Aus der Klinik
für Allgemein-, Viszeral-, und Transplantationschirurgie
Charité, Medizinische Fakultät der Humboldt Universität zu Berlin
Campus Virchow Klinikum

DISSERTATION

Beurteilung biochemischer Stoffwechselaktivitäten eines hybriden Leberunterstützungssystems während erster klinischer Anwendungen

zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt Universität zu Berlin

von
Adrian Phillip Mundt

aus Heidelberg

Dekan:
Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Neuhaus
2. Prof. Dr. med. Schnoy
3. Prof. Dr. med. Hopf

Datum der Einreichung: 28.10.2001

Datum der Promotion: 10. Juni 2002

Zusammenfassung

Ziel der Arbeit ist die Beurteilung der biochemischen Stoffwechselaktivität eines hybriden, extrakorporalen Leberunterstützungssystems während initialer therapeutischer Anwendungen. Das System basiert auf der Nutzung porciner Hepatozyten, die in einem Bioreaktor kultiviert werden. Acht Patienten in akutem Leberversagen, Komagrad III-IV, wurden unter kontinuierlicher Plasmaseparation mit dem System behandelt.

Es wird ein Modell zur Bestimmung der Netto-Stoffwechselbilanz des Bioreaktors vorgestellt. Dieses Modell basiert auf der gleichzeitigen Bestimmung von Stoffkonzentrationen im Patientenplasma, gewonnen vom Patienten direkt und nach Durchfließen des Bioreaktors in bestimmten Zeitintervallen. Die Stoffwechselaktivität des Bioreaktors bezüglich der Stoffe Ammonium, Glutamin, Harnstoff, porcines Albumin, Glucose und Laktat wird dargestellt. Fünf der sieben eingesetzten Bioreaktoren nahmen kontinuierlich Ammonium auf, sechs von sieben Bioreaktoren synthetisierten Harnstoff und alle Bioreaktoren synthetisierten porcines Albumin. Die Ergebnisse zeigen, daß die Parameter Harnstoff und Ammonium am besten geeignet sind, Aussagen über die Stoffwechselaktivität der Bioreaktoren während der Therapie zu liefern. Porcines Albumin kann retrospektiv als Kontrolle der Syntheseleistung eingesetzt werden, steht aber nicht während der Therapie zur Verfügung. Die Bilanzierung von Glucose wird am stärksten durch äußere Einflußfaktoren gestört. Laktat stellt sich als ungeeignet für eine Verlaufskontrolle heraus, weil die Bioreaktoren die stark schwankenden Patientenplasmaspiegel nur unwesentlich beeinflussen konnten.

Eigene Schlagworte: Hybride Leberunterstützung, extrakorporal, Ammonium, Harnstoff

Abstract

A hybrid liver support system based on porcine liver cells was investigated in patients suffering from acute liver failure, coma stage III-IV. The biochemical activity of the system during the application was studied. Patient plasma was drawn systemically and after circulation through the bioreactor system at four hour intervals. A method is introduced that takes into account the rate of plasma flow and the differences in plasma concentration systemically and after circulation through the liver support system to determine the net release or uptake of metabolites such as ammonia, urea and glucose, glutamine, porcine albumine, lactate. Urea release was seen in 6 out of 7 bioreactors at all time points during treatment. Continuous ammonia uptake was seen in 5 out of 7 bioreactors used for treatment. Porcine albumine was seen in all patients. An active role of the system in glucose metabolism was observed. Lactate levels did not yield any information on bioreactor metabolic activity. All patients were bridged successfully to liver transplantation.

Keywords: Hybrid liver, extracorporeal , ammonia , urea

Inhaltsverzeichnis

• 1  EINLEITUNG
  • 1.1 Akutes Leberversagen
  • 1.2 Die hepatische Enzephalopathie
    • 1.2.1 Ammonium
    • 1.2.2 Mercaptane
    • 1.2.3 Kurz- und mittelkettige Fettsäuren
    • 1.2.4 Phenole
    • 1.2.5 Synergismus der einzelnen Neurotoxine
  • 1.3  Ammonium-, Aminosäure- und Proteinstoffwechsel, Harnstoffzyklus
  • 1.4  Glucosestoffwechsel der Hepatozyten
  • 1.5 Laktatstoffwechsel
  • 1.6 Konservative Therapie des akuten Leberversagens
  • 1.7 Leberunterstützungssysteme
    • 1.7.1 Künstliche Leberunterstützungssysteme
    • 1.7.2 Biologische Leberunterstützungssysteme
    • 1.7.3 Hybride Leberunterstützungssysteme
  • 1.8 Indikation für die extrakorporale Leberunterstützung
  • 1.9 Beurteilung der Stoffwechselaktivität hybrider Leberunterstützungssysteme anderer Arbeitsgruppen
    • 1.9.1 Arbeitsgruppe Demetriou[89, 90]
    • 1.9.2 Arbeitsgruppe Sussman, Kelly[95]
    • 1.9.3 Arbeitsgruppe Margulis[97, 98]
  • 1.10 Fragestellung der eigenen Arbeit
• 2  MATERIAL UND METHODEN
  • 2.1 Beschreibung des Leberzellreaktors
  • 2.2 Sicherheitsfunktionen des Bioreaktors
  • 2.3 Systemaufbau
  • 2.4 Spendertiere
  • 2.5 Organentnahme
  • 2.6 Zellisolierungsverfahren
  • 2.7 Zellmenge und -viabilität, Quantifizierung der Zellschädigung
  • 2.8 Kulturmedium
  • 2.9 Zelleinfüllung
  • 2.10 Der Zellkulturbetrieb
    • 2.10.1  Einstellungen
    • 2.10.2 Funktions- und Qualitätsabschätzung der Zellkultur
    • 2.10.3 Leberfunktionstests und Stoffwechselleistung
    • 2.10.4 Protokollierung
  • 2.11 Voraussetzungen für den klinischen Einsatz und Therapieplanung
  • 2.12 Einschlußkriterien
  • 2.13 Ausschlußkriterien
  • 2.14  Darstellung der Plasmaseparation
  • 2.15 Therapieüberwachung und Datenerhebung
  • 2.16 Bestimmung der Stoffwechselleistung
  • 2.17 Bestimmung der Parameter
    • 2.17.1 Bestimmung der Glucose–Konzentration
    • 2.17.2 Bestimmung der Laktat-Konzentration
    • 2.17.3 Bestimmung der Harnstoff-Konzentration
    • 2.17.4 Bestimmung der Ammonium-Konzentration
• 3  ERGEBNISSE
  • 3.1  Ammoniumstoffwechsel
  • 3.2  Glutaminstoffwechsel
  • 3.3  Harnstoffwechsel
  • 3.4 Liberation porcinen Albumins
  • 3.5  Glucosestoffwechsel
    • 3.5.1 Glucosespiegel der Patienten
    • 3.5.2 Begleitmedikation mit Einfluß auf den Glucosespiegel des Patienten
    • 3.5.3  Glucosestoffwechsel des Bioreaktors
  • 3.6  Laktat
• 4  DISKUSSION
  • 4.1 Ammoniumstoffwechsel
  • 4.2 Glutaminstoffwechsel
  • 4.3 Harnstoffwechsel
  • 4.4 Porcines Albumin
  • 4.5  Glucosestoffwechsel
    • 4.5.1 Glucoseeinstellung der Patienten während der Therapie
    • 4.5.2 Glucosestoffwechsel des Bioreaktors
  • 4.6 Laktatstoffwechsel
  • 4.7  Effektivität hybrider Leberunterstützungssysteme im klinischen Einsatz / Möglichkeiten der Optimierung
  • 4.8 Risiken hybrider Leberunterstützungssysteme
    • 4.8.1 Antikoagulation
    • 4.8.2 Biokompatibilität
    • 4.8.3  Transmissionsrisiko durch xenogenen Kontakt
    • 4.8.4  Immunologische Aspekte
  • 4.9  Ethische Aspekte
  • 4.10 Ausblick
    • 4.10.1 Zellquellen
    • 4.10.2 Qualitätssicherung hybrider Leberunterstützungssysteme
• Literaturverzeichnis
• Abkürzungsverzeichnis
• Lebenslauf
• Danksagung
• Erklärung an Eides Statt

Tabellen

• Tabelle 1: Ursachen des akuten Leberversagens nach W. M. Lee 1993[5]
• Tabelle 2:Zuordnung von Klassifikation und Ätiologie des Leberversagens nach O’Grady und Williams[6]
• Tabelle 3: Gradeinteilung der Enzephalopathie nach Trey[1]
• Tabelle 4: Meilensteine in der Entwicklung hybrider Leberunterstützungssysteme nach Busse 1999[87]
• Tabelle 5: Effektparameter für die Bioartificial Liver BAL, Rozga 1994
• Tabelle 6: Biochemische Effektparameter aus der Arbeitsgruppe Margulis
• Tabelle 7: Ausschluß von Zoonosen
• Tabelle 8: Zusammensetzung der Zellisolationslösungen
• Tabelle 9: Leberfunktionstests
• Tabelle 10: Voraussetzungen einer Zellkultur für den Einsatz zur Therapie
• Tabelle 11: Allgemeine Patientendaten
• Tabelle 12: Bioreaktordaten
• Tabelle 13: Glucoseinfusion
• Tabelle 14: Noradrenalingabe bei Patient 5 und 6
• Tabelle 15: Gabe von FFP-Konserven
• Tabelle 16: verwendete Zellmasse verschiedener hybrider Leberunterstützungssysteme
• Tabelle 17: Filtratflußraten verschiedener Leberunterstützungssysteme
• Tabelle 18: Risiken hybrider Leberunterstützung

Bilder

• Abb. 1: Schematische Darstellung des Glutaminzyklus und des Harnstoffzyklus
• Abb. 2: Schematische Darstellung des hLUS. A. Bioreaktor mit Schutzgehäuse und Erwärmungsvorrichtung. B. Bioreaktormonitor mit Gasversorgung und Pumpen für den Bioreaktorkreislauf. C. Patientenmonitor zur Plasmagewinnung.
• Abb. 3: Schematische Darstellung des Kapillarnetzwerkes
• Abb. 4: Schematische Darstellung des extrakorporalen Kreislaufs. P = Druckmessung, LD = Luftdetektor, SV = Sicherheitsventil, BP = Blutpumpe, RP = Reaktorpumpe, FP = Filtratpumpe
• Abb. 5: Ammoniumspiegel der Patienten während der Therapie; gestrichelte Linie: Therapieende bzw. –unterbrechung; Therapiebeginn bei Zeitpunkt 0.
• Abb. 6: Ammoniumplasmaspiegel in Patient 6 und Bioreaktor 6; berechnete Ammoniumaufnahme durch den Bioreaktor (graue Balken); gestrichelte Linie: Therapieunterbrechung.
• Abb. 7: Ammoniumaufnahme und -freisetzung durch die Bioreaktoren; gestrichelte Linie: Therapieunterbrechung
• Abb. 8: Verlauf der Glutaminspiegel der Patienten während der Therapie; gestrichelte Linien: Therapieende bzw. -unterbrechung; Therapiebeginn bei Zeitpunkt 0.
• Abb. 9: Glutaminaufnahme/-freisetzung der Bioreaktoren
• Abb. 10: Verlauf der Harnstoffspiegel aller Patienten während der Therapie; gestrichelte Linien: Therapieende bzw. -unterbrechung; Therapiebeginn bei Zeitpunkt 0.
• Abb.10 a: Verlauf der Harnstoffspiegel aller Patienten außer Patient 2 während der Therapie; Patient 2 hatte auf Grund einer vorbestehenden renalen Erkrankung hohe Plasmaharnstoffkonzentrationen, so daß durch Weglassen eine übersichtlichere Darstellung der Y-Achse ermöglicht wird. Therapiebeginn bei Zeitpunkt 0; gestrichelte Linie: Therapieende bzw Therapieunterbrechung.
• Abb. 11: Creatininspiegel aller Patienten während der Therapie; Therapiebeginn bei Zeitpunkt 0; gestrichelte Linie: Therapieende bzw. -unterbrechung.
• Abb. 12: Harnstoffplasmaspiegel in Patient 6 und Bioreaktor 6; graue Balken: Harnstoffliberation durch den Bioreaktor; gestrichelte Linie: Therapieunterbrechung
• Abb. 13: Harnstoffaufnahme/-freisetzung der Bioreaktoren während der Therapie
• Abb. 14: Schweinealbumin-Plasmakonzentration der Patienten
• Abb. 15: Glucosespiegel der Patienten während der Therapie; gestrichelte Linie: Therapieende bzw. –unterbrechung; Therapiebeginn bei Zeitpunkt 0.
• Abb. 16: Fresh Frozen Plasma
• Abb. 17: Glucosefreisetzung/-aufnahme durch die Bioreaktoren während der Therapie
• Abb. 18: Glucoseplasmaspiegel von Patient 6 und Bioreaktor 6; graue Balken: berechnete Glucosefreisetzung durch den Bioreaktor; gestrichelte Linie: Therapieunterbrechung
• Abb. 19: Laktatplasmaspiegel von Patient 1 und Bioreaktor 1 (Normalbereich 0,63-2,44 mmol/l)
• Abb. 20: Laktatplasmaspiegel Patient 2 und Bioreaktor 2 (Normalbereich 0,63-2,44 mmol/l)
• Abb. 21: Laktatplasmaspiegel von Patient 3 und Bioreaktor 3 (Normalbereich 0,63-2,44 mmol/l)
• Abb. 22: Laktatplasmaspiegel von Patient 4 und Bioreaktor 4 (Normalbereich 0,63-2,44 mmol/l) a = Konzentrationsdifferenz am Zeitpunkt 2 Stunden b = zeitliche Verzögerung durch Durchmischungsverhältnisse im Bioreaktor von ca. 2 Stunden
• Abb. 23: Laktatspiegel Bioreaktor um 2 Std. verzögert und Patient 4 (Normalbereich 0,63-2,44 mmol/l)
• Abb. 24: Laktatplasmaspiegel Patient 5 und Bioreaktor 5 (Normalbereich 0,63-2,44 mmol/l)
• Abb. 25: Laktatplasmaspiegel Patient 6 und Bioreaktor 6 (Normalbereich 0,63-2,44 mmol/l)
• Abb. 26: Laktatplasmaspiegel von Patient 7 und Bioreaktor 7 (Normalbereich 0,63-2,44 mmol/l)
• Abb. 27: Laktatplasmaspiegel Patient 8 und Bioreaktor 8 (Normalbereich 0,63-2,44 mmol/l)
• Abb. 28: Ammoniumbilanz von 14 Bioreaktoren aus dem Zellkulturbetrieb
• Abb. 29: Netto-Harnstoffbilanz von 7 Bioreaktoren im Zellkulturbetrieb
• Abb. 30: Glucosebilanz von 14 Bioreaktoren im Zellkulturbetrieb
• Abb. 31: Laktatbilanz von 15 Bioreaktoren aus dem Zellkulturbetrieb