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4.  Materialien und Methoden

4.1. Materialien

4.1.1. Geräte

Analysenwaage, SBA 332; Scaltec, Heiligenstedt

Chromasorb W-AW;Serva, Heidelberg

Eppendorf K-Küvetten 4071/1; Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg

Eppendorf-PCP 6121; Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg

Eppendorf-Pipetten; Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg

Fastblot B43; Biometra, Göttingen

HPLC-System; ChromSystems Instruments & Chemicals GmbH, München

Minishaker MS1; Ika-Works-INC

Multigel-Long; Biometra, Göttingen

Omni 2000 international; Digitana, Schweiz

pH-Meßgerät Delta 320; Mettler

Power Pack P25; Biometra, Göttingen

Rapid Elektrophorese; Helena Laboratories, Cleveland, Ohio

Spectrofluorometer RF-5001 PC; Shimadzu, Japan

Thermomixer 5433; Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg

Ultraschallstab Labsonic 1510, B. Braun

UV-VIS Scanning Spectrophotometer UV-2101 PC; Shimadzu, Japan


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4.1.2.  Chemikalien

1-Butanol für die Spektroskopie; Merck, Darmstadt

2-Mercaptoaethanol; Ferrak, Berlin

2-Thiobarbitursäure; Serva Feinbiochemica, Heidelberg

Acrylamid; Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Deisenhofen

Color-Marker RPN 756; Amersham, Braunschweig

Colorsubstrat BCIP/NBT, S3771; Promega, Mannheim

Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat; Merck, Darmstadt

Ethylenglycol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N´,N´-tetraacetat (EGTA); Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Deisenhofen

Folin-Reagenz; Merck, Darmstadt

Gel-Blotting-Paper GB 004; Schleicher & Schuell, Dassel

Glycerin; Merck, Darmstadt

Glycin; Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Deisenhofen

Kaliumhydrogenphosphat; Merck, Darmstadt

Kaliumnatriumtatrat-4-hydrat; VK Labor- und Feinchemikalien

Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat; VK Labor- und Feinchemikalien

Malondialdehyd-bis-(diethylacetal); Merck-Schuchardt, Hohenbrunn

Natriumcarbonat; VK Labor- und Feinchemikalien

Natriumcyanid; Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Deisenhofen

Natriumdodecylsulfat (SDS); Merck, Darmstadt

Nitrocellulose Transfer Membran Protan BA83; Schleicher & Schuell, Dassel

N,N´-Methylen-bis-Acrylamid; Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Deisenhofen

N,N,N´,N´-Tetramethyl-ethylendiamin, Serva Feinbiochemica, Heidelberg

Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Merck, Darmstadt

Triton® X100; Merck, Darmstadt

Tween 20; Serva Feinbiochemica, Heidelberg


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4.2.  Methoden

4.2.1. 1.Tiermodell: Hypertonie-induzierte Herzhypertrophie bei transgenen Ratten (TGR)

Bohlender et al. [56] gelang es am Max Delbrück Zentrum für molekulare Medizin in Berlin ein neues Rattenmodell der Hypertonie zu entwickeln. Dabei wurde durch Kreuzung ein doppelt transgener Rattenstamm erzeugt, der heterozygot für das komplette menschliche Angiotensinogen- und Renin-Gen ist. Dazu wurden männliche, normotensive Sprague-Dawley-Ratten, die homozygot für das humane Angiotensinogen-Gen waren mit weiblichen normotensiven TGR, homozygot für das menschliche Renin-Gen, gekreuzt. Die Nachkommen entwickelten einen Hypertonus mit systolischen Mitteldrücken um 220 mm Hg und starben unbehandelt im Mittel nach 55 Tagen. Bei den vorangegangenen Modellen produzierten die transgenen Ratten nur das menschliche Angiotensinogen. Da aber die Konversion von humanen Angiotensinogen zu Angiotensin I nur durch das humane Renin, nicht aber durch das Renin der Ratte erfolgen kann [57], war es nötig den Tieren zur Auslösung und Aufrechterhaltung eines Bluthochdrucks kontinuierlich menschliches Renin per Infusion zuzuführen. Derartiger Aufwand machte dieses Modell ungeeignet für das Studium der kardialen Hypertrophie, hypertensiven Nephrosklerose und anderen Folgen. Mit der oben beschriebenen Methode gelang nun die Erzeugung eines neuen Stammes, bei dem die Ratten alle Komponenten des humanen Renin-Angiotensin-Systems zur Produktion von AngII und damit zur Entwicklung eines spontanen Hypertonus in sich tragen. Die Tiere erhielten über den gesamten Versuchszeitraum Standard-Pelletfutter und Wasser ad libidum.

Für die Untersuchungen des Sauerstoffradikalmetabolismus und der Creatinkinase wurden uns 14 Herzproben der doppelt transgenen Sprague-Dawley-Ratten (TGR) überlassen. Als Kontrollgruppe dienten 14 altersentsprechende nicht transgene Kontrolltiere, ebenfalls Sprague-Dawley-Ratten („wild type“ - WT).

4.2.2. 2.Tiermodell: Myokardinfarkt-induzierte Herzhypertrophie bei Ratten*

Der Myokardinfarkt wurde entsprechend einer Vorschrift von Johns und Olson [58] durch die Ligation der Arteria coronaria sinistra verursacht. Dazu wurden die 6 Wochen alten Wistar Rat[Seite 27↓]ten mit einem Gewicht von 250 bis 280 g durch intraperitoneale Injektion von 75 mg/kg Ketaminhydrochlorid (Ketanest®, Sanovi-Ceva) mit 7,5 mg/kg Xylazinhydrochlorid (Rompun®, Bayer) anästhesiert. Anschließend wurden sie intubiert und mit Luft ventiliert. Nach Thorakotomie und Freilegung des Herzens wurde die linke Koronararterie zwischen der Pulmonalarterie und dem linken Atrium ligiert. Die Okklusion wurde durch die regionale Zyanose des Myokards und die begleitenden Elevation des ST-Segments im EKG gesichert. Die Kontrollgruppe (Sham) wurde der identischen chirurgischen Prozedur unterzogen mit dem Unterschied, dass der Faden neben der Arterie geknüpft wurde. Die Tiere erhielten ebenfalls über den Versuchszeitraum Standard-Pelletfutter und Wasser ad libidum. Jede der beiden Gruppen MI (Myokardinfarkt) und Sham wurden dann randomisiert auf jeweils vier Untergruppen verteilt. Für vier unterschiedliche postoperative Zeitspannen (0, 3, 6, 9 Wochen) entstanden so vier mal zwei Tiergruppen. Für den Zeitpunkt 0 Wochen wurden die Herzen nach 14-16 Stunden nach Operation entnommen.

4.2.3. Proben- und Plasmagewinnung

Nach Anästhesie der Ratten durch Äther wurde der Thorax geöffnet und durch Herzpunktion das Blut gewonnen. Aus diesem wurde nachfolgend Plasma abzentrifugiert, welches bei –80° C bis zur Messung gelagert wurde. Das Herz wurde entnommen und gewogen, ebenso wie nach erfolgter Präparation die Vorhöfe, Ventrikel und Papillarmuskeln. Für die biochemische Analytik wurden anschließend jeweils rund 50 mg Gewebe aus dem rechten und linken Ventrikel (nicht infarziertes Areal), portioniert und ebenso wie ein separierter Papillarmuskel bis zur Analytik in flüssigem Stickstoff gelagert. Aufgrund der geringen Materialmenge beschränkten wir uns bei den biochemischen Untersuchungen des Papillarmuskels im ersten Tiermodell auf die GSH-Px und die Hsp-Analytik. Im zweiten Modell wurde im Papillarmuskel nur der Hsp-Status bestimmt. Ein zweiter Papillarmuskel wurde unmittelbar nach der Isolierung den Messungen zur Charakterisierung der Herzleistung zugeführt.

4.2.4. Aufarbeitung der Gewebeproben für die biochemischen Untersuchungen

Von den tiefgekühlten Gewebeproben wurden jeweils 30 mg in gefrorenem Zustand eingewogen und in 1200 μl 0,9 %iger NaCl-Lösung mit dem Messerhomogenisator unter Eiskühlung homogenisiert. Dabei wurde nach folgendem Schema verfahren: 4 mal 15s Homogenisierung mit jeweils 10 s Pause. Anschließend wurden die Proben portioniert und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C eingefroren. Die Aufarbeitung der Gewebe für die Bestimmung der Stressproteine ist in Kapitel 4.2.11. beschrieben.


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4.2.5.  Aktivitätsbestimmung der Creatinkinase

Grundlage für die Bestimmung der CK-Aktivität bildet ein gekoppelter optischer Test, mit dem alle CK-Isoenzyme erfasst werden. Die Creatinkinase katalysiert den Transfer des energiereichen Phosphatrests vom Creatinphosphat auf ADP (Gleichung 17). Anschließend wird Glukose mit ATP in Gegenwart von Hexokinase (HK) zu Glukose-6-Phosphat phosphoryliert (Gleichung 18). Dieses reagiert mit NADP+ unter Bildung von Gluconolacton-6-Phosphat und NaDPH2, katalysiert durch die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH) (Gleichung 19). Die CK-Aktivität ist proportional zu der pro Zeiteinheit gebildeten Menge NADPH2.

Es wurde der Test-Kit CK-NAC opt. der Firma Lehmann Labor und Technik, Berlin verwand, dessen Zusammensetzung in Tabelle 3 aufgeführt ist.

Tabelle 3: Zusammensetzung des CK- Test-Kits der Firma Lehmann

Inhalt

Konzentration im Test

1. Enzyme

Hexokinase

3,5 U/ml

G6P-DH

2,0 U/ml

ADP

2 mmol/l

AMP

5 mmol/l

Diadenosinpentaphosphat

10 μmol/l

NADP

2 mmol/l

Creatinphosphat

30 mmol/l

N-Acetylcystein

20 mmol/l

2. Puffer

Imidazol-Puffer

100 mmol/l, pH = 6,7

Glukose

20 mmol/l

Mg-Acetat

10 mmol/l

EDTA

2 mmol/l

Die Homogenate wurden vor der Messung für 3 s mit dem Ultraschallstab rehomogenisiert und aus Stabilitätsgründen ebenso wie die Reagenzien über die Zeit der Messungen auf Eis gelagert. Die Proben wurden im Verhältnis 1:20 mit einem Phosphatpuffer verdünnt, um im zuvor be[Seite 29↓]stimmten linearen Bereich zu messen. 500 μl der Reagenzlösung wurden in einer Küvette bei 37° C vortemperiert und anschließend 20 μl der verdünnten Probenlösung dazugegeben. Der Ansatz wurde 10s mit dem Thermomixer gerüttelt und die Küvette in die Messkammer des Eppendorf-PCP 6121 überführt. Die Extinktionsmessung erfolgte bei folgenden Parametern:

Wellenlänge:

334 nm

Schichtdicke der Küvette:

1 cm

Messtemperatur:

37 °C

Messzeit:

1 min

Die Berechnung erfolgte auf der Grundlage des Lambert-Beerschen Gesetzes: ΔΕ = ε • c • d, wobei ΔΕ die Extinktionsänderung, c die Konzentration, d die Schichtdicke der Küvette und ε den molaren Extinktionskoeffizienten bezeichnet. Die Aktivität der CK wurde zum Vergleich der Ergebnisse auf den Eiweißgehalt bezogen in U/mg Protein angegeben.

4.2.6. Elektrophoretische Bestimmung des Creatinkinase-Isoenzymmusters

Die Trennung der Isoenzyme erfolgt entsprechend ihrer elektrophoretischen Wanderungsfähigkeit im Agarosegel, bestimmt durch ihre isoelektrischen Punkte. Dabei wandert die BB-Fraktion am weitesten anodisch gefolgt von der MB-Fraktion; CK-MM bleibt nahezu an der Auftragstelle und die CK-Mi bewegt sich zur Katode hin. Nach Inkubation des Gels mit einem fluoreszierenden Farbstoff wird das gebildete und in den Banden lokalisierte NADPH2 sichtbar gemacht und auf diese Weise die CK-Muster quantitativ densitometrisch auswertbar. Zur Bestimmung des CK-Isoenzymmusters wurde die Rapid-Elektrophorese-Technik der Firma Helena Laboratories genutzt. Die Zusammensetzung des CK-Isoformen-Kit ist in Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 4:Zusammensetzung des CK-Isoformenkit der Firma Helena Laboratories

Inhalt

Konzentration im Test

Hexokinase

9000 U/l

G6P-DH

7500 U/l

ADP

12 mmol/l

AMP

15 mmol/l

NAD

6 mmol/l

Creatinphosphat

90 mmol/l

N-Acetylcystein

60 mmol/l

D-Glukose

60 mmol/l

Mg-Acetat

60 mmol/l


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Das Gerät wurde mit folgenden Parametern programmiert:

Probenauftragsvolumen:

1 µl

Spannung:

1400 Volt

Elektrophoresedauer:

10 min

Temperatur:

15° C

4.2.7. Aktivitätsbestimmung der Glutathionperoxidase (GSH-Px)

Die auf der Basis eines gekoppelten optischen Test beruhende Aktivitätsbestimmung der GSH-Px wurde erstmalig von Paglia und Valentine beschrieben [59]. Glutathionperoxidase katalysiert die Oxidation von Glutathion (Gleichung 20). In Gegenwart von Glutathionreduktase (GSSG-R) und NADPH wird das oxidierte Glutathiondisulfid (GSSG) wieder zu Glutathion reduziert, wobei gleichzeitig das NADPH zu NADP+ oxidiert wird (Gleichung 21). Gemessen wird die Abnahme der NADPH-Extinktion bei 340 nm.

Zur GSH-Px-Bestimmung wurde ein Test-Kit der Firma Randox Laboratories genutzt, der auf der Basis des obigen Reaktionsprinzip arbeitet. Tabelle 5 zeigt die Zusammensetzung des Tests. Nach dem Rehomogenisieren wurden die Proben , sowie die Reagenzien über den Zeitraum der Messungen auf Eis gelagert und entsprechend dem folgendem Pipettierschema der Analytik zugeführt.

Lösungen

Leerwert (in μl)

Probe (in μl)

unverdünnte Probe

-

10

aqua dest

50

40

Reagenz

500

500

Cumenhydroperoxid

20

20

Zur Aktivitätsbestimmung wurden folgende Parameter gewählt:

Wellenlänge:

340 nm

Schichtdicke der Küvette:

0,5 cm

Messtemperatur:

37 °C

Messzeit:

3,5 min

Die Glutathionperoxidase-Aktivität erhält man durch Abzug der nichtenzymatischen NADPH-Abnahme (Leerwert) von der Gesamtaktivität. Somit ergibt sich, dass 1 Unit genau der Menge GSH-Px entspricht, die notwendig ist um 1 μmol GSH bei pH 7,4 und 37 °C innerhalb einer Minute zu oxidieren. Die gemessenen Aktivitäten sind ebenfalls in U/mg Protein angegeben.


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Tabelle 5: Zusammensetzung des GSH-Px-Test-Kits der Firma Randox-Laboratories

Inhalt

Konzentration im Test

1. Reagenz

 

Glutathion

4,0 mmol/l

Glutathionreduktase

≥ 0,5 U/l

NADPH

0,28 mmol/l

2. Puffer

 

Phosphatpuffer

0,05 mmol/l, pH = 7,2

EDTA

4,3 mmol/l

3. Cumenhydroperoxid

0,18 U/l

4. Verdünnungslösung

 

4.2.8. Aktivitätsbestimmung der Superoxiddismutase (SOD)

Die SOD-Bestimmung beruht auf einer Vorschrift von Beauchamp und Fridovich [60]. Dabei werden mit Xanthin als Substrat durch Xanthinoxidase (XOD) Superoxidradikale produziert (Gleichung 22). In einer Folgeraktion wird durch die entstandenen Superoxidradikale ein roter Formazan-Farbstoff (I.N.T.) gebildet. Andererseits können die Superoxidradikale auch über die Dismutationsreaktion der SOD zu molekularem Sauerstoff und H2O2 metabolisiert werden (Gleichung 23). Die Enzymaktivität wird somit über die Hemmung der Formazan-Farbstoffbildung bestimmt.

Zur SOD-Aktivitätsbestimmung wurde ein dieses Reaktionsprinzip nutzender Test-Kit der Firma Randox Laboratories genutzt. Tabelle 6 zeigt die Zusammensetzung des Test-Kits.

Tabelle 6:Zusammensetzung des SOD-Test-Kits der Firma Randox-Laboratories

Inhalt

Konzentration im Test

1. Substrat-Mix

 

Xanthin

0,05 mmol/l

I.N.T.

0,025 mmol/l

2. Puffer

 

CAPS

40 mmol/l, pH = 10,2

EDTA

0,94 mmol/l

3. Xanthinoxidase

80 U/l


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Die zu messenden Gewebehomogenate wurden wie oben beschrieben rehomogenisiert und zusammen mit den Reagenzien für die gesamte Dauer der Messung auf Eis gelagert. Da diese Methode indirekt ist, d.h. auf der Bildung von O• in einer vorgeschalteten Generatorreaktion beruht, besteht nur in einem bestimmten Bereich ein lineares Verhältnis zwischen Hemmung der Indikatorreaktion und Aktivität der SOD. In vorangegangenen Studien konnte für diese Methode eine lineare Beziehung im Bereich zwischen 24 und 55% Hemmung ermittelt werden. Die Verdünnung des Probenvolumens in der Küvette mit aqua dest wurde deshalb so angepasst, dass die gemessene Hemmung in diesem Bereich lag. Das Messen der Mn-SOD erfolgte aus dem reinen Herzhomogenat, während es für die Gesamt-SOD notwendig war, im Verhältnis 1:100 zu verdünnen.

Das Pipettierschema ist der folgenden Tabelle zu entnehmen (Angaben in μl):

Lösungen

Leerwert

Gesamt-SOD

Mn-SOD

Probe

-

x (< 100)

x (< 50)

aqua dest

100

100-x

50-x

Mixsubstrat

340

340

340

XOD

50

50

50

NaCN (0,02 M)

-

-

50

Nach Mixen der Lösungen in der Küvette wurde bei folgenden Parametern gemessen:

Wellenlänge:

505 nm

Schichtdicke der Küvette:

0,5 cm

Messtemperatur:

37 °C

Messzeit:

3,5 min

Gemessen wurde die zeitabhängigen Zunahme der Farbstoffintensität in ΔE/min. Es wurden Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Hemmung der Farbstoffbildung durch die SOD wurde nach folgender Formel berechnet:

Zur Angabe der Aktivität in Units wurde eine 50%ige Hemmung der Indikatorreaktion definiert als 1 Unit/ml. In der Literatur angegebene SOD-Aktivitäten basieren neben dieser auch auf anderen Definitionen. Diese Unterschiede führen dazu, dass publizierte SOD-Werte nicht zwangsläufig miteinander verglichen werden können.


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4.2.8.1.  Differenzierung der SOD-Isoenzyme

Durch Zugabe von Zyanid wird ein Teil der SOD-Aktivität gehemmt. In ausreichender Konzentration zugeführtes Zyanid vermag nur das Kupfer-Zink-Isoenzym zu blockieren, während die Mangan enthaltende SOD unbeeinflusst bleibt. Da in den Gewebehomogenaten nur ein relativ geringer Anteil des Proteingehalts auf die SOD entfällt und auch andere Proteine durch Bindung die Konzentration freier CN-Moleküle im Test verringern, ist es von Bedeutung die notwendige Menge CN auszutitrieren, die eine selektive Hemmung der CuZn-SOD gewährleistet. In Abbildung 8 wird der Zusammenhang zwischen der SOD-Aktivität und der CN-Konzentration dargestellt. Daraus wird ersichtlich, dass im Rattenherzhomogenat erst ab einer Konzentration von ≥1,0 mmol/l im Testansatz eine ausreichende Hemmung der CuZn-SOD erreicht wird. Allerdings ist auch zu erkennen, dass es ab Konzentrationen ≥2,0 mmol/l zu einem weiteren Aktivitätsverlust kommt, der sich durch die Hemmung von im Test-Kit vorhandenen Komponenten, am ehesten der Xanthinoxidase, erklären lässt. Diese Vermutung ließ sich durch das Verhalten des Leerwertes bei Zugabe steigender CN-Konzentrationen bestätigen. Abbildung 9 zeigt die Verminderung der Formazan-Farbstoffbildung und damit auch der Sauerstoffradikalgenerierung ab 2,0 mmol/l NaCN unter diesen Bedingungen. Folglich wurde zur Bestimmung der Mn-SOD die Hemmung der Farbstoffbildung in Anwesenheit von 1,0 mmol/l NaCN im Testansatz gemessen und die Konzentration analog der Gesamt-SOD berechnet. Durch Subtraktion der Mn-SOD von der Gesamt-SOD lässt sich nachfolgend die CuZn-SOD berechnen. Die Aktivität der SOD und ihrer Isoenzyme wurde zum Vergleich der Ergebnisse ebenfalls auf den Eiweißgehalt bezogen in U/mg Protein angegeben.

Abbildung 8:NaCN-Wirkung auf die SOD-Aktivität im Rattenherzhomogenat (Gesamt-SOD = 1,34 U/l)


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Abbildung 9:NaCN-Wirkung auf den Leerwert bei der SOD-Bestimmung

4.2.9. Bestimmung der Lipidperoxid-Konzentration

Zur Bestimmung der Lipidperoxid-Konzentration in den Herzhomogenaten wurde die von Ohkawa et al. [61] entwickelte Methode genutzt. Wie in Kapitel 2.2.1.3. beschrieben, entsteht bei der Lipidperoxidation Malondialdehyd (MDA). Mit Thiobarbitursäure (TBA) bildet MDA einen roten Polymethinfarbstoff, der fluorimetrisch gemessen werden kann. Unter den Testbedingungen (niedriger pH-Wert, hohe Temperatur) reagieren auch Vorstufen der MDA-Bildung mit TBA. Die Reaktionsprodukte werden demnach als Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS) bezeichnet. Tabelle 7 zeigt die genutzten Chemikalien und ihre Konzentrationen im Test.

Tabelle 7:Testzusammensetzung für die Bestimmung der TBARS

Lösung

Konzentration

NaCl

0,154 mol/l

20%ige Essigsäure

mit NaOH auf pH 3,5 eingestellt

Natriumdodecylphosphat (SDS)

0,28 mol/l

2-Thiobarbitursäure (TBA)

0,049 mol/l

n-Butanol

-

Die Leerwerte, Eichreihen und Proben wurde anhand folgendem Pipettierschema in Reagenzgläsern gemischt:


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Lösungen

Leerwert (in μl)

Eichreihe (in µl)

Probe (in μl)

unverdünnte Probe

-

-

x

MDA-Lösung

-

5;10;15;20;30

-

aqua dest

150

150

150-x

Acetatpuffer (pH 7,4)

300

300

300

SDS

40

40

40

TBA

300

300

300

Die Testansätze wurden für 60 min bei 90 °C inkubiert und nachfolgend im Eisbad abgekühlt. Anschließend wurden 200 µl aqua dest und 1000 µl Butanol zugegeben und für 20 min geschüttelt. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 3000 U/min konnte die Messung der Fluoreszenz in der überstehenden organischen Phase bei folgenden Parametern erfolgen:

Wellenlänge:

Exzitation:

515 nm

Temperatur:

25 °C

 

Emission:

553 nm

Schichtdicke der Küvette:

1 cm

Die Berechnung der Konzentration an TBARS-Konzentrationen erfolgte nach Subtraktion des Leerwertes anhand der Eichreihe mit Standartkonzentrationen an MDA, gebildet aus 1,1,3,3-Tetraethoxypropan in nmol/mg Protein.

4.2.10. Bestimmung der Vitamin E-Konzentration im Serum

Zur Analyse des Serum-Vitamin E-Gehalts wurde ein in der Labor-Routine gebräuchliches high-performance-liquid-chromatographie-(HPLC)-System der Firma ChromSystems verwandt.

4.2.11.  Bestimmung von Hsp25 und Hsp72

Die Bestimmung der Hsp25- und 72-Konzentration im Ventrikelgewebe und im Papillarmuskel erfolgte nach einer Vorschrift von Lutsch et al. [62].

Probenaufbereitung

Zur Probenaufbereitung wurden 5-10 mg Gewebe mit 100µl Puffer (pH 6,8: 62,5 mM Tris, 2% SDS, 10% Glycerin) inkubiert und anschließend nach Zugabe von weiteren 50µl Puffer homogenisiert. Das Homogenat wurde in Eppendorfröhrchen überführt und 5 min bei 15000 U/min zentrifugiert. Der entstandene klare Überstand wird für die Bestimmung abgenommen. Zunächst erfolgte die Proteinbestimmung mittels Bio-Rad DC Protein Assay in jedem Homo[Seite 36↓]genat. Nachfolgend wird das Homogenat mit ß-Mercaptoethanol auf eine Endkonzentration von 5-6% und mit Bromphenolblau auf 0,001% eingestellt. Durch 3minütiges Kochen im Wasserbad werden die Proteine denaturiert und durch das Bromphenolblau markiert. 100µg Protein werden von jeder Probe der nachfolgenden Elektrophorese zugeführt.

Elektrophorese

Zum Auftrennen der Proteine wird ein Gradientengel aus 7,5% Acrylamid/0,2% N,N´-Methylen-bis-Acrylamid und 15% Acrylamid/0,6% N,N´-Methylen-bis-Acrylamid hergestellt. Weiterhin ist zur Verbesserung der Banden-Auflösung die Herstellung eines großporigen Sammelgels aus 3% Acrylamid/0,08% N,N´-Methylen-bis-Acrylamid nötig. Als Laufzeitende der Elektrophorese im Puffer (pH 6,8: 25mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 192mM Glycin, 0,1% SDS) wurde das Erreichen der Gelunterkante durch das Bromphenolblau festgelegt.

Western-Blotting

Durch das anschließende Semi-Dry-Elektro-Blotting bei 0.8 mA/cm2 erfolgt ein Überführung der aufgetrennten Proteine auf die Nitrocellulose mittels eines Transferpuffers (pH 8,3: 25mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 150mM Glycin, 10% Methanol). Danach wurde mit einer 5%igen Magermilchlösung in TBS-Puffer (pH 7,3) + 0,05% Tween 20 geblockt (60´), um freie Bindungsstellen auf der Nitrocellulose mit Protein zu besetzen.

Quantitativer Nachweis

Der Antigen-spezifische erste Antikörper bindet an das Hsp-Protein und wird seinerseits durch den spezifischen Enzym-gekoppelten Sekundärantikörper gebunden. Durch das Enzym Alkalische Phosphatase wird nachfolgend ein Colorsubstrat unter Farbstoffbildung umgesetzt, was die Banden anfärbt und eine quantitative densitometrische Auswertung der Produktmenge ermöglicht. Nachfolgend die benutzten Antikörper im Einzelnen:

Hsp25:

1. Antikörper:

Anti-Hsp25

Berlin Buch

  

Kaninchen-Antikörper

 

2. Antikörper:

Anti-Rabbit IgG(Fc),

Promega, Mannheim (S 3731)

  

AP Conjugate

Hsp72:

1. Antikörper:

Anti-Hsp72

Sigma-Aldrich-Chemie GmbH (H 5147)

  

Mouse IgG

 

2. Antikörper:

Anti-Mouse IgG(H+L);

Promega, Mannheim (S 3721)

  

AP Conjugate


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Aufgrund der Blotting-Technik mit unterschiedlichen Fixierungszeiten werden anstelle der absoluten Konzentrationen die Hsp-Konzentrationen in Prozent angegeben. Dafür wurden in jedem Blot die Kontrollen und Experiment-Tiere in gleicher Anzahl kombiniert. Die Konzentration der TGR wurde bezogen auf die Konzentration der WT im jeweiligen Blot angegeben, deren Mittelwert als 100% angenommen wird.

4.2.12. Proteinbestimmung

Die Analyse des Proteingehaltes erfolgte nach Lowry et al. [63].

Nach gründlicher Mischung und 10minütiger Inkubation, der im nachfolgendem Pipettierschema zusammengefassten Reagenzien, mussten ebenso wie der Eichreihe mit humanem Serumalbumin (0,39 mg/ml) noch 150µl Folin-Lösung hinzugefügt und erneut für 60 min inkubiert werden. Die Messung der Extinktion erfolgte dann am UV-VIS Scanning Spektrophotometer bei 750 nm. Der Nullabgleich erfolgte gegen den Leerwert.

Lösungen

Leerwert (in μ l)

Eichreihe (in µl)

Probe (in μ l)

unverdünnte Probe

-

-

20

Serumalbuminlösung

-

x

-

aqua dest

200

200-x

180

NaOH (1N)

20

20

20

Gebrauchslösung

1500

1500

1500

4.2.13. Funktionelle Parameter zur Charakterisierung der Herzleistung*

Um Aussagen zur funktionellen Leistung des Myokards unter Hypoxie/Reoxygenierungsstress machen zu können, wurden - wie in Kapitel 2.2.5. - beschrieben, isometrischen Kontraktionen der Papillarmuskeln im Gewebe-Bad ausgelöst. Diese Blutersatzlösung war folgendermaßen zusammengesetzt (Angaben in mmol/l): NaCl 140,0; KCl 5,0; CaCl2 0,75; MgCl2 1,1; Tris/HCl 10,0; D-Glukose 11,1; pH 7,4. Zur Simulation der Hypoxie wurde das Gewebebad mit Stickstoff und im Fall der Reoxygenierung mit Sauerstoff durchströmt.


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4.2.14.  Statistische Auswertung

Die Verwaltung und Auswertung der erhobenen Daten erfolgte unter Nutzung des Computerprogramms Excel 97. Zur statistische Auswertung wurde die Software SPSS unter Anwendung des t-Tests für abhängige und unabhängige Stichproben genutzt. Für die Mehrfachvergleiche 0,3,6,9 Wo nach MI wurde der ANOVA-Test durchgeführt ebenfalls unter Nutzung des Computerprogramm SPSS.

Alle angeführten und dargestellten Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM = Standard error of mean) angegeben.


Fußnoten und Endnoten

* Operationen: AG Dr. Stauß; Institut für Physiologie der Medizinischen Fakultät der HU-Berlin

* AG Prof. Dr. Scholz; Institut für Physiologie der Medizinischen Fakultät der HU-Berlin



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21.01.2005