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1  EINLEITUNG

Zur Therapie des Leberversagens befinden sich verschiedene extrakorporale Behandlungsverfahren in der klinischen Erprobung. Neben artifiziellen Verfahren finden sich biologische und hybride, kombiniert biologisch-artifizielle, Verfahren zur Leberunterstützungstherapie. In die Gruppe der letztgenannten gehören Systeme, bei denen Leberzellen in einem extrakorporalen Kreislauf mit dem Plasma der Patienten in Kontakt gebracht werden. Ziel ist eine unterstützende Stoffwechselleistung durch diese Leberzellen, um die Progression des Leberversagens zu stoppen bzw. die Symptome zu mildern, in der Hoffnung, Zeit für eine spontane Regeneration der patienteneigenen Leber zu gewinnen oder eine sichere Überbrückung der Patienten bis zur Durchführung einer Organtransplantation zu ermöglichen.

Neben der klinischen Bewertung solcher Systeme gehört ein Verständnis der Kapazität des Stoffumsatzes zu den Voraussetzungen für eine kritische Evaluation und eine Weiterentwicklung dieser jungen biomedizinischen Methode. Eine solche Beurteilung soll anhand von klinischen Daten für das BELS (Berliner Extrakorporales Leberunterstützungssystem) durchgeführt werden, und die Ergebnisse sollen den Darstellungen anderer Arbeitsgruppen gegenübergestellt werden.

1.1 Akutes Leberversagen

Das akute Leberversagen ist ein schweres, rasch progredientes und oft tödlich verlaufendes Krankheitsbild, dem massive Leberzellschädigung oder -nekrosen zugrunde liegen. Innerhalb von 8-12 Wochen nach Auftreten eines Ikterus kommt es zum Einsetzen der hepatischen Enzephalopathie bei zuvor lebergesunden Personen.[1] In der Folge kommt es zu Störungen im Säure-Basen-Haushalt, der Nierenfunktion, sämtlicher Organsysteme bis hin zu hyperdynamem Kreislaufversagen, Sepsis und der oft lebensbedrohenden Hirndrucksteigerung mit Gefahr einer Herniation.[2] Die Letalität des akuten Leberversagens beträgt in Abhängigkeit der Ätiologie 20%-80%.

Die häufigste Ursache des akuten Leberversagens weltweit sind virale Hepatitiden,[3] gefolgt von medikamenteninduziertem Leberversagen. Jedoch sind große regionale Unterschiede festzustellen. So ist zum Beispiel die Acetaminophenvergiftung mit suizidaler Absicht in Großbritannien die häufigste Ursache, wohingegen sie in anderen Ländern eine untergeordnete Rolle spielt.[4]


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Tabelle 1: Ursachen des akuten Leberversagens nach W. M. Lee 1993[5]

Ursache des ALF

verantwortliches Agens

Virushepatitis

Hepatitis Virus A, B, C, D, E und F (?)

Herpes Simplex Virus

Medikamenteninduziert

Acetaminophen

idiosynkratische Reaktionen

Toxine

Tetrachlorkohlenstoffe

Amanita phalloides

Phosphor

Gefäßbedingt

Ischämie

venöse Verschlußkrankheit

Hitzschlag

Tumor

verschiedene

Morbus Wilson

Schwangerschaftsfettleber

Reye’s Syndrom

O’Grady schlug eine weitere Einteilung des Leberversagens in hyperakut, akut und subakut vor, mit einem zeitlichen Abstand zwischen Einsetzen des Ikterus und der hepatischen Enzephalopathie von wenigen Tagen beziehungsweise Wochen oder Monaten. Daraus ergibt sich für jede Klasse ein unterschiedlicher Schweregrad der Prognose in Abhängigkeit der Ätiologie.


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Tabelle 2:Zuordnung von Klassifikation und Ätiologie des Leberversagens nach O’Grady und Williams[6]

 

hyperakut

akut

subakut

Zeitspanne zwischen Einsetzen von Ikterus und hepatischer Enzephalopathie

0-7 Tage

1-4 Wochen

1-6 Monate

Ätiologie

Intoxikationen (Paracetamol, Ammanita phalloides), HAV, HBV

HBV, Arzneimittel-reaktionen

NANB Hepatitis

Nach Ausschöpfen konventioneller Therapiemethoden stellt die Lebertransplantation die derzeit anerkannte Therapie für das akute Leberversagen dar.[7] Die Überlebensraten in den USA nach Lebertransplantation reichen von 46% bis 89%.[8] Um die Überlebensrate der Patienten zu verbessern, wurden drei prinzipiell unterschiedliche Verfahren entwickelt. Artifizielle Systeme wie Dialyse, Aktivkohlefilter oder Plasmaaustausch können lediglich detoxifizierende Funktionen der Leber übernehmen. Die extrakorporale Perfusion ganzer Organe, die auch metabolische Funktionen übernehmen, konnte sich klinisch bisher nicht durchsetzen. Mit der klinischen Erprobung hybrider Leberunterstützungsverfahren konnten die Effekte der beiden anderen Methoden kombiniert werden. Erste klinische Anwendungen weltweit lieferten vielversprechende Ergebnisse.

1.2 Die hepatische Enzephalopathie

Das akute Leberversagen ist durch das Auftreten einer rasch progredienten Enzephalopathie charakterisiert, die in folgende Stadien eingeteilt werden kann.


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Tabelle 3: Gradeinteilung der Enzephalopathie nach Trey[1]

Grad

Bewußtsein

Tremor

EEG

Prognose

I

Wechselnde Verwirrung, Konzentrationsschwäche, wechselnde Stimmung, verwaschene Sprache

leicht

unauffällig

gut

II

Steigerung von Grad I, Verhaltensstörung, Desorientierung, Verlust der Sphinkterkontrolle

positiv

verlangsamt

gut

III

stupurös, erweckbar, inkohärente Sprache

positiv

abnormal

ernst

IVa

komatös, Abwehrreaktion auf Schmerzreiz

negativ

abnormal

ernst

IVb

komatös, fehlende Abwehrreaktion auf Schmerzreiz

negativ

abnormal

ernst

Hirnödem ist eine häufig letale Komplikation des akuten Leberversagens.[9] Die Ursache der hepatischen Enzephalopathie konnte bisher nicht völlig geklärt werden. Eine Auswahl der an der Pathophysiologie beteiligten Stoffe wird im folgenden einzeln besprochen.[10, 11, 12]

1.2.1 Ammonium

Ammonium liegt bei physiologischem pH-Wert zu 1% als diffusionsfähiges Ammoniak NH3 und zu 99% in seiner ionisierten Form als Ammonium-Ion NH4+ vor.[13] In der Literatur und im allgemeinen Sprachgebrauch werden die Begriffe Ammonium und Ammoniak häufig unscharf voneinander abgegrenzt oder Synonym verwendet.

Es gibt Hinweise darauf, daß ein erhöhter Ammoniumplasmaspiegel eine hepatische Enzephalopathie auslösen oder verstärken kann. Zu den neuropsychiatrischen Symptomen eines erhöhten Ammoniumspiegels zählen Stimmungserhöhung, Persönlichkeitsveränderungen, kognitive Defizite, Ataxie, Koma und Krämpfe. Ein verminderter Ammoniumspiegel wirkt sich therapeutisch generell günstig aus.[14] Für den Mechanismus der toxischen Wirkung von Ammonium auf das zentrale Nervensystem gibt es verschiedene Theorien.[15, 16, 17]

  1. Eine Veränderung der Blut-Liquor-Schranke führt zu erhöhter Permeabilität für aromatische Aminosäuren, die Vorläufer für bestimmte monoamine Neurotransmitter darstellen.
  2. Elektrophysiologische Veränderungen sind Folge einer Hemmung des IPSP (inhibitory postsynaptic potential).[Seite 14↓]
  3. Hemmung der Alpha-Ketoglutarat-Dehydrogenase und des Malat-Aspartat Shuttle führen zu einem energetischen Defizit.
  4. Die normale Aufnahme, Speicherung und Freisetzung verschiedener Neurotransmitter, so zum Beispiel die Speicherung von Monoaminen, ist gestört.
  5. Die hohe Affinität von Astrozyten und Neuronen für die Aufnahme von Glutamat ist gehemmt. Die verminderte Ausprägung des Glutamat-Transporters GLT-1 führt zu erhöhter extrazellulärer Glutamatkonzentration.[18]
  6. Die Entgiftung von Ammonium erfolgt über eine erhöhte Bildung von Glutamin in den Astrozyten, die durch osmotische Wirkung für die Hirndrucksteigerung verantwortlich sein könnte.[19] Einige Autoren gehen so weit, zu sagen, daß sämtliche toxischen Wirkungen von Ammonium auf das Gehirn durch die Bildung von Glutamin zustandekommen.[20] Die charakteristische Schwellung der Astrozyten wird als Alzheimer Typ II Astrozytose bezeichnet.[21]
  7. Ammonium hat einen direkten Effekt auf GABA-A-Rezeptoren.

1.2.2 Mercaptane

Mercaptane entstehen beim bakteriellen Abbau der Aminosäure Methionin. Die neurotoxischen Mercaptane Methanthiol, Dimethylsulfid und Äthylmercaptan sind bei Patienten mit hepatischer Enzephalopathie in ihrer Konzentration in Blut, Liquor und Urin erhöht. Ihre Neurotoxizität wird mit einer Hemmung der Na+/K+ ATPase erklärt.[13]

1.2.3 Kurz- und mittelkettige Fettsäuren

Kurz- und mittelkettige Fettsäuren entstehen durch Mikroorganismen aus Nahrungsfetten im Darm. Als Mechanismus für die Neurotoxizität werden ebenfalls die Hemmung der Na+/K+ ATPase sowie die Hemmung der hepatischen Harnstoffsynthese und ein vermehrter Tryptophanübertritt in das Gehirn angenommen.[13]

1.2.4 Phenole

Phenole entstehen ebenfalls unter Einwirkung von Mikroorganismen im Darm aus aromatischen Aminosäuren. Der Mechanismus ihrer Neurotoxizität ist ungeklärt.[13]

1.2.5 Synergismus der einzelnen Neurotoxine

Im Tierexperiment wirken die oben genannten Neurotoxine synergistisch. Zum Beispiel ist die zur Auslösung eines Komas benötigte Ammoniumgabe bei gleichzeitiger subkomatöser Gabe von Methanthiol vermindert.[22]


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1.3  Ammonium-, Aminosäure- und Proteinstoffwechsel, Harnstoffzyklus

Im folgenden werden kurz die grundlegenden biochemischen Stoffwechselwege der gemessenen Parameter beschrieben. Genaue Kenntnisse sind für eine Beurteilung der Stoffwechselaktivität der Bioreaktoren erforderlich.

Beim erwachsenen Menschen mit einem Körpergewicht von 70kg entfallen etwa 12kg auf Protein. Der Proteinumsatz beträgt 250-300 g/d, die Aufnahme 100 g/d. Die Leber synthetisiert aus Aminosäuren täglich etwa 50g Protein, davon entfallen 14g auf Albumin.[13] Albumin ist ein Sammelbegriff für gut wasserlösliche, globuläre Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 66.000 Da. Es dient der Regulierung des intravasalen, onkotischen Drucks und wird ausschließlich durch die Leber synthetisiert, so daß es als leberspezifischer Parameter für die Bewertung der Stoffwechselleistung von Hepatozytenkulturen herangezogen wird. Auch andere Plasmaproteine wie Fibrinogen, Gerinnungsfaktoren und Apoproteine werden ausschließlich in der Leber synthetisiert. Auch im Aminosäurenstoffwechsel hat die Leber in Wechselwirkung mit anderen Organen eine zentrale Rolle. Das der Leber über das Pfortaderblut zugeführte Aminosäurenspektrum erfährt in der Leber Veränderungen, da die Aminosäuren unter Harnstoffbildung abgebaut und für die Proteinbiosythese oder Glucosebildung verwendet werden oder auch unverändert die Leber passieren.

Da in der Leber überwiegend die aromatischen AS (Phenylalanin, Tyrosin), in der Muskulatur überwiegend die verzweigtkettigen AS (Valin, Leucin, Isoleucin) abgebaut werden, enthält das Blut der Vena hepatica relativ höhere Spiegel an verzweigtkettigen AS als das Pfortaderblut. Die verzweigtkettigen AS dienen in der Muskulatur und im Gehirn der Energiegewinnung. Dagegen können die aromatischen AS, die mit den verzweigtkettigen AS um das Transportsystem der Blut-Hirn-Schranke konkurrieren, im Gehirn in Neurotransmitter umgewandelt werden. Die Ammoniumentgiftung in Gehirn und Muskulatur erfolgt durch Bildung von Glutamin aus Glutamat. Glutamin wird mit dem Blut zur Niere und zur Leber transportiert. In der Leber erfolgt die Entgiftung von Ammonium aus Glutamin über den Harnstoff. Die Leber ist das einzige Organ, das in quantitativ wichtiger Menge Harnstoff erzeugen kann.

Hauptbildungsort des freien Ammoniums1 sind Darm (300-500 mmol/d), Muskulatur (in Ruhe [Seite 16↓]sind Abgabe und Aufnahme ausgeglichen) und Niere (30 mmol/d). Ammonium entsteht aus dem Abbau von Proteinen, Aminosäuren und Harnstoff. Für Darmmukosazellen stellt Glutamin die wichtigste Energiequelle dar. Etwa 20% des in der Leber synthetisierten Harnstoffs werden im Dickdarm von Mikroorganismen hydrolysiert. Der daraus entstehende Ammonium wird erneut der Leber zugeführt. Etwa die Hälfte des zur Harnstoffsynthese benötigten Stickstoffs stammt aus dem Abbau von Aminosäuren in der Leber selbst.

Im einzelnen wird die Eliminierung von Ammonium in der Leber durch den Krebs-Henseleit-Zyklus beschrieben. Durch die Verwertung der Aminosäuren und Proteine entstehen durch die Wirkung von Transaminasen, wie schon beschrieben, große Mengen an GLU aus a-Ketoglutarat, welches Ammonium für den Zyklus anliefert.[23] Ist der Energiebedarf hoch, kann GLU in den Mitochondrien auch wieder zu a-Ketoglutarat desaminiert werden, wobei wiederum vermehrt Ammonium anfällt, aber a-Ketoglutarat für den Citratzyklus bereitgestellt wird. Ammonium kann auch durch die direkte Desaminierung anderer Aminosäuren (Cystein, Serin, Histidin) entstehen. Die meisten AS werden aber zunächst durch Transaminierung in a-Ketosäuren überführt. Die a-Aminogruppen werden zum a-Ketoglutarat geschleust, wodurch Glutamat entsteht, das dann oxidativ durch GLDH zu Ammonium und a-Ketoglutarat desaminiert wird. Die Ammonium-Elimination in der Leber ist über zwei Enzymsysteme möglich:


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Abb. 1: Schematische Darstellung des Glutaminzyklus und des Harnstoffzyklus

Das erste Enzymsystem zeigt den Glutaminzyklus. Glutamin wird durch Ammoniumübertragung aus Glutamat mittels Glutamin-Synthetase gebildet. Die Abspaltung von Ammoniumionen aus Glutamin erfolgt durch die Glutaminase.

Das zweite Enzymsystem zeigt den Harnstoffzyklus. Im ersten Schritt geschieht die Bildung von Carbamoylphosphat aus Ammonium und Bicarbonat durch die Carbamoylphosphat-Synthetase. Carbamoylphosphat wird auf Ornithin mittels Ornithin-Transcarbamoylase übertragen, wodurch Citrullin entsteht. Citrullin kondensiert dann in einer folgenden Reaktion mit Aspartat durch die [Seite 18↓]Argininosuccinat-Synthetase zu Argininosuccinat. Schließlich spaltet die Argininosuccinase das Argininosuccinat in Fumarat und Arginin. Arginin ist unmittelbare Vorstufe des Harnstoffs; es wird durch die Arginase zu Harnstoff und Ornithin hydrolysiert. Der Harnstoff wird zu den Nieren transportiert, und das Ornithin ist wieder frei für die Aufnahme von Carbamoylphosphat.

Nach dem Konzept der metabolischen Zonierung sind der Harnstoffzyklus und die Glutaminasereaktion des Glutaminzyklus in der periportalen Zone lokalisiert, während die Glutamin-Synthetasereaktion des Glutaminzyklus in der perivenösen Zone angeordnet ist.[24]

Da das geschwindigkeitsbestimmende Enzym des periportal lokalisierten Harnstoffzyklus, die Carbamoylphosphat-Synthetase, eine geringere Affinität zu Ammoniumionen hat (Km= 1–2mmol/l) als die perivenös lokalisierte Glutamin–Synthetase des Glutaminzyklus (Km= 0,3mmol/l), wird nur bei hohen Konzentrationen Ammonium im Harnstoffzyklus entgiftet. Die Ammoniumionen, die beim Blutstrom des Periportalblutes von periportal nach perivenös nicht über den Harnstoffzyklus entgiftet werden, werden infolge der höheren Affinität der Glutamin-Synthetase zu Ammonium noch in der perivenösen Zone des Leberazinus entgiftet. Auf diese Weise wird das Ammonium sowohl über die Bildung von Harnstoff als auch über die Glutaminsynthese entgiftet. Die Ausprägung der Enzyme des Harnstoffzyklus werden durch das Proteinangebot gesteuert. Sie steigt bei proteinreicher Ernährung, bei Hunger wegen der katabolen Stoffwechsellage und bei Glucocorticoidgabe. Aktivierenden Einfluß auf die Harnstoffsynthese aus Glutamin nimmt das Hormon Glucagon.[25]

Eine weitere wichtige Funktion des Harnstoffzyklus ist die Ausscheidung von Bikorbonat, das zusammen mit dem Ammonium beim Aminosäurekatabolismus anfällt. Damit kommt der Leber ebenfalls eine Bedeutung in der Regulation des Säure-Basen-Haushaltes zu. Bei dem Absinken des physiologischen pH-Wertes von 7,4 auf unter 7,3 spricht man von Acidose. In acidotischer Stoffwechsellage wird die Ammoniumentgiftung von Harnstoffsynthese zu Glutaminsynthese verlagert, so daß Bicarbonat als Base dem System weiterhin zur Verfügung steht. Die Harnstoffproduktion sinkt gleichzeitig.[26] Neuere Experimente an Ratten deuten darauf hin, daß die Rolle der Leber bei lange anhaltender Acidose untergeordnet ist, weil sich die Harnstoffproduktion nach vier Tagen wieder einem Normalwert angleicht.[27]

Nach der Desaminierung von Aminosäuren können die verbleibenden Kohlenstoffgerüste zur Energiegewinnung in den Citratcyclus oder in die Gluconeogenese eingehen.

Die Quellen zu den biochemischen Grundlagen sind dem Buch The liver: biology and pathobiology[13] zu entnehmen.


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1.4  Glucosestoffwechsel der Hepatozyten

Die Leber hat zentrale Funktion bei der Aufrechterhaltung eines konstanten Glucosespiegels. Bei Nahrungsaufnahme gelangt die Glucose über das Pfortaderblut zur Leber. Die Glucose kann dort gespeichert und bei Nahrungskarenz zur Energieversorgung an die peripheren Gewebe abgegeben werden, indem 4,5 g/h aus Glycogenolyse und 3 g/h durch Gluconeogenese aus Aminosäuren, Lactat, Glycerin sowie aus Transformation anderer Kohlenhydrate bereitgestellt werden. Dabei sind die Zellen einiger Gewebe, Erythrozyten, Retina und Nierenmark obligat auf Glucose als Energiesubstrat angewiesen.[28] Die Hormone Insulin und seine Gegenspieler Glucagon und Noradrenalin sowie Glucocorticoide regulieren die Enzyme, die an der Glycolyse, Glycogensynthese sowie Gluconeogenese beteiligt sind.[29] Bei Glucoseaufnahme durch die Nahrung werden ca. 37% der Glucose vornehmlich im Gehirn oxidiert. 63% der Glucose werden hauptsächlich in der Leber in Form von Glycogen gespeichert. Dabei geschieht die Glucoseaufnahme in die Leber hauptsächlich über den Glut-2-Glucosetransporter,[30] der im Gegensatz zum Glut-4-Glucosetransporter, der in Muskulatur und Fettgewebe ausgeprägt ist, nicht auf intrazelluläre Membranen translociert werden kann. Der transmembranäre Glucosetransport ist daher unabhängig von hormoneller Regulation und nicht limitierend für Glucoseaufnahme oder -freisetzung. Als weitere Faktoren für Glucoseaufnahme in die Leber gelten Glucose per se[31] und die Innervation.[32] In einer Hepatozytenkultur von Ratten fanden Ohno et al. 1994,[33] daß die Sauerstoffversorgung entscheidender Faktor für die Regulation der Glycolyse war. Durch ein Absenken der Sauerstoffversorgung wurden Glycolyse und Laktatbildung angeregt. Den Hormonen Insulin und Glucagon kam hier eine untergeordnete Rolle zu.

1.5 Laktatstoffwechsel

Die Laktatbildung im Körper erfolgt unter anaeroben Bedingungen bei kataboler Stoffwechsellage, wenn die Pyruvatproduktion durch die Glycolyse die Rate der Pyruvatoxidation durch den Citratzyklus übersteigt.

Die Laktatbildung wird im Organismus für die anaerobe Regenerierung von NAD+ verwendet. Damit dient die Glycolyse in den Skelettmuskeln und den Erythrozyten der Bereitstellung von Energie. Die Laktatbildung verlagert einen Teil der Stoffwechsellast von der Muskulatur auf die Leber. Die Leber verwertet das Laktat dann zur Gluconeogenese.[13]

In der Hypoxie wird die Leber zur Deckung ihres eigenen Energiebedarfes von einem Laktatverwerter zu einem Laktatproduzenten. Die Hypoxie bewirkt eine unzureichende Regenerierung von NADH, wodurch ein intrazellulärer Anstieg der H+-Ionen-Konzentration [Seite 20↓]entsteht. Die H+-Ionen werden von intra- nach extrazellulär verlagert und verursachen dort eine metabolische Laktatazidose, wenn die Pufferkapazität des Blutes nicht ausreicht. Bei akutem Leberversagen kommt es zu einem Anstieg der Laktatkonzentration im Plasma, der zu einer metabolischen Azidose führt.[34, 35]

1.6 Konservative Therapie des akuten Leberversagens

Zur metabolischen Behandlung der hepatischen Enzephalopathie werden folgende intensivmedizinische Maßnahmen durchgeführt:

  1. Durch selektive Darmdekontamination (z.B. mit Nystatin) werden Darmbakterien abgetötet, die für einen Großteil der Ammoniumbildung verantwortlich sind.
  2. Adaptierte Aminosäureinfusionen sind frei von aromatischen Aminosäuren und hoch im Gehalt an verzweigtkettigen Aminosäuren.

Zur Prophylaxe der Hirndrucksteigerung gibt es folgende Möglichkeiten:

Mannitol-Infusionen, Hochlagerung des Oberkörpers um 30°, milde Hyperventilation, Hypothermie.

Der Hypoglykämie wird durch Glucoseinfusion entgegengewirkt.

Die Patienten unterliegen gleichzeitig der Gefahr einer Blutung durch den Mangel an Gerinnungsfaktoren und einer disseminierten intravasalen Gerinnung DIC durch den Mangel an gerinnungshemmenden Faktoren. Maßnahme ist die Gabe von: FFP, PPSB, EK, TK, Heparin, AT III, Aprotinin.

Zur Prophylaxe des Nierenversagens werden folgende Substanzen gegeben: Furosemid i.v., Urodilatin i.v., Dopamin i.v.

Bei Hypalbuminämie wird Humanalbumin i.v. gegeben.

Bei der Intoxikation mit Paracetamol steht Acetylcystein i.v. als Antidot zur Verfügung, bei der Intoxikation mit Knollenblätterpilz steht Sibilin i.v. als Antidot zur Verfügung.

1.7 Leberunterstützungssysteme

1.7.1 Künstliche Leberunterstützungssysteme

Austauschperfusion

In den siebziger Jahren führte man die Austauschperfusion, Vollblutersatz bei gleichzeitigem Aderlaß, durch, um Entgiftungsfunktionen der Leber zu ersetzen[36, 37]. Das Verfahren konnte die Mortalität nicht senken, zudem bestand das Risiko eines Transfusionssyndroms mit Nieren- und Lungenversagen.

[Seite 21↓]Plasmapherese

Seit Beginn der achtziger Jahre gab es Bestrebungen, die Patienten durch Plasmapherese zu entgiften, indem man das Patientenplasma durch FFP-Konserven ersetzte.[38, 39, 40, 41] Kontrollierte Studien zur Effektivität und Mortalität gibt es nicht. Das Risiko eines Transfusionssyndromes besteht gleichermaßen wie bei der Austauschperfusion. Regenerative Faktoren, wie z. B. HGF, werden dem Plasma entzogen.

Dialyse, Hämofiltration, Aktivkohlefiltration

Zahlreiche künstliche Leberunterstützungsysteme, die auf Dialyse und Hämofiltration durch Flach-Membranen oder Hohlfasermodule basieren, sowie Aktivkohlefiltration wurden klinisch erprobt. Bei der Dialyse werden niedermolekulare Plasmabestandteile entfernt.[42, 43] Die Hämofiltration entfernt zusätzlich Substanzen mittleren Molekulargewichts aus dem Plasma. Eine kontrollierte Studie an zehn Patienten zeigte ein schlechteres Ergebnis für die Behandlung mit Aktivkohlefiltration und Austauschharzen nach Plasmaseperation als für eine konventionell behandelte Kontrollgruppe.[44] Eine weitere Studie zur Aktivkohlefiltration, durchgeführt an 137 Patienten am Londoner King’s College, zeigte eine Abhängigkeit der Überlebensrate nur von der Ätiologie des Leberversagens.[45] Nachteil der künstlichen Verfahren ist es, daß die Substanzen ungerichtet aus dem Plasma entfernt werden. Dabei kommt es neben einer Entgiftung immer auch zum Verlust wichtiger körpereigener Stoffe, wie z.B. der für die Leberregeneration benötigten Wachstumsfaktoren. Man kam mehr und mehr zu der Überzeugung, daß die komplexen regulatorischen Funktionen, die Vielzahl der Stoffwechselleistungen in Auf- und Abbau von Substanzen, nicht durch rein künstliche Verfahren zu ersetzen seien und begann mit der Entwicklung von hybriden Systemen, die biologische und künstliche Komponenten kombinieren. Dennoch laufen zur Zeit große klinische Studien zu rein artifiziellen Systemen, die große logistische Vorteile gegenüber den hybriden Systemen haben und effektive Entgiftungsleistung aufweisen.

1.7.2 Biologische Leberunterstützungssysteme

Extrakorporale Fremdorganperfusion

Die extrakorporale Perfusion menschlicher Organe wurde klinisch erprobt.[46, 47] Es gibt positive Einzelfallschilderungen. Perfusionszeiten von bis zu 39 Stunden wurden realisiert.[48] Aufgrund hervorragender Ergebnisse der Lebertransplantation ist die extrakorporale Perfusion menschlicher Lebern heute nicht mehr gerechtfertigt.

Extrakorporale Perfusionen tierischer Organe von Primaten[49] und von Schweinen[50, 51, 52] [Seite 22↓]wurden durchgeführt. Bei Perfusion mit Vollblut jedoch sind Perfusionsstörungen wegen hyperakuter Abstoßungsreaktionen nach wenigen Minuten bis Stunden therapiebegrenzend.[53, 54] Bei mehrfacher Anwendung kann es zu Hypersensitivitätsreaktionen vom anaphylaktischen Typ kommen.[55] Neuere Verfahren befinden sich in der Erprobung, um die Perfusionszeiten zu verlängern. Medikamentöse Behandlung mit Prostaglandin E1 und Insulin zeigte Erfolg mit einer deutlichen Verlängerung der Perfusionszeit.[56] Immunoadsorptionsverfahren wurden entwickelt, um die menschlichen Anti-Schwein-Antikörper vor der Perfusion des Fremdorgans aus dem Blut zu entfernen.[57, 58]

Xenotransplantation

Die Transplantation tierischer Organe war bisher auf Grund der hyperakuten Abstoßungsreaktion nicht erfolgreich.[59, 60, 61] Ein Risiko der Xenotransplantation bilden bekannte sowie unbekannt humanpathogene Erreger. Neben dem ungelösten Problem der immunologischen Abstoßung bleibt die Ungewißheit über die dauerhafte Funktion des Transplantates aufgrund physiologischer Differenzen zwischen den Spezies.

1.7.3 Hybride Leberunterstützungssysteme

Von verschiedenen Arbeitsgruppen wurden künstliche und biologische Komponenten in hybriden Systemen kombiniert, um neben der Entgiftungsfunktion rein artifizieller Verfahren auch regulierende Funktionen zu ermöglichen. Dazu wurden entweder primäre Leberzellen von Mensch oder Tier (Schwein, Kaninchen) oder in-vitro kultivierte Hepatoblastomzellinien verwendet. Gentechnologisch immortalisierte Zellen[62, 63] und humane Leberstammzellen[64, 65, 66] sind in der Erprobung. Bei den gentechnologisch immortalisierten Zellen ist der Verlust spezifischer Funktionen wie Albumin- und Harnstoffsynthese ein ungelöstes Problem,[67] obwohl es Bestrebungen gibt, die Zellen gezielt mit Genen für einzelne biologische Funktionen zu transfizieren.[68]

In extrakorporalen LUS werden die Hepatozyten in einem künstlichen Gehäuse kultiviert und über den extrakorporalen Kreislauf mit Vollblut oder, bei erfolgter Plasmaseparation, mit Plasma perfundiert.

Wesentliche Bedingung für die Konstruktion hybrider Systeme war die Entwicklung semipermeabler Hohlfasermembranen,[69, 70, 71] mit denen es möglich wurde, zelluläre und immunkompetente Bestandteile des Plasmas von der Zellkultur zu trennen. Somit wurden Abstoßungsreaktionen vermieden und gleichzeitig Stoffaustausch ermöglicht. Mit künstlichen Membranen wurden stabile Perfusionsverhältnisse geschaffen, während bei der Perfusion ganzer Organe die Destruktion der Mikrozirkulation therapielimitierend war. Eine weitere [Seite 23↓]Voraussetzung für die Entwicklung hybrider Leberunterstützung war die Entdeckung geeigneter Zellisolierungs- und Kultivierungstechniken. Erst mit der Einführung enzymatischer Isolierungsverfahren durch Berry 1969,[72] modifiziert durch Seglen 1972 und 1973[73, 74, 75] konnten quantitativ und qualitativ relevante Zellmassen in Einzelzellsuspension gewonnen werden. Die Methode wurde von Gerlach et al. zu einem 5-Schritt-Verfahren weiterentwickelt.[76, 77, 78] Gezielte Verbesserung der Hepatozytenfunktion und Verlängerung der Überlebenszeit in Kultur wurden durch folgende Verfahren erreicht:


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Tabelle 4: Meilensteine in der Entwicklung hybrider Leberunterstützungssysteme nach Busse 1999[87]

Jahr

Entwicklung

1956

Einführung von Dialysatoren in die Therapie des ALF

1969

Enzymatische Zellisolierung durch Berry

1972

Modifizierung und Verbesserung der enzymatischen Zellisolierung durch Seglen

1975

Nutzung von Dialysefiltern und Hohlfaserkapillaren für die Kultivierung von Hepatozyten durch Wolf

1977

Eisenman el al. erproben die Nutzung einer Hepatozytensuspension vom Schwein in einem Cuprophan-Flachbrett-Dialysator (cut-off 5-10 kDa). Die Hepatozyten zirkulieren durch das Blutkompartment des Dialysators, das Blut der Versuchstiere (12 anhepatische Schweine) wird durch den Dialysatraum geleitet.

1983

Margulis et al. führen an 59 Patienten im Leberversagen eine Perfusion von Schweinehepatozyten durch.

1987

Matsumara et al. verwenden eine zuvor kryokonservierte Hepatozytensuspension von Kaninchen in einem Flachbett-Dialysator bei einem Patienten im Endstadium einer chronischen Lebererkrankung.

1993

Sussman et al. erproben klinisch humane Hepatoblastomzellen in einem Kapillarhohlfaser-Dialysator.

1994

Gerlach stellt einen komplexen Kapillarhohlfaserbioreaktor vor, der speziell zur Kultivierung primärer Hepatozyten entwickelt wurde.

1996

Williams et al. führen die erste randomisierte klinische Studie zur Effektivität hybrider Systeme mit Tumorzellen durch.

1997

Demetriou et al. führen im Rahmen einer Phase-I-Studie eine multizentrische Untersuchung eines hybriden Leberunterstützungssystems mit Schweinehepatozyten durch.

1.8 Indikation für die extrakorporale Leberunterstützung

Ziel der extrakorporalen Leberunterstützung ist es, die Komplikationen des ALF zu beherrschen. Im Idealfall kann die Leberfunktion so lange ersetzt werden, bis eine Regeneration des geschädigten Organs stattgefunden hat.[88] Mit zunehmender Bedeutung der Transplantation als [Seite 25↓]erfolgreicher Therapie des ALF kommen weitere Indikationen für die hLUS hinzu:

Darüber hinaus besteht der Bedarf für eine Leberunterstützung bei:

1.9 Beurteilung der Stoffwechselaktivität hybrider Leberunterstützungssysteme anderer Arbeitsgruppen

1.9.1 Arbeitsgruppe Demetriou[89, 90]

Die Arbeitsgruppe benützt ein hybrides, extrakorporales Leberunterstützungssystem, das ca. 50g kryokonservierte Hepatozyten vom Schwein enthält, die auf kollagenbeschichteten Microcarriern immobilisiert wurden. Die Viabilität der Zellen wird mit 60-70% angegeben; das bedeutet, daß ein Modul maximal 30g lebende Zellen enthalten kann. Zwei Aktivkohlefilter sind in den Reaktorkreislauf geschaltet. In Tierversuchen wurde die biochemische Stoffwechselaktivität des Systems in einer kontrollierten Studie an Hunden durch stündliche Messungen nachgewiesen.[91] Seit 1993 wurden 33 Patienten mit dem System behandelt, bei denen die Stoffwechselaktivität des Bioreaktors durch Konzentrationsdifferenzen biochemischer Parameter wie Glucose, Harnstoff, Ammonium und Bilirubin im Plasma der Patienten vor und nach der 6-18 Stunden dauernden Behandlung festgestellt wurde.[92] Die Bioreaktormodule wurden nach sechs Stunden Behandlungsdauer gewechselt. Aus den Angaben der Autoren läßt sich bei den geschilderten Ergebnissen nicht zwischen metabolischer Leistung des Systems und den Effekten der weiteren Therapiemaßnahmen sowie spontanen Stoffwechseländerungen der Patienten unterscheiden. In einem Bericht der Autoren 1994 über die ersten sieben behandelten Patienten wurden folgende Effektparameter für die Aktivität des Systems genannt.[93]


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Tabelle 5: Effektparameter für die Bioartificial Liver BAL, Rozga 1994

Parameter

vor Behandlung

nach Behandlung

Wahrscheinlichkeits-koeffizient

Hirndruck in mmHg

23,0 ± 2,3

7,8 ± 1,7

p < 0,005

NH3 in µmol/l

163,3 ± 21,3

112.2 ± 9,8

p < 0,01

Enzephalopathieindex

0,60 ± 0,17

1,24 ± 0,22

p < 0,03

Es werden keine Aussagen über Begleitbehandlungen mit senkendem Einfluß auf den Hirndruck gemacht, wie z. B. Mannitolinfusionen, Hochlagerung des Oberkörpers, Hyperventilation oder andere, die zur Standardbehandlung des akuten Leberversagens gehören. 1999 berichten Demetriou et al.[94] über acht Patienten, die nach den King’s College-Kriterien ein acetaminopheninduziertes, akutes Leberversagen hatten, das ohne Transplantation mit einer Mortalität von über 90% einhergeht. Drei Patienten wurden mit dem System bis zur Transplantation überbrückt, fünf erlebten eine spontane Erholung der eigenen Leberfunktion.

1.9.2 Arbeitsgruppe Sussman, Kelly[95]

Mit dem hybriden Leberunterstützungssystem der Arbeitsgruppe Sussman, Kelly wurden 23 Patienten behandelt. Im Gegensatz zu allen anderen Systemen basiert dieses System auf der Nutzung einer humanen C3A Hepatoblastomzellinie (HepG2). Vollblut wird mit einem Fluß von 150-300 ml/min durch einen Kapillarhohlfaser-Dialysator perfundiert. Der Vorteil der humanen Hepatoblastomzellinie ist, daß die Zellen in-vitro proliferieren und gut im Dialysator kultivierbar sind. Einen Nachteil stellt die Gefahr einer möglichen Metastasierung dar. Die Autoren weisen auf eine physiologische metabolische Aktivität und kontaktinhibiertes Wachstum der Zellinie hin, veröffentlichte Daten gibt es jedoch kaum. Die Arbeitsgruppe von Nyberg verglich die Stoffwechselaktivität einer anderen HepG2-Zellinie mit der primärer Rattenhepatozyten und fanden eine deutlich höhere Aktivität bei der Nutzung der primären Zellen.[96]

1.9.3 Arbeitsgruppe Margulis[97, 98]

In den Jahren 1983-1988 wurden 59 Patienten im Rahmen einer kontrollierten Studie mit einem Leberunterstützungssystem behandelt. 4x107 Zellen, das entspricht ca. 0,68g, wurden nach Isolierung in PVC-Kapseln gepackt und bei einem Fluß von 80-100 ml/min mit Vollblut perfundiert. Folgende Daten für die biochemische Stoffwechselaktivität des Systems liegen vor:


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Tabelle 6: Biochemische Effektparameter aus der Arbeitsgruppe Margulis

Parameter

Vor Therapie

Nach Therapie

Freies Bilirubin

401±202 µmol/l

45,5±12,3% (182,4±49,3 µmol/l)

NH3

1203±176,3 µmol/l

50,3±9,3% (605±11,9 µmol/l)

Phenole

500±200 µmol/l

42,3±15,3% (211,5±76,5 µmol/l)

Ähnlich wie in den Ansätzen anderer Arbeitsgruppen werden bei dieser Methodik alle Stoffwechselveränderungen des Patienten im Zeitraum der Therapie dem Bioreaktor zugeschrieben. Es gibt keine Beschreibung der übrigen Einflußfaktoren, so daß eine differenzierte Betrachtung der Stoffwechselaktivität nicht möglich ist. Die verwendete Zellmasse steht im Widerspruch zu den angegebenen Effekten.

Biochemische Daten wurden nur aus der Effektgruppe veröffentlicht, die entsprechenden aus der Kontrollgruppe liegen nicht vor. Der Verteilungsmodus der Effekt- und Kontrollgruppe wird nicht erwähnt. Bei einem Vergleich der beiden Gruppen fällt auf, daß der Anteil der Patienten mit einer Enzephalopathie Grad III-IV in der Kontrollgruppe mit 44,7% höher ist als in der Effektgruppe mit 33,9%. Die Verteilung der Ätiologie unterscheidet sich ebenfalls.

1.10 Fragestellung der eigenen Arbeit

Das Ziel dieser Arbeit ist es, anhand biochemischer Parameter Auskunft über die Stoffwechselleistung porciner Hepatozyten während einer temporären, extrakoporalen Leberunterstützungstherapie zu erhalten. Nur bei vorhandener biochemischer Stoffwechselleistung der Hepatozyten kann von einem positiven Effekt der Therapie auf den Patienten ausgegangen werden. Im Rahmen einer Verlaufskontrolle ist es außerdem notwendig, die Stoffwechselleistung der Hepatozyten während der Therapie durch schnell verfügbare Parameter zu kontrollieren, um die Entscheidung zu treffen, mit der Therapie fortzufahren oder sie gegebenenfalls rechtzeitig abzubrechen. Die erhobenen Daten dienen ferner der Optimierung und Weiterentwicklung des Systems. Dazu ergaben sich folgende Fragestellungen:


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Als Voraussetzung für die zu findenden Parameter gilt, daß sie schnell verfügbar sein müssen. Darüber hinaus sollten sie in direktem Zusammenhang mit dem Krankheitsbild stehen. Von Interesse wäre ein Bezug zu der lebensbedrohenden Enzephalopathie, deren Ursache bei akutem Leberversagen noch nicht komplett geklärt ist. Die Schwierigkeit dieser Aufgabe verdeutlicht, daß bei der Wahl der zu untersuchenden Parameter Kompromisse eingegangen werden müssen.

Zur Erörterung oben genannter Fragestellungen wurden bei sieben Patientenbehandlungen die Plasmaspiegel von Ammonium, Harnstoff, Glutamin, Glucose, Laktat bestimmt und Bilanzierungen für die eingesetzten Bioreaktoren vorgenommen.


Fußnoten und Endnoten

1 Unter Ammonium versteht man die Summe von ionisiertem NH4+ und nicht ionisiertem NH3 (Ammoniak). Es besteht ein Dissoziationsgleichgewicht: NH3 + H+º NH4+. Bei einem Blut-pH im Normbereich von 7,4 liegt Ammonium zu 99% als NH4+ vor.



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21.01.2005