Ziel der Arbeit ist die Beurteilung der biochemischen Stoffwechselaktivität eines hybriden, extrakorporalen Leberunterstützungssystems während initialer therapeutischer Anwendungen. Das System basiert auf der Nutzung porciner Hepatozyten, die in einem Bioreaktor kultiviert werden. Acht Patienten in akutem Leberversagen, Komagrad III-IV, wurden unter kontinuierlicher Plasmaseparation mit dem System behandelt.
Es wird ein Modell zur Bestimmung der Netto-Stoffwechselbilanz des Bioreaktors vorgestellt. Dieses Modell basiert auf der gleichzeitigen Bestimmung von Stoffkonzentrationen im Patientenplasma, gewonnen vom Patienten direkt und nach Durchfließen des Bioreaktors in bestimmten Zeitintervallen. Die Stoffwechselaktivität des Bioreaktors bezüglich der Stoffe Ammonium, Glutamin, Harnstoff, porcines Albumin, Glucose und Laktat wird dargestellt. Fünf der sieben eingesetzten Bioreaktoren nahmen kontinuierlich Ammonium auf, sechs von sieben Bioreaktoren synthetisierten Harnstoff und alle Bioreaktoren synthetisierten porcines Albumin. Die Ergebnisse zeigen, daß die Parameter Harnstoff und Ammonium am besten geeignet sind, Aussagen über die Stoffwechselaktivität der Bioreaktoren während der Therapie zu liefern. Porcines Albumin kann retrospektiv als Kontrolle der Syntheseleistung eingesetzt werden, steht aber nicht während der Therapie zur Verfügung. Die Bilanzierung von Glucose wird am stärksten durch äußere Einflußfaktoren gestört. Laktat stellt sich als ungeeignet für eine Verlaufskontrolle heraus, weil die Bioreaktoren die stark schwankenden Patientenplasmaspiegel nur unwesentlich beeinflussen konnten.
A hybrid liver support system based on porcine liver cells was investigated in patients suffering from acute liver failure, coma stage III-IV. The biochemical activity of the system during the application was studied. Patient plasma was drawn systemically and after circulation through the bioreactor system at four hour intervals. A method is introduced that takes into account the rate of plasma flow and the differences in plasma concentration systemically and after circulation through the liver support system to determine the net release or uptake of metabolites such as ammonia, urea and glucose, glutamine, porcine albumine, lactate. Urea release was seen in 6 out of 7 bioreactors at all time points during treatment. Continuous ammonia uptake was seen in 5 out of 7 bioreactors used for treatment. Porcine albumine was seen in all patients. An active role of the system in glucose metabolism was observed. Lactate levels did not yield any information on bioreactor metabolic activity. All patients were bridged successfully to liver transplantation.
Zur Therapie des Leberversagens befinden sich verschiedene extrakorporale Behandlungsverfahren in der klinischen Erprobung. Neben artifiziellen Verfahren finden sich biologische und hybride, kombiniert biologisch-artifizielle, Verfahren zur Leberunterstützungstherapie. In die Gruppe der letztgenannten gehören Systeme, bei denen Leberzellen in einem extrakorporalen Kreislauf mit dem Plasma der Patienten in Kontakt gebracht werden. Ziel ist eine unterstützende Stoffwechselleistung durch diese Leberzellen, um die Progression des Leberversagens zu stoppen bzw. die Symptome zu mildern, in der Hoffnung, Zeit für eine spontane Regeneration der patienteneigenen Leber zu gewinnen oder eine sichere Überbrückung der Patienten bis zur Durchführung einer Organtransplantation zu ermöglichen.
Neben der klinischen Bewertung solcher Systeme gehört ein Verständnis der Kapazität des Stoffumsatzes zu den Voraussetzungen für eine kritische Evaluation und eine Weiterentwicklung dieser jungen biomedizinischen Methode. Eine solche Beurteilung soll anhand von klinischen Daten für das BELS (Berliner Extrakorporales Leberunterstützungssystem) durchgeführt werden, und die Ergebnisse sollen den Darstellungen anderer Arbeitsgruppen gegenübergestellt werden.
Das akute Leberversagen ist ein schweres, rasch progredientes und oft tödlich verlaufendes Krankheitsbild, dem massive Leberzellschädigung oder -nekrosen zugrunde liegen. Innerhalb von 8-12 Wochen nach Auftreten eines Ikterus kommt es zum Einsetzen der hepatischen Enzephalopathie bei zuvor lebergesunden Personen.[1] In der Folge kommt es zu Störungen im Säure-Basen-Haushalt, der Nierenfunktion, sämtlicher Organsysteme bis hin zu hyperdynamem Kreislaufversagen, Sepsis und der oft lebensbedrohenden Hirndrucksteigerung mit Gefahr einer Herniation.[2] Die Letalität des akuten Leberversagens beträgt in Abhängigkeit der Ätiologie 20%-80%.
Die häufigste Ursache des akuten Leberversagens weltweit sind virale Hepatitiden,[3] gefolgt von medikamenteninduziertem Leberversagen. Jedoch sind große regionale Unterschiede festzustellen. So ist zum Beispiel die Acetaminophenvergiftung mit suizidaler Absicht in Großbritannien die häufigste Ursache, wohingegen sie in anderen Ländern eine untergeordnete Rolle spielt.[4]
O’Grady schlug eine weitere Einteilung des Leberversagens in hyperakut, akut und subakut vor, mit einem zeitlichen Abstand zwischen Einsetzen des Ikterus und der hepatischen Enzephalopathie von wenigen Tagen beziehungsweise Wochen oder Monaten. Daraus ergibt sich für jede Klasse ein unterschiedlicher Schweregrad der Prognose in Abhängigkeit der Ätiologie.
Nach Ausschöpfen konventioneller Therapiemethoden stellt die Lebertransplantation die derzeit anerkannte Therapie für das akute Leberversagen dar.[7] Die Überlebensraten in den USA nach Lebertransplantation reichen von 46% bis 89%.[8] Um die Überlebensrate der Patienten zu verbessern, wurden drei prinzipiell unterschiedliche Verfahren entwickelt. Artifizielle Systeme wie Dialyse, Aktivkohlefilter oder Plasmaaustausch können lediglich detoxifizierende Funktionen der Leber übernehmen. Die extrakorporale Perfusion ganzer Organe, die auch metabolische Funktionen übernehmen, konnte sich klinisch bisher nicht durchsetzen. Mit der klinischen Erprobung hybrider Leberunterstützungsverfahren konnten die Effekte der beiden anderen Methoden kombiniert werden. Erste klinische Anwendungen weltweit lieferten vielversprechende Ergebnisse.
Das akute Leberversagen ist durch das Auftreten einer rasch progredienten Enzephalopathie charakterisiert, die in folgende Stadien eingeteilt werden kann.
Hirnödem ist eine häufig letale Komplikation des akuten Leberversagens.[9] Die Ursache der hepatischen Enzephalopathie konnte bisher nicht völlig geklärt werden. Eine Auswahl der an der Pathophysiologie beteiligten Stoffe wird im folgenden einzeln besprochen.[10, 11, 12]
Ammonium liegt bei physiologischem pH-Wert zu 1% als diffusionsfähiges Ammoniak NH3 und zu 99% in seiner ionisierten Form als Ammonium-Ion NH4+ vor.[13] In der Literatur und im allgemeinen Sprachgebrauch werden die Begriffe Ammonium und Ammoniak häufig unscharf voneinander abgegrenzt oder Synonym verwendet.
Es gibt Hinweise darauf, daß ein erhöhter Ammoniumplasmaspiegel eine hepatische Enzephalopathie auslösen oder verstärken kann. Zu den neuropsychiatrischen Symptomen eines erhöhten Ammoniumspiegels zählen Stimmungserhöhung, Persönlichkeitsveränderungen, kognitive Defizite, Ataxie, Koma und Krämpfe. Ein verminderter Ammoniumspiegel wirkt sich therapeutisch generell günstig aus.[14] Für den Mechanismus der toxischen Wirkung von Ammonium auf das zentrale Nervensystem gibt es verschiedene Theorien.[15, 16, 17]
Eine Veränderung der Blut-Liquor-Schranke führt zu erhöhter Permeabilität für aromatische Aminosäuren, die Vorläufer für bestimmte monoamine Neurotransmitter darstellen.
Elektrophysiologische Veränderungen sind Folge einer Hemmung des IPSP (inhibitory postsynaptic potential).
Die normale Aufnahme, Speicherung und Freisetzung verschiedener Neurotransmitter, so zum Beispiel die Speicherung von Monoaminen, ist gestört.
Die hohe Affinität von Astrozyten und Neuronen für die Aufnahme von Glutamat ist gehemmt. Die verminderte Ausprägung des Glutamat-Transporters GLT-1 führt zu erhöhter extrazellulärer Glutamatkonzentration.[18]
Die Entgiftung von Ammonium erfolgt über eine erhöhte Bildung von Glutamin in den Astrozyten, die durch osmotische Wirkung für die Hirndrucksteigerung verantwortlich sein könnte.[19] Einige Autoren gehen so weit, zu sagen, daß sämtliche toxischen Wirkungen von Ammonium auf das Gehirn durch die Bildung von Glutamin zustandekommen.[20] Die charakteristische Schwellung der Astrozyten wird als Alzheimer Typ II Astrozytose bezeichnet.[21]
Ammonium hat einen direkten Effekt auf GABA-A-Rezeptoren.
Mercaptane entstehen beim bakteriellen Abbau der Aminosäure Methionin. Die neurotoxischen Mercaptane Methanthiol, Dimethylsulfid und Äthylmercaptan sind bei Patienten mit hepatischer Enzephalopathie in ihrer Konzentration in Blut, Liquor und Urin erhöht. Ihre Neurotoxizität wird mit einer Hemmung der Na+/K+ ATPase erklärt.[13]
Kurz- und mittelkettige Fettsäuren entstehen durch Mikroorganismen aus Nahrungsfetten im Darm. Als Mechanismus für die Neurotoxizität werden ebenfalls die Hemmung der Na+/K+ ATPase sowie die Hemmung der hepatischen Harnstoffsynthese und ein vermehrter Tryptophanübertritt in das Gehirn angenommen.[13]
Phenole entstehen ebenfalls unter Einwirkung von Mikroorganismen im Darm aus aromatischen Aminosäuren. Der Mechanismus ihrer Neurotoxizität ist ungeklärt.[13]
Im Tierexperiment wirken die oben genannten Neurotoxine synergistisch. Zum Beispiel ist die zur Auslösung eines Komas benötigte Ammoniumgabe bei gleichzeitiger subkomatöser Gabe von Methanthiol vermindert.[22]
Im folgenden werden kurz die grundlegenden biochemischen Stoffwechselwege der gemessenen Parameter beschrieben. Genaue Kenntnisse sind für eine Beurteilung der Stoffwechselaktivität der Bioreaktoren erforderlich.
Beim erwachsenen Menschen mit einem Körpergewicht von 70kg entfallen etwa 12kg auf Protein. Der Proteinumsatz beträgt 250-300 g/d, die Aufnahme 100 g/d. Die Leber synthetisiert aus Aminosäuren täglich etwa 50g Protein, davon entfallen 14g auf Albumin.[13] Albumin ist ein Sammelbegriff für gut wasserlösliche, globuläre Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 66.000 Da. Es dient der Regulierung des intravasalen, onkotischen Drucks und wird ausschließlich durch die Leber synthetisiert, so daß es als leberspezifischer Parameter für die Bewertung der Stoffwechselleistung von Hepatozytenkulturen herangezogen wird. Auch andere Plasmaproteine wie Fibrinogen, Gerinnungsfaktoren und Apoproteine werden ausschließlich in der Leber synthetisiert. Auch im Aminosäurenstoffwechsel hat die Leber in Wechselwirkung mit anderen Organen eine zentrale Rolle. Das der Leber über das Pfortaderblut zugeführte Aminosäurenspektrum erfährt in der Leber Veränderungen, da die Aminosäuren unter Harnstoffbildung abgebaut und für die Proteinbiosythese oder Glucosebildung verwendet werden oder auch unverändert die Leber passieren.
Da in der Leber überwiegend die aromatischen AS (Phenylalanin, Tyrosin), in der Muskulatur überwiegend die verzweigtkettigen AS (Valin, Leucin, Isoleucin) abgebaut werden, enthält das Blut der Vena hepatica relativ höhere Spiegel an verzweigtkettigen AS als das Pfortaderblut. Die verzweigtkettigen AS dienen in der Muskulatur und im Gehirn der Energiegewinnung. Dagegen können die aromatischen AS, die mit den verzweigtkettigen AS um das Transportsystem der Blut-Hirn-Schranke konkurrieren, im Gehirn in Neurotransmitter umgewandelt werden. Die Ammoniumentgiftung in Gehirn und Muskulatur erfolgt durch Bildung von Glutamin aus Glutamat. Glutamin wird mit dem Blut zur Niere und zur Leber transportiert. In der Leber erfolgt die Entgiftung von Ammonium aus Glutamin über den Harnstoff. Die Leber ist das einzige Organ, das in quantitativ wichtiger Menge Harnstoff erzeugen kann.
Hauptbildungsort des freien Ammoniums Unter Ammonium versteht man die Summe von ionisiertem NH4+ und nicht ionisiertem NH3 (Ammoniak). Es besteht ein Dissoziationsgleichgewicht: NH3 + H+º NH4+. Bei einem Blut-pH im Normbereich von 7,4 liegt Ammonium zu 99% als NH4+ vor.
Im einzelnen wird die Eliminierung von Ammonium in der Leber durch den Krebs-Henseleit-Zyklus beschrieben. Durch die Verwertung der Aminosäuren und Proteine entstehen durch die Wirkung von Transaminasen, wie schon beschrieben, große Mengen an GLU aus a-Ketoglutarat, welches Ammonium für den Zyklus anliefert.[23] Ist der Energiebedarf hoch, kann GLU in den Mitochondrien auch wieder zu a-Ketoglutarat desaminiert werden, wobei wiederum vermehrt Ammonium anfällt, aber a-Ketoglutarat für den Citratzyklus bereitgestellt wird. Ammonium kann auch durch die direkte Desaminierung anderer Aminosäuren (Cystein, Serin, Histidin) entstehen. Die meisten AS werden aber zunächst durch Transaminierung in a-Ketosäuren überführt. Die a-Aminogruppen werden zum a-Ketoglutarat geschleust, wodurch Glutamat entsteht, das dann oxidativ durch GLDH zu Ammonium und a-Ketoglutarat desaminiert wird. Die Ammonium-Elimination in der Leber ist über zwei Enzymsysteme möglich:
Das erste Enzymsystem zeigt den Glutaminzyklus. Glutamin wird durch Ammoniumübertragung aus Glutamat mittels Glutamin-Synthetase gebildet. Die Abspaltung von Ammoniumionen aus Glutamin erfolgt durch die Glutaminase.
Das zweite Enzymsystem zeigt den Harnstoffzyklus. Im ersten Schritt geschieht die Bildung von Carbamoylphosphat aus Ammonium und Bicarbonat durch die Carbamoylphosphat-Synthetase. Carbamoylphosphat wird auf Ornithin mittels Ornithin-Transcarbamoylase übertragen, wodurch Citrullin entsteht. Citrullin kondensiert dann in einer folgenden Reaktion mit Aspartat durch die
Nach dem Konzept der metabolischen Zonierung sind der Harnstoffzyklus und die Glutaminasereaktion des Glutaminzyklus in der periportalen Zone lokalisiert, während die Glutamin-Synthetasereaktion des Glutaminzyklus in der perivenösen Zone angeordnet ist.[24]
Da das geschwindigkeitsbestimmende Enzym des periportal lokalisierten Harnstoffzyklus, die Carbamoylphosphat-Synthetase, eine geringere Affinität zu Ammoniumionen hat (Km= 1–2mmol/l) als die perivenös lokalisierte Glutamin–Synthetase des Glutaminzyklus (Km= 0,3mmol/l), wird nur bei hohen Konzentrationen Ammonium im Harnstoffzyklus entgiftet. Die Ammoniumionen, die beim Blutstrom des Periportalblutes von periportal nach perivenös nicht über den Harnstoffzyklus entgiftet werden, werden infolge der höheren Affinität der Glutamin-Synthetase zu Ammonium noch in der perivenösen Zone des Leberazinus entgiftet. Auf diese Weise wird das Ammonium sowohl über die Bildung von Harnstoff als auch über die Glutaminsynthese entgiftet. Die Ausprägung der Enzyme des Harnstoffzyklus werden durch das Proteinangebot gesteuert. Sie steigt bei proteinreicher Ernährung, bei Hunger wegen der katabolen Stoffwechsellage und bei Glucocorticoidgabe. Aktivierenden Einfluß auf die Harnstoffsynthese aus Glutamin nimmt das Hormon Glucagon.[25]
Eine weitere wichtige Funktion des Harnstoffzyklus ist die Ausscheidung von Bikorbonat, das zusammen mit dem Ammonium beim Aminosäurekatabolismus anfällt. Damit kommt der Leber ebenfalls eine Bedeutung in der Regulation des Säure-Basen-Haushaltes zu. Bei dem Absinken des physiologischen pH-Wertes von 7,4 auf unter 7,3 spricht man von Acidose. In acidotischer Stoffwechsellage wird die Ammoniumentgiftung von Harnstoffsynthese zu Glutaminsynthese verlagert, so daß Bicarbonat als Base dem System weiterhin zur Verfügung steht. Die Harnstoffproduktion sinkt gleichzeitig.[26] Neuere Experimente an Ratten deuten darauf hin, daß die Rolle der Leber bei lange anhaltender Acidose untergeordnet ist, weil sich die Harnstoffproduktion nach vier Tagen wieder einem Normalwert angleicht.[27]
Nach der Desaminierung von Aminosäuren können die verbleibenden Kohlenstoffgerüste zur Energiegewinnung in den Citratcyclus oder in die Gluconeogenese eingehen.
Die Quellen zu den biochemischen Grundlagen sind dem Buch The liver: biology and pathobiology[13] zu entnehmen.
Die Leber hat zentrale Funktion bei der Aufrechterhaltung eines konstanten Glucosespiegels. Bei Nahrungsaufnahme gelangt die Glucose über das Pfortaderblut zur Leber. Die Glucose kann dort gespeichert und bei Nahrungskarenz zur Energieversorgung an die peripheren Gewebe abgegeben werden, indem 4,5 g/h aus Glycogenolyse und 3 g/h durch Gluconeogenese aus Aminosäuren, Lactat, Glycerin sowie aus Transformation anderer Kohlenhydrate bereitgestellt werden. Dabei sind die Zellen einiger Gewebe, Erythrozyten, Retina und Nierenmark obligat auf Glucose als Energiesubstrat angewiesen.[28] Die Hormone Insulin und seine Gegenspieler Glucagon und Noradrenalin sowie Glucocorticoide regulieren die Enzyme, die an der Glycolyse, Glycogensynthese sowie Gluconeogenese beteiligt sind.[29] Bei Glucoseaufnahme durch die Nahrung werden ca. 37% der Glucose vornehmlich im Gehirn oxidiert. 63% der Glucose werden hauptsächlich in der Leber in Form von Glycogen gespeichert. Dabei geschieht die Glucoseaufnahme in die Leber hauptsächlich über den Glut-2-Glucosetransporter,[30] der im Gegensatz zum Glut-4-Glucosetransporter, der in Muskulatur und Fettgewebe ausgeprägt ist, nicht auf intrazelluläre Membranen translociert werden kann. Der transmembranäre Glucosetransport ist daher unabhängig von hormoneller Regulation und nicht limitierend für Glucoseaufnahme oder -freisetzung. Als weitere Faktoren für Glucoseaufnahme in die Leber gelten Glucose per se[31] und die Innervation.[32] In einer Hepatozytenkultur von Ratten fanden Ohno et al. 1994,[33] daß die Sauerstoffversorgung entscheidender Faktor für die Regulation der Glycolyse war. Durch ein Absenken der Sauerstoffversorgung wurden Glycolyse und Laktatbildung angeregt. Den Hormonen Insulin und Glucagon kam hier eine untergeordnete Rolle zu.
Die Laktatbildung im Körper erfolgt unter anaeroben Bedingungen bei kataboler Stoffwechsellage, wenn die Pyruvatproduktion durch die Glycolyse die Rate der Pyruvatoxidation durch den Citratzyklus übersteigt.
Die Laktatbildung wird im Organismus für die anaerobe Regenerierung von NAD+ verwendet. Damit dient die Glycolyse in den Skelettmuskeln und den Erythrozyten der Bereitstellung von Energie. Die Laktatbildung verlagert einen Teil der Stoffwechsellast von der Muskulatur auf die Leber. Die Leber verwertet das Laktat dann zur Gluconeogenese.[13]
In der Hypoxie wird die Leber zur Deckung ihres eigenen Energiebedarfes von einem Laktatverwerter zu einem Laktatproduzenten. Die Hypoxie bewirkt eine unzureichende Regenerierung von NADH, wodurch ein intrazellulärer Anstieg der H+-Ionen-Konzentration
Zur metabolischen Behandlung der hepatischen Enzephalopathie werden folgende intensivmedizinische Maßnahmen durchgeführt:
Durch selektive Darmdekontamination (z.B. mit Nystatin) werden Darmbakterien abgetötet, die für einen Großteil der Ammoniumbildung verantwortlich sind.
Adaptierte Aminosäureinfusionen sind frei von aromatischen Aminosäuren und hoch im Gehalt an verzweigtkettigen Aminosäuren.
Zur Prophylaxe der Hirndrucksteigerung gibt es folgende Möglichkeiten:
Mannitol-Infusionen, Hochlagerung des Oberkörpers um 30°, milde Hyperventilation, Hypothermie.
Der Hypoglykämie wird durch Glucoseinfusion entgegengewirkt.
Die Patienten unterliegen gleichzeitig der Gefahr einer Blutung durch den Mangel an Gerinnungsfaktoren und einer disseminierten intravasalen Gerinnung DIC durch den Mangel an gerinnungshemmenden Faktoren. Maßnahme ist die Gabe von: FFP, PPSB, EK, TK, Heparin, AT III, Aprotinin.
Zur Prophylaxe des Nierenversagens werden folgende Substanzen gegeben: Furosemid i.v., Urodilatin i.v., Dopamin i.v.
Bei Hypalbuminämie wird Humanalbumin i.v. gegeben.
Bei der Intoxikation mit Paracetamol steht Acetylcystein i.v. als Antidot zur Verfügung, bei der Intoxikation mit Knollenblätterpilz steht Sibilin i.v. als Antidot zur Verfügung.
In den siebziger Jahren führte man die Austauschperfusion, Vollblutersatz bei gleichzeitigem Aderlaß, durch, um Entgiftungsfunktionen der Leber zu ersetzen[36, 37]. Das Verfahren konnte die Mortalität nicht senken, zudem bestand das Risiko eines Transfusionssyndroms mit Nieren- und Lungenversagen.
Seit Beginn der achtziger Jahre gab es Bestrebungen, die Patienten durch Plasmapherese zu entgiften, indem man das Patientenplasma durch FFP-Konserven ersetzte.[38, 39, 40, 41] Kontrollierte Studien zur Effektivität und Mortalität gibt es nicht. Das Risiko eines Transfusionssyndromes besteht gleichermaßen wie bei der Austauschperfusion. Regenerative Faktoren, wie z. B. HGF, werden dem Plasma entzogen.
Zahlreiche künstliche Leberunterstützungsysteme, die auf Dialyse und Hämofiltration durch Flach-Membranen oder Hohlfasermodule basieren, sowie Aktivkohlefiltration wurden klinisch erprobt. Bei der Dialyse werden niedermolekulare Plasmabestandteile entfernt.[42, 43] Die Hämofiltration entfernt zusätzlich Substanzen mittleren Molekulargewichts aus dem Plasma. Eine kontrollierte Studie an zehn Patienten zeigte ein schlechteres Ergebnis für die Behandlung mit Aktivkohlefiltration und Austauschharzen nach Plasmaseperation als für eine konventionell behandelte Kontrollgruppe.[44] Eine weitere Studie zur Aktivkohlefiltration, durchgeführt an 137 Patienten am Londoner King’s College, zeigte eine Abhängigkeit der Überlebensrate nur von der Ätiologie des Leberversagens.[45] Nachteil der künstlichen Verfahren ist es, daß die Substanzen ungerichtet aus dem Plasma entfernt werden. Dabei kommt es neben einer Entgiftung immer auch zum Verlust wichtiger körpereigener Stoffe, wie z.B. der für die Leberregeneration benötigten Wachstumsfaktoren. Man kam mehr und mehr zu der Überzeugung, daß die komplexen regulatorischen Funktionen, die Vielzahl der Stoffwechselleistungen in Auf- und Abbau von Substanzen, nicht durch rein künstliche Verfahren zu ersetzen seien und begann mit der Entwicklung von hybriden Systemen, die biologische und künstliche Komponenten kombinieren. Dennoch laufen zur Zeit große klinische Studien zu rein artifiziellen Systemen, die große logistische Vorteile gegenüber den hybriden Systemen haben und effektive Entgiftungsleistung aufweisen.
Die extrakorporale Perfusion menschlicher Organe wurde klinisch erprobt.[46, 47] Es gibt positive Einzelfallschilderungen. Perfusionszeiten von bis zu 39 Stunden wurden realisiert.[48] Aufgrund hervorragender Ergebnisse der Lebertransplantation ist die extrakorporale Perfusion menschlicher Lebern heute nicht mehr gerechtfertigt.
Extrakorporale Perfusionen tierischer Organe von Primaten[49] und von Schweinen[50, 51, 52]
Die Transplantation tierischer Organe war bisher auf Grund der hyperakuten Abstoßungsreaktion nicht erfolgreich.[59, 60, 61] Ein Risiko der Xenotransplantation bilden bekannte sowie unbekannt humanpathogene Erreger. Neben dem ungelösten Problem der immunologischen Abstoßung bleibt die Ungewißheit über die dauerhafte Funktion des Transplantates aufgrund physiologischer Differenzen zwischen den Spezies.
Von verschiedenen Arbeitsgruppen wurden künstliche und biologische Komponenten in hybriden Systemen kombiniert, um neben der Entgiftungsfunktion rein artifizieller Verfahren auch regulierende Funktionen zu ermöglichen. Dazu wurden entweder primäre Leberzellen von Mensch oder Tier (Schwein, Kaninchen) oder in-vitro kultivierte Hepatoblastomzellinien verwendet. Gentechnologisch immortalisierte Zellen[62, 63] und humane Leberstammzellen[64, 65, 66] sind in der Erprobung. Bei den gentechnologisch immortalisierten Zellen ist der Verlust spezifischer Funktionen wie Albumin- und Harnstoffsynthese ein ungelöstes Problem,[67] obwohl es Bestrebungen gibt, die Zellen gezielt mit Genen für einzelne biologische Funktionen zu transfizieren.[68]
In extrakorporalen LUS werden die Hepatozyten in einem künstlichen Gehäuse kultiviert und über den extrakorporalen Kreislauf mit Vollblut oder, bei erfolgter Plasmaseparation, mit Plasma perfundiert.
Wesentliche Bedingung für die Konstruktion hybrider Systeme war die Entwicklung semipermeabler Hohlfasermembranen,[69, 70, 71] mit denen es möglich wurde, zelluläre und immunkompetente Bestandteile des Plasmas von der Zellkultur zu trennen. Somit wurden Abstoßungsreaktionen vermieden und gleichzeitig Stoffaustausch ermöglicht. Mit künstlichen Membranen wurden stabile Perfusionsverhältnisse geschaffen, während bei der Perfusion ganzer Organe die Destruktion der Mikrozirkulation therapielimitierend war. Eine weitere
Immobilisierung der Hepatozyten[79]
Zell-Zellkontakte[80]
Dreidimensionale Reorganisation[81]
Interaktion von Hepatozyten und Extrazellulärmatrix[82, 83]
Einsatz von Wachstumsfaktoren[84, 85]
Einsatz von Hormonen[86]
Ziel der extrakorporalen Leberunterstützung ist es, die Komplikationen des ALF zu beherrschen. Im Idealfall kann die Leberfunktion so lange ersetzt werden, bis eine Regeneration des geschädigten Organs stattgefunden hat.[88] Mit zunehmender Bedeutung der Transplantation als
Überbrückung der Leberfunktion bis zum Eintreffen eines Spenderorgans
Verbesserung und Stabilisierung des präoperativen Zustands
Prognosesicherung und Ausschluß von Übertransplantationen
primäre Unterfunktion des Transplantates (primary graft poor function) oder Transplantatversagen (primary graft failure)
Darüber hinaus besteht der Bedarf für eine Leberunterstützung bei:
akutem Organversagen bei chronischer Leberinsuffizienz
Leberteilresektion mit Resektatmangelfunktion
akutem Organversagen bei angeborenen Stoffwechselstörungen im Kindesalter
Die Arbeitsgruppe benützt ein hybrides, extrakorporales Leberunterstützungssystem, das ca. 50g kryokonservierte Hepatozyten vom Schwein enthält, die auf kollagenbeschichteten Microcarriern immobilisiert wurden. Die Viabilität der Zellen wird mit 60-70% angegeben; das bedeutet, daß ein Modul maximal 30g lebende Zellen enthalten kann. Zwei Aktivkohlefilter sind in den Reaktorkreislauf geschaltet. In Tierversuchen wurde die biochemische Stoffwechselaktivität des Systems in einer kontrollierten Studie an Hunden durch stündliche Messungen nachgewiesen.[91] Seit 1993 wurden 33 Patienten mit dem System behandelt, bei denen die Stoffwechselaktivität des Bioreaktors durch Konzentrationsdifferenzen biochemischer Parameter wie Glucose, Harnstoff, Ammonium und Bilirubin im Plasma der Patienten vor und nach der 6-18 Stunden dauernden Behandlung festgestellt wurde.[92] Die Bioreaktormodule wurden nach sechs Stunden Behandlungsdauer gewechselt. Aus den Angaben der Autoren läßt sich bei den geschilderten Ergebnissen nicht zwischen metabolischer Leistung des Systems und den Effekten der weiteren Therapiemaßnahmen sowie spontanen Stoffwechseländerungen der Patienten unterscheiden. In einem Bericht der Autoren 1994 über die ersten sieben behandelten Patienten wurden folgende Effektparameter für die Aktivität des Systems genannt.[93]
Es werden keine Aussagen über Begleitbehandlungen mit senkendem Einfluß auf den Hirndruck gemacht, wie z. B. Mannitolinfusionen, Hochlagerung des Oberkörpers, Hyperventilation oder andere, die zur Standardbehandlung des akuten Leberversagens gehören. 1999 berichten Demetriou et al.[94] über acht Patienten, die nach den King’s College-Kriterien ein acetaminopheninduziertes, akutes Leberversagen hatten, das ohne Transplantation mit einer Mortalität von über 90% einhergeht. Drei Patienten wurden mit dem System bis zur Transplantation überbrückt, fünf erlebten eine spontane Erholung der eigenen Leberfunktion.
Mit dem hybriden Leberunterstützungssystem der Arbeitsgruppe Sussman, Kelly wurden 23 Patienten behandelt. Im Gegensatz zu allen anderen Systemen basiert dieses System auf der Nutzung einer humanen C3A Hepatoblastomzellinie (HepG2). Vollblut wird mit einem Fluß von 150-300 ml/min durch einen Kapillarhohlfaser-Dialysator perfundiert. Der Vorteil der humanen Hepatoblastomzellinie ist, daß die Zellen in-vitro proliferieren und gut im Dialysator kultivierbar sind. Einen Nachteil stellt die Gefahr einer möglichen Metastasierung dar. Die Autoren weisen auf eine physiologische metabolische Aktivität und kontaktinhibiertes Wachstum der Zellinie hin, veröffentlichte Daten gibt es jedoch kaum. Die Arbeitsgruppe von Nyberg verglich die Stoffwechselaktivität einer anderen HepG2-Zellinie mit der primärer Rattenhepatozyten und fanden eine deutlich höhere Aktivität bei der Nutzung der primären Zellen.[96]
In den Jahren 1983-1988 wurden 59 Patienten im Rahmen einer kontrollierten Studie mit einem Leberunterstützungssystem behandelt. 4x107 Zellen, das entspricht ca. 0,68g, wurden nach Isolierung in PVC-Kapseln gepackt und bei einem Fluß von 80-100 ml/min mit Vollblut perfundiert. Folgende Daten für die biochemische Stoffwechselaktivität des Systems liegen vor:
Ähnlich wie in den Ansätzen anderer Arbeitsgruppen werden bei dieser Methodik alle Stoffwechselveränderungen des Patienten im Zeitraum der Therapie dem Bioreaktor zugeschrieben. Es gibt keine Beschreibung der übrigen Einflußfaktoren, so daß eine differenzierte Betrachtung der Stoffwechselaktivität nicht möglich ist. Die verwendete Zellmasse steht im Widerspruch zu den angegebenen Effekten.
Biochemische Daten wurden nur aus der Effektgruppe veröffentlicht, die entsprechenden aus der Kontrollgruppe liegen nicht vor. Der Verteilungsmodus der Effekt- und Kontrollgruppe wird nicht erwähnt. Bei einem Vergleich der beiden Gruppen fällt auf, daß der Anteil der Patienten mit einer Enzephalopathie Grad III-IV in der Kontrollgruppe mit 44,7% höher ist als in der Effektgruppe mit 33,9%. Die Verteilung der Ätiologie unterscheidet sich ebenfalls.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, anhand biochemischer Parameter Auskunft über die Stoffwechselleistung porciner Hepatozyten während einer temporären, extrakoporalen Leberunterstützungstherapie zu erhalten. Nur bei vorhandener biochemischer Stoffwechselleistung der Hepatozyten kann von einem positiven Effekt der Therapie auf den Patienten ausgegangen werden. Im Rahmen einer Verlaufskontrolle ist es außerdem notwendig, die Stoffwechselleistung der Hepatozyten während der Therapie durch schnell verfügbare Parameter zu kontrollieren, um die Entscheidung zu treffen, mit der Therapie fortzufahren oder sie gegebenenfalls rechtzeitig abzubrechen. Die erhobenen Daten dienen ferner der Optimierung und Weiterentwicklung des Systems. Dazu ergaben sich folgende Fragestellungen:
Kann das hybride Leberunterstützungssystem im klinischen Einsatz eine meßbare Stoffwechselaktivität erbringen?
Hat die erbrachte Stoffwechselaktivität einen Effekt auf die Stoffwechsellage des Patienten?
Gibt es schnell zu bestimmende Parameter, die eine Aussagekraft über die Stoffwechselaktivität der Hepatozyten während der Therapie besitzen?
Zur Erörterung oben genannter Fragestellungen wurden bei sieben Patientenbehandlungen die Plasmaspiegel von Ammonium, Harnstoff, Glutamin, Glucose, Laktat bestimmt und Bilanzierungen für die eingesetzten Bioreaktoren vorgenommen.
Bei dem hybriden Leberunterstützungssystem hLUS stehen der Leberzellreaktor und die Hepatozytenkultur im Zentrum der Betrachtung. Die Hepatozytenkultur befindet sich in dem Bioreaktor. Durch den Bioreaktor ist es möglich, die Zellkultur über mehrere Wochen in einem dreidimensionalen Zellverband in Funktion zu halten. Der Bioreaktor hängt freibeweglich in einem durchsichtigen Plexiglasgehäuse, das auf zwei Dialysemonitorrohlingen steht. Ein Dialysemonitor dient der Plasmapherese während der Therapie, der andere dient der Rezirkulation von Mediumflüssigkeit in den Bioreaktor. Die Gesamtapparatur ist rollbar und kann somit problemlos zum zu behandelnden Patienten gebracht werden (siehe Abb. 2).
Der Bioreaktor besteht aus einem Netzwerk von Kapillarhohlfasermembranen, die von einem
Das dritte Kapillarbündel (hydrophobe Oxygenierungsmembranen der Firma Mitsubishi, Tokio, Japan), welches waagerecht durch die PES-Bündel verläuft, dient der Sauerstoffversorgung der im Reaktor befindlichen Hepatozytenkultur. Diese etwa 10000 Einzelkapillare bilden eine Gasaustauschfläche von ca. 2,42 m². Eine eigene Einlaufkappe an der Oberfläche des Reaktors, von der offen endende Silastikkapillare in den Reaktor führen, ermöglicht die Beimpfung des extrakapillären Kompartiments mit Hepatozyten. Nach der Beimpfung dient dieser Zugang der Druckmessung im Reaktorinnenraum.
Der hier gewählte Aufbau des Bioreaktors dient folgenden Funktionen:
Der Möglichkeit einer Reorganisation der Zellen in einem dreidimensionalen Zellverband (in etwa den physiologischen Leberverhältnissen entsprechend)
Der vollständigen Flüssigkeitszirkulation durch das Leberzellkompartiment mittels der voneinander unabhängigen Kapillarbündel, von denen eines dem Flüssigkeitsantransport und das andere dem Flüssigkeitsabtransport dient
Durch das Verweben der Kapillarbündel werden im Bioreaktor kurze Stofftransportstrecken ermöglicht.
Die benötigte und ausreichende Sauerstoffversorgung der Hepatozytenkultur wird durch die im Reaktor integrierten Gasaustauschflächen sichergestellt.
Die für die Hepatozytenkultur wichtige Aufrechterhaltung des physiologischen pH-Wertes geschieht über eine ins Zellkompartiment eingeleitete trockene Gaszufuhr aus Sauerstoff, CO2 und Druckluft, in Abhängigkeit zum aktuellen pH-Wert. Die Basismischung der oben erwähnten Gase beträgt 45% Druckluft (Hausanlage), 50% Sauerstoff (AGA 0.1) und 5% Kohlendioxid (AGA 5.0, AGA Gas GmbH Hamburg).
Für die Aufrechterhaltung einer konstanten Temperatur von 39ºC ist der Bioreaktor von einem 8 mm Acrylglasgehäuse umgeben, das mittels eines Tangentialheizgebläses (230 V/50 Hz) mit ca. 80 m³/h Luft nach dem Umwälzprinzip ventiliert wird. Ein Leistungsmodul (Fa. Kemo, Berlin) läßt eine Regulation der Heizleistung von max. 1000 W zu. Die Messung der Ist-/Soll-Temperatur erfolgt über eine im Gehäuse angebrachte Meßsonde (Typ PT 100 RS Components, Mörfelden-Walldorf), deren Werte über einen im Acrylglasgehäuse integrierten, digitalen, selbstoptimierenden Regler (CAL 9900 RS Components, Mörfelden-Walldorf) angezeigt, reguliert und korrigiert werden können.
Die Basis der Perfusionseinrichtungen zum Reaktor und zurück bilden zwei miteinander gekoppelte Dialysemonitorrohlinge (HD-Secura, Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen), die aufgabenspezifisch modifiziert sind und als Apperateträger für Pumpen, Klemmventile, Druckanzeigen, Steuerelektronik, Plasmafilter, Perfusoren und alle weiteren Systemkomponenten dienen.
Um physiologisch angepaßte Drücke und Volumenströme zu erreichen, finden Schlauchpumpen mit Zahnriemengetriebe (Typ 49 V, 437, 348 und 260 Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen) Verwendung. Unter Berücksichtigung der in den einzelnen Zirkulatinskreisläufen maximal
Der Patientenmonitor gibt somit Aufschluß über den Blut-Ansaugedruck, Prä-Plasmafilterdruck, Plasmafilterdruck und Blutrücklauf.
Der Reaktormonitor zeigt die Druckverhältnisse vor Reaktorpassage (Prä), Reaktorinnendruck (Intra) und nach Reaktorpassage (Post) an.
Zur Vermeidung von Luftembolien des Patienten beziehungsweise des Reaktorkapillarsystems sind in der Expansionskammerhalterung der zum Patienten zurückführenden Blutleitung und der Bioreaktorkreislaufpumpe Luftdetektoren (Typ SAD BV 49 LKL, Fa. B. Braun Melsungen AG, Melsungen) installiert.
Im Alarmfall bewirken Klemmenventile (Typ 49 V 229 Fa. Braun Melsungen AG, Melsungen) eine Kompression der in die Klemmführung eingelegten Schlauchsysteme. Die Blutpumpe arbeitet druckgeregelt. Grenzwerte der Druckmessung für Blut-Ansaugdruck, Prä-Plasmafilterdruck und Blutrücklaufdruck schalten die Schlauchpumpe unter folgenden Bedingungen ab: Blut-Ansaugdruck > -100 mmHg, Prä-Plasmafilterdruck > 200 mmHg, Blutrücklauf > 100 mmHg. Die Filtratpumpe des Patientenmonitors soll nur bei intaktem Plasmafilter arbeiten. Es muß ein Filtratdruck >10 mmHg anliegen, damit die Filtratpumpe ihre Arbeit aufnimmt. Mit diesen Maßnahmen werden eine Schädigung der Blutbestandteile, Kollabieren und Drucknekrose der Patientenvenen verhindert. Um ein Bersten der Leitungssysteme und Bioreaktoren zu vermeiden, ist der Grenzwert für den Prä-Reaktordruck bei 250 mmHg, für den Reaktorinnendruck mit 120 mmHg definiert. Bei Überschreiten dieser
Die einzelnen Bestandteile des Reaktorkreislaufs (Bioreaktor, Schlauchsysteme, Blasenfallen, Druckmeßleitungen, Bakterienfilter, 3-Wege-Hähne, Konnektoren, Adaptoren) werden als gassterilisierte, folienverschweißte Einmalartikel geliefert. Der Zusammenbau erfolgt unter sterilen Arbeitsbedingungen nach Herstellervorschrift in einer Laminar-Air-Flow-Werkbank (Fa. Heraeus Instruments). Das geschlossene System wird in die Perfusionseinheit integriert: Der Bioreaktor wird in Halterungen im Plexiglasgehäuse festgeschraubt, der Silastikabschnitt des Kreislaufs in die Rollerpumpe der Kreislaufzirkulation bzw. der des Mediumzulaufs in die Fingerprint-Pumpe der Mediumzufuhr eingelegt. Die wird Gaszuleitung an den Anschluß der Gasmischeinheit, und die Druckübertragungsschläuche werden an die Drucksensoren angeschlossen. Anschließend wird der Kreislauf mit 1,2 l NaCl-Lösung 0,9% befüllt und entlüftet. Es erfolgt eine Umwälzung des Volumens über die Kreislaufpumpe bis zum Austausch der Kochsalzlösung durch Kulturmedium am Tag der Zelleinfüllung. Nach Einstellung des pH-Wertes über die Gasmischung auf pH 7,38 – 7,42 ist der Bioreaktor für das Einbringen der Zellen vorbereitet.
Für die Leberzellisolierung werden Schweine aus der Versuchstierhaltung der Charité verwendet, die unter pathogenfreien Bedingungen gefüttert, gehalten und transportiert werden. Vor der Organentnahme werden die Tiere individuell auf bakterielle und virale Erreger von Zoonosen untersucht.
Die Tiere werden als Jungtiere zur Organentnahme genommen, damit die Lebern wenig Bindegewebe enthalten und die Hepatozyten sich besser isolieren lassen. Das Gewicht der für die Therapie verwendeten Spendertiere beiderlei Geschlechts betrug zwischen 12 und 19 kg, das der entnommenen Lebern zwischen 300 und 680g, was einer Ausbeute von 2,2 bis 4,0 x 109 Zellen entspricht.
Die Prämedikation erfolgt intramuskulär etwa 1 Stunde vor Operationsbeginn mit 3-5 mg/kg KG Azaperon (Stresnil-Janssen, Fa. Janssen, Neuss) und 0,05 mg/kg KG Atropin (Atropinsulfat Braun, Fa. Braun Melsungen, Melsungen). Die Narkoseeinleitung wird über eine Ohrvene mit 0,01 mg/kg KG Fentanyl (Fentanyl-Janssen, Fa. Janssen, Neuss) und 0,3 ml/kg KG Etomidat (Etomidat-Lipuro, Fa. Braun Melsungen, Melsungen) durchgeführt. Als Narkoseverfahren wurde die TIVA gewählt, die mit Repetitionsdosen von 0,07 mg/kg KG Pancuronium (Pancuronium Curamed, Fa. Curamed, Karlsruhe) und einer Dauerapplikation von 0,6 mg/kg KG/h Etomidat (Etomidat-Lipuro, Fa. Braun Melsungen, Melsungen) sowie mit 0,02 mg/kg KG/h Fentanyl aufrecht erhalten wird. Intraoperativ erfolgt die Beatmung des Tieres über einen Trachealtubus mit einem Sauerstoff-Lachgasgemisch in einem Verhältnis von 1:2.
Zur Isolierung der Hepatozyten aus der operativ entnommenen Leber wird die enzymatische
Die Leber wird nach Explantation in eine sterile Stahlschüssel des Zellisolierungswagens gegeben. Der Zellisolierungswagen besteht aus einem Perfusionsmonitor (Bestandteile: Schutzgehäuse, 3 Rollerpumpen für die Leitungen der V. portae, der A. hepatica und des Abflußes, Schüsselhalterung, Wärmetauscher auf 42° C eingestellt), einem Sterilcontainer (Inhalt: Schläuche für die Porta- und Arterienperfusion, Abfallsleitung, doppelwandiges Glasgefäß mit Metallhalterung, Schüssel- und Glasgefäßerwärmung) und einer Metallschüssel mit Sieb. Der Schlauch für die Portaperfusion wird mit dem einen Ende über den Ablaufzylinder der Schüssel gestülpt und mit dem anderen an die kanülierte V. portae angeschlossen. Analog wird der Schlauch der Arterienperfusion mit dem entsprechende Gegenstück der Schüssel verbunden und mit dem freien Ende an die ebenfalls kanülierte A. hepatica des Organs angeschlossen. Die Leitung für die Portaperfusion gibt einen Zweig ab, der in einem Abfallgefäß endet; dadurch wird erreicht, daß das Systems mit jeder Lösung perfundiert wird. Alle drei beschriebenen Schläuche werden in die entsprechenden Rollerpumpen eingelegt. Die verschiedenen Lösungen werden, der Reihe nach, in den Metallcontainer gegossen, in dem die Leber liegt, und durchfließen das Organ.
Die bei der Isolierung erzielte Zellausbeute dient als Marker für die Mikroperfusion und ist damit Ausdruck der Qualität der Perfusionsschritte (Zellausbeute = isoliertes Zellpellet / Ausgangsgewicht der Leber).
Bei der Besiedlung des Bioreaktors mit Hepatozyten wird das Gesamtvolumen der Zellsuspension bestimmt. Durch Inkubation einer Probe der Suspension in einer Neubauer Zählkammer wird lichtmikroskopisch die Zellzahl pro Mikroliter ermittelt. Zu der eigentlichen Viabilitätsbeurteilung wird eine Trypanblau-Färbung der frischen Zellen durchgeführt (100 µl Zellsuspension, 100 µl Trypanblau-Lösung 0,5 % : Firma Sigma, NaCl 0,9 %). Die Zellviabilität wird in Prozent der nicht gefärbten Zellen anteilig zu den insgesamt ausgezählten Zellen angegeben.
Die Kultur erfolgte unter Verwendung eines serumfreien, hormondefinierten Mediums. Als Ausgangsrezeptur wurde Williams E-Medium verwendet (Standard in der Hepatozytenkultur).
Arginin, Phenylalanin, Serin, Tryptophan, Tyrosin: 10x
Histidin: 5x
Glycin, Leucin, Methionin, Prolin, Threonin: 3x
Alanin, Valin: 2x
Die Hormone Dexamethason, Insulin und Glucagon wurden zugefügt.
Als Puffer enthielt das Medium 2,8 g/l NaHCO3.
Die Konzentrationen einzelner wesentlicher Inhaltstoffe betrugen:
Na+ 130 mmol/l; Cl- 110 mmol/l; Glucose 8,33 mmol/l
Eine komplette Liste der Konzentrationen aller Inhaltstoffe sind dem Katalog der Firma Biochrom AG, Berlin, Germany, Seite 83-84, Heparmed-Medium für Leberzellen, zu entnehmen.
Die Kulturen erfolgten serumfrei. Lediglich zu Beginn der Kulturen am ersten Tag wurden einmalig 100 ml Plasma des Spendertieres den Kulturen zugefügt.
Die bei der Zellisolierung gewonnene Zellsuspension wird zur Minimierung der anoxischen Schädigung hypotherm zur Einfüllung in den Bioreaktor transportiert. Die Zellsuspension wird über ein Schlauchsystem mittels 3-Wege-Hahn über das Zelleinfüllungssystem in den Bioreaktor gefüllt. Durch wiederholtes Schwenken des Bioreaktors um zwei Achsen bis nach Beginn der Adhäsionsphase der Hepatozyten (6-8 h) wird eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im Intra-Kompartiment erreicht. Nach Ende der Zelleinfüllung dient die Zugabe von 200-300 ml Plasma des Spendertieres, durch Zentrifugation aus Vollblut gewonnen und leukozytenfiltriert, der Supplementierung mit Hormonen und Substraten des tierischen Organismus. Eine Antikoagulation ist durch kontinuierliche Infusion von 100 I.E. Heparin (Liquemin N 25000, Hoffmann-LaRoche AG, Grenzach-Wyhlen) pro h über 24h gewährleistet.
Der Zellkulturbetrieb gewährleistet die Erhaltung der Vitalfunktionen der Zellkultur und die ständige Bereitschaft zur Therapie.
Die Einstellungen werden so gewählt, daß der Prä-Druck 250 mmHg nicht überschreitet und der Intradruck 0 bis 60 maximal 120 mmHg beträgt. Zur Aufrechterhaltung einer adäquaten Dauerperfusion bedarf es eines Mindestflusses von 50 ml/min, der unter Beachtung obiger Druckgrenzen bis zu einem Maximalfluß von 300 ml/min gesteigert werden kann. Umstände, die einen Betrieb des Reaktors mit einer Flußgeschwindigkeit unter 50 ml/min nötig machen, haben eine Beendigung des Zellkulturbetriebs zur Folge.
Die O2-, CO2-, und Druckluftgaseinstellung wird an der Gasmischbox des Bioreaktors getrennt vorgenommen, so daß der pH sich in den Grenzen von 7,35 und 7,45 und der pO2 sich zwischen 200 und 260 mmHg bewegt. Die Höhe der Drucklufteinstellung bestimmt die Verweildauer der Gase im Reaktor. Basal wird ein Druckluftfluß von 200 ml/min, ein Sauerstofffluß von 20 ml/min und ein Kohlendioxidfluß von 2 ml/min eingestellt.
Die Einspeisung von frischem Kulturmedium in den Kreislauf erfolgt am ersten Tag mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/h über eine Mediumpumpe. Am zweiten Tag wird sie auf 100 ml/h reduziert und ab dem vierten Tag noch einmal auf 50 ml/h. Die Mediumzufuhr gewährleistet eine kontinuierliche Auffrischung des zirkulierenden Mediums.
Die Temperatur im Bioreaktorgehäuse auf konstant 39° C eingestellt. Sie wird durch eine thermostatgesteuerte Heizvorrichtung aufrechterhalten.
Der Zellkulturbetrieb umfaßt eine regelmäßige Kontrolle und Protokollierung der Pumpraten, Druckwerte, Gaseinstellungen und Blutgasanalysen. Bei Abweichungen erfolgen nach einer sorgfältigen Analyse entsprechende Interventionen, die wiederum eine Kontrolle notwendig machen.
Um die Zelleistung oder das Ausmaß einer Zellschädigung einschätzen zu können, wird während des Stand-by-Betriebs eine biochemische Verlaufskontrolle durchgeführt. Aus den täglich abgenommenen Proben werden Parameter des Stoffwechsels bestimmt, die Rückschlüsse auf die Zellintegrität erlauben.
Zu den täglich bestimmten Parametern gehören:
Natrium, Kalium, Calcium, Chlorid, Phosphat, Glucose, Harnstoff, AST, LDH, GLDH, abgenommen mit einer Plasmamonovette mit einem Volumen von 5 ml, Ammonium, ebenfalls mit einer Plasmamonovette mit einem Volumen von 5 ml und Laktat mit einer EDTA-Monovette mit einem Volumen von 2 ml. Alle drei Tage werden zusätzlich mit einer Serummonovette 5 ml
Mit Hilfe von Leberfunktionstests (LFT) erfolgt die Beurteilung der Stoffwechselleistungen der Hepatozyten. Es werden unterschiedliche Testsubstanzen kontinuierlich zusammen mit dem Nährmedium in den Reaktorkreislauf eingebracht. Die Testsubstanzen werden vor dem Anschluss eines neuen Mediumbeutels unter sterilen Bedingungen mit folgenden Zielkonzentrationen in diesen eingespritzt:
Kontolliert wird die gleichmäßige Zugabe von den LFT-Testsubstanzen durch Abnahme von Mediumleerwerten aus den Mediumbeuteln. Weiterhin wird die Hepatozytensyntheseleistung durch Bestimmung von Schweinealbumin erfaßt.
Alle Parameter, die am Reaktormonitor erhoben werden, BGA-Ergebnisse, Perfusionsmodus sowie sämtliche Interventionen werden in Protokollen festgehalten und anschließend in eine Datenbank eingegeben.
Unmittelbar nach der Benachrichtigung über einen eventuellen Therapieeinsatz in der chirurgischen Klinik muß der im Zellkulturbetrieb laufende Bioreaktor auf seine Therapiebereitschaft überprüft werden. Die Bewertung der Zellkultur erfolgt aus den täglich erhobenen Daten des Stand-by-Betriebes. Voraussetzungen für eine Verwendung sind in folgender Tabelle zusammengefaßt:
Einschlußkriterien für die Behandlung mit dem Leberunterstützungssystem waren hyperakutes, akutes oder akutes nach chronischem (acute on chronic) Leberversagen bei gleichzeitiger Indikation für eine Lebertransplantation. Die Patienten müssen eine Enzephalopathie Grad II oder höher entwickelt haben. Das Alter der Patienten muß höher als 15 und niedriger als 60 Jahre sein. Folgende Grenzwerte wurden bei den klinischen Parametern als Voraussetzung für eine Therapie gesetzt:
Quick < 20%
SerumAmmonium > 100 µmol/l
Bilirubin > 85,5 µmol/l
Enzephalopathie > Grad II.
Ausschlußkriterien für die Therapie sind Leberversagen ohne Indikation für eine Transplantation bei aktivem Alkoholismus, akute Portalvenenthrombose, Budd-Chiari-Syndrom sowie Leberversagen im Zuge eines Multi-Organ-Versagens, nach chronischer Herz-, Lungen- oder Niereninsuffizienz. Weitere Ausschlußkriterien sind das Vorliegen einer schweren Infektion, einer intracerebralen Blutung, einer bösartigen Neubildung oder einer Schwangerschaft.
Der Aufbau des Plasmaseparationsystems und der Plasma- Mediumaustausch am Bioreaktorkreislauf erfolgen auf der Intensivstation der chirurgischen Klinik. Vor Beginn der Therapie wird das Nährmedium durch sechs Konserven Heparinplasma (Blutgruppengleich oder AB-Plasma) substituiert. Bei Bedarf werden sie bei –80°C zwischengelagert und erst unmittelbar vor der Therapie aufgetaut. Während der gesamten Therapie erfolgt bei den Patienten eine kontinuierliche Plasmaseparation aus folgenden Gründen:
Die Konvektion über die zellundurchlässigen Membranen des Bioreaktors kann nur mit Plasma, nicht mit Vollblut geschehen.
Thrombozytenaggregate im Bioreaktor müssen ausgeschlossen werden.
Die Plasmaseperation ermöglicht eine Trennung von immunkompetenten Zellen des Patienten und den Hepatozyten im Bioreaktor.
Die Drücke an sämtlichen Druckmeßpunkten wurden ständig kontrolliert, entsprechend wurde bei Druckanstieg durch Verminderung der Pumpleistungen, Plasmafilterwechsel oder Änderung des Perfusionsmodus reagiert. Die Gaseinstellungen wurden stündlich durch Blutgasanalysen des Plasmas nach Durchfließen des Bioreaktors überprüft. Die ACT wurde stündlich vor Ort bestimmt.
Um die Konzentrationen der am Bioreaktor gemessenen biochemischen Parameter zu beurteilen, wurden sie mit den Konzentrationen derselben Stoffe zum selben Zeitpunkt im Patienten verglichen. Die absoluten Konzentrationen haben wenig Aussagewert. Es ist wichtig zu wissen, ob und wie sich die Stoffzusammensetzung des Patientenplasmas nach Durchfließen des Bioreaktors verändert hat. Nach Berechnung des Stoffumsatzes, das heißt der Netto-Freisetzung bzw. Netto-Aufnahme bezogen auf ein Zeitintervall, können Rückschlüsse auf die Stoffwechselleistung des Bioreaktors gezogen werden. Neben der Konzentrationsdifferenz eines Stoffes zwischen Bioreaktor und Patient an zwei verschiedenen Zeitpunkten gehen die Filtratflußgeschwindigkeit und die Zeitdifferenz zwischen zwei Meßpunkten mit in die Formel ein. Daraus ergeben sich folgende Überlegungen:
Für
U = Stoffumsatz
F = Filtrationsrate
CB1 = Konzentration Bioreaktor zu Meßzeitpunkt 1
CB2 = Konzentration Bioreaktor zu Meßzeitpunkt 2
CP1 = Konzentration Patient zu Meßzeitpunkt 1
CP2 = Konzentration Patient zu Meßzeitpunkt 2
t1 = Meßzeitpunkt 1
t2 = Meßzeitpunkt 2
gilt:
U = [F(CB1-CP1)e-F(t2-t1)/1,3 + F(CB2-CP2)] / [1-e-F(t2-t1)/1,3]
Für ein Meßintervall von vier Stunden wird der Ausdruck, der durch die Exponentialfunktion beschrieben wird, vernachlässigbar, so daß
U=F(CB-CP)
eine gute Näherung der wahren Verhältnisse darstellt.
Bei allen Modellen gehen wir davon aus, daß sich der Patient in einem Steady State befindet und der Bioreaktor gut durchmischt ist. Bei sehr starken Schwankungen der Patientenspiegel auf der Zeitachse müssen die errechneten Ergebnisse mit Vorsicht betrachtet werden, da die Veränderung der Konzentration zeitlich verzögert im Bioreaktor stattfindet, diese Verzögerung aber nicht genau quantifiziert werden kann, weil die Durchmischungsverhältnisse nicht immer bekannt sind und von Bioreaktor zu Bioreaktor variieren. Außerdem kann die Durchmischungsqualität einzelner Bereiche im Reaktorinnenraum durch das Verstopfen von Poren im Verlauf der Therapie abnehmen.
Die Bestimmung der Glucose–Konzentration findet im Zentrallabor der Charité statt. Die angewandte Methode wird von Thomas[99], Seite 154-166 beschrieben und von der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie empfohlen.
Die Bestimmung der Glucose-Konzentration erfolgt als kinetisch-enzymatischer UV-Test. Glucose wird in Anwesenheit von Hexokinase mit ATP zu Glucose-6-Phosphat phosphoryliert. Dieses reagiert mit NADP unter Bildung von 6-Phosphogluconat und NADPH2 in Anwesenheit der Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase. Die Meßgröße ist die Geschwindigkeit der NADPH2-Zunahme bis zum Stillstand der Reaktion. Die Zunahme verhält sich proportional zur Glucose-
Die Bestimmung der Laktat–Konzentration findet im Zentrallabor der Charité statt. Die angewandte Methode wird von Thomas[99], Seite 268–272 beschrieben und von der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie empfohlen.
Die Bestimmung der Laktat-Konzentration erfolgt als kinetisch-enzymatischer Test. Laktat wird durch Laktatoxidase zu Pyruvat und Wasserstoffperoxid (H2O2) umgesetzt. Das H2O2 bildet dann in einem weiteren Schritt durch Peroxidase einen Farbstoff, dessen Absorptionsmaximum bei 540nm liegt. Die Meßgröße ist der Absorptionsanstieg bei 540 nm. Der Anstieg verhält sich proportional zur Laktat-Konzentration. Der Test wird am Kodak Ektachem 250 (Fa. Johnson & Johnson) mit Reagenzien der Firma Johnson & Johnson durchgeführt. Die Einheit der Meßwerte ist mg/dl.
Die Bestimmung der Harnstoff–Konzentration findet im Zentrallabor der Charité statt. Die angewandte Methode wird von Thomas[99], Seite 422-426 beschrieben und wird von der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie empfohlen.
Die Bestimmung der Harnstoff-Konzentration erfolgt als kinetisch-enzymatischer UV-Test. Nach enzymatischer Hydrolyse des Harnstoffs durch Urease wird der gebildete Ammonium mit 2-Oxoglutarat und NADH2 zu Glutamat, NAD und Wasser mittels Glutamat-Dehydrogenase umgesetzt. Die Meßgröße ist die Abnahme der Absorption von NADH. Die Abnahme verhält sich proportional zur Harnstoff-Konzentration und wird bei 340nm photometrisch bestimmt. Der Test wird am Technicon DAX 72 (Technicon, Fa. Bayer) mit Reagenzien der Firma Bayer durchgeführt. Die Einheit der Meßwerte ist mg/dl.
Die Bestimmung der Ammonium-Konzentration findet im Zentrallabor der Charité statt. Die angewandte Methode wird von Thomas[99], Seite 213-216 beschrieben und von der Deutschen Gesellschaft für Klinische Chemie empfohlen.
Die Bestimmung der Ammonium-Konzentration erfolgt als kinetisch-enzymatischer UV-Test. Ammonium wird mit 2-Oxoglutarat und NADH2 zu Glutamat, NAD und Wasser mittels Glutamat-Dehydrogenase umgesetzt. Die Meßgröße ist die Abnahme der Absorption von
Im Rahmen der ersten klinischen Anwendung des oben beschriebenen hybriden Leberunterstützungssystems wurden acht Patienten behandelt. Alle Patienten wurden nach der Behandlung transplantiert und konnten aus dem Krankenhaus entlassen werden. Ziel dieser klinischen Studie war es, Informationen über die Verträglichkeit und Wirksamkeit des Systems zu erlangen. Alle Patienten befanden sich im akuten Leberversagen und waren für eine Lebertransplantation gelistet. Es sollten Informationen über die biochemische Funktion der zur Therapie verwendeten Zellkulturen gesammelt werden. Tabelle 11 gibt allgemeine Informationen zu den behandelten Patienten. Tabelle 12 gibt Auskunft über die zur Anwendung gekommenen Bioreaktoren. Bei dem ersten behandelten Patienten kamen zwei unterschiedliche Bioreaktoren zum Einsatz. Beginnend mit der Behandlung des zweiten Patienten wurde ein System der Probenentnahme und Datenerhebung entwickelt, das Bilanzierungen für den Stoffwechsel der eingesetzten Bioreaktoren erlaubt. Die Datenerhebung bei Behandlung des ersten Patienten war ungenügend. Die Probenentnahme in Bioreaktoren und Patient erfolgte nicht gleichzeitig; Wechsel zwischen den eingesetzten Bioreaktoren und häufige Therapieunterbrechungen lassen eine Bilanzierung nicht sinnvoll erscheinen. Die zur Behandlung des ersten Patienten eingesetzten Bioreaktoren werden bei nachfolgenden Bilanzierungen nicht berücksichtigt. Die Behandlung des ersten Patienten diente unter anderem der Entwicklung einer geeigneten Datenerhebung. Die klinische Anwendung des Systems erfolgte mit Genehmigung der Ethikkommission, der Senatsstelle für Gesundheit und des Landesamtes für Arbeitsschutz und technische Sicherheit. Die Behandlung erfolgte mit dem Einverständnis der gesetzlichen Vertreter der Patienten.
Abb. 5 zeigt den Verlauf der Ammoniumspiegel während der Therapie und wenige Stunden nach Beendigung der Therapie (gestrichelte Linie: nach Beendigung der Therapie bzw. Therapieunterbrechung). Aus der Abbildung geht hervor, daß alle Patienten einen erhöhten, deutlich über dem Normalbereich liegenden Ammoniumspiegel aufweisen. Ein Absinken des Spiegels im Verlauf der Therapie ist lediglich bei Patient 2 zu verzeichnen, der im Anschluß an die Therapie sogar vorübergehend den Normalbereich erreichte. Relativ konstant blieb der Ammoniumspiegel während der Therapie bei den Patienten 6 und 8. Bei allen übrigen wurde ein weiterer Anstieg der Ammoniumkonzentration im Plasma im Verlauf der Therapie nicht verhindert.
Abb. 6 zeigt den Konzentrationsverlauf von Ammonium im Plasma von Patient 6 entnommen aus einer Kubitalvene (blaue Linie) und nach Durchlaufen des Bioreaktors (rote Linie) während der Therapie (gestrichelte Linie: Therapieunterbrechung). Patient 6 dient einer exemplarischen Verlaufsbetrachtung, weil hier die längste Behandlungsdauer erreicht wurde. Die Linien der Konzentrationsverläufe bewegen sich gleichsinnig, das heißt, die Konzentrationsänderungen des Patienten sind bei guter Durchmischung auch im Bioreaktor nachzuvollziehen. Nach Durchlaufen des Bioreaktors ist der Ammoniumplasmaspiegel auf niedrigerem Niveau. Diese Konzentrationsdifferenz wird durch eine kontinuierliche Stoffwechselleistung des Bioreaktors aufrechterhalten. Das Plasma wurde mit einer Ammoniumkonzentration von 94 bis maximal 236 µmol/l in den Bioreaktor geleitet und mit einer Konzentration von 43 bis 126 µmol dem Patienten zurückgeführt. Während des langen Behandlungsintervalls von Stunde 8 bis 32 wurde der Ammoniumspiegel im Bioreaktor auf physiologische Werte von ca. 50 µmol/l gesenkt. Mit Hilfe der unter 2.16 beschrieben Formel U = F(C
B -C P) wird die Nettoaufnahme (graue Balken) bezogen auf ein Zeitintervall von einer Stunde berechnet. Die Filtrationsrate bei Patient 6 betrug
Die Werte auf Abb. 7 zeigen die Nettoaufnahme (positive Werte) beziehungsweise Freisetzung (negative Werte) der Bioreaktoren von Ammonium pro Stunde und Gramm Zellen. Dazu wurde die Nettobilanz nach der in 2.16 genannten Formel, wie oben ausführlich für Patient 6 beschrieben, berechnet und auf die Zellmasse des Lebergewebes im Bioreaktor bezogen, um Werte mehrerer Bioreaktoren untereinander vergleichbar zu machen. Bei fünf Patienten war der Ammoniumspiegel nach Durchlaufen des Bioreaktors erniedrigt, das heißt, daß eine Ammoniumaufnahme durch die Bioreaktoren stattfand. Bei zwei Patienten war der Ammoniumspiegel nach Durchlaufen des Bioreaktors erhöht, es geschah also eine Nettofreisetzung durch die Bioreaktoren.
Abb. 8 zeigt, daß die Glutaminspiegel der Patienten 7 und 8 im Normalbereich liegen, die Patienten 2 und 3 einen leicht erhöhten Spiegel haben und die Patienten 1, 4, 5 und 6 einen extrem erhöhten Glutaminspiegel über den gesamten Therapieverlauf aufweisen. Glutamin ist Intermediärprodukt im Stickstoffwechsel. In den übrigen Geweben wird Glutamin zur Ammoniumentgiftung aus Glutamat und Ammonium synthetisiert und zur Leber transportiert. Dort ist es Substrat für die Harnstoffsynthese. Wenn die Harnstoffsynthese ausfällt, kann es zum Anstau von Glutamin im Plasma kommen.
Die Bioreaktoren zeigen häufiger eine Glutaminaufnahme (positive Werte). Nur Bioreaktor 3 zeigt eine kontinuierliche Glutaminfreisetzung. Der Stickstoff aus Glutamin kann für die Bioreaktoren als Substrat für die Harnstoffsynthese verwendet werden. Anschließend kann über die Glutaminsynthetase aus dem anfallenden Glutamat und freiem Ammonium wieder Glutamin hergestellt werden. Das Freisetzen von Glutamin kann durch gute Funktion der Glutaminsynthetase erklärt werden. Bei Patient 3 geht die Nettosynthese von Glutamin mit den höchsten Werten in der Ammoniumelimination einher.
Bei Patient 2 fällt ein sehr starker Anstieg der Harnstoffkonzentration während der Therapie auf, der auf einsetzendes Nierenversagen zurückzuführen ist. Ein Teil des Harnstoffs, der nicht mehr eliminiert werden konnte, stammte aus dem Bioreaktor. Es wäre aber falsch, die Stoffwechselaktivität des Bioreaktors an diesem Anstieg zu messen. Hier wird deutlich, daß in einem multifaktoriellen Zusammenhang das Gegenüberstellen einzelner Parameter vor und nach der Therapie wenig hilfreich zur Beurteilung der Funktion von LUS ist. Da die Konzentration von Patient 2 stark von der der anderen abweicht, wird die gleiche Tabelle ohne diesen Patienten gezeigt.
Patienten 1, 3, 7 und 8 verzeichnen einen Anstieg der Harnstoffkonzentration während der Therapie. Bei den übrigen Patienten blieb die Konzentration im Verlauf der Therapie konstant. Alle Patienten außer Patient 6 befinden sich unterhalb des Referenzbereichs, wie es für Patienten im akuten Leberversagen typisch ist. Patient 1 und 3 bewegen sich während der Therapie in den Referenzbereich. Wie alle Stoffe, die im menschlichen Plasma enthalten sind, wurde auch Harnstoff den Patienten durch FFP-Konserven zugeführt (siehe Abb. 16), folglich wurden die erniedrigten Spiegel durch die FFP-Konserven dem Normalbereich angenähert. Weiterhin haben die Patienten durch die Restfunktion der eigenen Leber eine endogene Synthese. Um die Harnstoffkonzentration der Patienten zu bewerten, muß man gleichzeitig die Nierenfunktion betrachten.
Der Verlauf des Creatininspiegels von Patient 2 bestätigt das mit der Therapie einsetzende Nierenversagen und erklärt ausreichend die überschießende Harnstoffkonzentration. Alle übrigen Patienten hatten eine gute Nierenfunktion.
Für den Patienten 6 erfolgt exemplarisch die Darstellung des Konzentrationsverlaufs von Patient, Bioreaktor und Nettofreisetzung in einem Diagramm.
Abb. 13 zeigt, daß die Plasma-Harnstoffkonzentration nach Durchfließen des Bioreaktors während der Therapie durchgehend höher war als im Patienten. Daraus wird eine Nettofreisetzung von Harnstoff durch den Bioreaktor abgeleitet. Bei guter Durchmischung während der Therapie gleicht sich die Konzentration im Bioreaktor immer wieder der des Patienten an. Bei einer Unterbrechung der Therapie (gestrichelte Linie) und des Stoffaustausches zwischen Bioreaktor und Patient ist zu erkennen, daß die Harnstoffkonzentration im Bioreaktor bei kontinuierlicher Produktion sofort einem höheren Niveau zustrebt. Der parallele Verlauf der Kurven ist unterbrochen. Bei erneuter Aufnahme der Therapie nähert sich die Konzentrationskurve wieder der des Patienten an, bleibt aber parallel dazu oberhalb verlaufend.
Abb. 14 zeigt, daß die Harnstoffkonzentration im Plasma der Patienten 2 bis 7 zu jedem Meßzeitpunkt nach Durchlaufen des Bioreaktors gleich hoch oder höher war, das heißt, daß in dem Bilanzierungsmodell die Harnstoffbilanz der Bioreaktoren negativ war. Ausnahme bildet Patient 8, bei dem nach Durchlaufen des Bioreaktors eine niedrigere Plasma-Harnstoff-Konzentration gemessen wurde. Mögliche Erklärungen hierfür sind eine unzureichende Durchmischung des Systems sowie die mangelnde Zahl von Meßpunkten bei dieser Anwendung. Harnstoff ist ein Indikator für die biochemische Syntheseleistung des Bioreaktors.
Porcines Albumin ist ein vom humanen Albumin unterscheidbares Protein, das im Plasma der Patienten aufgrund der Therapie nachweisbar ist. Porcines Albumin ist deswegen ein spezifischer Parameter für die Synthesefunktion des Bioreaktors. Die Bestimmung von porcinem Albumin erfolgte mittels ELISA retrospektiv aus zuvor kryokonservierten Proben in den Tagen und Wochen im Anschluß an die Therapie. Sie dient daher nicht einer Verlaufskontrolle der Behandlung, sondern einer nachträglichen Kontrolle der Syntheseleistung.
Abb. 15 zeigt die Schweinealbumin-Konzentration im Patientenplasma im Verlauf der Therapie und im Anschluß (gestrichelte Linie). Ein deutlicher Anstieg der Schweinealbumin-Konzentration im Patientenplasma zu Beginn der Therapie wurde bei den Patienten 1, 2, 5, 6, 8 verzeichnet. Nach Therapieende (bei Patient 6 ebenfalls während der Therapieunterbrechung, gestrichelte Linie) sank die Schweinealbumin-Konzentration bei den Patienten 4, 5, 6, 7 rasch ab. Der höchste Plasmaspiegel von 72 mg/dl und daher die beste Syntheseleistung wurde bei der Behandlung von Patient 6 erzielt. Bei den Patienten 3 und 7 wurden Leerwerte im Bereich von 20 mg/dl vor Therapiebeginn gemessen, die im Verlauf der Therapie nicht wesentlich überschritten wurden. Bei diesen Patienten bleibt also fraglich, ob porcines Albumin synthetisiert wurde. Die mangelnde Validität der Meßmethode wird deutlich. Für die Patienten 1 und 4 liegen keine Werte vor Therapiebeginn vor.
Abb. 16 zeigt den Glucosespiegel der Patienten im Verlauf der Therapie und einige Stunden im Anschluß an die Therapie (gestrichelte Linie). Auffällig ist, daß alle Patienten, die im akuten Leberversagen dazu neigen, hypoglykämisch zu werden, überkorrigiert wurden und sich in hyperglykämischer Stoffwechsellage befanden. Lediglich Patient 6 konnte, mit Ausnahme des Therapieintervalls von Stunde 8 bis 12, konstant an der oberen Grenze des Referenzbereichs für Glucose gehalten werden. Die meisten Patienten bewegten sich im deutlich hyperglykämischen Bereich der Nierenschwelle von Glucose (ca. 10 bis 11 mmol/l). Die Patienten 2 und 4 erlebten während der Therapie Stoffwechselentgleisungen mit hyperglykämischen Spitzen von über 15 mmol/l bei Patient 2 im Therapieintervall von Stunde 2 bis 10 und bei Patient 4 im Intervall von Stunde 16 bis zum Therapieende bei Stunde 28. Patient 4 erlitt eine Blutzuckerspitze von über 25 mmol/l zu Therapiezeitpunkt 16 Stunden. Die kontinuierliche Glucoseinfusion wurde bei diesem Meßwert für zwei Stunden unterbrochen und im Anschluß von 39 auf 28 mmol/h reduziert, im Zeitintervall von Stunde 21 bis 24 erneut unterbrochen (siehe Tabelle 12). Die Insulinzufuhr
Patienten in akutem Leberversagen haben eine erniedrigte Gluconeogenese, daher benötigen sie Glucoseinfusionen.
Die Patienten 2, 4 und 5 erhielten darüber hinaus Insulininfusionen, um den zu stark korrigierten Blutglucosespiegel wieder zu senken, obwohl Patienten in akutem Leberversagen zu einer Hyperinsulinämie neigen, da das Peptidhormon vermindert durch die Leber abgebaut wird.
Die diabetogene Komedikation von Adrenalin und Dopamin bei einzelnen Patienten hatte einen weiterhin erhöhenden Einfluß auf den Glucosespiegel. Die Patienten 5 und 6 erhielten während der Therapie Noradrenalin. Die Patienten 1-4 und 7-8 benötigten keine Katecholamine.
Alle Patienten erhielten im Rahmen der Leberunterstützungstherapie, je nach Bedarf, in unregelmäßigen Abständen FFP-Konserven (siehe Abb. 16).
Tabelle 15 zeigt die Aufnahme von FFP-Konserven insgesamt.
Eine Konserve enhält ca. 300 ml FFP. Die wiederholte Gabe von FFP-Konserven bewirkte ein Absinken des Glucosespiegels in Richtung Normoglykämie. Entsprechende Verschiebungen in Richtung Normalbereich fanden für alle Stoffe durch die Gabe von FFP-Konserven statt.
Die Betrachtung der Nettofreisetzung beziehungsweise Aufnahme von Glucose durch den Bioreaktor dient der Überprüfung der Stoffwechselaktivität des Bioreaktors. Die Glucosekonzentration ist als Parameter schnell verfügbar, reagiert schnell auf Stoffwechselveränderungen und gibt Auskunft über den Energiestoffwechsel des Bioreaktors.
Der Bioreaktor kann sowohl Gluconeogenese leisten als auch Glucose aufnehmen und als Energiesubstrat verwenden. Positive Werte bedeuten, wie bei allen Bilanzierungen, Nettoaufnahme (positive Bilanz) des Bioreaktors, negative Werte Nettofreisetzung (negative Bilanz) des Bioreaktors. Da die Glucoseplasmaspiegel starke Schwankungen während der Therapie durchmachten, können Verzerrungen in der Berechnung der Nettofreisetzung des Bioreaktors (wie in Kapitel 2.16 beschrieben) entstehen. Die Kurven der errechneten Freisetzung bzw. Aufnahme des Bioreaktors zeigen ein uneinheitliches Bild, dennoch war tendenziell eine Nettofreisetzung festzustellen, das heißt, der Glucoseplasmaspiegel war nach Durchlaufen des Bioreaktors höher, als zu gleichem Zeitpunkt am Patienten gemessen. Für mehrere Patienten zeigen die Kurven einen Wechsel von Glucoseaufnahme und -freisetzung. Bei Patient 4 wurden zwei Meßpunkte unmittelbar nach kleinen (ca. einstündigen) Therapieunterbrechungen an den
Patient 6 zeigt bei sehr konstantem Glucoseplasmaspiegel des Patienten im Verlauf der (mit 45 Stunden), längsten Therapie eine sehr konstante Glucosefreisetzung des Bioreaktors. Durch die zeitliche Konstanz der Plasmaspiegel sind Verzerrungen durch eine verzögerte Durchmischung ausgeschlossen. Die Daten deuten auf eine gute Stoffwechselleistung des Bioreaktors während der Therapie hin.
Eine Durchsicht der Ergebnisse des Laktatstoffwechsels ergab keinen Hinweis auf eine Beeinflussung des Parameters durch die Bioreaktoren. Die Werte, gemessen in Patient und Bioreaktor, bewegten sich gleichsinnig und zeigten keine wesentlichen Konzentrationsdifferenzen, so daß hier auf eine Bilanzierung verzichtet wurde. Bei einigen Patienten lagen die Werte wechselnd geringfügig höher oder tiefer als im Bioreaktor.
a = Konzentrationsdifferenz am Zeitpunkt 2 Stunden
b = zeitliche Verzögerung durch Durchmischungsverhältnisse im Bioreaktor von ca. 2 Stunden
Bei Patient 4 sind die Konzentrationsdifferenzen auf ein Artefakt zurückzuführen, hervorgerufen durch verzögerte Durchmischung bei steilen Konzentrationsänderungen; daher möchte ich an dieser Stelle einige Beobachtungen zur Durchmischung des Systems anstellen. Man beachte, daß der Anstieg der Laktatkonzentration in den ersten 5 Stunden der Behandlung im Bioreaktor ca. 800% beträgt. Die Skalierung der Ordinate ist anders gewählt als bei den anderen Patienten, so daß die Steilheit optisch nur zum Teil zur Geltung kommt. Wenn man bei diesem Konzentrationsverlauf den Bioreaktor mit einer zeitlichen Verzögerung von zwei Stunden aufträgt, sieht man, daß keine wesentlichen Konzentrationsdifferenzen bestehen.
Ein Ziel dieser Arbeit ist die Definition von Parametern zur Beurteilung der Leberfunktion von hybriden Leberunterstützungssystemen unter der Anwendung. Ein Urteil über die Stoffwechselaktivität von Bioreaktoren muß sich aus der Interpretation mehrerer biochemischer Parameter ergeben. Jeder biochemische Parameter unterliegt Störgrößen, die seine Aussagekraft limitieren. Folgende Aufzählungsliste soll einen Überblick über die behandelten Parameter geben.
Ammonium: Eine direkte ursächliche Verknüpfung mit dem Krankheitsbild der Enzephalopathie begründet eine genaue Beobachtung der Stoffwechselbeeinflußung durch den Bioreaktor. Die Meßgenauigkeit wird vom Labor als etwas niedriger angegeben als für die häufig untersuchten Standardparameter, ist dennoch ausreichend bei raschem, eisgekühltem Transport. Die Testergebnisse sind innerhalb von einer Stunde verfügbar.
Harnstoff: ebenfalls hohe Relevanz für die Ausbildung von Symptomen; hohe Meßgenauigkeit; geringer Aufwand; Verfügbarkeit innerhalb einer Stunde; Nachteil: starke Schwankungen der Patientenplasmaspiegel bei Nachlassen der Nierenfunktion.
Glutamin: Relevanz für die Ausbildung von Symptomen; Spezialuntersuchung: höherer Aufwand, geringere Meßgenauigkeit; Verfügbarkeit: nach der Therapie, keine Verlaufskontrolle möglich.
Porcines Albumin: hochspezifischer Parameter für die Funktion der Bioreaktoren, geringer Einfluß von Störgrößen; Spezialuntersuchung mit geringer Meßgenauigkeit, hohem Aufwand; Nachteil: Verfügbarkeit nach der Therapie, keine Verlaufskontrolle möglich; keine Relevanz für die Ausprägung von Symptomen; als Makromolekül vermehrtes Zurückhalten durch langsam verstopfende Plasmafilter bei abnehmender Filterqualität.
Glucose: Verfügbarkeit: sofort; Aufwand: gering; Meßgenauigkeit: hoch; Nachteil: starke Beeinflußung durch Störgrößen, Medikamente, Glucoseinfusion; stark schwankende Plasmaspiegel; keine Relevanz für die Ausprägung von Symptomen.
Laktat: Vefügbarkeit innerhalb einer Stunde; geringe Relevanz für die Ausprägung von Symptomen. Nachteil: stark schwankende Patientenplasmaspiegel, keine spezifischer Test der Leberfunktion.
Auf eine Darstellung spezifischer Leberenzyme wie ALT und AST, sowie der weniger spezifischen LDH und GLDH wurde aus folgenden Gründen verzichtet, obwohl die Bestimmung in-vitro als Marker für die Zellqualität herangezogen wird: Die indirekte Bestimmung, die den
Nachfolgend soll diese Bewertung für die einzelnen Parameter ausführlich diskutiert werden.
Positiv zu bewerten ist der detoxifizierende Effekt der Bioreaktoren auf den Ammoniumstoffwechsel bei 5 der 7 ausgewerteten Patientenbehandlungen. Wir können davon ausgehen, daß der Ammoniumspiegel dieser Patienten ohne die Behandlung mit dem Bioreaktor noch stärker angestiegen wäre (siehe Abb. 7). Bei zwei Patienten, 2 und 7, war das Gegenteil der Fall. Die Bioreaktoren bewirkten eine weitere Erhöhung des Plasmaspiegels. Wenn wir uns an Abb. 5 erinnern, hatte Patient 2 ohnehin einen der Norm nahen, im Absinken begriffenen Plasmaspiegel, jedoch können wir dieses Absinken ausdrücklich nicht dem Bioreaktor zuschreiben (vgl. Abb. 7).
Für eine Ammoniumfreisetzung, die durch die Bioreaktoren bei den Patienten 2 und 7 geschah, kommen verschiedene Erklärungen in Frage. Starker Zellzerfall mit ausgedehnten nekrotischen Gebieten im Reaktorinnern, wie sie auf licht- und elektronenmikroskopischen Aufnahmen des Gewebes nach Behandlung zu sehen sind, kann ein Freisetzen von Zelltrümmern und Proteinen bewirken. Durch den Abbau freiwerdender Aminosäuren kann zusätzlich Ammonium entstehen.
stellt die Ammoniumbilanz von 14 Bioreaktoren im Zellkulturbetrieb (vor Therapie) dar (negative Werte = Freisetzung, positive Werte = Aufnahme). Es wird deutlich, daß die Bioreaktoren in der Anfangsphase der Zellkultur, unmittelbar nach initialer Zellschädigung durch die Zellisolierung, und wieder nach einer Kulturdauer von mehr als 12 Tagen Ammonium freisetzen. In der Zwischenzeit überwiegt eine Nettoaufnahme, die das Optimum einer therapeutischen Nutzung darstellt. Die Werte in der Anfangsphase sind sehr stark gestreut. Bei den Bioreaktoren, die für die Therapie verwendet wurden, fällt auf, daß eine Ammoniumfreisetzung bei den Patienten 2 und 7 durch die mit Abstand ältesten Zellkulturen geschah (siehe Tabelle 11). Patient 2 wurde mit einer Zellkultur behandelt, die 8 Tage alt war, Patient 7 mit einer Zellkultur, die 12 Tage alt war. Daher ist meine Empfehlung, bis zu einer weiteren Verbesserung der Kulturbedingungen Zellkulturen, die nicht älter als eine Woche sind, zu verwenden, um einer weiteren Belastung der Patienten mit Ammonium vorzubeugen.
Eine biochemische Erklärung für die Ammoniumfreisetzung ist eine gesteigerte Glutaminasereaktion der Hepatozytenkultur bei hoher Glutaminbelastung. Wenn der aus der Glutaminasereaktion frei werdende Ammonium die Harnstoffsynthesekapazität der Hepatozyten
Abb. 9 zeigt weder ein einheitliches Bild der Bioreaktoren untereinander noch eine Konstanz einzelner Bioreaktoren. In allen Bioreaktoren kann der Stickstoff aus dem Glutamin zur Harnstoffsynthese verwendet werden. Nicht alle Bioreaktoren scheinen über das Enzym Glutaminsynthetase zu verfügen, das in Zellkulturen häufig einer Schädigung unterworfen ist.[101] Lediglich bei den Patienten 3 und 5 ist über eine gewisse Konstanz von mehreren Meßpunkten eine Glutaminfreisetzung zu verzeichnen. Daraus ist zu folgern, daß die Glutaminsynthetasekapazität die der für die Harnstoffsynthese benötigten Glutaminasereaktion übersteigt. Daher ist die Nettoammoniumentgiftung dieser Bioreaktoren besonders hoch. Darüber hinaus hatten alle Bioreaktoren eine negative Glutamatbilanz, so daß in den anderen Geweben zusätzlich toxisches Ammonium über die Glutaminsynthetase gebunden werden kann. Um eine komplette Bilanz des Stickstoffwechsels zu erreichen, müssen die Bilanzen aller Aminosäuren analysiert werden. Von besonderem Interesse in diesem Zusammenhang ist eine Analyse der Fisher-Ratio, die das Verhältnis der verzweigtkettigen AS Isoleucin, Leucin und Valin zu den aromatischen AS Phenylalanin und Tyrosin widerspiegelt. Physiologischerweise benutzt die Leber bevorzugt die aromatischen, potentiell neurotoxischen AS zur Energiegewinnung und stellt verzweigtkettige AS für andere Gewebe bereit. Eine Analyse aller AS-Bilanzen übersteigt den Umfang dieser Arbeit.
Nach vorliegenden Ergebnissen zu urteilen, ist Harnstoff der geeignetste Parameter für eine Verlaufskontrolle im Sinne der Fragestellung. Bei einer negativen Harnstoffbilanz des Bioreaktors ist von einer guten Stoffwechselfunktion auszugehen. Wenn die Harnstoffbilanz des Bioreaktors jedoch über mehrere Meßzeitpunkte positiv bleibt, wie es bei Patient 8 der Fall war, kann man den Verdacht auf mangelnde Stoffwechselfunktion des Bioreaktors aussprechen.
Die Abbildung zeigt die Harnstoffbilanz von 7 Bioreaktoren, die ausschließlich im Zellkulturbetrieb liefen. Es fällt eine Stufung der Netto-Harnstoffproduktion in Abhängigkeit von der Mediumzufuhr ins Auge, die am ersten Tag 200 ml/h, vom zweiten bis vierten Tag 100 ml/h und ab dem vierten Tag 50 ml/h beträgt (siehe Kapitel 2.10.1). Unter Kulturbedingungen zeigt sich die Harnstoffsynthese konstant in Abhängigkeit von der angebotenen Substratmenge, die durch die Mediumflußrate und die Konzentration an benötigten Aminosäuren im Medium bestimmt wird. Der Mittelwert der Harnstoffsynthese der zur Therapie eingesetzen Bioreaktoren beträgt 2,2 µmol/h/gBM, liegt also im Bereich der Bioreaktoren, die in der Zellkultur 100 ml/h Medium erhielten. Spitzenwerte, die deutlich darüber liegen, wurden gemessen und sind durch ein höheres Substratangebot während der Therapie erklärbar. Der hier durchgeführte Vergleich zwischen Bioreaktoren, die in der Therapie eingesetzt wurden und Bioreaktoren, die im Zellkulturbetrieb liefen, bekräftigt die in 4.7 formulierte Theorie, daß die Stoffwechselleistung
Der Stoffwechselverlauf von Patient 2 zeigt, wie problematisch Harnstoff als Indikator der Stoffwechselleistung des Bioreaktors ist. Die starke Zunahme der Konzentration im Plasma des Patienten im Verlauf der gesamten Therapie war auf ein gleichzeitig eintretendes Nierenversagen zurückzuführen. Die Mischungsverhältnisse im Rezirkulationsmodell des extrakorporalen Kreislaufs führen bei einem kontinuierlichen Konzentrationsanstieg zu einem verzögerten Anstieg im Bioreaktor, so daß die errechnete Nettofreisetzung nicht der tatsächlichen Syntheseleistung des Bioreaktors entspricht, sondern höher liegt. Daß eine starke Erhöhung der Harnstoffkonzentration stattfand, ist als positives Zeichen für den Bioreaktor zu werten. Die Restfunktion der eigenen Leber wäre dazu wahrscheinlich nicht mehr in der Lage gewesen. Wenn man in diesem Falle, wie zum Beispiel die Arbeitsgruppe von Demetriou[102] oder auch alle anderen Arbeitsgruppen, die Harnstoffkonzentration vor und nach der Therapie als Referenz für die Stoffwechselaktivität genommen hätte, käme man zu irreführenden Ergebnissen, weil der gesamte Konzentrationsanstieg während der Behandlung dem Bioreaktor zugeschrieben würde.
Der Nachweis von porcinem Albumin im Patientenplasma ist ein direkter Nachweis für die Stoffwechselaktivität der Hepatozyten im Bioreaktor. Da dieser Stoff ausschließlich von Schweineleberzellen produziert wird, kann hier auf Bilanzierungsmodelle und Berechnungen verzichtet werden, die ihrerseits Risiken der Verzerrung und Fehler enthalten. Porcines Albumin war im Plasma aller Patienten nachweisbar. Das rasche Absinken nach Therapieende spricht für eine anhaltende Stoffwechselaktivität der Hepatozyten bis zum Therapieende. Die Kurven der Schweinealbumin-Spiegel und die Kurven der berechneten Harnstoffsyntheseleistung des Bioreaktors zeigen keine Korrelation. Beide Stoffe sind Syntheseparameter für die Stoffwechselaktivität, beide basieren auf der Funktion sehr unterschiedlicher Enzymsysteme in unterschiedlichen Zellorganellen, so daß ein Nachlassen der Funktion nicht unbedingt gleichsinnig und gleichzeitig zu erwarten ist. Albumin ist gegenüber Harnstoff ein viel größeres Molekül, daher wird es eher in den Poren der Membranen oder im Plasmafilter zurückgehalten, so daß entsprechend mehr synthetisiert wurde als im Patientenplasma nachweisbar ist. Nachteil dieses Parameters ist, daß er nur nachträglich bestimmt werden kann. Die Bestimmung wird in Speziallaboratorien durchgeführt, die Genauigkeit ist nicht vergleichbar mit der standardmäßig bestimmter Parameter. Außerdem kann dieser Parameter nicht für einen Vergleich mit Systemen, die auf humanen Zellinien basieren, herangezogen werden.
Die Leber hat eine zentrale Rolle bei der Stabilisierung des Glucosespiegels, entsprechend kritisch ist der Glucosespiegel im ALV.
Die Glucoseeinstellung der Patienten während der Therapie hat sich als schwierige Aufgabe erwiesen. Einerseits neigen Patienten in akutem Leberversagen zur Hypoglykämie, weil die Leber als glucoseproduzierendes Organ ausfällt. Andererseits reagieren die Patienten auch empfindlich auf Glucosegabe, da die Leber als Speicherorgan in seiner Funktion limitiert ist. Die Glucosespiegel der Patienten waren während der Therapie extremen Schwankungen unterworfen. Besonders gefährlich waren Glucosespitzen, die bei Patienten 2 und 4 gemessen wurden, da bei nachfolgendem raschem Abfall des Glucosespiegels eine weitere Hirndrucksteigerung droht.
Der Bioreaktor kann sowohl Glucose als Energiesubstrat aufnehmen und abbauen oder speichern als auch Gluconeogenese leisten. Bei den meisten Bioreaktoren wurde eher Glucose abgegeben. Bei einigen Patienten wurde aber vorübergehend eine Glucoseaufnahme gemessen. Die größte errechnete Glucoseaufnahme der Bioreaktoren wurde bei Patient 4 zum Zeitpunkt der höchsten Glucosespiegel gemessen, so daß eine intelligente Stoffwechselbeeinflussung durch den Bioreaktor wahrscheinlich ist. Aus den Kurven der Glucosefreisetzung und -aufnahme durch die Bioreaktoren ist Stoffwechselaktivität zu erkennen. Die Stoffwechselaktivität geschieht jedoch nicht so gleichmäßig, daß sie im Sinne der Fragestellung für eine Verlaufskontrolle in Frage kommt. Bei anhaltend hohem Glucoseverbrauch durch den Bioreaktor kann der Verdacht auf eine bakterielle Kontamination geäußert werden. Dies war bei keinem Behandlungsverlauf zu beobachten. Bei vorübergehender Glucoseaufnahme durch den Bioreaktor ist nicht auf nachlassende Stoffwechselleistung der Hepatozyten zu schließen.
Mit Glucoseinfusion und Insulininfusion liegen starke Instrumente zur Einstellung des Glucosespiegels bei der Hand, so daß der Einfluß des Bioreaktoren auf den Patienten eine untergeordnete Rolle spielt. Die errechnete Nettofreisetzung von Glucose der Bioreaktoren lag je nach Zellmasse in der Größenordnung 1/40 der Glucoseinfusion. Die Glucoseinfusion mußte im Verlauf der Therapie immer wieder adaptiert und bei einigen Patienten zwischenzeitlich unterbrochen werden, so daß eine schwankende Einflußgröße bestand, die die Bilanzierung für den Bioreaktor erschwerte.
Bei 14 Bioreaktoren, die ausschließlich im Zellkulturbetrieb liefen, zeigte sich die Glucosebilanz in starker Abhängigkeit vom Alter der Zellkultur. Unmittelbar nach Zellisolierung findet eine starke Glucosefreisetzung statt, die mit einem Entleeren der Glycogenspeicher erklärt werden kann. Die Freisetzung läßt am zweiten Kulturtag stark nach und geht ab dem sechsten Tag in eine Netto-Aufnahme über. Wiederum sieht man eine Abhängigkeit des Stoffumsatzes von der Mediumzufuhr, über die das Substratangebot für den Stoffumsatz gesteuert wird. Wenn man sich das Alter der Zellkulturen, die zur Therapie benutzt wurden (Tabelle 11) und die Glucosebilanz während der Therapie (Abb. 18) ins Gedächtnis ruft, erkennt man, daß die Abhängigkeit von Alter der Zellkultur und Glucosebilanz während der Therapie aufgehoben ist. Die Therapie könnte ähnlich der Zellisolierung eine allgemeine Streßsituation für die Zellen darstellen, so daß sie mit einer katabolen Stoffwechsellage reagieren und eher Glucose freisetzen.
Der Laktatspiegel der Patienten ist während der Therapie so starken Schwankungen ausgesetzt, daß auf eine Bilanzierung für die Bioreaktoren verzichtet wurde (Verlauf der Spiegel, siehe 3.6). Die Laktatspiegel der Bioreaktoren bewegen sich gleichsinnig wie die der Patienten, so daß sich unregelmäßig eine leichte Nettofreisetzung bzw. -aufnahme abwechseln. Ein Blick auf die
Die Abbildung zeigt, daß die Bioreaktoren im Zellkulturbetrieb nicht die von Lebergewebe normalerweise erbrachte Senkung der Laktatspiegel durchführen. Sie setzten Laktat frei. Grund dafür könnte eine für entsprechenden Energiebedarf zu niedrige Sauerstoffversorgung sein, so daß Glucose anaerob zu Laktat abgebaut wird. Aber auch eine Zellschädigung kann Laktatfreisetzung hervorrufen. Die Bioreaktoren zeigen während der Therapie ungleich der Situation im reinen Zellkulturbetrieb keine durchgehende Laktatfreisetzung.
An dieser Stelle möchte ich einige Überlegungen und Berechnungen einfügen, um die Effektivität und Leistungsfähigkeit hybrider Leberunterstützungssysteme besser einschätzen zu können. Gleichzeitig können die an sie gerichteten Erwartungen präzisiert werden. Hierzu müssen die leistungslimitierenden Faktoren definiert und betrachtet werden.
Zunächst ist die verwendete Zellmasse entscheidend für die Effektivität der Systeme. Dazu dient ein Vergleich der verschiedenen, zum Einsatz gekommenen Systeme.
Man bedenke, daß die angegebenen Werte die maximal erzielbare Zellausbeute darstellen; es ist jedoch anzunehmen, daß unter Kultur- und insbesondere unter Therapiebedingungen einige Zellen absterben. Aus den Zahlen wird ersichtlich, daß die Therapie mit einem Leberunterstützungssystem von Margulis minimale Auswirkungen auf den Stoffwechsel der Patienten hat. Die von ihm angegebenen biochemischen Effekte (siehe Kapitel 1.9.3) sind nicht mit der im System verwendeten Zellmasse vereinbar. Ähnlich verhält es sich bei Demetriou, der die gleiche Methodik verwendete, nämlich Plasmakonzentrationen vor und nach der Therapie verglich, um die biochemische Stoffwechselaktivität der Zellen zu überprüfen, und dabei ähnlichen Störfaktoren ausgesetzt ist. Die Zellmasse liegt zwar 50fach höher als bei Margulis, erscheint aber dennoch zu gering, um selbst bei optimalen Bedingungen einen nennenswerten Effekt ausüben zu können. Die von unserer Arbeitsgruppe verwendeten Bioreaktoren einthielten eine mittlere Zellmasse von 284g, somit wesentlich weniger als die unter optimalen Bedingungen erreichbaren 500g. Eine Zellmasse von mindestens 300 g, die mit 20% der physiologischen Zellmasse im Bereich der kritischen Masse für die Leberregeneration[13] liegt, erscheint erstrebenswert.
Bei biochemischen Stoffwechselprozessen in der Leber findet die Umwandlung eines Substrates in ein Stoffwechselprodukt statt. Ein wichtiger limitierender Faktor für den Stoffumsatz ist die Versorgung der Bioreaktoren mit Substrat. Dazu einige Daten zur Leberphysiologie:
Masse: ca. 1500g
bei einem Hkt von 0,44 ergibt sich ein hepatischer Plasmafluß von 660 ml/min
Bei dem von uns verwendeten Therapiedesign wurde ein mittlerer Plasmafluß für den Bioreaktor von 31 ml/min erzielt. Der Plasmafluß im Bioreaktor ist durch den maximalen Blutfluß in der V. femoralis, aus der mit einem Doppellumenkatheter das Blut gewonnen wird, und durch die Technik der Plasmafiltration, mit der ca. 20% aus dem Volumen des Blutes filtriert werden kann, limitiert. Am Beispiel der Ammoniumentgiftung ergeben sich daher folgende Überlegungen: Die mittlere Ammoniumkonzentration im Plasma aller Patienten an allen Meßzeitpunkten betrug 174 µmol/l, der mittlere Plasmafluß im Bioreaktor betrug 1,9 l/h.
Substratangebot Ammonium: 174 µmol/l * 1,9 l/h = 331 µmol/h oder 7,93 mmol/d
Daraus ist zu folgern, daß selbst bei beliebig hoher Zellmasse im Bioreaktorinnenraum mit perfekter Stoffwechselaktivität maximal, bei kompletter Ammoniumelimination, 7,93 mmol/d aus dem Plasma entfernt werden können. Die normale tägliche Ammoniumbelastung des Menschen liegt jedoch bei 300-500 mmol/d.[13] Wahrscheinlich kann die tägliche Ammoniumbelastung trotz Darmsterilisation mit Elimination ureaseaktiver Bakterien und angepaßter Aminosäureinfusion nicht so weit reduziert werden, daß eine Stoffwechselkapazität von 8 mmol/d ausreichen könnte.
Ähnliche Verhältnisse treffen für andere Stoffwechselwege zu. Die Plasmafiltrationsrate genügt nicht, um die kultivierten Zellen ausreichend mit Substrat zu versorgen. Hier muß alles unternommen werden, die Flußraten zu erhöhen, um der eingesetzten Zellmasse zu Wirkung zu verhelfen.
Ein Blick auf die anderen Systeme zeigt, daß ähnliche Probleme existieren. Mit einem Filtratfluß von 30 ml/min im hLUS wird das zirkulierende Plasma nicht ausreichend ausgetauscht. Die Arbeitsgruppe von Demetriou erzielte einen Filtratfluß, der ähnlich dem unserer Arbeitsgruppe unbefriedigend war; jedoch benötigte die Gruppe dafür einen deutlich niedrigeren Blutfluß. Durch die Zentrifugation kann ein höherer Prozentsatz des Plasmas separiert werden als durch Filtration.
Ein Nachteil der Systeme anderer Arbeitsgruppen ist das Festsetzen der Behandlungszeit auf 8 Stunden pro Tag, während das System unserer Arbeitsgruppe 24 Stunden pro Tag läuft. Alle anderen Systeme können somit noch weniger den erforderlichen Tagesstoffumsatz leisten.
Ein weiteres Problem, das die Effektivität der Therapie begrenzen kann, sind die Durchmischungsverhältnisse im Reaktorinnern. Hierzu gibt es wenig Daten, ein Vergleich zwischen verschiedenen Systemen ist kaum möglich. Dennoch einige Anmerkungen zu dem von uns eingesetzten System: Durch die im Vergleich zu Kulturbedingungen sehr viel höhere Belastung des Systems mit Eiweißen, Zelltrümmern und anderen hochmolekularen Stoffen kommt es zu einem raschen Verstopfen der Poren in den PES-Membranen. Als Folge muß der generell vorzuziehende Perfusionsmodus, bei dem das Plasma von einem Kapillarbündel über den Zwischenraum, in dem sich die Zellen befinden, zum Abfluß in das andere Kapillarbündel übertritt, verlassen werden und auf Grund von Drucksteigerungen in den Diffusionsmodus umgeschaltet werden, bei dem das Plasma direkt über dasselbe Kapillarbündel aus dem System austreten kann. Der Stoffaustausch geschieht entlang der Kapillare über die Poren, ist weniger intensiv, braucht also mehr Zeit und eine höhere Konzentrationsdifferenz. Auf ähnliche Weise könnten auch einzelne Kapillare verstopfen, so daß bestimmte Gebiete verminderten
Aktuelle Studien unserer Arbeitsgruppe haben dieses Problem aufgegriffen und durch einige Konfigurationsänderungen im System hervorragende Ergebnisse bei weiteren klinischen Anwendungen erzielt: Im Plasmafilter zirkuliert das Plasma im Gegenstrom zum Blut, so daß Stoffaustausch durch Diffusion entlang der Kapillare durch Konzentrationsgradienten geschieht. Das Blut wird weiterhin mit einer Flußrate von bis zu 300 ml/min entnommen. Das Plasma kann auf Grund technischer Verbesserungen im Innern des Bioreaktors mit 600 ml/min rezirkulieren und gelangt im Gegenstromverfahren in den Plasmafilter. Dadurch, daß das Plasma nicht mehr dem Vollbut entnommen und später wieder zugeführt wird, bleibt eine Konzentrierung des Blutes aus. Daher kann die Heparinisierung der ohnehin bereits blutungsgefährdeten Patienten reduziert werden. Das gesamte System wurde einfacher. Ein zwischengeschalteter Kreislauf und zwei Pumpen, die mehrere Druckmessungen erforderten, konnten eingespart werden. In Farbtracerstudien wurde ein erheblich verbesserter Stoffaustausch gemessen und in weiteren klinischen Anwendungen praktiziert. Theoretisch ist jetzt der Blutfluß aus dem Doppellumenkatheter mit 300 ml/min das limitierende Element im System; der Blutfluß entspricht einem Fünftel des physiologischen Blutstroms durch die Leber.
Die Risiken hybrider Leberunterstützungssysteme lassen sich in folgender Übersicht in zwei verschiedene Kategorien unterteilen:
Im folgenden sollen einzelne Aspekte genauer beleuchtet werden.
Spontane Blutungen gehören zu den schwersten Komplikationen im akuten Leberversagen.[113] Verminderte Synthese von Gerinnungsfaktoren geht mit einem erhöhten Verbrauch einher. Der
Studien zeigen, daß schwere Nebenwirkungen der Plasmaseparation wie Blutdruckabfall und Hämaturie mit 1,4% bzw. 0,4% selten sind,[115] dabei kommt es auf die Biokompatibilität der verwendeten Membranen an.[116]
Die von unserer Arbeitsgruppe durchgeführten Studien ergaben keinen Hinweis auf Biokompatibilitätsprobleme. Untersuchungen zur Biokompatibilität der Plasmaseparation im Zusammenhang mit der von Demetriou durchgeführten hLUS ergaben keine schweren Nebenwirkungen. Es wurde lediglich ein signifikanter Abfall der Fibrinogenspiegel gemessen. Außerdem wurde ein Abfall von freiem Calcium festgestellt, weil das Ion mit dem von der Gruppe verwendeten Antikoagulans, Citrat, Chelate bildet.[117]
In der Routine werden die für eine Behandlung und den direkten Kontakt mit Humanplasma in Frage kommenden Schweine unter SPF-Bedingungen gehalten und transportiert. Die FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Association) empfiehlt dazu, zahlreiche Untersuchungen auf bakterielle und virale Erreger durchzuführen.[118]
Trotz Testung der Spendertiere auf alle bekannten Zoonosen können Übertragungen von unbekannten Zoonosen vom Tier auf den Menschen nicht ausgeschlossen werden. In besonderem Maße gilt dies für Primaten, die als Quelle einiger humanpathogener Viren (Marburg Virus und Ebola Virus) in Frage kommen. Aufgrund der engen genetischen Verwandtschaft zwischen SIV Simian Immunodeficiency Virus und dem HIV Human Immunodeficiency Virus wird auch hier ein Übertragungsweg über die Primaten diskutiert.[119]
Das dauerhafte Überschreiten natürlicher Barrieren zwischen Mensch und Tier bringt eine
Da Schweine unter den Tieren als potentielle Organspender favorisiert werden, gilt dem PERV Porcine Endogenous Retrovirus besondere Aufmerksamkeit. Das PERV-Genom ist in jeder Schweinezelle vorhanden. Das Virus ist infektiös für humane Immunzellen;[123] darüber, wie jedoch das Infektionsrisiko eines Transplantatempfängers oder eines Patienten, der mit einem hLUS basierend auf Schweinehepatozyten behandelt wird, einzuschätzen ist, gibt es unterschiedliche Meinungen in der Literatur. Pitkin et al.[124] untersuchten 28 Patienten, die mit einem hLUS behandelt wurden. Alle waren PERV negativ. Die Autoren fanden, daß der Einsatz semipermeabler Membranen in bioartifiziellen Systemen das Übertragungsrisiko um das 105fache senkt. Paradis et al.[125] untersuchten 160 behandelte Patienten auf PERV. Sie fanden weder eine Virämie, noch konnten sie den Befall mononukleärer Zellen nachweisen. Trotz aller Entwarnungen bleibt die Frage nach Xenozoonosen brisant, denn eine Übertragung von Erregern könnte nicht nur für den Patienten, sondern für die Spezies Mensch schwerwiegende Folgen haben.
Die eigene Arbeitsgruppe untersucht daher die Verwendung primärer humaner Hepatozyten als Alternative.
Alle hLUS, die auf tierischen Zellen basieren, verwenden Membranen, um die Zellkultur vor direktem Kontakt und Zerstörung durch immunkompetente Zellen der Patienten zu schützen. Die Porengröße der Membranen ist so gewählt, daß sie für Proteine durchlässig ist, weil der proteingebundene Stoffaustausch erwünscht ist. Damit ist die Membran auch permeabel für Antikörper und Komplementfaktoren, so daß theoretisch eine Aktivierung des Komplementsystems auf klassischem und alternativem Weg stattfinden kann, mit der Gefahr einer Lyse von tierischen Zellen. Natürliche Antikörper des Menschen sind gegen Oberflächenantigene auf PAEC Porcine Aortic Endothelial Cells gerichtet.[126] Versuche von Fujioka et al.[127] zeigten, daß Hepatozyten vom Schwein weniger anfällig für Zytotoxizität
Auch hier wäre die Verwendung humaner Leberzellen von Vorteil.
Die gezielte Züchtung und Haltung von Schweinen oder Primaten zur Organspende werfen Fragen zur ethischen Vertretbarkeit auf.[130] Es gibt verschiedene Gründe, aus denen Primaten nur ungern für Xenotransplantationen herangezogen werden. Ihre Ähnlichkeit zum Menschen löst eher Mitgefühl aus, die genetische Ähnlichkeit erhöht das Risiko für die Übertragbarkeit von Infektionskrankheiten. Die Erschöpfbarkeit einiger Arten, die langsamen Vermehrungszyklen und die Aufzucht unter SPF-Bedingungen führen zu erheblichen logistischen Problemen. Das Schwein dagegen vermehrt sich sehr rasch und ist nicht vom Aussterben bedroht, sondern wird seit langer Zeit gezüchtet und verspeist. Die oben besprochenen Infektionsrisiken müssen auch unter ethischen Gesichtspunkten betrachtet und im Sinne eines Verantwortungsbewußtseins ständig weiter untersucht werden. Schließlich gibt es möglicherweise psychologische Probleme oder religiöse Bedenken bei Patienten, die mit tierischen Organen behandelt oder transplantiert werden. Zur weiteren Vertiefung sei auf Texte von Daar et al.[131] und Derenge[132] verwiesen.
Ethische Fragestellungen ergeben sich auch bei der Suche nach neuen Zellquellen. Mehrere Arbeitsgruppen, die sich mit der Kultivierung, Proliferation und in-vitro Differenzierung von embryonalen Stammzellen beschäftigen, hoffen, in Zukunft geeignete Zellinien für Bioreaktoren herstellen zu können.[133, 134, 135] Die aktuelle Rechtsprechung, die auf diesem Gebiet einige Zeit hinter dem wissenschaftlich Möglichen hinterherzieht, ist dabei, klare Richtlinien zu definieren. Noch ist die Rechtsprechung in den einzelnen Ländern der Europäischen Union sehr unterschiedlich. In Deutschland ist der Gebrauch von menschlichen Embryonen zu wissenschaftlichen Zwecken generell verboten. Der Europarat empfiehlt ein Verbot der Herstellung menschlicher Embryonen ausschließlich für die Forschung, äußert sich aber nicht prinzipiell gegen das Verwenden ohnehin anfallenden Materials.[136] In den USA pflegt die
Ethisch wenig problematisch erscheint die Verwendung humaner Hepatozyten aus Organen, die für eine Transplantation entnommen worden sind, anschließend jedoch abgelehnt und ansonsten verworfen werden.
Andere ethische Gesichtspunkte sind zu beachten bei der Indikationsstellung für eine hLUS-Therapie. In der Arbeitsgruppe Demetriou wurde beispielsweise eine Gruppe von 10 Patienten behandelt, die mit akuter Exazerbation chronischer Lebererkrankungen wegen aktiven Alkoholismus oder anderer Gründe nicht für eine Transplantation gelistet waren.[139] Zwei Patienten erholten sich, acht starben wenig später. Die Therapie konnte hier bei terminaler Krankheit nur eine kurze Verzögerung des einsetzenden Todes leisten. Der Einsatz des hLUS war hier ethisch fragwürdig, denn beim heutigen Stand der Technik ist das Einleiten einer spontanen Regeneration durch hLUS noch nicht wahrscheinlich. Es ist nicht sicher, daß die Regeneration bei den beiden Patienten durch die hLUS eingeleitet wurde.
Trotz aller Bedenken ist es wichtig, sich diese Bereiche völlig neuer Technologien und Fragestellungen vorzuwagen.
Eine neue Dimension von Möglichkeiten bietet die Verbesserung gentechnologisch hergestellter Humanzellinien. Durch Transfektion mit dem Simian Virus (SV 40) T-Antigen ist es einigen Arbeitsgruppen gelungen, immortalisierte, nicht-tumorogene Zellinien herzustellen. Der Verlust an Stoffwechselfunktion gegenüber primären Zellen ist jedoch erheblich. So produziert beispielsweise die von Liu hergestellte Zellinie HepLiuD63 anfangs noch Albumin, verliert diese Funktion jedoch nach einigen Zellpassagen. Cytochrom-P450-Aktivität konnte nachgewiesen werden. Carbamoylphosphat-Synthetase wurde als Schlüsselenzym der Harnstoffsynthese
Die Gewinnung von Leberstammzellen gilt als vielversprechendes Gebiet der Forschung nach neuen Zellquellen. Man erhofft sich eine gezielte Zellproliferation bis zu einer gewünschten Zielgröße und gute Differenzierung. Thomson et al.[142] [143] und Gearhart et al.[144] arbeiten an der Gewinnung pluripotenter embryonaler Stammzellen, mit denen nach anschließender Proliferierung und Differenzierung verschiedene menschliche Gewebe hergestellt werden könnten. Die Durchführung von Versuchen an menschlichen Embryonen wirft nicht nur neue ethische Fragen auf (siehe Seite 74), auch scheint die Proliferierung und Ausdifferenzierung unter Kulturbedingungen in weiter Ferne. Außerdem gibt es Versuche, Stammzellen aus Lebern von Rattenembryonen zu isolieren.[145] Forscher vom Albert Einstein College of Medicine in New York haben Zellinien aus Lebern von Rattenembryonen gewonnen und zu einem gewissen Differenzierungsgrad gebracht.[146, 147, 148] Michalopoulos konnte auch im Knochenmark Hepatic Oval Cells (HOV) identifizieren, von denen angenommen wird, daß sie bipotent sind und sowohl in Hepatozyten als auch in Gallengangepithel differenzieren können.[149, 150] Eine japanische Arbeitsgruppe konnte durch Transfektion von HGF über ein Adenovirus die Proliferation von HOV in vivo stimulieren.[151]
Forscher aus der Gruppe von Demetriou gewannen Hepatozyten aus menschlichen Organen, die wegen Steatose und Alter der Spender von allen Transplantationszentren abgelehnt wurden. Nach Isolierung wurden leberspezifische Funktionen in Kultur gemessen.[152] Studien mit humanen Hepatozyten als Zellquelle für den Einsatz im Bioreaktor aus Organen, die für eine Transplantation entnommen, aber anschließend abgelehnt wurden, laufen gegenwärtig in der eigenen Arbeitsgruppe. Die Organe sind nicht von ausreichender Qualität, um eine Transplantation zu verantworten, jedoch genügend um funktionstüchtige Hepatozyten zu isolieren und temporäre Leberunterstützung zu leisten. Es wurden in ersten klinischen Anwendungen hervorragende Ergebnisse erzielt. Nachteil ist, daß man damit auch auf das Eintreffen von Spenderorganen angewiesen ist und nicht wie bei Schweinelebern beliebig viele zu jedem bestimmbaren Zeitpunkt zur Verfügung hat. Der Vorteil ist, daß die unter 4.8.3 genannten Risiken der Transmission durch Xenokontakt wegfallen und die unter 4.8.4 genannten
Für die Zukunft wäre es wünschenswert, einen internationalen, vergleichbaren Standard für die Stoffwechselaktivität hybrider Leberunterstützungssysteme zu haben. Damit könnten eine Qualitätssicherung der Kultur vor der Therapie, eine engmaschige und schnelle Überprüfung während der Therapie und eine retrospektive Analyse durch aufwendig in Speziallaboratorien zu bestimmende Parameter im Anschluß an die Therapie erfolgen. Wenn man als Basis die Freisetzung bzw. Aufnahme eines Stoffes pro Stunde heranzieht und sie auf ein Gramm Zellmasse bezieht, werden die unterschiedlichen Systeme, die international zum Einsatz kommen, untereinander vergleichbar. Anschließend kann man über die Empfehlung einer Mindestzellmasse diskutieren, die den Einsatz eines Systems rechtfertigt.
Zusätzlich gilt es, weitere Parameter, die für eine Verlaufskontrolle und Qualitätssicherung während der Therapie in Frage kommen, zu erforschen. Spezifische Leberenzyme wie ALT und AST sowie die weniger spezifischen Parameter LDH und GLDH können in-vitro als Marker für die Zellqualität herangezogen werden.[153] Während der Therapie gibt es aber den Nachteil, daß im Patientenplasma durch den Zerfall der eigenen Leber enorme Konzentrationen dieser Enzyme bereits vorhanden sind, somit ein weiterer Anstieg nur schwer zu entdecken wäre. Außerdem ist die Molekülgröße ein Nachteil für die Passage von Membranen und Filtern.
Bilirubin ist ein weiterer Parameter, den es zu analysieren gilt. Hepatozytenkulturen sind in der Lage, Bilirubin zu konjugieren. Die Konzentration des direkten Bilirubins müßte nach Durchfließen des Bioreaktors erhöht sein gegenüber der Konzentration des indirekten Bilirubins.
Ein weiteres ungelöstes Problem aller hLUS ist die Entkoppelung vom enterohepatischen Kreislauf. Die exkretorische Funktion der Leber kann nicht erfüllt werden. Gallensalze können nicht direkt in den Darm sezerniert werden. Konjugierte Stoffe können in das Plasma freigesetzt werden und eventuell über die Nieren ausgeschieden werden. Wegen der Komplexität der Einflußfaktoren bleibt eine weitere Erforschung notwendig.
Trotz der diskutierten Nachteile und Risiken der hybriden Leberunterstützung sollten auf diesem jungen Gebiet der Forschung im Sinne der Patienten und der Wissenschaft alle Anstrengungen unternommen werden, um weitere Entwicklungen voranzutreiben.
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Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Peter Neuhaus für die Überlassung des Themas und die Unterstützung der Arbeitsgruppe Experimentelle Chirurgie. Ich danke Herrn PD Dr. Jörg Gerlach für die Leitung des Projekts, das er mit bewundernswerter Energie und Kreativität ins Leben rief und bis zur klinischen Anwendung weiterentwickelte. Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Benedikt Busse, der mit Anregungen, Kritik und wissenschaftlichen Diskussionen die Arbeit betreute. Ich danke Herrn Dimitrios Kardassis für die Betreuung und das Heranführen an die praktische, wissenschaftliche Arbeit. Ich danke Herrn Dr. Mark Smith für Diskussionen und Überlegungen zu mathematisch-physikalischen Modellen. Mein Dank gilt Frau Dipl. Ing. Nicole Obermeyer und Herrn Dr. Markus Krämer für Anregungen und Unterstützung. Ich danke ganz besonders meinen Mitdoktorandinnen und Mitdoktoranden Richard Doll, Christina Fotopoulou, Gereon Gäbelein, Winfried Höhn, Raphael Hofbauer und Rainer Richard für freundschaftliche Unterstützung, Teamgeist und Motivation in Zeiten der Rückschläge. Herrn Philippe Huguenin und Beatriz Porcar, danke ich für mathematisch-physikalische Überlegungen. Ich danke Frau Dr. Katrin Zeilinger, Frau Dr. Gabriele Spatkowski, Herrn Dipl. Ing. Stephan Auth, Frau Patricia Burkhardt und Frau Ines Puschendorf für ihre Unterstützung.
Meine Eltern unterstützten mich in jeder Hinsicht emotional, inhaltlich und finanziell.
Die Dissertation wurde von mir selbst ohne (unzulässige) Hilfe Dritter verfaßt. Sie stellt auch in Teilen keine Kopie anderer Arbeiten dar. Benutzte Hilfsmittel sowie Literatur sind vollständig angegeben.