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2  MATERIAL UND METHODEN

2.1 Beschreibung des Leberzellreaktors

Bei dem hybriden Leberunterstützungssystem hLUS stehen der Leberzellreaktor und die Hepatozytenkultur im Zentrum der Betrachtung. Die Hepatozytenkultur befindet sich in dem Bioreaktor. Durch den Bioreaktor ist es möglich, die Zellkultur über mehrere Wochen in einem dreidimensionalen Zellverband in Funktion zu halten. Der Bioreaktor hängt freibeweglich in einem durchsichtigen Plexiglasgehäuse, das auf zwei Dialysemonitorrohlingen steht. Ein Dialysemonitor dient der Plasmapherese während der Therapie, der andere dient der Rezirkulation von Mediumflüssigkeit in den Bioreaktor. Die Gesamtapparatur ist rollbar und kann somit problemlos zum zu behandelnden Patienten gebracht werden (siehe Abb. 2).

Abb. 2: Schematische Darstellung des hLUS. A. Bioreaktor mit Schutzgehäuse und Erwärmungsvorrichtung. B. Bioreaktormonitor mit Gasversorgung und Pumpen für den Bioreaktorkreislauf. C. Patientenmonitor zur Plasmagewinnung.

Der Bioreaktor besteht aus einem Netzwerk von Kapillarhohlfasermembranen, die von einem [Seite 30↓]Polyurethangehäuse umgeben sind (PU-R725, Fa. Morton, Bremen). Das Kapillarbündel setzt sich aus miteinander verwobenen semipermeablen Membranbündeln (jeweils ca. 3000 Einzelkapillare) zusammen, die den Innenraum des Bioreaktors in ein extrakapilläres und intrakapilläres Kompartiment teilen. Die eingefüllten Hepatozyten adhärieren an der Oberfläche der Kapillaren. Jedes Membranbündel kann über zwei eigene Eintrittskappen zum Bioreaktorgehäuse durchströmt werden. Zwei der drei Kapillarbündel dienen dem Mediuman- und -abtransport in der Zellkulturphase bzw. dem Plasmadurchfluß während des klinischen Einsatzes des Bioreaktors. Die Bündel bestehen aus Polyethersulfon (PES, Fa. Akzo, Wuppertal) mit einem NMWCO (normal molecular weight cut off) von 200.000 Da. Die Gesamtaustauschfläche für Flüssigkeiten errechnet sich aus der Summe der Innenoberflächen aller Einzelkapillare eines Bündels und beträgt beim Reaktor ca. 0,55m².

Das dritte Kapillarbündel (hydrophobe Oxygenierungsmembranen der Firma Mitsubishi, Tokio, Japan), welches waagerecht durch die PES-Bündel verläuft, dient der Sauerstoffversorgung der im Reaktor befindlichen Hepatozytenkultur. Diese etwa 10000 Einzelkapillare bilden eine Gasaustauschfläche von ca. 2,42 m². Eine eigene Einlaufkappe an der Oberfläche des Reaktors, von der offen endende Silastikkapillare in den Reaktor führen, ermöglicht die Beimpfung des extrakapillären Kompartiments mit Hepatozyten. Nach der Beimpfung dient dieser Zugang der Druckmessung im Reaktorinnenraum.

Abb. 3: Schematische Darstellung des Kapillarnetzwerkes

Der hier gewählte Aufbau des Bioreaktors dient folgenden Funktionen:

  1. Der Adhäsion der Hepatozyten in einem eigenem Kompartiment (extrakapillär)
  2. Der Möglichkeit einer Reorganisation der Zellen in einem dreidimensionalen Zellverband (in etwa den physiologischen Leberverhältnissen entsprechend)
  3. Der vollständigen Flüssigkeitszirkulation durch das Leberzellkompartiment mittels der voneinander unabhängigen Kapillarbündel, von denen eines dem Flüssigkeitsantransport und das andere dem Flüssigkeitsabtransport dient
  4. Durch das Verweben der Kapillarbündel werden im Bioreaktor kurze Stofftransportstrecken ermöglicht.
  5. Die benötigte und ausreichende Sauerstoffversorgung der Hepatozytenkultur wird durch die im Reaktor integrierten Gasaustauschflächen sichergestellt.

Die für die Hepatozytenkultur wichtige Aufrechterhaltung des physiologischen pH-Wertes geschieht über eine ins Zellkompartiment eingeleitete trockene Gaszufuhr aus Sauerstoff, CO2 und Druckluft, in Abhängigkeit zum aktuellen pH-Wert. Die Basismischung der oben erwähnten Gase beträgt 45% Druckluft (Hausanlage), 50% Sauerstoff (AGA 0.1) und 5% Kohlendioxid (AGA 5.0, AGA Gas GmbH Hamburg).

Für die Aufrechterhaltung einer konstanten Temperatur von 39ºC ist der Bioreaktor von einem 8 mm Acrylglasgehäuse umgeben, das mittels eines Tangentialheizgebläses (230 V/50 Hz) mit ca. 80 m³/h Luft nach dem Umwälzprinzip ventiliert wird. Ein Leistungsmodul (Fa. Kemo, Berlin) läßt eine Regulation der Heizleistung von max. 1000 W zu. Die Messung der Ist-/Soll-Temperatur erfolgt über eine im Gehäuse angebrachte Meßsonde (Typ PT 100 RS Components, Mörfelden-Walldorf), deren Werte über einen im Acrylglasgehäuse integrierten, digitalen, selbstoptimierenden Regler (CAL 9900 RS Components, Mörfelden-Walldorf) angezeigt, reguliert und korrigiert werden können.

Die Basis der Perfusionseinrichtungen zum Reaktor und zurück bilden zwei miteinander gekoppelte Dialysemonitorrohlinge (HD-Secura, Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen), die aufgabenspezifisch modifiziert sind und als Apperateträger für Pumpen, Klemmventile, Druckanzeigen, Steuerelektronik, Plasmafilter, Perfusoren und alle weiteren Systemkomponenten dienen.

2.2 Sicherheitsfunktionen des Bioreaktors

Um physiologisch angepaßte Drücke und Volumenströme zu erreichen, finden Schlauchpumpen mit Zahnriemengetriebe (Typ 49 V, 437, 348 und 260 Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen) Verwendung. Unter Berücksichtigung der in den einzelnen Zirkulatinskreisläufen maximal [Seite 32↓]notwendigen Volumenströme sind für Blutzuführung und Reaktorkreislauf die Pumpen mit einer Förderleistung von maximal 600ml/min, beziehungsweise für den Plasma-Medium-Zu-/Ablauf Pumpen mit einer Maximalleistung von jeweils 200 ml/min dimensioniert. Der Förderfluß aller Pumpen ist von Null bis zum jeweiligen Maximalfluß stufenlos manuell regulierbar und über einzelne LCD-Displays ablesbar. Zur Vermeidung von Druckspitzen und unphysiologischen Strömungsverhältnissen, die unter Umständen zum Bersten beziehungsweise Kollabieren des Bioreaktors und der Perfusionsleitung führen könnten, sind in den einzelnen Perfusionskreisläufen Druckaufnehmer (Typ BV 49 B 90 Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen) positioniert. Mit ihnen ist es möglich, druckgeregelt die einzelnen Arbeitszustände der Pumpen aufeinander abzustimmen und bei Überschreitung definierbarer Grenzwerte gegebenenfalls abzuschalten. Ablesung des Ist-Wertes und Einstellungen der Schaltergrenzwerte erfolgen über separate Druckanzeiger (Typ 49 V189 Fa. Braun Melsungen AG, Melsungen), die in den jeweiligen Monitoren installiert sind. Als druckstabile Leistungen werden Combidynschläuche (Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen) verwendet. Diese verbinden Expansionskammern (Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen) mit den jeweiligen Druckaufnehmern auf den Monitorplatten. Das Leitungssystem wird durch Sterilfilter (Minisart Fa. Satorius AG, Gotischen) geschützt.

Der Patientenmonitor gibt somit Aufschluß über den Blut-Ansaugedruck, Prä-Plasmafilterdruck, Plasmafilterdruck und Blutrücklauf.

Der Reaktormonitor zeigt die Druckverhältnisse vor Reaktorpassage (Prä), Reaktorinnendruck (Intra) und nach Reaktorpassage (Post) an.

Zur Vermeidung von Luftembolien des Patienten beziehungsweise des Reaktorkapillarsystems sind in der Expansionskammerhalterung der zum Patienten zurückführenden Blutleitung und der Bioreaktorkreislaufpumpe Luftdetektoren (Typ SAD BV 49 LKL, Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen) installiert.


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Abb. 4: Schematische Darstellung des extrakorporalen Kreislaufs. P = Druckmessung, LD = Luftdetektor, SV = Sicherheitsventil, BP = Blutpumpe, RP = Reaktorpumpe, FP = Filtratpumpe

Im Alarmfall bewirken Klemmenventile (Typ 49 V 229 Fa. Braun Melsungen AG, Melsungen) eine Kompression der in die Klemmführung eingelegten Schlauchsysteme. Die Blutpumpe arbeitet druckgeregelt. Grenzwerte der Druckmessung für Blut-Ansaugdruck, Prä-Plasmafilterdruck und Blutrücklaufdruck schalten die Schlauchpumpe unter folgenden Bedingungen ab: Blut-Ansaugdruck > -100 mmHg, Prä-Plasmafilterdruck > 200 mmHg, Blutrücklauf > 100 mmHg. Die Filtratpumpe des Patientenmonitors soll nur bei intaktem Plasmafilter arbeiten. Es muß ein Filtratdruck >10 mmHg anliegen, damit die Filtratpumpe ihre Arbeit aufnimmt. Mit diesen Maßnahmen werden eine Schädigung der Blutbestandteile, Kollabieren und Drucknekrose der Patientenvenen verhindert. Um ein Bersten der Leitungssysteme und Bioreaktoren zu vermeiden, ist der Grenzwert für den Prä-Reaktordruck bei 250 mmHg, für den Reaktorinnendruck mit 120 mmHg definiert. Bei Überschreiten dieser [Seite 34↓]Grenzwerte stoppt die Reaktorkreislaufpumpe. Einem Volumenrückstau und einer Regurgation von Plasma/Medium entgegenwirkend, findet bei Überschreitung des Post-Reaktordruckes von 15 mmHg eine Aktivierung der Ableitungspumpe statt.

2.3 Systemaufbau

Die einzelnen Bestandteile des Reaktorkreislaufs (Bioreaktor, Schlauchsysteme, Blasenfallen, Druckmeßleitungen, Bakterienfilter, 3-Wege-Hähne, Konnektoren, Adaptoren) werden als gassterilisierte, folienverschweißte Einmalartikel geliefert. Der Zusammenbau erfolgt unter sterilen Arbeitsbedingungen nach Herstellervorschrift in einer Laminar-Air-Flow-Werkbank (Fa. Heraeus Instruments). Das geschlossene System wird in die Perfusionseinheit integriert: Der Bioreaktor wird in Halterungen im Plexiglasgehäuse festgeschraubt, der Silastikabschnitt des Kreislaufs in die Rollerpumpe der Kreislaufzirkulation bzw. der des Mediumzulaufs in die Fingerprint-Pumpe der Mediumzufuhr eingelegt. Die wird Gaszuleitung an den Anschluß der Gasmischeinheit, und die Druckübertragungsschläuche werden an die Drucksensoren angeschlossen. Anschließend wird der Kreislauf mit 1,2 l NaCl-Lösung 0,9% befüllt und entlüftet. Es erfolgt eine Umwälzung des Volumens über die Kreislaufpumpe bis zum Austausch der Kochsalzlösung durch Kulturmedium am Tag der Zelleinfüllung. Nach Einstellung des pH-Wertes über die Gasmischung auf pH 7,38 – 7,42 ist der Bioreaktor für das Einbringen der Zellen vorbereitet.

2.4 Spendertiere

Für die Leberzellisolierung werden Schweine aus der Versuchstierhaltung der Charité verwendet, die unter pathogenfreien Bedingungen gefüttert, gehalten und transportiert werden. Vor der Organentnahme werden die Tiere individuell auf bakterielle und virale Erreger von Zoonosen untersucht.


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Ausschluß von Zoonosen:

Tabelle 7: Ausschluß von Zoonosen

Bakteriell

Viral

Leptospira

Influenza A

Brucella

Influenza B

Salmonella paratyphi OH, H, O

Rotavirus

Salmonella typhi H, O

Pseudorabies

Salmonella typhimurium

 

Yersinia enterocolitica

 

Yersinia pseudotubercularis

 

Francisella tularensis

 

Die Tiere werden als Jungtiere zur Organentnahme genommen, damit die Lebern wenig Bindegewebe enthalten und die Hepatozyten sich besser isolieren lassen. Das Gewicht der für die Therapie verwendeten Spendertiere beiderlei Geschlechts betrug zwischen 12 und 19 kg, das der entnommenen Lebern zwischen 300 und 680g, was einer Ausbeute von 2,2 bis 4,0 x 109 Zellen entspricht.

2.5 Organentnahme

Die Prämedikation erfolgt intramuskulär etwa 1 Stunde vor Operationsbeginn mit 3-5 mg/kg KG Azaperon (Stresnil-Janssen, Fa. Janssen, Neuss) und 0,05 mg/kg KG Atropin (Atropinsulfat Braun, Fa. Braun Melsungen, Melsungen). Die Narkoseeinleitung wird über eine Ohrvene mit 0,01 mg/kg KG Fentanyl (Fentanyl-Janssen, Fa. Janssen, Neuss) und 0,3 ml/kg KG Etomidat (Etomidat-Lipuro, Fa. Braun Melsungen, Melsungen) durchgeführt. Als Narkoseverfahren wurde die TIVA gewählt, die mit Repetitionsdosen von 0,07 mg/kg KG Pancuronium (Pancuronium Curamed, Fa. Curamed, Karlsruhe) und einer Dauerapplikation von 0,6 mg/kg KG/h Etomidat (Etomidat-Lipuro, Fa. Braun Melsungen, Melsungen) sowie mit 0,02 mg/kg KG/h Fentanyl aufrecht erhalten wird. Intraoperativ erfolgt die Beatmung des Tieres über einen Trachealtubus mit einem Sauerstoff-Lachgasgemisch in einem Verhältnis von 1:2.

2.6 Zellisolierungsverfahren

Zur Isolierung der Hepatozyten aus der operativ entnommenen Leber wird die enzymatische [Seite 36↓]Isolierung mittels Kollagenaseperfusion, erstmal beschrieben von Seglen, modifiziert durch Gerlach, als Fünf-Schritt-Methode angewendet. Die zu dem Prozeß erforderlichen fünf Lösungen (Fa. Biochrom, Berlin) werden steril geliefert und bei 4° C gelagert. Sie enthalten folgende Zusammensetzung:

Tabelle 8: Zusammensetzung der Zellisolationslösungen

Lösung A

Phosphatgepufferte Na+ - Cl- -K+ - Lösung (= PBS) ohne Calcium/Magnesium, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Amphotericin B und 2% EDTA-Lösung

Lösung B

PBS ohne Calcium und Magnesium, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Amphotericin B, 1% NaHCO3-Lösung und 1% Glukose 10%

Lösung C

Medium 199 mit HEPES (N-2 Hydroxyethylpiperacin-N-2-Ethansulphon-Säure, 1% Penicillin/Streptomycin und Amphotericin B)

Lösung D

Medium 199 mit NaHCO3, oder Williams-E-Medium mit NaHCO3, 1% Penicillin/Streptomycin, 1% Amphotericin B und 0,03% Kollagenase (Fa. Biochrom, Berlin).

Lösung E

Medium 199 mit HEPES, 1% Penicillin/Streptomycin und 1% Amphotericin B

Die Leber wird nach Explantation in eine sterile Stahlschüssel des Zellisolierungswagens gegeben. Der Zellisolierungswagen besteht aus einem Perfusionsmonitor (Bestandteile: Schutzgehäuse, 3 Rollerpumpen für die Leitungen der V. portae, der A. hepatica und des Abflußes, Schüsselhalterung, Wärmetauscher auf 42° C eingestellt), einem Sterilcontainer (Inhalt: Schläuche für die Porta- und Arterienperfusion, Abfallsleitung, doppelwandiges Glasgefäß mit Metallhalterung, Schüssel- und Glasgefäßerwärmung) und einer Metallschüssel mit Sieb. Der Schlauch für die Portaperfusion wird mit dem einen Ende über den Ablaufzylinder der Schüssel gestülpt und mit dem anderen an die kanülierte V. portae angeschlossen. Analog wird der Schlauch der Arterienperfusion mit dem entsprechende Gegenstück der Schüssel verbunden und mit dem freien Ende an die ebenfalls kanülierte A. hepatica des Organs angeschlossen. Die Leitung für die Portaperfusion gibt einen Zweig ab, der in einem Abfallgefäß endet; dadurch wird erreicht, daß das Systems mit jeder Lösung perfundiert wird. Alle drei beschriebenen Schläuche werden in die entsprechenden Rollerpumpen eingelegt. Die verschiedenen Lösungen werden, der Reihe nach, in den Metallcontainer gegossen, in dem die Leber liegt, und durchfließen das Organ.


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Die Perfusion erfolgt flußgesteuert über die V. portae mit einem Fluß von etwa 2 ml/min/g Lebergewebe, entsprechend einem Gesamtfluß zwischen 500-800 ml/min und druckgesteuert über die A. hepatica mit einem Mitteldruck von 80 mmHg, entsprechend einem physiologischen Fluß von etwa 0,5 ml/min/g Lebergewicht. Der erreichte Gesamtfluß ist vom Organgewicht abhängig und kann bis zu 1000 ml/min reichen. Die Perfusion des Organs mit Lösung A beginnt bereits in situ und dauert 5 Minuten. Dadurch werden das Freispülen von Blut und das Entfernen von Calcium erzielt. Danach wird die mobilisierte Leber in die Perfusionsapparatur gelegt und an die Perfusion angeschlossen (s.o.). Die darauffolgend rezirkulierende Perfusion mit Lösung B dauert 20 Minuten und erreicht über die Calciumentfernung die Auflockerung der desmosomalen Verbindungen innerhalb der Hepatozyten. Lösung C, im Sinne einer single pass perfusion, setzt die Voraussetzungen für eine optimale Wirkung der Kollagenaseperfusion (Calciumsubstitution, Temperaturoptimum von 37° C). Letztere führt zu einer Aufhebung der bindegewebigen Grundmatrix der Leber und somit zu der eigentlichen Zellisolierung. Anschließend wird die Kollagenase mit der, auf 4° C gekühlten, Lösung E ausgewaschen. Die Zellen werden dann vorsichtig manuell aus der Leberkapsel gelöst. Die entstandene Zellsuspension wird durch 900 µm und 400 µm Edelstahlnetze gesiebt und anschließend bei 4° C gewaschen und in einem Beutel aufgehängt. Dabei setzen sich die Zellen ab und werden später vom Überstand abgetrennt. Dieser Vorgang wird ca. 3-4 mal wiederholt. Die Zellen sind dann zu der Einfüllung in den Bioreaktor bereit.

Die bei der Isolierung erzielte Zellausbeute dient als Marker für die Mikroperfusion und ist damit Ausdruck der Qualität der Perfusionsschritte (Zellausbeute = isoliertes Zellpellet / Ausgangsgewicht der Leber).

2.7 Zellmenge und -viabilität, Quantifizierung der Zellschädigung

Bei der Besiedlung des Bioreaktors mit Hepatozyten wird das Gesamtvolumen der Zellsuspension bestimmt. Durch Inkubation einer Probe der Suspension in einer Neubauer Zählkammer wird lichtmikroskopisch die Zellzahl pro Mikroliter ermittelt. Zu der eigentlichen Viabilitätsbeurteilung wird eine Trypanblau-Färbung der frischen Zellen durchgeführt (100 µl Zellsuspension, 100 µl Trypanblau-Lösung 0,5 % : Firma Sigma, NaCl 0,9 %). Die Zellviabilität wird in Prozent der nicht gefärbten Zellen anteilig zu den insgesamt ausgezählten Zellen angegeben.

2.8 Kulturmedium

Die Kultur erfolgte unter Verwendung eines serumfreien, hormondefinierten Mediums. Als Ausgangsrezeptur wurde Williams E-Medium verwendet (Standard in der Hepatozytenkultur). [Seite 38↓]Im Gegensatz zur Origanalrezeptur wurden weitere essentielle Spurenelemente, Fettsäuren (Arachidonsäure) und Vitamine (Pyridoxal.HCl, Calciferol) ergänzt. Neben der Glucose wurden Fructose und D-Galactose als weitere Kohlehydrate ergänzt. Als Aminosäure wurde Ornithin hinzugefügt, die Konzentration folgender Aminosäuren (alle L-Form) wurde erhöht:

Die Hormone Dexamethason, Insulin und Glucagon wurden zugefügt.

Als Puffer enthielt das Medium 2,8 g/l NaHCO3.

Die Konzentrationen einzelner wesentlicher Inhaltstoffe betrugen:

Na+ 130 mmol/l; Cl- 110 mmol/l; Glucose 8,33 mmol/l

Eine komplette Liste der Konzentrationen aller Inhaltstoffe sind dem Katalog der Firma Biochrom AG, Berlin, Germany, Seite 83-84, Heparmed-Medium für Leberzellen, zu entnehmen.

Die Kulturen erfolgten serumfrei. Lediglich zu Beginn der Kulturen am ersten Tag wurden einmalig 100 ml Plasma des Spendertieres den Kulturen zugefügt.

2.9 Zelleinfüllung

Die bei der Zellisolierung gewonnene Zellsuspension wird zur Minimierung der anoxischen Schädigung hypotherm zur Einfüllung in den Bioreaktor transportiert. Die Zellsuspension wird über ein Schlauchsystem mittels 3-Wege-Hahn über das Zelleinfüllungssystem in den Bioreaktor gefüllt. Durch wiederholtes Schwenken des Bioreaktors um zwei Achsen bis nach Beginn der Adhäsionsphase der Hepatozyten (6-8 h) wird eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im Intra-Kompartiment erreicht. Nach Ende der Zelleinfüllung dient die Zugabe von 200-300 ml Plasma des Spendertieres, durch Zentrifugation aus Vollblut gewonnen und leukozytenfiltriert, der Supplementierung mit Hormonen und Substraten des tierischen Organismus. Eine Antikoagulation ist durch kontinuierliche Infusion von 100 I.E. Heparin (Liquemin N 25000, Hoffmann-LaRoche AG, Grenzach-Wyhlen) pro h über 24h gewährleistet.

2.10 Der Zellkulturbetrieb

Der Zellkulturbetrieb gewährleistet die Erhaltung der Vitalfunktionen der Zellkultur und die ständige Bereitschaft zur Therapie.


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2.10.1  Einstellungen

Die Einstellungen werden so gewählt, daß der Prä-Druck 250 mmHg nicht überschreitet und der Intradruck 0 bis 60 maximal 120 mmHg beträgt. Zur Aufrechterhaltung einer adäquaten Dauerperfusion bedarf es eines Mindestflusses von 50 ml/min, der unter Beachtung obiger Druckgrenzen bis zu einem Maximalfluß von 300 ml/min gesteigert werden kann. Umstände, die einen Betrieb des Reaktors mit einer Flußgeschwindigkeit unter 50 ml/min nötig machen, haben eine Beendigung des Zellkulturbetriebs zur Folge.

Die O2-, CO2-, und Druckluftgaseinstellung wird an der Gasmischbox des Bioreaktors getrennt vorgenommen, so daß der pH sich in den Grenzen von 7,35 und 7,45 und der pO2 sich zwischen 200 und 260 mmHg bewegt. Die Höhe der Drucklufteinstellung bestimmt die Verweildauer der Gase im Reaktor. Basal wird ein Druckluftfluß von 200 ml/min, ein Sauerstofffluß von 20 ml/min und ein Kohlendioxidfluß von 2 ml/min eingestellt.

Die Einspeisung von frischem Kulturmedium in den Kreislauf erfolgt am ersten Tag mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/h über eine Mediumpumpe. Am zweiten Tag wird sie auf 100 ml/h reduziert und ab dem vierten Tag noch einmal auf 50 ml/h. Die Mediumzufuhr gewährleistet eine kontinuierliche Auffrischung des zirkulierenden Mediums.

Die Temperatur im Bioreaktorgehäuse auf konstant 39° C eingestellt. Sie wird durch eine thermostatgesteuerte Heizvorrichtung aufrechterhalten.

Der Zellkulturbetrieb umfaßt eine regelmäßige Kontrolle und Protokollierung der Pumpraten, Druckwerte, Gaseinstellungen und Blutgasanalysen. Bei Abweichungen erfolgen nach einer sorgfältigen Analyse entsprechende Interventionen, die wiederum eine Kontrolle notwendig machen.

2.10.2 Funktions- und Qualitätsabschätzung der Zellkultur

Um die Zelleistung oder das Ausmaß einer Zellschädigung einschätzen zu können, wird während des Stand-by-Betriebs eine biochemische Verlaufskontrolle durchgeführt. Aus den täglich abgenommenen Proben werden Parameter des Stoffwechsels bestimmt, die Rückschlüsse auf die Zellintegrität erlauben.

Zu den täglich bestimmten Parametern gehören:

Natrium, Kalium, Calcium, Chlorid, Phosphat, Glucose, Harnstoff, AST, LDH, GLDH, abgenommen mit einer Plasmamonovette mit einem Volumen von 5 ml, Ammonium, ebenfalls mit einer Plasmamonovette mit einem Volumen von 5 ml und Laktat mit einer EDTA-Monovette mit einem Volumen von 2 ml. Alle drei Tage werden zusätzlich mit einer Serummonovette 5 ml [Seite 40↓]zirkulierendes Medium abgenommen, um die Osmolalität zu bestimmen. Die Dokumentation erfolgt mit Hilfe einer Datenbank.

2.10.3 Leberfunktionstests und Stoffwechselleistung

Mit Hilfe von Leberfunktionstests (LFT) erfolgt die Beurteilung der Stoffwechselleistungen der Hepatozyten. Es werden unterschiedliche Testsubstanzen kontinuierlich zusammen mit dem Nährmedium in den Reaktorkreislauf eingebracht. Die Testsubstanzen werden vor dem Anschluss eines neuen Mediumbeutels unter sterilen Bedingungen mit folgenden Zielkonzentrationen in diesen eingespritzt:

Tabelle 9: Leberfunktionstests

Lidocain (Lidocain 1%, Apotheke des Virchow-Klinikums, Humboldt-Universität, Berlin)

6 mg/l

Sorbitol (Sorbitol 40%, Fa. SerumWerk Bernburg AG, Bernburg)

1 g/l

Galaktose (Galaktose 25%, Apotheke des Virchow-Klinikums, Humboldt-Universität, Berlin)

1 g/l

Kontolliert wird die gleichmäßige Zugabe von den LFT-Testsubstanzen durch Abnahme von Mediumleerwerten aus den Mediumbeuteln. Weiterhin wird die Hepatozytensyntheseleistung durch Bestimmung von Schweinealbumin erfaßt.

2.10.4 Protokollierung

Alle Parameter, die am Reaktormonitor erhoben werden, BGA-Ergebnisse, Perfusionsmodus sowie sämtliche Interventionen werden in Protokollen festgehalten und anschließend in eine Datenbank eingegeben.

2.11 Voraussetzungen für den klinischen Einsatz und Therapieplanung

Unmittelbar nach der Benachrichtigung über einen eventuellen Therapieeinsatz in der chirurgischen Klinik muß der im Zellkulturbetrieb laufende Bioreaktor auf seine Therapiebereitschaft überprüft werden. Die Bewertung der Zellkultur erfolgt aus den täglich erhobenen Daten des Stand-by-Betriebes. Voraussetzungen für eine Verwendung sind in folgender Tabelle zusammengefaßt:


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Tabelle 10: Voraussetzungen einer Zellkultur für den Einsatz zur Therapie

Parameter

Wert

Bewertung

Alter der Zellkultur

>24h; <3 Wochen

Über-/Unterschreitung nur unter Ausnahmebedingung

LDH- Liberation

Anstieg um 50/75/100 I.U. in 24 h bei Mediumzufuhr 200/100/50 ml/h

Kontaminationsverdacht

pH

Abfall um 0,1 Einheiten/h bei unveränderter Gaszufuhr und Zirkulation

Kontaminationsverdacht (gültig nur außerhalb der initialen Adhäsion)

pCO2

Anstieg um 10 mmHg/h bei unveränderter Gaszufuhr und Zirkulation

Kontaminationsverdacht (gültig nur außerhalb der initialen Adhäsion)

NH3

Anstieg über 150 µmol/l basal

Differenzierungs- und Funktionsverlust

2.12 Einschlußkriterien

Einschlußkriterien für die Behandlung mit dem Leberunterstützungssystem waren hyperakutes, akutes oder akutes nach chronischem (acute on chronic) Leberversagen bei gleichzeitiger Indikation für eine Lebertransplantation. Die Patienten müssen eine Enzephalopathie Grad II oder höher entwickelt haben. Das Alter der Patienten muß höher als 15 und niedriger als 60 Jahre sein. Folgende Grenzwerte wurden bei den klinischen Parametern als Voraussetzung für eine Therapie gesetzt:

  1. Quick < 20%
  2. SerumAmmonium > 100 µmol/l
  3. Bilirubin > 85,5 µmol/l
  4. Enzephalopathie > Grad II.

2.13 Ausschlußkriterien

Ausschlußkriterien für die Therapie sind Leberversagen ohne Indikation für eine Transplantation bei aktivem Alkoholismus, akute Portalvenenthrombose, Budd-Chiari-Syndrom sowie Leberversagen im Zuge eines Multi-Organ-Versagens, nach chronischer Herz-, Lungen- oder Niereninsuffizienz. Weitere Ausschlußkriterien sind das Vorliegen einer schweren Infektion, einer intracerebralen Blutung, einer bösartigen Neubildung oder einer Schwangerschaft.


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2.14  Darstellung der Plasmaseparation

Der Aufbau des Plasmaseparationsystems und der Plasma- Mediumaustausch am Bioreaktorkreislauf erfolgen auf der Intensivstation der chirurgischen Klinik. Vor Beginn der Therapie wird das Nährmedium durch sechs Konserven Heparinplasma (Blutgruppengleich oder AB-Plasma) substituiert. Bei Bedarf werden sie bei –80°C zwischengelagert und erst unmittelbar vor der Therapie aufgetaut. Während der gesamten Therapie erfolgt bei den Patienten eine kontinuierliche Plasmaseparation aus folgenden Gründen:

2.15 Therapieüberwachung und Datenerhebung

Die Drücke an sämtlichen Druckmeßpunkten wurden ständig kontrolliert, entsprechend wurde bei Druckanstieg durch Verminderung der Pumpleistungen, Plasmafilterwechsel oder Änderung des Perfusionsmodus reagiert. Die Gaseinstellungen wurden stündlich durch Blutgasanalysen des Plasmas nach Durchfließen des Bioreaktors überprüft. Die ACT wurde stündlich vor Ort bestimmt.

2.16 Bestimmung der Stoffwechselleistung

Um die Konzentrationen der am Bioreaktor gemessenen biochemischen Parameter zu beurteilen, wurden sie mit den Konzentrationen derselben Stoffe zum selben Zeitpunkt im Patienten verglichen. Die absoluten Konzentrationen haben wenig Aussagewert. Es ist wichtig zu wissen, ob und wie sich die Stoffzusammensetzung des Patientenplasmas nach Durchfließen des Bioreaktors verändert hat. Nach Berechnung des Stoffumsatzes, das heißt der Netto-Freisetzung bzw. Netto-Aufnahme bezogen auf ein Zeitintervall, können Rückschlüsse auf die Stoffwechselleistung des Bioreaktors gezogen werden. Neben der Konzentrationsdifferenz eines Stoffes zwischen Bioreaktor und Patient an zwei verschiedenen Zeitpunkten gehen die Filtratflußgeschwindigkeit und die Zeitdifferenz zwischen zwei Meßpunkten mit in die Formel ein. Daraus ergeben sich folgende Überlegungen:

Für

U = Stoffumsatz

F = Filtrationsrate


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V = Volumen des Bioreaktorkreislaufs = 1,3 Liter

CB1 = Konzentration Bioreaktor zu Meßzeitpunkt 1

CB2 = Konzentration Bioreaktor zu Meßzeitpunkt 2

CP1 = Konzentration Patient zu Meßzeitpunkt 1

CP2 = Konzentration Patient zu Meßzeitpunkt 2

t1 = Meßzeitpunkt 1

t2 = Meßzeitpunkt 2

gilt:

U = [F(CB1-CP1)e-F(t2-t1)/1,3 + F(CB2-CP2)] / [1-e-F(t2-t1)/1,3]

Für ein Meßintervall von vier Stunden wird der Ausdruck, der durch die Exponentialfunktion beschrieben wird, vernachlässigbar, so daß

U=F(CB-CP)

eine gute Näherung der wahren Verhältnisse darstellt.

Bei allen Modellen gehen wir davon aus, daß sich der Patient in einem Steady State befindet und der Bioreaktor gut durchmischt ist. Bei sehr starken Schwankungen der Patientenspiegel auf der Zeitachse müssen die errechneten Ergebnisse mit Vorsicht betrachtet werden, da die Veränderung der Konzentration zeitlich verzögert im Bioreaktor stattfindet, diese Verzögerung aber nicht genau quantifiziert werden kann, weil die Durchmischungsverhältnisse nicht immer bekannt sind und von Bioreaktor zu Bioreaktor variieren. Außerdem kann die Durchmischungsqualität einzelner Bereiche im Reaktorinnenraum durch das Verstopfen von Poren im Verlauf der Therapie abnehmen.

2.17 Bestimmung der Parameter

2.17.1 Bestimmung der Glucose–Konzentration

Die Bestimmung der Glucose–Konzentration findet im Zentrallabor der Charité statt. Die angewandte Methode wird von Thomas[99], Seite 154-166 beschrieben und von der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie empfohlen.

Die Bestimmung der Glucose-Konzentration erfolgt als kinetisch-enzymatischer UV-Test. Glucose wird in Anwesenheit von Hexokinase mit ATP zu Glucose-6-Phosphat phosphoryliert. Dieses reagiert mit NADP unter Bildung von 6-Phosphogluconat und NADPH2 in Anwesenheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase. Die Meßgröße ist die Geschwindigkeit der NADPH2-Zunahme bis zum Stillstand der Reaktion. Die Zunahme verhält sich proportional zur Glucose-[Seite 44↓]Konzentration und wird bei 340 nm photometrisch bestimmt. Der Test wird am Technicon DAX 72 (Technicon, Fa. Bayer) mit Reagenzien der Firma Bayer durchgeführt. Die Einheit der Meßwerte ist mg/dl.

2.17.2 Bestimmung der Laktat-Konzentration

Die Bestimmung der Laktat–Konzentration findet im Zentrallabor der Charité statt. Die angewandte Methode wird von Thomas[99], Seite 268–272 beschrieben und von der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie empfohlen.

Die Bestimmung der Laktat-Konzentration erfolgt als kinetisch-enzymatischer Test. Laktat wird durch Laktatoxidase zu Pyruvat und Wasserstoffperoxid (H2O2) umgesetzt. Das H2O2 bildet dann in einem weiteren Schritt durch Peroxidase einen Farbstoff, dessen Absorptionsmaximum bei 540nm liegt. Die Meßgröße ist der Absorptionsanstieg bei 540 nm. Der Anstieg verhält sich proportional zur Laktat-Konzentration. Der Test wird am Kodak Ektachem 250 (Fa. Johnson & Johnson) mit Reagenzien der Firma Johnson & Johnson durchgeführt. Die Einheit der Meßwerte ist mg/dl.

2.17.3 Bestimmung der Harnstoff-Konzentration

Die Bestimmung der Harnstoff–Konzentration findet im Zentrallabor der Charité statt. Die angewandte Methode wird von Thomas[99], Seite 422-426 beschrieben und wird von der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie empfohlen.

Die Bestimmung der Harnstoff-Konzentration erfolgt als kinetisch-enzymatischer UV-Test. Nach enzymatischer Hydrolyse des Harnstoffs durch Urease wird der gebildete Ammonium mit 2-Oxoglutarat und NADH2 zu Glutamat, NAD und Wasser mittels Glutamat-Dehydrogenase umgesetzt. Die Meßgröße ist die Abnahme der Absorption von NADH. Die Abnahme verhält sich proportional zur Harnstoff-Konzentration und wird bei 340nm photometrisch bestimmt. Der Test wird am Technicon DAX 72 (Technicon, Fa. Bayer) mit Reagenzien der Firma Bayer durchgeführt. Die Einheit der Meßwerte ist mg/dl.

2.17.4 Bestimmung der Ammonium-Konzentration

Die Bestimmung der Ammonium-Konzentration findet im Zentrallabor der Charité statt. Die angewandte Methode wird von Thomas[99], Seite 213-216 beschrieben und von der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie empfohlen.

Die Bestimmung der Ammonium-Konzentration erfolgt als kinetisch-enzymatischer UV-Test. Ammonium wird mit 2-Oxoglutarat und NADH2 zu Glutamat, NAD und Wasser mittels Glutamat-Dehydrogenase umgesetzt. Die Meßgröße ist die Abnahme der Absorption von [Seite 45↓]NADH. Die Abnahme verhält sich proportional zur Harnstoff-Konzentration und wird bei 340nm photometrisch bestimmt. Der Test wird am Kodak Ektachem 250 (Fa. Johnson & Johnson) mit Reagenzien der Firma Johnson & Johnson durchgeführt.


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21.01.2005