Aus der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe der Medizinischen Fakultät Charité der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Molekulargenetische, endokrinologische und klinische Untersuchungen bei Patientinnen mit Polyzystischem Ovar Syndrom und Ovariellem Überstimulationssyndrom

Zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Susanne Müller

aus Leipzig

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. W. Lichtenegger
2. Prof. Dr. med. W. Friedmann
3. Prof. Dr. med. H. Alexander

Datum der Promotion:20.01.2003

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Aufgabenstellung der Arbeit
  • 1.2 Polyzystisches Ovar Syndrom (PCOS)
    • 1.2.1 Einführung
    • 1.2.2 Klinik
    • 1.2.3 Morphologie
    • 1.2.4  Biochemische Befunde
    • 1.2.5  Pathogenese des PCOS
    • 1.2.6 Folgeerkrankungen
      • 1.2.6.1 Kardiovaskuläre Erkrankungen
      • 1.2.6.2 Diabetes mellitus
      • 1.2.6.3 Malignome
    • 1.2.7 PCOS und Gravidität
  • 1.3 Ovarielles Hyperstimulationssyndrom (OHSS)
    • 1.3.1 Einführung
    • 1.3.2 Klinik
    • 1.3.3  Klassifikation
    • 1.3.4 Pathogenese und Risikofaktoren
    • 1.3.5 Koinzidenz von PCOS und OHSS
  • 1.4 21-Hydroxylase
    • 1.4.1 Das Enzym 21-Hydroxylase
      • 1.4.1.1 Funktion der 21-Hydroxylase
      • 1.4.1.2 Klinik des 21-Hydroxylase-Mangels
      • 1.4.1.3 Diagnostik des 21-Hydroxylase-Mangels
    • 1.4.2 Das Gen CYP 21
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Patientenkollektiv
  • 2.2 Untersuchungsablauf
  • 2.3 Klinische Untersuchungen
  • 2.4 Endokrinologische Untersuchungen
    • 2.4.1 LHRH-Test
    • 2.4.2 ACTH-Test
    • 2.4.3 Metabolische Parameter
  • 2.5 Genetische Untersuchungen
    • 2.5.1 Präparation genomischer DNA
    • 2.5.2 Untersuchung der DNA
      • 2.5.2.1 Southern-Blot-Analyse
      • 2.5.2.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
      • 2.5.2.3 Sequenzierung
  • 2.6 Statistische Auswertung
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Ergebnisse der klinischen und biochemischen Untersuchungen
    • 3.1.1 Statistische Grundlagen
    • 3.1.2 Klinische Befunde
    • 3.1.3  Biochemische Befunde
      • 3.1.3.1 LHRH-Test
      • 3.1.3.2 ACTH-Test
      • 3.1.3.3 Metabolische Parameter
    • 3.1.4 Korrelationsanalyse
  • 3.2 Ergebnisse der molekulargenetischen Untersuchungen
    • 3.2.1 Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse
    • 3.2.2 Ergebnisse des Mutationsscreenings
• 4  Diskussion
  • 4.1 Diskussion der Ergebnisse der klinischen und biochemischen Untersuchungen
    • 4.1.1 Ziel der Untersuchungen
    • 4.1.2  Unterschiede im Hormonprofil zwischen PCOS-Patientinnen und Kontrollen
    • 4.1.3 Hinweise auf ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung eines OHSS
    • 4.1.4 Bedeutung der metabolischen Parameter
      • 4.1.4.1 Leptin
      • 4.1.4.2 Insulin
      • 4.1.4.3 Insulin-like growth factor 1
    • 4.1.5 Beurteilung der Aussagekraft biochemischer Untersuchungen zur Differenzierung zwischen den Gruppen
    • 4.1.6  Beurteilung der Ergebnisse der Blutdruckmessung
  • 4.2 Diskussion der Ergebnisse der molekulargenetischen Untersuchungen
    • 4.2.1 Genetische Untersuchungen im Zusammenhang mit PCOS
      • 4.2.1.1 Genetische Modelle
      • 4.2.1.2 Kandidatgene
      • 4.2.1.3  CYP21A1 als Kandidatgen
    • 4.2.2 Bedeutung von Pseudogenen
    • 4.2.3 Allele des CYP21A2-Gens
    • 4.2.4 Diskussion der eigenen genetischen Ergebnisse
    • 4.2.5 Genotyp-Phänotyp-Korrelation
    • 4.2.6 Methodenkritik
    • 4.2.7 Notwendigkeit der genetischen Untersuchung der 21-Hydroxylase
• 5  Zusammenfassung
• Literaturverzeichnis
• Erklärung
• Danksagung
• Lebenslauf
• Eigene Publikationen und Kongressbeiträge
• Patientenaufklärung
• Einverständniserklärung
• Verwendete Stammlösungen und Chemikalien
• Abkürzungen
• Quelldaten
• Tabelle A.1 - Verteilung der Polymorphismen

Tabellen

• Tab. 2.1: Sequenzen der PCR-Primerpaare zur Amplifikation von Fragment 1-3; r= reverse primer. Jeweils ein Primer enthält eine für das CYP21A2-Gen spezifische Sequenz.
• Tab. 2.2: Thermoprofile der Cyclerprogramme
• Tab. 2.3: Zusammensetzung der PCR-Ansätze
• Tab. 2.4: Sequenzen der eingesetzten Sequenzierprimer, r= reverse primer
• Tab. 3.1: Ergebnisse der Southern-Blot-Analyse.Gruppe 1: KontrollpatientinnenGruppe 2: Patientinnen mit PCOSGruppe 3: Patientinnen mit PCOS und OHSS
• Tab. 3.2: Mutationen, die in unserem Patientenkollektiv in heterozygotem Zustand auftraten und deren klinische Auswirkung bei homozygotem Auftreten
• Tab. 3.3: Heterozygote Mutationen des CYP21A2-Gens und wichtige biochemische Parameter.Q1: 17αOHP0/F0 : Quotient aus 17αOHP und Cortisol vor Stimulation durch ACTHQ2: 17αOHP60/ F60 : Quotient aus 17αOHP und Cortisol 60 min nach Stimulation durch ACTHQ3: 21 DOF0 x 100/ F0 :Quotient aus 21 DOF und Cortisol vor Stimulation durch ACTHQ4: 21 DOF60x 100/ F60 : Quotient aus 21 DOF und Cortisol 60 min nach Stimulation durch ACTH*Werte oberhalb der 90. Perzentile der Kontrollgruppe
• Tab. 3.4: Bisher nicht beschriebene Sequenzabweichungen im CYP21A2-Gen bei unseren Patientiennen und dazugehörige Laborparameter:Q1: Quotient aus 17α-OHP und Cortisol vor Stimulation durch ACTHQ2: Quotient aus 17α-OHP und Cortisol 60 min nach Stimulation durch ACTHQ3: Quotient aus 21- DOF x 100 und Cortisol vor Stimulation durch ACTHQ4: Quotient aus 21- DOF x 100 und Cortisol 60 min nach Stimulation durch ACTH*Werte oberhalb der 90. Perzentile der Kontrollgruppe
• Tab. 3.5: Polymorphismen des CYP21A2-Gens und ihre Allelfrequenz in unserem Patientenkollektiv (Kontroll-bzw. PCOS-Gruppe)
• Tab. 4.1: Durch Konversion aus CYP21A1 entstandene Mutationen des CYP21A2-Gens und biochemische Manifestation des 21-Hydroxylase-Mangels (SV: simple virilising; SW: salt wasting, NC: non classical), siehe auch Seiten 13 und 14.
• Tab. 4.2: Polymorphismen des CYP21A2-Gens, deren Sequenz mit der des Pseudogens übereinstimmt.
• Tab 4.3: Relevante Mutationen des CYP21A2-Gens ohne Zusammenhang zum CYP21A1-Gen.
• Tab. 4.4: CYP21A2-Polymorphismen, die nicht durch Konversion entstanden sind.
• Tab.A.1: Verteilung der detektierten Polymorphismen bei den einzelnen Patientinnen (x = heterozygote Form, xx = homozygote Form.

Bilder

• Abb. 1.1: Transvaginale sonografische Darstellung des linken Ovars bei einer 32jährigen Patientin mit PCO. Typische Verdickung der Tunica albuginea, zahlreiche randständige Follikel (Quelle: Frauenklinik der Charité Campus Mitte).
• Abb. 1.2: Transvaginalsonografische Abbildung des Situs einer 35jährigen Patientin mit einem ovariellen Überstimulationssyndrom 2.Grades. Ausgeprägter Ascites im Douglasschen Raum, kleiner anteflektierter Uterus, rechtes Ovar von 83 x 52 mm mit multiplen Follikeln (Quelle: Frauenklinik der Charité Campus Mitte)
• Abb. 1.3: Schematische Darstellung der adrenalen Steroidhormonbiosynthese
• Abb. 2.1: Gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkt 1 (ca. 1000 bp) und Längenstandard.
• Abb. 2.2: Gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkt 2 (ca. 1000 bp) und Längenstandard.
• Abb. 2.3: Gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkt 3 (ca. 2000 bp) und Längenstandard.
• Abb. 3.1: Verteilung der Body Mass Indices in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe aller PCOS-Patientinnen.
• Abb. 3.2: Verteilung der diastolischen und systolischen Blutdruckwerte in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe aller PCOS-Patientinnen.
• Abb. 3.3: Verteilung der LH-Basalwerte der drei Gruppen.
• Abb. 3.4: Darstellung der Quotienten aus LH30 und LH0 als Ausdruck des Anstiegs der LH-Werte p. stim. der drei Gruppen.
• Abb. 3.5: Verteilung der FSH-Basalwerte in den drei verschiedenen Gruppen.
• Abb. 3.6: Darstellung der Quotienten aus LH und FSH jeweils basal bzw. 30 min p.stim. in den drei verschiedenen Gruppen.
• Abb. 3.7: Verteilung der Serumwerte für freies Testosteron in den drei Gruppen
• Abb. 3.8: Verteilung der Serumwerte für Gesamttestosteron in den drei Gruppen
• Abb. 3.9: Verteilung der Serumwerte für SHBG in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe aller PCOS-Patientinnen.
• Abb. 3.10: Verteilung der Basalwerte für DHEAS im Serum in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe der PCOS-Patientinnen ohne bzw. mit anamnestischem OHSS.
• Abb. 3.11: Verteilung der basalen bzw. stimulierten Serumwerte für 17α-Hydroxyprogesteron in den drei Gruppen.
• Abb. 3.12: Verteilung der Androstendionwerte basal bzw. 60 min p. stim. in der Kontrollgruppe im Vergleich zur Gruppe aller PCOS-Patientinnen.
• Abb. 3.13: Verteilung der Serumleptinspiegel in den drei verschiedenen Gruppen.
• Abb. 3.14: Verteilung der Serumleptinspiegel bei verschieden stark ausgeprägter Zyklusstörung.
• Abb. 3.15: Zusammenhang zwischen den basalen Serumwerten für17α-OH Progesteron und freiem Testosteron.
• Abb. 3.16: Zusammenhang zwischen den basalen Serumwerten für 17α-OH Progesteron und Androstendion.
• Abb. 3.17: Zusammenhang von Serumleptinspiegeln und Body Mass Indices.
• Abb. 3.18: Medianwerte der Serumleptinspiegel bei verschiedenen Body Mass Indices, Vergleich zwischen Kontroll- und PCOS-Patientinnen.
• Abb. 3.19: Zusammenhang von Serumleptin- und SHBG-Spiegeln.
• Abb. 3.20: Autoradiogramm der 3,2 bzw. 3,7 kb grossen Fragmente. An Position 2 Nachweis einer homozygoten CYP21A1-Deletion (fehlende 3,2kb- Bande); in Position 5 Nachweis einer heterozygoten CYP21A1- Deletion (abgeschwächte 3,2kb-Bande).
• Abb. 3.21: Autoradiogramm der 10 bzw. 12kb großen Fragmente. An Position 2 Nachweis einer homozygoten CYP21A1-Deletion (fehlende 12kb- Bande); in Position 5 Nachweis einer heterozygoten CYP21A1- Deletion (abgeschwächte 12kb-Bande).