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4  DISKUSSION

Ein Ziel dieser Arbeit ist die Definition von Parametern zur Beurteilung der Leberfunktion von hybriden Leberunterstützungssystemen unter der Anwendung. Ein Urteil über die Stoffwechselaktivität von Bioreaktoren muß sich aus der Interpretation mehrerer biochemischer Parameter ergeben. Jeder biochemische Parameter unterliegt Störgrößen, die seine Aussagekraft limitieren. Folgende Aufzählungsliste soll einen Überblick über die behandelten Parameter geben.

Auf eine Darstellung spezifischer Leberenzyme wie ALT und AST, sowie der weniger spezifischen LDH und GLDH wurde aus folgenden Gründen verzichtet, obwohl die Bestimmung in-vitro als Marker für die Zellqualität herangezogen wird: Die indirekte Bestimmung, die den [Seite 72↓]Enzymumsatz mißt, unterscheidet nicht zwischen menschlichen und porcinen Enzymen. Die stark erhöhten Plasmaspiegel der Patienten erschweren eine Bilanz. Die Meßgenauigkeit würde hier nicht ausreichen, um Unterschiede, eventuell eine weitere Erhöhung der Plasmaspiegel durch die Bioreaktoren, festzustellen. Die relativ großen Moleküle sind in starkem Maß von der Durchlässigkeit der Plasmafilter und Membranen abhängig. Nach Erneuerung des Filters ist die Passage gut, verringert sich dann mit zunehmend verstopfenden Poren.

Nachfolgend soll diese Bewertung für die einzelnen Parameter ausführlich diskutiert werden.

4.1 Ammoniumstoffwechsel

Positiv zu bewerten ist der detoxifizierende Effekt der Bioreaktoren auf den Ammoniumstoffwechsel bei 5 der 7 ausgewerteten Patientenbehandlungen. Wir können davon ausgehen, daß der Ammoniumspiegel dieser Patienten ohne die Behandlung mit dem Bioreaktor noch stärker angestiegen wäre (siehe Abb. 7). Bei zwei Patienten, 2 und 7, war das Gegenteil der Fall. Die Bioreaktoren bewirkten eine weitere Erhöhung des Plasmaspiegels. Wenn wir uns an Abb. 5 erinnern, hatte Patient 2 ohnehin einen der Norm nahen, im Absinken begriffenen Plasmaspiegel, jedoch können wir dieses Absinken ausdrücklich nicht dem Bioreaktor zuschreiben (vgl. Abb. 7).

Für eine Ammoniumfreisetzung, die durch die Bioreaktoren bei den Patienten 2 und 7 geschah, kommen verschiedene Erklärungen in Frage. Starker Zellzerfall mit ausgedehnten nekrotischen Gebieten im Reaktorinnern, wie sie auf licht- und elektronenmikroskopischen Aufnahmen des Gewebes nach Behandlung zu sehen sind, kann ein Freisetzen von Zelltrümmern und Proteinen bewirken. Durch den Abbau freiwerdender Aminosäuren kann zusätzlich Ammonium entstehen.


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Abb. 28: Ammoniumbilanz von 14 Bioreaktoren aus dem Zellkulturbetrieb

[LINK to link] stellt die Ammoniumbilanz von 14 Bioreaktoren im Zellkulturbetrieb (vor Therapie) dar (negative Werte = Freisetzung, positive Werte = Aufnahme). Es wird deutlich, daß die Bioreaktoren in der Anfangsphase der Zellkultur, unmittelbar nach initialer Zellschädigung durch die Zellisolierung, und wieder nach einer Kulturdauer von mehr als 12 Tagen Ammonium freisetzen. In der Zwischenzeit überwiegt eine Nettoaufnahme, die das Optimum einer therapeutischen Nutzung darstellt. Die Werte in der Anfangsphase sind sehr stark gestreut. Bei den Bioreaktoren, die für die Therapie verwendet wurden, fällt auf, daß eine Ammoniumfreisetzung bei den Patienten 2 und 7 durch die mit Abstand ältesten Zellkulturen geschah (siehe Tabelle 11). Patient 2 wurde mit einer Zellkultur behandelt, die 8 Tage alt war, Patient 7 mit einer Zellkultur, die 12 Tage alt war. Daher ist meine Empfehlung, bis zu einer weiteren Verbesserung der Kulturbedingungen Zellkulturen, die nicht älter als eine Woche sind, zu verwenden, um einer weiteren Belastung der Patienten mit Ammonium vorzubeugen.

Eine biochemische Erklärung für die Ammoniumfreisetzung ist eine gesteigerte Glutaminasereaktion der Hepatozytenkultur bei hoher Glutaminbelastung. Wenn der aus der Glutaminasereaktion frei werdende Ammonium die Harnstoffsynthesekapazität der Hepatozyten [Seite 74↓]übersteigt, resultiert eine Nettofreisetzung von Ammonium durch den Bioreaktor. Ein weiteres Problem der Bioreaktoren ist die komplexe räumliche und funktionelle Anordnung der Hepatozyten, die unter Kulturbedingungen nicht erreicht werden kann.[100] Periportale Zellen enthalten ein System zur Harnstoffbildung mit hoher Kapazität zur Ammoniumentgiftung. Das System wird vorwiegend aus der Glutaminasereaktion gespeist, während perivenöse Zellen ein System zur Glutaminsynthese enthalten, das mit hoher Affinität zum freien Ammonium arbeitet.[26] Diese Zonierung ist nach der enzymatischen Zellisolierung aufgehoben. Eine mögliche Erklärung für die Ammoniumfreisetzung ist eine Schädigung der Glutaminsynthetase, denn bei beiden Patienten war eine Harnstoffliberation zu messen.

4.2 Glutaminstoffwechsel

Abb. 9 zeigt weder ein einheitliches Bild der Bioreaktoren untereinander noch eine Konstanz einzelner Bioreaktoren. In allen Bioreaktoren kann der Stickstoff aus dem Glutamin zur Harnstoffsynthese verwendet werden. Nicht alle Bioreaktoren scheinen über das Enzym Glutaminsynthetase zu verfügen, das in Zellkulturen häufig einer Schädigung unterworfen ist.[101] Lediglich bei den Patienten 3 und 5 ist über eine gewisse Konstanz von mehreren Meßpunkten eine Glutaminfreisetzung zu verzeichnen. Daraus ist zu folgern, daß die Glutaminsynthetasekapazität die der für die Harnstoffsynthese benötigten Glutaminasereaktion übersteigt. Daher ist die Nettoammoniumentgiftung dieser Bioreaktoren besonders hoch. Darüber hinaus hatten alle Bioreaktoren eine negative Glutamatbilanz, so daß in den anderen Geweben zusätzlich toxisches Ammonium über die Glutaminsynthetase gebunden werden kann. Um eine komplette Bilanz des Stickstoffwechsels zu erreichen, müssen die Bilanzen aller Aminosäuren analysiert werden. Von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang ist eine Analyse der Fisher-Ratio, die das Verhältnis der verzweigtkettigen AS Isoleucin, Leucin und Valin zu den aromatischen AS Phenylalanin und Tyrosin widerspiegelt. Physiologischerweise benutzt die Leber bevorzugt die aromatischen, potentiell neurotoxischen AS zur Energiegewinnung und stellt verzweigtkettige AS für andere Gewebe bereit. Eine Analyse aller AS-Bilanzen übersteigt den Umfang dieser Arbeit.

4.3 Harnstoffwechsel

Nach vorliegenden Ergebnissen zu urteilen, ist Harnstoff der geeignetste Parameter für eine Verlaufskontrolle im Sinne der Fragestellung. Bei einer negativen Harnstoffbilanz des Bioreaktors ist von einer guten Stoffwechselfunktion auszugehen. Wenn die Harnstoffbilanz des Bioreaktors jedoch über mehrere Meßzeitpunkte positiv bleibt, wie es bei Patient 8 der Fall war, kann man den Verdacht auf mangelnde Stoffwechselfunktion des Bioreaktors aussprechen.


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Um die Ergebnisse besser bewerten zu können, ist ein Vergleich der Stoffwechselleistung der Bioreaktoren, die zur Therapie benutzt wurden, mit denen, die ausschließlich im Zellkulturbetrieb liefen, sinnvoll. Bei letzteren ist eine Bilanzierung wesentlich exakter und ohne Störfaktoren durchführbar.

Abb. 29: Netto-Harnstoffbilanz von 7 Bioreaktoren im Zellkulturbetrieb

Die Abbildung zeigt die Harnstoffbilanz von 7 Bioreaktoren, die ausschließlich im Zellkulturbetrieb liefen. Es fällt eine Stufung der Netto-Harnstoffproduktion in Abhängigkeit von der Mediumzufuhr ins Auge, die am ersten Tag 200 ml/h, vom zweiten bis vierten Tag 100 ml/h und ab dem vierten Tag 50 ml/h beträgt (siehe Kapitel 2.10.1). Unter Kulturbedingungen zeigt sich die Harnstoffsynthese konstant in Abhängigkeit von der angebotenen Substratmenge, die durch die Mediumflußrate und die Konzentration an benötigten Aminosäuren im Medium bestimmt wird. Der Mittelwert der Harnstoffsynthese der zur Therapie eingesetzen Bioreaktoren beträgt 2,2 µmol/h/gBM, liegt also im Bereich der Bioreaktoren, die in der Zellkultur 100 ml/h Medium erhielten. Spitzenwerte, die deutlich darüber liegen, wurden gemessen und sind durch ein höheres Substratangebot während der Therapie erklärbar. Der hier durchgeführte Vergleich zwischen Bioreaktoren, die in der Therapie eingesetzt wurden und Bioreaktoren, die im Zellkulturbetrieb liefen, bekräftigt die in 4.7 formulierte Theorie, daß die Stoffwechselleistung [Seite 76↓]nach oben hin maßgeblich durch die Filtratflußrate des Patientenplasmas begrenzt ist.

Der Stoffwechselverlauf von Patient 2 zeigt, wie problematisch Harnstoff als Indikator der Stoffwechselleistung des Bioreaktors ist. Die starke Zunahme der Konzentration im Plasma des Patienten im Verlauf der gesamten Therapie war auf ein gleichzeitig eintretendes Nierenversagen zurückzuführen. Die Mischungsverhältnisse im Rezirkulationsmodell des extrakorporalen Kreislaufs führen bei einem kontinuierlichen Konzentrationsanstieg zu einem verzögerten Anstieg im Bioreaktor, so daß die errechnete Nettofreisetzung nicht der tatsächlichen Syntheseleistung des Bioreaktors entspricht, sondern höher liegt. Daß eine starke Erhöhung der Harnstoffkonzentration stattfand, ist als positives Zeichen für den Bioreaktor zu werten. Die Restfunktion der eigenen Leber wäre dazu wahrscheinlich nicht mehr in der Lage gewesen. Wenn man in diesem Falle, wie zum Beispiel die Arbeitsgruppe von Demetriou[102] oder auch alle anderen Arbeitsgruppen, die Harnstoffkonzentration vor und nach der Therapie als Referenz für die Stoffwechselaktivität genommen hätte, käme man zu irreführenden Ergebnissen, weil der gesamte Konzentrationsanstieg während der Behandlung dem Bioreaktor zugeschrieben würde.

4.4 Porcines Albumin

Der Nachweis von porcinem Albumin im Patientenplasma ist ein direkter Nachweis für die Stoffwechselaktivität der Hepatozyten im Bioreaktor. Da dieser Stoff ausschließlich von Schweineleberzellen produziert wird, kann hier auf Bilanzierungsmodelle und Berechnungen verzichtet werden, die ihrerseits Risiken der Verzerrung und Fehler enthalten. Porcines Albumin war im Plasma aller Patienten nachweisbar. Das rasche Absinken nach Therapieende spricht für eine anhaltende Stoffwechselaktivität der Hepatozyten bis zum Therapieende. Die Kurven der Schweinealbumin-Spiegel und die Kurven der berechneten Harnstoffsyntheseleistung des Bioreaktors zeigen keine Korrelation. Beide Stoffe sind Syntheseparameter für die Stoffwechselaktivität, beide basieren auf der Funktion sehr unterschiedlicher Enzymsysteme in unterschiedlichen Zellorganellen, so daß ein Nachlassen der Funktion nicht unbedingt gleichsinnig und gleichzeitig zu erwarten ist. Albumin ist gegenüber Harnstoff ein viel größeres Molekül, daher wird es eher in den Poren der Membranen oder im Plasmafilter zurückgehalten, so daß entsprechend mehr synthetisiert wurde als im Patientenplasma nachweisbar ist. Nachteil dieses Parameters ist, daß er nur nachträglich bestimmt werden kann. Die Bestimmung wird in Speziallaboratorien durchgeführt, die Genauigkeit ist nicht vergleichbar mit der standardmäßig bestimmter Parameter. Außerdem kann dieser Parameter nicht für einen Vergleich mit Systemen, die auf humanen Zellinien basieren, herangezogen werden.


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4.5  Glucosestoffwechsel

Die Leber hat eine zentrale Rolle bei der Stabilisierung des Glucosespiegels, entsprechend kritisch ist der Glucosespiegel im ALV.

4.5.1 Glucoseeinstellung der Patienten während der Therapie

Die Glucoseeinstellung der Patienten während der Therapie hat sich als schwierige Aufgabe erwiesen. Einerseits neigen Patienten in akutem Leberversagen zur Hypoglykämie, weil die Leber als glucoseproduzierendes Organ ausfällt. Andererseits reagieren die Patienten auch empfindlich auf Glucosegabe, da die Leber als Speicherorgan in seiner Funktion limitiert ist. Die Glucosespiegel der Patienten waren während der Therapie extremen Schwankungen unterworfen. Besonders gefährlich waren Glucosespitzen, die bei Patienten 2 und 4 gemessen wurden, da bei nachfolgendem raschem Abfall des Glucosespiegels eine weitere Hirndrucksteigerung droht.

4.5.2 Glucosestoffwechsel des Bioreaktors

Der Bioreaktor kann sowohl Glucose als Energiesubstrat aufnehmen und abbauen oder speichern als auch Gluconeogenese leisten. Bei den meisten Bioreaktoren wurde eher Glucose abgegeben. Bei einigen Patienten wurde aber vorübergehend eine Glucoseaufnahme gemessen. Die größte errechnete Glucoseaufnahme der Bioreaktoren wurde bei Patient 4 zum Zeitpunkt der höchsten Glucosespiegel gemessen, so daß eine intelligente Stoffwechselbeeinflussung durch den Bioreaktor wahrscheinlich ist. Aus den Kurven der Glucosefreisetzung und -aufnahme durch die Bioreaktoren ist Stoffwechselaktivität zu erkennen. Die Stoffwechselaktivität geschieht jedoch nicht so gleichmäßig, daß sie im Sinne der Fragestellung für eine Verlaufskontrolle in Frage kommt. Bei anhaltend hohem Glucoseverbrauch durch den Bioreaktor kann der Verdacht auf eine bakterielle Kontamination geäußert werden. Dies war bei keinem Behandlungsverlauf zu beobachten. Bei vorübergehender Glucoseaufnahme durch den Bioreaktor ist nicht auf nachlassende Stoffwechselleistung der Hepatozyten zu schließen.

Mit Glucoseinfusion und Insulininfusion liegen starke Instrumente zur Einstellung des Glucosespiegels bei der Hand, so daß der Einfluß des Bioreaktoren auf den Patienten eine untergeordnete Rolle spielt. Die errechnete Nettofreisetzung von Glucose der Bioreaktoren lag je nach Zellmasse in der Größenordnung 1/40 der Glucoseinfusion. Die Glucoseinfusion mußte im Verlauf der Therapie immer wieder adaptiert und bei einigen Patienten zwischenzeitlich unterbrochen werden, so daß eine schwankende Einflußgröße bestand, die die Bilanzierung für den Bioreaktor erschwerte.


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Abb. 30: Glucosebilanz von 14 Bioreaktoren im Zellkulturbetrieb

Bei 14 Bioreaktoren, die ausschließlich im Zellkulturbetrieb liefen, zeigte sich die Glucosebilanz in starker Abhängigkeit vom Alter der Zellkultur. Unmittelbar nach Zellisolierung findet eine starke Glucosefreisetzung statt, die mit einem Entleeren der Glycogenspeicher erklärt werden kann. Die Freisetzung läßt am zweiten Kulturtag stark nach und geht ab dem sechsten Tag in eine Netto-Aufnahme über. Wiederum sieht man eine Abhängigkeit des Stoffumsatzes von der Mediumzufuhr, über die das Substratangebot für den Stoffumsatz gesteuert wird. Wenn man sich das Alter der Zellkulturen, die zur Therapie benutzt wurden (Tabelle 11) und die Glucosebilanz während der Therapie (Abb. 18) ins Gedächtnis ruft, erkennt man, daß die Abhängigkeit von Alter der Zellkultur und Glucosebilanz während der Therapie aufgehoben ist. Die Therapie könnte ähnlich der Zellisolierung eine allgemeine Streßsituation für die Zellen darstellen, so daß sie mit einer katabolen Stoffwechsellage reagieren und eher Glucose freisetzen.

4.6 Laktatstoffwechsel

Der Laktatspiegel der Patienten ist während der Therapie so starken Schwankungen ausgesetzt, daß auf eine Bilanzierung für die Bioreaktoren verzichtet wurde (Verlauf der Spiegel, siehe 3.6). Die Laktatspiegel der Bioreaktoren bewegen sich gleichsinnig wie die der Patienten, so daß sich unregelmäßig eine leichte Nettofreisetzung bzw. -aufnahme abwechseln. Ein Blick auf die [Seite 79↓]Daten, die im Zellkulturbetrieb gesammelt wurden, verdeutlicht, daß die Bioreaktoren nicht in der Lage waren, Laktat abzubauen; es erfolgte vielmehr eine Nettofreisetzung:

Abb. 31: Laktatbilanz von 15 Bioreaktoren aus dem Zellkulturbetrieb

Die Abbildung zeigt, daß die Bioreaktoren im Zellkulturbetrieb nicht die von Lebergewebe normalerweise erbrachte Senkung der Laktatspiegel durchführen. Sie setzten Laktat frei. Grund dafür könnte eine für entsprechenden Energiebedarf zu niedrige Sauerstoffversorgung sein, so daß Glucose anaerob zu Laktat abgebaut wird. Aber auch eine Zellschädigung kann Laktatfreisetzung hervorrufen. Die Bioreaktoren zeigen während der Therapie ungleich der Situation im reinen Zellkulturbetrieb keine durchgehende Laktatfreisetzung.

4.7  Effektivität hybrider Leberunterstützungssysteme im klinischen Einsatz / Möglichkeiten der Optimierung

An dieser Stelle möchte ich einige Überlegungen und Berechnungen einfügen, um die Effektivität und Leistungsfähigkeit hybrider Leberunterstützungssysteme besser einschätzen zu können. Gleichzeitig können die an sie gerichteten Erwartungen präzisiert werden. Hierzu müssen die leistungslimitierenden Faktoren definiert und betrachtet werden.

Zunächst ist die verwendete Zellmasse entscheidend für die Effektivität der Systeme. Dazu dient ein Vergleich der verschiedenen, zum Einsatz gekommenen Systeme.


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Tabelle 16: verwendete Zellmasse verschiedener hybrider Leberunterstützungssysteme

 

Zellmasse [g]

Viabilität [%]

max. lebende Zellmasse [g]

Prozentsatz der physiologischen Lebermasse

Margulis[103, 104]

0,68

75,5

0,50

0,03

Sussman[105]

2 x 100

ca. 65 (geschätzt bei Kryokonservierung)

130

8,7

Demetriou[106, 107]

50

65 (Kryokonservierung)

33

2,2

Gerlach

500

97

485

32

Man bedenke, daß die angegebenen Werte die maximal erzielbare Zellausbeute darstellen; es ist jedoch anzunehmen, daß unter Kultur- und insbesondere unter Therapiebedingungen einige Zellen absterben. Aus den Zahlen wird ersichtlich, daß die Therapie mit einem Leberunterstützungssystem von Margulis minimale Auswirkungen auf den Stoffwechsel der Patienten hat. Die von ihm angegebenen biochemischen Effekte (siehe Kapitel 1.9.3) sind nicht mit der im System verwendeten Zellmasse vereinbar. Ähnlich verhält es sich bei Demetriou, der die gleiche Methodik verwendete, nämlich Plasmakonzentrationen vor und nach der Therapie verglich, um die biochemische Stoffwechselaktivität der Zellen zu überprüfen, und dabei ähnlichen Störfaktoren ausgesetzt ist. Die Zellmasse liegt zwar 50fach höher als bei Margulis, erscheint aber dennoch zu gering, um selbst bei optimalen Bedingungen einen nennenswerten Effekt ausüben zu können. Die von unserer Arbeitsgruppe verwendeten Bioreaktoren einthielten eine mittlere Zellmasse von 284g, somit wesentlich weniger als die unter optimalen Bedingungen erreichbaren 500g. Eine Zellmasse von mindestens 300 g, die mit 20% der physiologischen Zellmasse im Bereich der kritischen Masse für die Leberregeneration[13] liegt, erscheint erstrebenswert.

Bei biochemischen Stoffwechselprozessen in der Leber findet die Umwandlung eines Substrates in ein Stoffwechselprodukt statt. Ein wichtiger limitierender Faktor für den Stoffumsatz ist die Versorgung der Bioreaktoren mit Substrat. Dazu einige Daten zur Leberphysiologie:

Bei dem von uns verwendeten Therapiedesign wurde ein mittlerer Plasmafluß für den Bioreaktor von 31 ml/min erzielt. Der Plasmafluß im Bioreaktor ist durch den maximalen Blutfluß in der V. femoralis, aus der mit einem Doppellumenkatheter das Blut gewonnen wird, und durch die Technik der Plasmafiltration, mit der ca. 20% aus dem Volumen des Blutes filtriert werden kann, limitiert. Am Beispiel der Ammoniumentgiftung ergeben sich daher folgende Überlegungen: Die mittlere Ammoniumkonzentration im Plasma aller Patienten an allen Meßzeitpunkten betrug 174 µmol/l, der mittlere Plasmafluß im Bioreaktor betrug 1,9 l/h.

Substratangebot Ammonium: 174 µmol/l * 1,9 l/h = 331 µmol/h oder 7,93 mmol/d

Daraus ist zu folgern, daß selbst bei beliebig hoher Zellmasse im Bioreaktorinnenraum mit perfekter Stoffwechselaktivität maximal, bei kompletter Ammoniumelimination, 7,93 mmol/d aus dem Plasma entfernt werden können. Die normale tägliche Ammoniumbelastung des Menschen liegt jedoch bei 300-500 mmol/d.[13] Wahrscheinlich kann die tägliche Ammoniumbelastung trotz Darmsterilisation mit Elimination ureaseaktiver Bakterien und angepaßter Aminosäureinfusion nicht so weit reduziert werden, daß eine Stoffwechselkapazität von 8 mmol/d ausreichen könnte.

Ähnliche Verhältnisse treffen für andere Stoffwechselwege zu. Die Plasmafiltrationsrate genügt nicht, um die kultivierten Zellen ausreichend mit Substrat zu versorgen. Hier muß alles unternommen werden, die Flußraten zu erhöhen, um der eingesetzten Zellmasse zu Wirkung zu verhelfen.


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Tabelle 17: Filtratflußraten verschiedener Leberunterstützungssysteme

 

Blutfluß [ml/min]

Plasma-separation

Filtratfluß [ml/min]

Therapiedauer pro Tag [h]

Plasmafluß pro Tag [l]

Margulis[109, 110]

80-100

/

/

8

/

Sussman[111]

150-300

Mikrofiltration

30

8

14,4

Demetriou[112]

100

Zentrifugation

50

8

24

Gerlach

150-300

Filtration

30-60

24

43,2-86,4

Ein Blick auf die anderen Systeme zeigt, daß ähnliche Probleme existieren. Mit einem Filtratfluß von 30 ml/min im hLUS wird das zirkulierende Plasma nicht ausreichend ausgetauscht. Die Arbeitsgruppe von Demetriou erzielte einen Filtratfluß, der ähnlich dem unserer Arbeitsgruppe unbefriedigend war; jedoch benötigte die Gruppe dafür einen deutlich niedrigeren Blutfluß. Durch die Zentrifugation kann ein höherer Prozentsatz des Plasmas separiert werden als durch Filtration.

Ein Nachteil der Systeme anderer Arbeitsgruppen ist das Festsetzen der Behandlungszeit auf 8 Stunden pro Tag, während das System unserer Arbeitsgruppe 24 Stunden pro Tag läuft. Alle anderen Systeme können somit noch weniger den erforderlichen Tagesstoffumsatz leisten.

Ein weiteres Problem, das die Effektivität der Therapie begrenzen kann, sind die Durchmischungsverhältnisse im Reaktorinnern. Hierzu gibt es wenig Daten, ein Vergleich zwischen verschiedenen Systemen ist kaum möglich. Dennoch einige Anmerkungen zu dem von uns eingesetzten System: Durch die im Vergleich zu Kulturbedingungen sehr viel höhere Belastung des Systems mit Eiweißen, Zelltrümmern und anderen hochmolekularen Stoffen kommt es zu einem raschen Verstopfen der Poren in den PES-Membranen. Als Folge muß der generell vorzuziehende Perfusionsmodus, bei dem das Plasma von einem Kapillarbündel über den Zwischenraum, in dem sich die Zellen befinden, zum Abfluß in das andere Kapillarbündel übertritt, verlassen werden und auf Grund von Drucksteigerungen in den Diffusionsmodus umgeschaltet werden, bei dem das Plasma direkt über dasselbe Kapillarbündel aus dem System austreten kann. Der Stoffaustausch geschieht entlang der Kapillare über die Poren, ist weniger intensiv, braucht also mehr Zeit und eine höhere Konzentrationsdifferenz. Auf ähnliche Weise könnten auch einzelne Kapillare verstopfen, so daß bestimmte Gebiete verminderten [Seite 83↓]Stoffaustausch erfahren oder ganz abgeschnitten sind. Hinzu kommt die Verstopfung der Poren der Plasmafilter, die zwar regelmässig ausgetauscht werden, aber zwischenzeitlich einen verminderten Stoffaustausch höhermolekularer Substanzen bewirken. Alternativen zum derzeitigen Stoffaustauschverfahren müssen gesucht werden.

Aktuelle Studien unserer Arbeitsgruppe haben dieses Problem aufgegriffen und durch einige Konfigurationsänderungen im System hervorragende Ergebnisse bei weiteren klinischen Anwendungen erzielt: Im Plasmafilter zirkuliert das Plasma im Gegenstrom zum Blut, so daß Stoffaustausch durch Diffusion entlang der Kapillare durch Konzentrationsgradienten geschieht. Das Blut wird weiterhin mit einer Flußrate von bis zu 300 ml/min entnommen. Das Plasma kann auf Grund technischer Verbesserungen im Innern des Bioreaktors mit 600 ml/min rezirkulieren und gelangt im Gegenstromverfahren in den Plasmafilter. Dadurch, daß das Plasma nicht mehr dem Vollbut entnommen und später wieder zugeführt wird, bleibt eine Konzentrierung des Blutes aus. Daher kann die Heparinisierung der ohnehin bereits blutungsgefährdeten Patienten reduziert werden. Das gesamte System wurde einfacher. Ein zwischengeschalteter Kreislauf und zwei Pumpen, die mehrere Druckmessungen erforderten, konnten eingespart werden. In Farbtracerstudien wurde ein erheblich verbesserter Stoffaustausch gemessen und in weiteren klinischen Anwendungen praktiziert. Theoretisch ist jetzt der Blutfluß aus dem Doppellumenkatheter mit 300 ml/min das limitierende Element im System; der Blutfluß entspricht einem Fünftel des physiologischen Blutstroms durch die Leber.

4.8 Risiken hybrider Leberunterstützungssysteme

Die Risiken hybrider Leberunterstützungssysteme lassen sich in folgender Übersicht in zwei verschiedene Kategorien unterteilen:

Tabelle 18: Risiken hybrider Leberunterstützung

Künstlich

Biologisch

Antikoagulation

Transmission

Biokompatibilität

Immunologie

Im folgenden sollen einzelne Aspekte genauer beleuchtet werden.

4.8.1 Antikoagulation

Spontane Blutungen gehören zu den schwersten Komplikationen im akuten Leberversagen.[113] Verminderte Synthese von Gerinnungsfaktoren geht mit einem erhöhten Verbrauch einher. Der [Seite 84↓]Verbrauch von Gerinnungsfaktoren wird durch Thrombin und Plasminogen angeschoben. Die nekrotischen Leberzellen setzen thromboplastisches Material und Plasminogen setzt aktivierende Faktoren frei.[114] Für die kontinuierliche Plasmaseparation im extrakorporalen Kreislauf muß zusätzlich heparinisiert werden, um eine Koagulation und das Verstopfen von Filtern und Poren zu verhindern. In den Plasmafiltern bleiben zusätzlich Thrombozyten hängen oder werden inaktiviert. Es kommt zu einem Thrombozytenabfall. Die Patienten erhalten daher Thrombozytenkonzentrate und Gerinnungsfaktoren. Man begibt sich auf eine Gratwanderung zwischen notwendiger Antikoagulation und Blutungsgefahr. Es gibt wenig klinische Erfahrung über mögliche Risiken einer über mehrere Tage andauernden kontinuierlichen Plasmaseparation. Die Plasmaseparation ist limitierend für die Therapiedauer und die Menge des Stoffumsatzes.

4.8.2 Biokompatibilität

Studien zeigen, daß schwere Nebenwirkungen der Plasmaseparation wie Blutdruckabfall und Hämaturie mit 1,4% bzw. 0,4% selten sind,[115] dabei kommt es auf die Biokompatibilität der verwendeten Membranen an.[116]

Die von unserer Arbeitsgruppe durchgeführten Studien ergaben keinen Hinweis auf Biokompatibilitätsprobleme. Untersuchungen zur Biokompatibilität der Plasmaseparation im Zusammenhang mit der von Demetriou durchgeführten hLUS ergaben keine schweren Nebenwirkungen. Es wurde lediglich ein signifikanter Abfall der Fibrinogenspiegel gemessen. Außerdem wurde ein Abfall von freiem Calcium festgestellt, weil das Ion mit dem von der Gruppe verwendeten Antikoagulans, Citrat, Chelate bildet.[117]

4.8.3  Transmissionsrisiko durch xenogenen Kontakt

In der Routine werden die für eine Behandlung und den direkten Kontakt mit Humanplasma in Frage kommenden Schweine unter SPF-Bedingungen gehalten und transportiert. Die FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Association) empfiehlt dazu, zahlreiche Untersuchungen auf bakterielle und virale Erreger durchzuführen.[118]

Trotz Testung der Spendertiere auf alle bekannten Zoonosen können Übertragungen von unbekannten Zoonosen vom Tier auf den Menschen nicht ausgeschlossen werden. In besonderem Maße gilt dies für Primaten, die als Quelle einiger humanpathogener Viren (Marburg Virus und Ebola Virus) in Frage kommen. Aufgrund der engen genetischen Verwandtschaft zwischen SIV Simian Immunodeficiency Virus und dem HIV Human Immunodeficiency Virus wird auch hier ein Übertragungsweg über die Primaten diskutiert.[119]

Das dauerhafte Überschreiten natürlicher Barrieren zwischen Mensch und Tier bringt eine [Seite 85↓]Infektionsgefahr mit sich, obwohl durch Tierzucht seit Jahrtausenden ein enger Kontakt bestand, wie das Beispiel BSE (Bovine Spongiforme Enzephalitis) zeigt. Prusiner konnte zeigen, daß die durch Prionen hervorgerufene Krankheit zwischen Spezies übertragbar ist.[120, 121] Es besteht die Befürchtung, daß BSE bei Übertragung auf den Menschen vCJD, eine neue Form der Creutzfeldt-Jakob Disease, auslösen kann. Gleichzeitig wurde das Auftreten einer übertragbaren Form von TSE Transmissible Spongiform Encephalopathy bei Mäusen, Katzen und exotischen Arten von Wiederkäuern beobachtet, so daß eine Ausbreitung der Erkrankung über die Speziesgrenzen hinweg angenommen wird.[122]

Da Schweine unter den Tieren als potentielle Organspender favorisiert werden, gilt dem PERV Porcine Endogenous Retrovirus besondere Aufmerksamkeit. Das PERV-Genom ist in jeder Schweinezelle vorhanden. Das Virus ist infektiös für humane Immunzellen;[123] darüber, wie jedoch das Infektionsrisiko eines Transplantatempfängers oder eines Patienten, der mit einem hLUS basierend auf Schweinehepatozyten behandelt wird, einzuschätzen ist, gibt es unterschiedliche Meinungen in der Literatur. Pitkin et al.[124] untersuchten 28 Patienten, die mit einem hLUS behandelt wurden. Alle waren PERV negativ. Die Autoren fanden, daß der Einsatz semipermeabler Membranen in bioartifiziellen Systemen das Übertragungsrisiko um das 105fache senkt. Paradis et al.[125] untersuchten 160 behandelte Patienten auf PERV. Sie fanden weder eine Virämie, noch konnten sie den Befall mononukleärer Zellen nachweisen. Trotz aller Entwarnungen bleibt die Frage nach Xenozoonosen brisant, denn eine Übertragung von Erregern könnte nicht nur für den Patienten, sondern für die Spezies Mensch schwerwiegende Folgen haben.

Die eigene Arbeitsgruppe untersucht daher die Verwendung primärer humaner Hepatozyten als Alternative.

4.8.4  Immunologische Aspekte

Alle hLUS, die auf tierischen Zellen basieren, verwenden Membranen, um die Zellkultur vor direktem Kontakt und Zerstörung durch immunkompetente Zellen der Patienten zu schützen. Die Porengröße der Membranen ist so gewählt, daß sie für Proteine durchlässig ist, weil der proteingebundene Stoffaustausch erwünscht ist. Damit ist die Membran auch permeabel für Antikörper und Komplementfaktoren, so daß theoretisch eine Aktivierung des Komplementsystems auf klassischem und alternativem Weg stattfinden kann, mit der Gefahr einer Lyse von tierischen Zellen. Natürliche Antikörper des Menschen sind gegen Oberflächenantigene auf PAEC Porcine Aortic Endothelial Cells gerichtet.[126] Versuche von Fujioka et al.[127] zeigten, daß Hepatozyten vom Schwein weniger anfällig für Zytotoxizität [Seite 86↓]durch natürliche Antikörper sind als Endothelzellen. Baquerizo et al.[128] untersuchten die immunologischen Auswirkungen der Behandlung mit einem hLUS der Arbeitsgruppe Demetriou. Sie fanden bei mehrfacher Anwendung des hLUS einen starken Anstieg der IgM und IgG Xenoantikörper gegen das α-Gal-Oberflächenepitop, das hauptsächlich von PAEC-Zellen ausgeprägt wird. Erste klinische Erfahrungen mit hLUS zeigten keine immunologischen Komplikationen. Dennoch wird ein enges immunulogisches Monitoring der Patienten empfohlen.[129] Außerdem muß man durch den Kontakt mit Fremdmaterialien mit immunologischen Überempfindlichkeitsreaktionen rechnen.

Auch hier wäre die Verwendung humaner Leberzellen von Vorteil.

4.9  Ethische Aspekte

Die gezielte Züchtung und Haltung von Schweinen oder Primaten zur Organspende werfen Fragen zur ethischen Vertretbarkeit auf.[130] Es gibt verschiedene Gründe, aus denen Primaten nur ungern für Xenotransplantationen herangezogen werden. Ihre Ähnlichkeit zum Menschen löst eher Mitgefühl aus, die genetische Ähnlichkeit erhöht das Risiko für die Übertragbarkeit von Infektionskrankheiten. Die Erschöpfbarkeit einiger Arten, die langsamen Vermehrungszyklen und die Aufzucht unter SPF-Bedingungen führen zu erheblichen logistischen Problemen. Das Schwein dagegen vermehrt sich sehr rasch und ist nicht vom Aussterben bedroht, sondern wird seit langer Zeit gezüchtet und verspeist. Die oben besprochenen Infektionsrisiken müssen auch unter ethischen Gesichtspunkten betrachtet und im Sinne eines Verantwortungsbewußtseins ständig weiter untersucht werden. Schließlich gibt es möglicherweise psychologische Probleme oder religiöse Bedenken bei Patienten, die mit tierischen Organen behandelt oder transplantiert werden. Zur weiteren Vertiefung sei auf Texte von Daar et al.[131] und Derenge[132] verwiesen.

Ethische Fragestellungen ergeben sich auch bei der Suche nach neuen Zellquellen. Mehrere Arbeitsgruppen, die sich mit der Kultivierung, Proliferation und in-vitro Differenzierung von embryonalen Stammzellen beschäftigen, hoffen, in Zukunft geeignete Zellinien für Bioreaktoren herstellen zu können.[133, 134, 135] Die aktuelle Rechtsprechung, die auf diesem Gebiet einige Zeit hinter dem wissenschaftlich Möglichen hinterherzieht, ist dabei, klare Richtlinien zu definieren. Noch ist die Rechtsprechung in den einzelnen Ländern der Europäischen Union sehr unterschiedlich. In Deutschland ist der Gebrauch von menschlichen Embryonen zu wissenschaftlichen Zwecken generell verboten. Der Europarat empfiehlt ein Verbot der Herstellung menschlicher Embryonen ausschließlich für die Forschung, äußert sich aber nicht prinzipiell gegen das Verwenden ohnehin anfallenden Materials.[136] In den USA pflegt die [Seite 87↓]Regierung eine sehr passive Haltung und stellte unter Druck der Öffentlichkeit die Förderung dieser Form der Forschung ein; seither fließt das Geld aus der Industrie. Kirchliche Gruppen hingegen lehnen eine Verwertung menschlicher Embryonen generell ab und fordern dazu auf, Stammzellen aus dem Knochenmark Erwachsener oder aus Plazentargewebe zu gewinnen.[137, 138] Die Kirchen fordern eine strengere Gesetzgebung und bessere Prüfung bei der Vergabe von öffentlichen Geldern. Oft repräsentieren sie die Meinung einer großen Gruppe der Bevölkerung auf Grundlage von emotionalen und intuitiven Gesichtspunkten. Ich denke, daß hier viel Bedarf für Wissenschaftler besteht, die dazu neigen, auf Grundlage pragmatischer Gesichtspunkte das Machbare zu realisieren, sich mit Vertretern aus Politik und Verbänden an einen Tisch zu setzen, um ethische Grundlagen zu diskutieren.

Ethisch wenig problematisch erscheint die Verwendung humaner Hepatozyten aus Organen, die für eine Transplantation entnommen worden sind, anschließend jedoch abgelehnt und ansonsten verworfen werden.

Andere ethische Gesichtspunkte sind zu beachten bei der Indikationsstellung für eine hLUS-Therapie. In der Arbeitsgruppe Demetriou wurde beispielsweise eine Gruppe von 10 Patienten behandelt, die mit akuter Exazerbation chronischer Lebererkrankungen wegen aktiven Alkoholismus oder anderer Gründe nicht für eine Transplantation gelistet waren.[139] Zwei Patienten erholten sich, acht starben wenig später. Die Therapie konnte hier bei terminaler Krankheit nur eine kurze Verzögerung des einsetzenden Todes leisten. Der Einsatz des hLUS war hier ethisch fragwürdig, denn beim heutigen Stand der Technik ist das Einleiten einer spontanen Regeneration durch hLUS noch nicht wahrscheinlich. Es ist nicht sicher, daß die Regeneration bei den beiden Patienten durch die hLUS eingeleitet wurde.

Trotz aller Bedenken ist es wichtig, sich diese Bereiche völlig neuer Technologien und Fragestellungen vorzuwagen.

4.10 Ausblick

4.10.1 Zellquellen

Eine neue Dimension von Möglichkeiten bietet die Verbesserung gentechnologisch hergestellter Humanzellinien. Durch Transfektion mit dem Simian Virus (SV 40) T-Antigen ist es einigen Arbeitsgruppen gelungen, immortalisierte, nicht-tumorogene Zellinien herzustellen. Der Verlust an Stoffwechselfunktion gegenüber primären Zellen ist jedoch erheblich. So produziert beispielsweise die von Liu hergestellte Zellinie HepLiuD63 anfangs noch Albumin, verliert diese Funktion jedoch nach einigen Zellpassagen. Cytochrom-P450-Aktivität konnte nachgewiesen werden. Carbamoylphosphat-Synthetase wurde als Schlüsselenzym der Harnstoffsynthese [Seite 88↓]ebenfalls nachgewiesen.[140] Harnstoffsynthese können die Zellen allerdings nicht leisten. Außerdem gibt es wenig Erfahrung darüber, wie die Zellen unter Belastung mit Plasma von Patienten in akutem Leberversagen reagieren. Shi et al.[141] fanden, daß Wachstum, DNA-, RNA- und Proteinsynthese einer HepG2-Zellinie durch Kontakt mit Patientenplasma vermindert waren. Morphologische Veränderungen waren erkennbar. Die Autoren empfehlen eine Vorbehandlung des Patientenplasmas, um die Toxinbelastung zu senken.

Die Gewinnung von Leberstammzellen gilt als vielversprechendes Gebiet der Forschung nach neuen Zellquellen. Man erhofft sich eine gezielte Zellproliferation bis zu einer gewünschten Zielgröße und gute Differenzierung. Thomson et al.[142] [143] und Gearhart et al.[144] arbeiten an der Gewinnung pluripotenter embryonaler Stammzellen, mit denen nach anschließender Proliferierung und Differenzierung verschiedene menschliche Gewebe hergestellt werden könnten. Die Durchführung von Versuchen an menschlichen Embryonen wirft nicht nur neue ethische Fragen auf (siehe Seite 74), auch scheint die Proliferierung und Ausdifferenzierung unter Kulturbedingungen in weiter Ferne. Außerdem gibt es Versuche, Stammzellen aus Lebern von Rattenembryonen zu isolieren.[145] Forscher vom Albert Einstein College of Medicine in New York haben Zellinien aus Lebern von Rattenembryonen gewonnen und zu einem gewissen Differenzierungsgrad gebracht.[146, 147, 148] Michalopoulos konnte auch im Knochenmark Hepatic Oval Cells (HOV) identifizieren, von denen angenommen wird, daß sie bipotent sind und sowohl in Hepatozyten als auch in Gallengangepithel differenzieren können.[149, 150] Eine japanische Arbeitsgruppe konnte durch Transfektion von HGF über ein Adenovirus die Proliferation von HOV in vivo stimulieren.[151]

Forscher aus der Gruppe von Demetriou gewannen Hepatozyten aus menschlichen Organen, die wegen Steatose und Alter der Spender von allen Transplantationszentren abgelehnt wurden. Nach Isolierung wurden leberspezifische Funktionen in Kultur gemessen.[152] Studien mit humanen Hepatozyten als Zellquelle für den Einsatz im Bioreaktor aus Organen, die für eine Transplantation entnommen, aber anschließend abgelehnt wurden, laufen gegenwärtig in der eigenen Arbeitsgruppe. Die Organe sind nicht von ausreichender Qualität, um eine Transplantation zu verantworten, jedoch genügend um funktionstüchtige Hepatozyten zu isolieren und temporäre Leberunterstützung zu leisten. Es wurden in ersten klinischen Anwendungen hervorragende Ergebnisse erzielt. Nachteil ist, daß man damit auch auf das Eintreffen von Spenderorganen angewiesen ist und nicht wie bei Schweinelebern beliebig viele zu jedem bestimmbaren Zeitpunkt zur Verfügung hat. Der Vorteil ist, daß die unter 4.8.3 genannten Risiken der Transmission durch Xenokontakt wegfallen und die unter 4.8.4 genannten [Seite 89↓]Risiken nur bedingt zu treffen.

4.10.2 Qualitätssicherung hybrider Leberunterstützungssysteme

Für die Zukunft wäre es wünschenswert, einen internationalen, vergleichbaren Standard für die Stoffwechselaktivität hybrider Leberunterstützungssysteme zu haben. Damit könnten eine Qualitätssicherung der Kultur vor der Therapie, eine engmaschige und schnelle Überprüfung während der Therapie und eine retrospektive Analyse durch aufwendig in Speziallaboratorien zu bestimmende Parameter im Anschluß an die Therapie erfolgen. Wenn man als Basis die Freisetzung bzw. Aufnahme eines Stoffes pro Stunde heranzieht und sie auf ein Gramm Zellmasse bezieht, werden die unterschiedlichen Systeme, die international zum Einsatz kommen, untereinander vergleichbar. Anschließend kann man über die Empfehlung einer Mindestzellmasse diskutieren, die den Einsatz eines Systems rechtfertigt.

Zusätzlich gilt es, weitere Parameter, die für eine Verlaufskontrolle und Qualitätssicherung während der Therapie in Frage kommen, zu erforschen. Spezifische Leberenzyme wie ALT und AST sowie die weniger spezifischen Parameter LDH und GLDH können in-vitro als Marker für die Zellqualität herangezogen werden.[153] Während der Therapie gibt es aber den Nachteil, daß im Patientenplasma durch den Zerfall der eigenen Leber enorme Konzentrationen dieser Enzyme bereits vorhanden sind, somit ein weiterer Anstieg nur schwer zu entdecken wäre. Außerdem ist die Molekülgröße ein Nachteil für die Passage von Membranen und Filtern.

Bilirubin ist ein weiterer Parameter, den es zu analysieren gilt. Hepatozytenkulturen sind in der Lage, Bilirubin zu konjugieren. Die Konzentration des direkten Bilirubins müßte nach Durchfließen des Bioreaktors erhöht sein gegenüber der Konzentration des indirekten Bilirubins.

Ein weiteres ungelöstes Problem aller hLUS ist die Entkoppelung vom enterohepatischen Kreislauf. Die exkretorische Funktion der Leber kann nicht erfüllt werden. Gallensalze können nicht direkt in den Darm sezerniert werden. Konjugierte Stoffe können in das Plasma freigesetzt werden und eventuell über die Nieren ausgeschieden werden. Wegen der Komplexität der Einflußfaktoren bleibt eine weitere Erforschung notwendig.

Trotz der diskutierten Nachteile und Risiken der hybriden Leberunterstützung sollten auf diesem jungen Gebiet der Forschung im Sinne der Patienten und der Wissenschaft alle Anstrengungen unternommen werden, um weitere Entwicklungen voranzutreiben.


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21.01.2005