3,50

12,1*

0,15

1,27

1,39

1,54

0,06

0,16

Bei der lückenlosen Darstellung der Gensequenz stießen wir auf eine Vielzahl weiterer heterozygoter Sequenzabweichungen, die nach unserem Kenntnisstand bisher in der Literatur nicht beschrieben worden sind. Sie sind im einzelnen gemeinsam mit den dazugehörigen biochemischen Parametern in der folgenden Tabelle (Tab. 3.4) aufgeführt.

Zu oberhalb der 90. Perzentile liegenden Quotienten aus 21-DOF und Cortisol führt lediglich der heterozygote Basenaustausch in Intron 4 bei einer PCOS-Patientin mit OHSS. Bei derselben Patientin besteht gleichzeitig eine heterozygote Splice- Mutation in Intron 2. Bei [Seite 63↓]zwei weiteren Patientinnen fanden wir bei Basenaustausch in Intron 8 pathologisch erhöhte Quotienten aus 17α-OHP und Cortisol. Bei einer dieser Patientinnen ist gleichzeitig eine heterozygote Mutation in Exon 1 nachzuweisen.


[Seite 64↓]

Tab. 3.4: Bisher nicht beschriebene Sequenzabweichungen im CYP21A2-Gen bei unseren Patientiennen und dazugehörige Laborparameter:
Q1: Quotient aus 17α-OHP und Cortisol vor Stimulation durch ACTH
Q2: Quotient aus 17α-OHP und Cortisol 60 min nach Stimulation durch ACTH
Q3: Quotient aus 21- DOF x 100 und Cortisol vor Stimulation durch ACTH
Q4: Quotient aus 21- DOF x 100 und Cortisol 60 min nach Stimulation durch ACTH
*Werte oberhalb der 90. Perzentile der Kontrollgruppe

Position

Intron/

Exon

Basen-

austausch

Aminosäureaustausch

Pat.

Nr.

Gruppe

Q1

Q2

Q3

Q4

1491

vor

Exon 1

A-Del

 

41

2

0,69

0,64

0,29

0,1

1598

vor

Exon 1

A–>C

 

30

2

1,37

1,2

0,11

0,06

35

3

1,37

0,95

0,07

0,19

49

1

0,55

0,66

0,04

0,12

1719

Exon 1

G–>C

Gly–>Ala

22

2

0,7

0,78

0,05

0,03

1798

Exon 1

G–>C

Leu–>Leu

5

1

0,59

1,25

0,07

0,1

1950

Intron 1

T-Del

 

21

2

0,54

1,12

0,04

0,18

2266

Intron 2

G–>A

 

35

3

1,37

0,95

0,07

0,19

49

1

0,55

0,65

0,04

0,12

61

1

0,87

1,13

0,05

0,2

2365

Exon 3

G-Ins

 

42

2

0,49

0,61

0,61

0,25

2371

Exon 3

G–>C

Pro–>Pro

60

1

0,75

0,72

0,04

0,06

2782

Intron 4

C–>A

 

16

3

0,16

0,48

0,02

0,07

2789

Intron 4

T–>C

 

46

3

3,65*

1,24

0,1

0,46*

47

3

0,76

1,02

0,11

0,11

2862

Exon 5

2G–>3G

 

12

3

0,23

0,53

0,04

0,04

2917

Intron 5

G–>A

 

8

1

0,9

0,54

0,35

0,05

3547

Intron 7

G–>A

 

10

1

0,62

0,82

0,1

0,13

3885

Intron 8

G–>A

 

32

2

1,6*

1,7

0,06

0,16

40

1

1,6*

0,8

  

4047

Intron 9

G–>A

 

64

3

1,39

1,54

0,06

0,16

65

2

0,53

0,64

0,06

0,03

4091

Intron 9

C–>G

 

12

3

0,23

0,53

0,04

0,04

4097

Intron 9

C–>T

 

10

1

0,62

0,82

0,1

0,13


[Seite 65↓]

Die Auswertung der detektierten Polymorphismen ergab keinen wesentlichen Unterschied zwischen Kontrollen und Patientinnen mit PCOS. Die Allelfrequenzen in beiden Gruppen für die jeweiligen Polymorphismen zeigt die folgende Tabelle (Tab.3.5). In Tabelle A.1. im Anhang ist die genaue Verteilung der Allele in Bezug auf die 22 verschiedenen Polymorphismen für jede einzelne Patientin enthalten.

Tab. 3.5: Polymorphismen des CYP21A2-Gens und ihre Allelfrequenz in unserem Patientenkollektiv (Kontroll-bzw. PCOS-Gruppe)

Nr.

Position

Intron/ Exon

Basen-austausch

Bedeutung

Quelle

Allelfrequenz Kontroll-gruppe

Allelefrequenz PCO-Gruppe

1

1706

Exon 1

CTG-Ins.

+ L10

3

0,63

0,51

2

1793

Exon 1

T –> C

silent mutation

3

0,1

0,13

3

1813

Exon 1

A –> C

silent mutation

3

0,22

0,2

4

2074

Intron 2

T –> C

 

3

0,13

0,18

5

2097

Intron 2

C –> A

 

3

0,57

0,39

6

2132

Intron 2

T –> C

 

3

0,76

0,7

7

2242

Intron2

G-Ins.

  

0,72

0,49

8

2272

Intron 2

G –> A

  

0,02

0,01

9

2279

Intron2

C –> G/A

  

A: 0,11

G: 0,04

A: 0,13

G: 0

10

2307

Intron2

C –> G

  

0

0,01

11

2331

Intron2

C –> A

  

0,59

0,53

12

2361

Exon 3

A –> G

Lys–>Arg

2, 3

0,63

0,49

13

2538

Intron 3

C –> T

 

3

0,48

0,26

14

3098/ 99

Intron 6

AC–>GT

 

3

0,07

0,12

15

3235

Intron 6

C –> T

  

0,07

0,09

16

3264

Exon 7

C –> G

silent mutation

3

0,13

0,12

17

3323

Exon 7

G –> C

Ser–>Thr

2

0,07

0,09

18

3467

Intron 7

G –> C

  

0,02

0

19

3925

Exon 9

C –> T

silent mutation

3

0,07

0,18

20

4049

Intron 9

C –> G

  

0,93

0,9

21

4369

Exon 10

A –> G

silent mutation

3

0,63

0,59

22

4377

Exon 10

A –> G

Asn–>Ser

3

0,72

0,59


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11.02.2004