Gesteigerter oxidativer Stress ist ein typisches Zeichen in der Pathogenese der Herzinsuffizienz. Anhand von 2 Rattenmodellen sollen charakteristische Veränderungen des enzymatischen antioxidativen Systems, repräsentiert durch die Glutathionperoxidase (GSH-Px) und Superoxiddismutase (SOD) sowie Änderungen im Hitzeschockproteinsystem (Hsp) untersucht werden, für das stellvertretend Hsp25 und Hsp72 bestimmt wurden. Daneben wurde die Lipidperoxidation durch die Konzentration von Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS) quantifiziert. Im ersten Rattenmodell, der Hypertonie-induzierten Herzinsuffizienz durch permanente Renin-Angiotensin-System-Aktivierung in doppelt transgenen Ratten konnte eine linksventrikuläre Hypertrophie mit CK-Isoenzym-Shift mit vermehrter Expression von CK-MB und -BB beobachtet werden. Es kam in beiden Ventrikeln der transgenen Tiere zu einer Zunahme der Lipidperoxidation begleitet von einer Erniedrigung der Serum-Vitamin E-Konzentration durch Verbrauch. SOD und Hsp72 blieben unverändert. Durch die biventrikuläre Zunahme der GSH-Px-Aktivität bei linksventrikulär erhöhtem Hsp25-Gehalt konnte die Toleranz gegenüber Hypoxie/Reoxygenierungsstress erhöht werden. In der 2. Teilstudie - der Myokardinfarkt-induzierten Herzinsuffizienz - wurden die Parameter oxidativer Schädigung und antioxidativen Schutzes im Akutstadium (14-16h) und 3, 6 und 9 Wochen nach experimentellem Infarkt (MI) bestimmt. In der Akutphase zeigten sich in beiden Ventrikeln und im Papillarmuskel gesteigerte GSH-Px- und SOD-Aktivitäten, ohne dass kardiale Hypertrophie vorlag. Hsp72 und Hsp25 waren während der Akutphase nach MI im Papillarmuskel und im linken Ventrikel erhöht. In der Folge resultiert eine verbesserte kontraktile Funktion bei experimentellem Hypoxie/Reoxygenierungsstress. Damit gelang es erstmals eine Selbstprotektion des Myokards während eines akuten MI nachzuweisen. Erst ab der 6. Woche trat kardiale Hypertrophie auf, begleitet vom charakteristischen CK-Isoenzym-Shift. Während die SOD und die Hitzeschockproteine nach der akuten Phase auf das Niveau der Kontrollen absanken, blieb die hohe GSH-Px-Aktivität im linken Ventrikel über den gesamten Untersuchungszeitraum bestehen, bei zunehmender Toleranz des Herzens gegenüber Hypoxie/Reoxygenierungsstress. Die vorgelegten tierexperimentellen Untersuchungen zeigen, dass das Herz sowohl unter akut als auch unter chronisch gesteigertem oxidativen Stress Mechanismen zur Selbstprotektion aktivieren kann, die eine Prävention bzw. Minimierung von Schädigungsreaktionen durch Sauerstoffradikale ermöglichen.
Elevated oxidative stress is typical in the pathogenesis of heart failure. Characteristical changes in antioxidant enzyme status, represented by glutathionperoxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD), and changes in heat shock protein status (Hsp), denoted by Hsp25 and Hsp72, have been revealed in two different rat-models. Lipidperoxidation was quantified by the concentration of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). In the first model of heart failure caused by permanent activation of renin-angiotensin system in double transgenic rat, leftventricular hypertrophy accompanied by a shift of creatine kinase (CK) isoenzyme pattern to higher concentration of fetale CK-MB an -BB-isoforms was found. Higher TBARS concentrations and lower alpha-tocopherol levels caused by consumption have been measured. SOD and Hsp72 remained unchanged. The tolerance against experimental hypoxia/reoxygenation was improved by higher levels of GSH-Px and Hsp25 in both right and left ventricular tissue.
In the second study of heart failure caused by experimental myocardial infarction (MI) the parameters of oxidant demolishing and antioxidant defence were evaluated under acute conditions (14-16h) and 3, 6 and 9 weeks after infarction. In the acute period higher activities of GSH-Px and SOD in non-hypertrophied left and right ventricular tissue and papillary muscle have been reported. Leftventricular and papillary muscle Hsp25 and Hsp72 content showed higher levels 14-16 hours after MI compared with controls, improving the contractile function in hypoxia/reoxygenation experiments. These findings suggest for the first time a myocardial self-protection after acute myocardial infarction. 6 and 9 weeks after MI leftventricular hypertrophy occurred attended by the characteristic CK-isoenzymeshift. While SOD-activity and Hsp-content decreased to the levels of the controls, GSH-Px remained on higher altitude in leftventricular tissue in all examined periods after MI. This was accompanied by better tolerance against hypoxia/reoxygenation stress.
These findings of experimental-induced heart failure show the activation of myocardial self protecting mechanisms under acute and chronic oxidative stress conditions, minimizing or even preventing demolishing reactions of oxygen radicals.
In den Bevölkerungen industrialisierter Länder sind Erkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems die wesentlichste Ursache eines frühzeitigen Todes. Sie sind in der Bundesrepublik Deutschland die häufigsten stationären Behandlungsanlässe; jeder fünfte Mann und jede siebente Frau wird unter dieser Hauptdiagnose im Krankenhaus versorgt. Herz-Kreislauferkrankungen verursachten 1994, mit direkten Kosten von über 42,6 Milliarden DM, etwa 12,4% der direkten Gesamtausgaben für Gesundheit in der Bundesrepublik Deutschland. 1995 starben in der BRD insgesamt 183 736 Personen an ischämischen Herzkrankheiten, davon 87 739 Menschen am akuten Myokardinfarkt (MI). Damit war der Myokardinfarkt im Jahr 1995 die häufigste Einzeltodesursache überhaupt [1]. Die Gesamtzahl der akuten Herzinfarkte in der Bundesrepublik Deutschland beträgt ca. 240 000 / Jahr. Bei jedem 10. Patienten entwickelt sich nach überstandenem MI eine Herzinsuffizienz. Die chronische Herzinsuffizienz ist in Deutschland mit einer Prävalenz von ca. 2% der Bevölkerung eine häufige und ernst zu nehmende Erkrankung. Die 1-Jahres-Sterblichkeit beträgt bei Patienten mit geringer Symptomatik und adäquater Therapie ca. 20%. Bei schwerer Symptomatik steigt sie trotz Therapie auf mehr als 50% [2]. Somit ist der klinische Verlauf der Herzinsuffizienz schlechter als bei den meisten Malignomen. Hinsichtlich der ätiologischen Faktoren der Insuffizienzentwicklung konnte in den letzten Jahren eine deutliche Umverteilung gesichert werden. Während in der Framingham-Studie die arterielle Hypertonie mit etwa 75% eindeutig dominierte, zeigen die epidemiologischen Daten neuerer Studien, wie in Abbildung 1 dargestellt, eine Verschiebung hin zur koronaren Herzkrankheit (KHK). Sie steht heute mit 50-75% ursächlich eindeutig im Vordergrund. Dieser Rückgang wird als Folge der verbesserten und konsequenteren antihypertensiven Therapie begründet [3]. Dennoch stellt die Hypertonie in der Bevölkerung auch weiterhin einen nicht zu unterschätzenden Risikofaktor für die Entstehung anderer Herz-Kreislauferkrankungen dar. In der Bundesrepublik Deutschland haben nur ca. 55% der Bevölkerung normotensive Blutdruckwerte entsprechend der WHO-Definition (< 140/90 mmHg). Einen Borderline-Hypertonus haben 19,5% mit Werten zwischen 140/90 und 160/95 mmHg, und bei 19,8% liegt sogar einen Bluthochdruck mit Werten über 160/95 mmHg vor. Man geht davon aus, dass ein chronischer diastolischer Blutdruck > 105 mmHg das kardiovaskuläre Risiko verdoppelt und das Apoplexrisiko vervierfacht [4].
Trotz deutlicher Erfolge in der Therapie und Prävention ischämischer Herzerkrankungen in den letzten Jahren ist die weitere Erforschung der genauen pathophysiologischen Vorgänge, die schließlich zur Herzinsuffizienzentstehung durch chronische Hypertonie und durch Myokardinfarkt führen, von großem Interesse. Die vorliegende Arbeit soll zum Grundverständnis der hypertrophieassoziierten biochemischen und funktionellen Prozesse im hypertrophierten Myokard beitragen und so die Entwicklung neuer Therapiekonzepte bzw. die Verbesserung bestehender anregen.
Nach Braunwald [5] wird als Herzinsuffizienz „der Zustand des Herzens definiert, bei dem pathologische Veränderungen der Herzfunktion dazu führen, dass die pro Zeiteinheit ausgeworfene Blutmenge zur vollständigen Realisierung der metabolischen Prozesse in peripheren Organen nicht ausreicht oder der periphere Blutbedarf nur bei einem zu hohen Füllungsdruck realisiert werden kann“. Unter Berücksichtigung der Funktion vegetativer und neuronaler Regelkreise bei der Entwicklung der Herzinsuffizienz hat Packer [6] eine erweiterte Definition formuliert, nach der die Herzinsuffizienz als „komplexes klinisches Syndrom, charakterisiert durch Störungen der linksventrikulären Funktion und der vegetativen und neurohumoralen Regulation, begleitet von Leistungsminderung, Flüssigkeitsretention und reduzierter Lebenserwartung“ zu verstehen ist. Der in dargestellte doppelte Circulus vitiosus zeigt schematisch die Bedeutung der vegetativen und neurohumoralen Stimulation im Rahmen der Herzinsuffizienzentstehung. Diese Stimulation führt sowohl über den Weg struktureller als auch funktioneller Veränderungen zur Myokardschädigung.
Die Störung der Herzfunktion kann sich dabei akut (innerhalb von Sekunden bis Tagen) bzw. chronisch (innerhalb von Monaten bis Jahren) herausbilden. Die Herzinsuffizienz wird durch mechanisch induzierte Stoffwechselveränderungen im Herz (Drucküberlastung, Volumenüberlastung, Bewegungsbehinderung, Muskelfaserverlust) oder direkt metabolisch (Koronar
Als biochemisches Korrelat zur Kontraktilitätseinschränkung des Myokards werden u.a. Aktivitätseinschränkung des ß-Rezeptor-Adenylatcyklase-Systems, verminderte Aktivität der myofibrillären ATPase, Veränderung des Myosinisoenzymmusters und Störung des Ca-Flusses beschrieben [7]. Als Reaktion auf die Dysfunktion des Myokards werden Kompensationsmechanismen aktiviert, die eine Stabilisierung bzw. Steigerung der Herzleistung ermöglichen sollen. Wie von Eichhorn und Bristow [8] zusammenfassend dargestellt wurde, gehören zu diesen Kompensationsmechanismen entsprechend der zeitlichen Abfolge a) Zunahme der Herzfrequenz, b) Zunahme der Kontraktilität, c) Vorlastzunahme und d) Zunahme der Zahl kontraktiler Elemente. Von entscheidender Bedeutung für die Aktivierung dieser Kompensationsmechanismen ist die Aktivitätssteigerung neuronal/autokrin-parakriner Systeme, insbesondere des adrenergen Systems und Renin-Angiotensin-Systems (RAS).
Die als Folge beobachteten strukturellen und funktionellen Umbauprozesse im Myokard werden unter „Myokardremodeling“ zusammengefasst. Myokardremodeling findet sich als physiologischer Vorgang bei Leistungssportlern und dient dort der Anpassung des Herzens an gesteigerte Leistungsanforderung. Myokardremodeling im Verlauf der Herzinsuffizienzentwicklung dient kurzzeitig ebenfalls zur Aufrechterhaltung der kardialen Leistung, verstärkt jedoch im Langzeitverlauf - wie in dargestellt - die myokardiale Dysfunktion. Nach Colucci [9] schließt das pathologische Myokardremodeling a) die Zunahme der Myokardmasse verbunden mit der Hypertrophie der Einzelmyozyten, b) die veränderte Genexpression mit bevorzugter Exprämierung fetaler Gene, c) die Änderungen in Qualität und Quantität der extrazellulären Matrix und d) die Apoptoseinduktion ein.
Am Beispiel der durch einen Myokardinfarkt hervorgerufenen Herzinsuffizienz weisen Blaufarb und Sonnenblick [10] darauf hin, dass das Remodeling zeitlich unterschiedlich auftretende, strukturelle und funktionelle Veränderungen beinhaltet. Zu den frühen Remodelingprozessen zählen sie den in der akuten Infarktphase eintretenden Zellverlust, gefolgt vom bindegewebigen Umbau und Narbenbildung im infarzierten Myokard. Die daraus resultierenden strukturellen Gewebeveränderungen, die in die Übergangsregion zum nichtinfarzierten Myokard hineinreichen, bilden die Grundlage für die Vergrößerung des infarzierten Gebietes. Zur Kompensation des Verlustes an funktionsfähigem Myokard reagiert das nichtinfarzierte Herz
Hypertrophie bezeichnet die Zunahme der Herzmuskelmasse und kann prinzipiell alle Anteile des Herzens betreffen, ist aber in den Ventrikeln am ausgeprägtesten. Es werden nach morphologischen Kriterien zwei Formen der Hypertrophie unterschieden, die auch als Mischform auftreten können:
die durch eine Volumenbelastung erzeugte exzentrische Hypertrophie,
die auf einer Druckbelastung basierende konzentrische Hypertrophie.
Bei der Ersteren kommt es aufgrund der erforderlichen Erhöhung des Schlagvolumens und des größeren enddiastolischen Restvolumens zur Gefügedilatation, wohingegen das Ventrikelvolumen bei der konzentrischen Hypertrophie nahezu gleich bleibt.
Wie mechanische Belastung genau in Wachstum umgesetzt wird ist noch nicht vollständig geklärt. Kardiomyozyten scheinen äußere Belastung wahrnehmen zu können und in Reaktion darauf zu hypertrophieren. Es existieren eine Reihe von Daten, von Eichhorn und Bristow [8] zusammengefasst, die zeigen, dass sowohl in Tiermodellen als auch beim Menschen die Aktivierung des RAS einen potenten Hypertrophiestimulus darstellt. Dehnung von Kardiomyozyten als Folge erhöhter Wandspannung führt demnach zur autokrin-parakrinen Freisetzung von Angiotensin II (AngII) und Aktivierung der Proteinkinase C. Folge ist die Expression von Wachstum-induzierenden Genen, beispielsweise von c-fos, c-jun, und c-myc. Nakamura et al. [11] zeigten, dass eine Inhibition der durch Ang II und Tumornekrosefaktor α (TNF-α) aus
Parallel zur kardialen Hypertrophie kommt es auch zu einer Interstitium-Fibrosierung des Herzmuskelgewebes. Die Stimulation der Kollagensynthese durch AngII sowie seine mitogene Wirkung auf Kardiofibroblasten könnten als Ursache angesehen werden. Hypertrophiereduktion unter ß-Blockade lässt vermuten, dass auch adrenerge Mechanismen Hypertrophie-induzierend wirken. Andrerseits können auch ischämische Episoden allein die Expression der oben beschriebenen wachstum-induzierenden Gene auslösen [12]. In Tierversuchen, aber auch in Gewebeproben aus humanem Herz wurden als adaptive Reaktion auf hämodynamische Belastungssituationen immer wieder die Reexpression fetaler Proteingene beobachtet, so beispielsweise für Isoformen von α-Aktin, Tropomyosin, β-Myosin und Creatinkinase [13].
Muskelkontraktionen und -relaxationen sind ATP-abhängig. Da die Zelle über nur sehr begrenzte ATP-Reserven verfügt, ist die permanente Regenerierung aus Glykogen und Triglyceriden notwendig. Dieser Metabolismus nimmt aufgrund der Komplexität seiner Reaktionen viel Zeit in Anspruch. Zur kurzfristigen Überbrückung gibt es das Reservoir an energiereichen Phosphorylgruppen in Form des Creatinphosphats (CrP), aus welchem die kontinuierliche Nachbildung von ATP durch die zytosolische Creatinkinase (CK) garantiert wird. Im ruhenden Muskel ist CrP die in größter Konzentration vorhandene energiereiche Verbindung.
In Abbildung 3 sind zusammenfassend die Wirkorte und -mechanismen der CK dargestellt. In der Erholungsphase wird Creatin durch die mitochondriale CK zu Creatinphosphat rephosphoryliert. Durch Lokalisation der mitochondrialen CK an der Außenseite der inneren Mitochondrienmembran ist ein enger Bezug zur oxidativen Phosphorylierung gegeben, als Garant für die schnelle Energiebereitstellung. Der Transport des gebildeten CrP aus dem Mitochondrium ins Zytosol, dem Ort des Energieverbrauchs (Kontraktion, Ionenkanäle, Synthesen), wird durch das CrP-Shuttle vollzogen. Dort erfolgt dann die Resynthese des ATP aus
Aus tierischem und humanem Gewebe lassen sich 3 zytoplasmatische CK-Isoenzyme isolieren: die CK-MM, CK-MB und CK-BB, die aus monomeren Untereinheiten: M (= muscle) und B (= brain) bestehen. Aufgrund der Organverteilung der CK-Isoenzyme wird die CK-MM als Muskeltyp, die CK-MB als Myokardtyp und die CK-BB als Hirntyp bezeichnet. Die mitochondrialen Isoenzyme werden uneinheitlich als CK-Mi, CK-MiMi, mCK, CK-MT oder CK-mito abgekürzt.
Vergleicht man die Michaelis-Konstanten (KM) zwischen CK-MB und CK-MM, so lässt sich erkennen, dass der KM-Wert der CK-MB für Creatinphosphat kleiner (3,5 vs. 4,7) und für Creatin doppelt so groß ist (20,6 vs. 10,0). Beim CK-BB-Isoenzym verglichen mit der CK-MM verhält es sich gleichermaßen: KM-Wert für Creatinphosphat 2,2 vs. 4,7. Dies bedeutet, dass die B-Isoformen eher den Abbau von CrP zu Creatin unter Bereitstellung von Energie in Form von ATP fördern, während die CK-MM eher die Energiespeicherung durch Synthese von CrP begünstigt.
Im geschädigten, vor allem aber hypertrophierten Myokard wird regelmäßig ein Verlust der CK-Gesamtaktivität verzeichnet, mit begleitender Veränderung des Isoenzymmusters [14]. 1976 konnte zum ersten Mal ein Anstieg des CK-MB-Anteils im hypertrophierten Myokard beobachtet werden [15]. Im Gegenzug nahm der prozentuale Anteil der CK-MM an der Gesamt-CK ab. Die Akkumulation der CK-MB-, aber auch der CK-BB-Isoenzyme kann unter dem Aspekt der oben erläuterten KM-Werte als eine Adaptation an chronischen Energiemangel gewertet werden. Bei Hypoxie ist der CrP-Spiegel als Ausdruck einer ungenügenden oxidativen Phosphorylierung erniedrigt. Kompensatorisch steigen die Anteile der fetalen Isoenzyme mit B-Untereinheiten an, da durch diese aufgrund der höheren Affinität zu Creatinphosphat ein erheblich schnellerer Phosphattransfer erreicht werden kann [16]. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die CK-Mi spezifisch abnimmt, wofür ein erniedrigter Creatin-Pool als Ursache angesehen wird. Man geht davon aus, dass der Anstieg der fetalen CK-Isoenzyme charakteristisch für die kompensierenden Herzhypertrophie ist, während sich der Übergang von der Hypertrophie zur Herzinsuffizienz durch die zusätzliche Abnahme der CK-Mi auszeichnet [17].
Weniger bekannt ist, welche Reaktionswege von den unterschiedlichen mechanischen und metabolischen Initialreaktionen zum nahezu uniformen Erscheinungsbild der manifesten Herzinsuffizienz führen. Denkbar ist, dass Sauerstoffradikale, deren gesteigerte Bildung im Verlauf der aufgeführten pathophysiologischen Stoffwechselsituationen bekannt ist, als Mediatoren wirken.
Der Begriff"Sauerstoffradikale" wird als Synonym für radikalische und nichtradikalische Moleküle (Tabelle 1) bezeichnet, die bei univalenter Reduktion von Sauerstoff oder in Reaktionen der primär gebildeten Spezies miteinander bzw. mit anderen Biomolekülen entstehen.
Die hervorstechendste Eigenschaft von Sauerstoffradikalen ist ihre Reaktionsfähigkeit. Sie ist eine notwendige Voraussetzung für physiologische Reaktionen (Fremdstoffmetabolisierung, Eikosanoidmetabolismus, Phagozytose, Synthese biogener Amine u.a.), kann aber auch über unspezifische Reaktionen zur Zellschädigung führen.
Das Superoxidradikal
Superoxidradikale sind verglichen mit anderen freien Radikalen relativ träge Reaktionspartner, worauf sich auch ihre verhältnismäßig geringe Zytotoxizität zurückführen lässt. Größere Bedeutung haben die von ihnen ausgehenden Folgereaktionen, die zur Bildung von Hydroxylradikalen (Haber-Weiss-Reaktion) (Gleichung 1) und Singulett-Sauerstoff (Gleichung 2) führen.
Durch Spontandismutation werden Wasserstoffperoxid und Sauerstoff gebildet (Gleichung 3).
Durch das Enzym Superoxiddismutase (SOD) katalysiert, wird die Geschwindigkeit der Dismutation um den Faktor 109 gesteigert.
Hydroxylradikale werden bei der sogenannten Fenton-Reaktion (Gleichung 4 und 5) gebildet, die im Prinzip nur die übergangsmetallkatalysierte Form der Haber-Weiss-Reaktion darstellt.
Unter den freien Radikalen gilt das Hydroxylradikal als besonders toxisch. Dies begründet sich zum einen durch die außerordentliche Reaktionsfreudigkeit, andererseits gibt es physiologischerweise keine effektiven, spezifischen Schutzmechanismen, wie sie für andere Sauerstoffradikale in Gestalt der Enzyme SOD und Katalase existieren. Entscheidende Folgen des Einwirkens von Hydroxylradikalen sind DNA-Destruktion und Initiation der Lipidperoxidation.
Wasserstoffperoxid
Die Toxizität des Wasserstoffperoxids wird ebenfalls durch Folgereaktionen erklärt. H2O2 als stabiles Zwischenprodukt allein besitzt kaum zellschädigende Wirkung. Erst die Produkte der oben beschriebenen Haber-Weiss- und Fenton-Reaktion führen zur Bildung von Sauerstoffspezies mit größerer toxischer Potenz (Gleichung 4 und 5).
Hypochlorit
Hypochlorit entsteht in Makrophagen als Produkt der Myeloperoxidase. Dieses Enzym wandelt das nach primärer Bildung von O
Reaktive Sauerstoffspezies können entweder direkt bei der schrittweisen Reduktion von Sauerstoff oder als Ergebnis der Reaktionen primär gebildeter Sauerstoffradikale miteinander oder mit anderen Molekülen entstehen. Bei vielen dieser Reaktionen sind Übergangsmetalle als Katalysatoren beteiligt. Des Weiteren besteht die Möglichkeit der Bildung durch
Makrophagen
Nach ihrer Aktivierung erzeugen Makrophagen im Rahmen der sogenannten Respiratory-burst-Reaktion vermehrt Superoxidradikale. Diese wirken bakterizid und sind so im Rahmen des Immunsystems erwünschte und unentbehrliche Metabolite.
Mitochondrien
Superoxidradikale entstehen als unumgängliches Produkt der Atmungskette. Allerdings werden dabei nur ca. 1-4% des Elektronenflusses in O
Peroxisomen
Peroxisomen kommen vor allem in Zellen mit hoher metabolischer Leistung vor, d.h. beispielsweise in Nieren- und Leberepithelien. In diesen Zellorganellen, die der Energiebereitstellung dienen (β-Oxidation, Fructoseabbau), werden durch verschiedene Oxidasen und Peroxidasen erhebliche Mengen an H2O2 gebildet. Die in diesem Kompartiment in hoher Konzentration vorkommende Katalase vermag einen Großteil davon zu eliminieren. Dennoch können bis zu 40% in das Zytoplasma übertreten [20].
Xanthinoxidasekonversion
1982 wurde eine Hypothese vorgelegt, nach der die Hauptquelle der bei Ischämie/Reperfusionsvorgängen auftretenden Sauerstoffradikale in der Umwandlung der - unter physiologischen Bedingungen als Dehydrogenase reagierenden - Xanthinoxidoreduktase zur Oxidase zu suchen sei [21]. Die Xanthinoxidase (XOD) verwendet dabei Sauerstoff als Elektronenakzeptor und katalysiert folgende Reaktionen (Gleichung 8 und 9):
Beim Purinabbau unter Ischämie/Reperfusionsstress fallen so nicht unerhebliche Mengen Superoxidanionen an.
Erhöhter Sympathikotonus ist mit einer vermehrten Ausschüttung von Katecholaminen verbunden, deren Abbau sowohl über die Monoaminooxidasen als auch über den Weg der Autooxidation freie Radikale entstehen lässt [22].
Eicosanoidbildung
Gesteigerte Synthese von Prostaglandinen und Leukotrienen aus Arachidonsäure, wie es auch während Ischämie der Fall ist, kann ebenfalls durch den stattfindende Elektronentransfer zur Bildung von radikalischen Sauerstoffabkömmlingen führen.
Unter physiologischen Bedingungen werden Sauerstoffradikale nach ihrer Entstehung eliminiert und eine Schädigung so verhindert. Da Sauerstoffradikale in der Lage sind mit nahezu allen Biomolekülen zu reagieren, kann es bei vermehrter Bildung und/oder verminderter Metabolisierung zu zahlreichen Schädigungsprozessen kommen, die in Abbildung 4 zusammengestellt sind.
Um ihre Funktion und Fluidität aufrechterhalten zu können, brauchen die Membranen ungesättigte Fettsäuren. Diese sind der vornehmliche Angriffspunkt bei der Schädigung der Membranen durch Sauerstoffradikale, was als Lipidperoxidation bezeichnet wird. Diese verläuft, einmal initiiert, als Kettenreaktion, die prinzipiell über zwei Wege zur Schädigung führen kann: zum einen durch direkte Strukturveränderung der Membranen, zum anderen über indirekte Zerstörung von anderen Zellkomponenten durch die entstehenden reaktiven Aldehyde. Dabei reichen die Folgen je nach Ausmaß der Schädigung vom unspezifischen Anstieg der Ionenpermeabilität über die Beeinflussung membrangebundener Proteine bis hin zur vollständigen Destruktion der Membranen.
Urheber der Lipidperoxidation ist bevorzugt das Hydroxylradikal (OH•), aber auch Perhydroxylradikale (HO2•) und Singulett-Sauerstoff (1O2) sind dazu in der Lage. Angriffspunkt für Hydroxylradikale ist dabei das α-Methylen-C-Atom unkonjugierter Doppelbindungen von polyungesättigten Fettsäuren. Dabei kommt es zunächst durch Abstraktion eines Wasserstoffatoms zur Bildung eines Lipidradikals (L•) (Gleichung 10). Dieses wird durch die nachfolgende Dien-Konjugation stabilisiert (Gleichung 11).
Die dabei ablaufende cis-trans-Isomerisierung der PUFA stellt bereits eine Störung des Membrangefüges dar. Im weiteren Verlauf kommt es durch Addition von Sauerstoff zur Entstehung des Peroxydradikals (LOO•) (Gleichung 12). Dieses ist fähig Wasserstoff eines weiteren ungesättigten Fettsäuremoleküls (LH) zu abstrahieren und somit ein neues Lipidradikal (L•) zu generieren (Gleichung 13).
Damit ist der Circulus vitiosus der Propagation (L• → LOO• → LOOH + L•) eingeleitet. Lipidperoxide (LOOH) zerfallen entweder spontan oder übergangsmetallkatalysiert (Fe2+/Fe3+)
Durch diese Mechanismen ist es möglich, dass sich die Propagation selbst unterhält, bis stabile Endprodukte gebildet werden, die ein weiteres Voranschreiten der Kettenreaktion nicht mehr möglich machen (Termination). Bei ausreichendem antioxidativen Potential erfolgt ein frühzeitiger Abbruch der Kettenreaktion. Ist dies nicht der Fall, werden im Verlauf von komplizierten Fragmentierungsreaktionen schließlich Aldehyde gebildet (Malondialdehyd [MDA], 4-Hydroxynonenal), die ihrerseits auf verschiedene Weise andere Zellkomponenten, vor allem Proteinbestandteile schädigen können.
Proteine
Zur Proteinenmodifikation können neben den Produkte der Lipidperoxidation auch Sauerstoffradikale direkt und dabei hauptsächlich das Hydroxylradikal (OH•) führen. Es kommt dabei zur Oxidation von Aminosäuren der Seitenketten, aber auch des Grundgerüsts, mit nachfolgender Protein-Fragmentierung und der Entstehung von intra- und intermolekularen cross-link-Verbindungen [23]. Dabei reagieren die reaktiven Sauerstoffspezies bevorzugt mit NH- und SH-Gruppen. Im Falle von Enzymen resultiert daraus häufig eine Aktivitätserniedrigung. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass Enzyme, deren Aktivität an SH-Gruppen gebunden ist, wie unter anderem die Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase und die NADP-abhängige Isocitratdehydrogenase, durch Sauerstoffradikale inaktiviert werden können [24].
DNA
Neben Strangbrüchen betreffen Schädigungen der DNA besonders häufig die Basen. Dort führen Sauerstoffradikale und deren Reaktionsprodukte zur Entstehung von Thymindimeren und 8-Hydroxydeoxyguanosinresten. Nachfolgende Basenfehlpaarungen führen, wenn nicht durch DNA-Reparaturenzyme behoben, zur Störung der Proteinbiosynthese. Durch das Auftreten derartiger Strukturveränderungen in der genetischen Substanz lässt sich die mutagene Wirkung von Sauerstoffradikalen erklären.
Kohlenhydrate
Es ist bekannt, dass Hyaluronsäure und Proteoglykane oxidativ geschädigt werden können und dabei depolymerisiert werden. Folge ist die Abnahme der Viskosität und damit ein verminderter Schmiereffekt der Synovialflüssigkeit. Die in der Synovialflüssigkeit vorkommende SOD schützt diese Verbindungen vor derartigen Schädigungen.
Um den Abbau reaktiver Sauerstoffspezies zu ermöglichen, benutzt der Organismus eine Anzahl sich ergänzender Mechanismen: das antioxidative System. Dazu gehören sowohl enzymatische als auch nichtenzymatische Antioxidantien, die prinzipiell auf drei Ebenen auf Sauerstoffradikale wirken können:
Verhinderung der Bildung,
Verhinderung der Wirkung auf Biomoleküle,
Beseitigung und Reparatur der durch sie verursachten Schäden.
Eine Auswahl wichtiger Antioxidantien ist in Tabelle 2 zusammengefasst
Tierische Zellen verfügen über antioxidative Enzyme, die entsprechend ihrer physiologischen Substrate in den verschiedenen Zellkompartimenten vorkommen.
(1) Glutathionperoxidase (GSH-Px)
Die GSH-Px ist ein Selenoenzym, dass in den verschiedenen Organen in unterschiedlichen Konzentrationen zu finden ist, wo es in der Regel zu 30% in den Mitochondrien und zu 70%
Unter physiologischen Bedingungen liegen das dabei gebildete Glutathiondisulfid (GSSG) und seine reduzierte Form GSH im Verhältnis 1:500 vor. Das gewährleistet das Enzym Glutathionreduktase (GSSG-R) durch die schnelle Regenerierung des Glutathions unter Verbrauch von Nikotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH/H+) aus dem Pentosephosphatweg [27] (Gleichung 15).
Dementsprechend wirkt sich eine Störung im NADP-Haushalt auch auf die Aktivität der GSH-Px aus.
(2) Superoxiddismutase (SOD)
Die enzymatische Funktion der SOD wurde erstmalig 1969 von Fridovich und McCord beschrieben [28]. Diese besteht in der Dismutation des Superoxidradikals zu Wasserstoffperoxid und Sauerstoff (Gleichung 16).
Die SOD ist für die Entgiftung der in der Regel primär entstehenden Superoxidradikale zuständig und dementsprechend insbesondere an den Orten ihrer Bildung lokalisiert. Sie existiert in drei verschiedenen Isoformen, die sich im Metallion des katalytischen Zentrums unterscheiden:
(1) die zytosolische CuZn-SOD
(2) die in den Mitochondrien lokalisierte Mn-SOD
(3) das Eisen-SOD-Isoenzym (Fe-SOD)
Das Hämenzym Katalase ist in erster Linie für die Entgiftung von H2O2 zu Wasser verantwortlich (siehe auch Abbildung 5). In den Peroxisomen lässt sich die höchste Katalaseaktivität nachweisen.
(4) Kooperation im enzymatischen System
Ein optimaler antioxidativer Schutz erfordert die enge Kooperation der enzymatischen Mechanismen. Abbildung 5 zeigt eine vereinfachte Zusammenstellung der sich ergänzenden antioxidativen Enzyme.
Am Beispiel der SOD kann die notwendige Kooperation verdeutlicht werden. Bekannt ist, dass die CuZn-SOD durch das eigene Reaktionsprodukt H2O2 oxidativ modifiziert und nachfolgend inhibiert wird. Ursache ist die leichte Oxidierbarkeit eines Histidins im aktiven Zentrum [29]. Die SOD-Aktivität kann damit nur aufrechterhalten werden, wenn das anfallende H2O2 durch Katalase und GSH-Px kontinuierlich metabolisiert wird.
(1) α -Tocopherol (Vitamin E)
In der Familie der E-Vitamine, einer Gruppe von Chromanderivaten, stellt das lipidlösliche α-Tocopherol den größten Anteil dar. In Membranen und Lipoproteinen wirkt es als „Kettenreaktionsbrecher“ und schützt auf diese Weise polyungesättigte Fettsäuren vor der Peroxidation. Dabei wirkt es synergistisch mit Ascorbinsäure. Durch die isoprenoide Seitenkette, die die Lipophilie vermittelt, wird der Einbau in Membranen ermöglicht. Dort können sie direkt am Ort der Lipidperoxidation ihre hohe Effektivität bei deren Hemmung entfalten. Bei der Reaktion mit Peroxyradikalen von Fettsäuren (LOO•) wird eine am Chromanring gebundene Hydroxylgruppe oxidiert, wobei das Tocopherolradikal entsteht.
(2) Ascorbinsäure (Vitamin C)
Das hydrophile γ-Lacton Ascorbinsäure (Asc) wird von höheren Pflanzen und den meisten Tieren aus Glucose synthetisiert. Der Mensch und Primaten, sowie das Meerschweinchen sind zur Vitamin C-Synthese nicht fähig. Dadurch sind diese Spezies gezwungen die benötigte Menge mit der Nahrung aufzunehmen. Im Sauerstoffradikalstoffwechsel ist Vitamin C durch die Reduktion von Superoxidradikalen und Hydroxylradikalen von Bedeutung. Des Weiteren kann Ascorbinsäure Vitamin E regenerieren. Dieses Zusammenwirken wird in Abbildung 6 dargestellt. Den in hohen Dosen antioxidativen Eigenschaften des Vitamin C stehen die in niedrigen Konzentrationen prooxidativen Wirkungen entgegen. Diese fördern bei entsprechenden Bedingungen die Bildung von Sauerstoffradikalen und die Propagation der Lipidperoxidation.
(3) Glutathion (GSH)
Die Wirkung des hydrophilen Glutathion als Antioxidans basiert auf unterschiedlichen Mechanismen. Zum einen besteht die Möglichkeit der direkten Reaktion mit reaktiven Sauerstoffspezies, daneben dient es der GSH-Px als Co-Substrat und ist außerdem in der Lage oxidiertes α-Tocopherol zu regenerieren. In allen Fällen wird es dabei selbst zum Disulfid oxidiert. Ferner besteht die Möglichkeit der Anlagerung von GSH an proteingebundene SH-Gruppen unter Bildung eines gemischten Disulfids [30], wodurch die für die Enzymaktivität essentiellen Thiol-Gruppen wirkungsvoll vor Oxidation geschützt werden.
Wie im enzymatischen System sind kooperative Wirkungen entscheidend für einen optimalen antioxidativen Schutz. Die Kooperation der wichtigen Vertreter des nichtenzymatischen System Vitamin E, C und Glutathion ist in Abbildung 6 dargestellt.
Das lipophile α-Tocopherol reagiert mit Peroxyradikalen von Fettsäuren (LOO•). Das entstehende Tocopherolradikal (α-Tocopherol—O•) wird von der hydrophilen Ascorbinsäure (Asc) oder Glutathion (GSH) reduziert, die dabei zum Ascorbinsäureradikal (Asc•) bzw. zu Glutathiondisulfid (GSSG) oxidiert werden.
Viele Zellen besitzen durch konstitutive Stressproteine eine gewisse natürliche Toleranz gegenüber verschiedenartigen Noxen. Durch verstärkte Synthese dieser Hitzeschockproteine als Folge von Stresseinwirkung (unphysiologische Temperaturen, Sauerstoffmangel, chemische Agenzien oder parasitäre Infektionen) kann die Toleranzschwelle noch erhöht werden [31]. Die Hsp sind entsprechend ihren Molmassen klassifiziert worden in:
die Hsp90-Familie (Hsp100, Hsp90, Hsp86)
die Hsp70-Familie (Grp73, Hsp72, Hsp70, Hsp 68)
die Hsp60-Familie (Hsp60, TCP-1)
das Hsp40
die Familie der kleinen Stressproteine (Hsp25/28, αB-Crystallin)
das Hsp10 und
das Hsp8 (Ubiquitin).
In der Zelle dienen die Stressproteine der Beseitigung molekularer Schäden und der Wiederherstellung der normalen Zellfunktion. Dabei bewirken einige (Hsp70, Hsp60/10-Komplex, Hsp25/28) als Chaprone die gerichtete Rückfaltung partiell denaturierter Proteine, ohne Teil des Produktes zu werden. Es ist nachgewiesen worden, dass die Hsp-Synthese durch Sauerstoffradikale direkt, aber auch durch Produkte radikalischer Reaktionen induziert wird [32]. Die die Induktion auslösenden Hitzeschock-Transkriptionsfaktoren (HSF) liegen bereits in inaktiver Form vor und binden unter Stress-Konditionen an eine spezifische DNA-Sequenz. Dadurch ist keine Proteinsynthese nötig um die Transkription der Hsp einzuleiten und verläuft dementsprechend schnell [33].
Es wurde gezeigt, dass Sauerstoffradikale in verschiedenen Modellen (Kaninchenseptum, isoliertes Rattenherz, Papillarmuskel) Reaktionen induzieren, die zur Einschränkung der Myokardkontraktion führen. Besonders sensitiv gegenüber oxidativem Stress sind die Membranstrukturen der Herzmuskelzelle. Beobachtet wurden oxidative Modulationen membranständiger Enzyme, veränderte Membranstrukturen oder sogar vollständige Membrandestruktion [24]. Nach Goldhaber und Weiss [34] beeinflussen Sauerstoffradikal-induzierte Reaktionen vor allem die Regulation der intrazellulären Ca2+-Konzentration durch Störung der Ca2+-Aufnahme ins Sarkoplasmatische Retikulum (SR) als Folge der Hemmung der Phospholamban-abhängigen sarkolemmalen Ca2+/Mg-ATPase und/oder verstärkten passiven Ca2+-Einstrom. Sauerstoffradikale beeinflussen auch den Ca2+/Na-Austausch, vermindern die Aktivität von Na/K-ATPase, sarkolemmaler Ca2+-ATPase und myofibrillärer ATPase und führen zur Hemmung von oxidativer Phosphorylierung und Glykolyse. Thioloxidation und Lipidperoxidation führen nach vorübergehender Sensitivitätszunahme zum Funktionsverlust des sarkolemmalen ß-Rezeptor-Adenylatcyclase-Systems [35]. Zur Einschränkung der Myokardfunktion können Sauerstoffradikale auch über die Freisetzung lysosomaler Enzyme und Inhibition von Transkriptions-/Translationsprozessen beitragen [36,37]. Dass Sauerstoffradikale auch direkt bei der durch RAS-Aktivierung induzierten Hypertrophie eine entscheidende Rolle spielen, wurde bereits im Kapitel 2.1.1 dargestellt. Tierexperimentell wurde gezeigt, dass
Gupta und Singal [40] konnten in Tierversuchen an Ratten unter chronischer Druckbelastung durch „aortic banding“ zeigen, dass stabile Hypertrophie ohne wesentliche Anzeichen der Herzinsuffizienz mit einem Anstieg der antioxidativen Kapazität im Herzgewebe einhergeht. Ferner zeigten sie, dass dadurch hypertrophierte Herzen aufgrund des gesteigerten Antioxidantien-Gehalt weniger empfindlich gegenüber exogenem oxidativen Stress (z.B. Xanthin/Xanthinoxidase) sind. Auch hinsichtlich des Hypoxie-/Reoxygenierungsstress sind hypertrophierte Herzen mit gesteigertem antioxidativen Potential weniger sensibel [41,42].
Sowohl für die konstitutiv exprimierte Form des Hsp70 (Hsp70c) als auch für seine induzierbare Form (Hsp70i) ist die kardioprotektive Wirkung (Zunahme der Ischämie-Toleranz) nachgewiesen worden [43]. Das Hsp72 wird nur während der Phasen der akuten Adaptation induziert und ist zum Zeitpunkt der stabilen kardialen Funktion in vielen Fällen nicht nachweisbar. So tritt eine Erhöhung der Hsp72-Konzentration im Myokard beim Übergang zur Hypertrophie auf und fällt nach erfolgter Anpassung wieder ab [44]. Es hat bei höherer Konzentration einen nachgewiesenen protektiven Effekt gegenüber Myokardinfarzierung [45]. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass das Hsp72 nicht direkt in Myozyten oder kardialen Neuronen lokalisiert ist, sondern zelltypspezifisch in den kleinen Blutgefäßen zwischen den Kardiomyozyten exprimiert wird [46]. Kardioprotektion kann auch von der Familie der kleinen Stressproteine erwartet werden, die in relativ großen Mengen in den I-Banden der Myozyten lokalisiert sind [47]. Vermutet wird, dass letztere Gruppe durch Verhinderung der Aggregation des Aktinfilaments irreversiblen Schäden am kontraktilen Apparat vorbeugt [48]. Bei erhöhter Produktion von Stressproteinen können diese auch als Autoantigene wirken, die die Zellen zu Zielen des Immunsystems machen [49], wodurch die Zellschädigung zunimmt.
Aus der stimulierten isometrischen Kontraktion des Papillarmuskels im Gewebe-Bad lässt sich ein Mechanogramm aufzeichnen, welches, wie Abbildung 7 zeigt, die Kraftentwicklung im Verlauf der Zeit darstellt. Aus dieser Darstellung des Kraftsignals lässt sich die peak force (PF) und aus der 1. Ableitung die dF/dtmax, die maximale Kraftanstiegsgeschwindigkeit, und die dF/dtmin, die maximale Erschlaffungsgeschwindigkeit ableiten, welche die Kontraktions-
Singal und Kirshenbaum [50] haben die Hypothese aufgestellt, nach der im kompensierten Stadium der Herzinsuffizienz, trotz gesteigerter Sauerstoffradikalbildung, infolge der adaptiven Zunahme des enzymatischen antioxidativen Potentials das hypertrophierte Myokard weitgehend vor Sauerstoffradikal-induzierter Schädigungen geschützt ist. Erst nach Ausschöpfung dieses myokardialen “Selbstprotektionsmechanismus” trägt die dann verstärkt einsetzende Sauerstoffradikal-induzierte Myokardschädigung zum Übergang in die dekompensierten Phase der Herzinsuffizienz bei. Detaillierte Vorstellungen zur Beteiligung von Stressproteinen an der Selbstprotektion des Myokards im Verlauf der Herzinsuffizienzentwicklung liegen nach unserer Kenntnis nicht vor.
Ziel der Arbeit war es:
am Rattenmodell der Hypertonie-bedingten Herzinsuffizienz und
am Rattenmodell der Myokardinfarkt-induzierten Herzinsuffizienz zu prüfen,
ob und in welcher Weise das Myokardremodeling, welches parallel durch die Hypertrophieparameter und die Veränderungen im CK-Isoenzym-System charakterisiert wurde, durch Änderungen im antioxidativen System und Hsp-System gekennzeichnet ist und ob dies eine Selbstprotektion des Myokard ermöglicht.
Nachfolgende Hypothesen wurden formuliert:
Hypothese 1
Beide Systeme tragen parallel zur Selbstprotektion des Myokards in der kompensierten Phase der Herzinsuffizienz bei. Dafür sprechen Untersuchungen, die nach Sauerstoffradikalbelastung eine parallele Induktion beider Systeme beschreiben [51,52].
Hypothese 2
Stressproteinsystem und enzymatisches antioxidatives System werden zur Selbstprotektion des Myokards zeitlich differenziert aktiviert. So ist bekannt, dass Stressproteine nach kurzzeitiger Myokardischämie exprimiert werden, ohne dass eine Aktivitätszunahme enzymatischer Antioxidantien beobachtet wurde [53]. Andererseits erfolgt die Syntheseinduktion von Hsp erst, wenn das antioxidative System als Folge langanhaltender oder exzessiv gesteigerter Bildung von Sauerstoffradikalen bereits überlastet bzw. geschädigt war [54,55].
Analysenwaage, SBA 332; Scaltec, Heiligenstedt
Chromasorb W-AW;Serva, Heidelberg
Eppendorf K-Küvetten 4071/1; Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg
Eppendorf-PCP 6121; Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg
Eppendorf-Pipetten; Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg
Fastblot B43; Biometra, Göttingen
HPLC-System; ChromSystems Instruments & Chemicals GmbH, München
Minishaker MS1; Ika-Works-INC
Multigel-Long; Biometra, Göttingen
Omni 2000 international; Digitana, Schweiz
pH-Meßgerät Delta 320; Mettler
Power Pack P25; Biometra, Göttingen
Rapid Elektrophorese; Helena Laboratories, Cleveland, Ohio
Spectrofluorometer RF-5001 PC; Shimadzu, Japan
Thermomixer 5433; Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg
Ultraschallstab Labsonic 1510, B. Braun
UV-VIS Scanning Spectrophotometer UV-2101 PC; Shimadzu, Japan
1-Butanol für die Spektroskopie; Merck, Darmstadt
2-Mercaptoaethanol; Ferrak, Berlin
2-Thiobarbitursäure; Serva Feinbiochemica, Heidelberg
Acrylamid; Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Deisenhofen
Color-Marker RPN 756; Amersham, Braunschweig
Colorsubstrat BCIP/NBT, S3771; Promega, Mannheim
Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat; Merck, Darmstadt
Ethylenglycol-bis-(β-aminoethylether)-N,N,N´,N´-tetraacetat (EGTA); Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Deisenhofen
Folin-Reagenz; Merck, Darmstadt
Gel-Blotting-Paper GB 004; Schleicher & Schuell, Dassel
Glycerin; Merck, Darmstadt
Glycin; Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Deisenhofen
Kaliumhydrogenphosphat; Merck, Darmstadt
Kaliumnatriumtatrat-4-hydrat; VK Labor- und Feinchemikalien
Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat; VK Labor- und Feinchemikalien
Malondialdehyd-bis-(diethylacetal); Merck-Schuchardt, Hohenbrunn
Natriumcarbonat; VK Labor- und Feinchemikalien
Natriumcyanid; Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Deisenhofen
Natriumdodecylsulfat (SDS); Merck, Darmstadt
Nitrocellulose Transfer Membran Protan BA83; Schleicher & Schuell, Dassel
N,N´-Methylen-bis-Acrylamid; Sigma-Aldrich-Chemie GmbH, Deisenhofen
N,N,N´,N´-Tetramethyl-ethylendiamin, Serva Feinbiochemica, Heidelberg
Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Merck, Darmstadt
Triton® X100; Merck, Darmstadt
Tween 20; Serva Feinbiochemica, Heidelberg
Bohlender et al. [56] gelang es am Max Delbrück Zentrum für molekulare Medizin in Berlin ein neues Rattenmodell der Hypertonie zu entwickeln. Dabei wurde durch Kreuzung ein doppelt transgener Rattenstamm erzeugt, der heterozygot für das komplette menschliche Angiotensinogen- und Renin-Gen ist. Dazu wurden männliche, normotensive Sprague-Dawley-Ratten, die homozygot für das humane Angiotensinogen-Gen waren mit weiblichen normotensiven TGR, homozygot für das menschliche Renin-Gen, gekreuzt. Die Nachkommen entwickelten einen Hypertonus mit systolischen Mitteldrücken um 220 mm Hg und starben unbehandelt im Mittel nach 55 Tagen. Bei den vorangegangenen Modellen produzierten die transgenen Ratten nur das menschliche Angiotensinogen. Da aber die Konversion von humanen Angiotensinogen zu Angiotensin I nur durch das humane Renin, nicht aber durch das Renin der Ratte erfolgen kann [57], war es nötig den Tieren zur Auslösung und Aufrechterhaltung eines Bluthochdrucks kontinuierlich menschliches Renin per Infusion zuzuführen. Derartiger Aufwand machte dieses Modell ungeeignet für das Studium der kardialen Hypertrophie, hypertensiven Nephrosklerose und anderen Folgen. Mit der oben beschriebenen Methode gelang nun die Erzeugung eines neuen Stammes, bei dem die Ratten alle Komponenten des humanen Renin-Angiotensin-Systems zur Produktion von AngII und damit zur Entwicklung eines spontanen Hypertonus in sich tragen. Die Tiere erhielten über den gesamten Versuchszeitraum Standard-Pelletfutter und Wasser ad libidum.
Für die Untersuchungen des Sauerstoffradikalmetabolismus und der Creatinkinase wurden uns 14 Herzproben der doppelt transgenen Sprague-Dawley-Ratten (TGR) überlassen. Als Kontrollgruppe dienten 14 altersentsprechende nicht transgene Kontrolltiere, ebenfalls Sprague-Dawley-Ratten („wild type“ - WT).
Operationen: AG Dr. Stauß; Institut für Physiologie der Medizinischen Fakultät der HU-Berlin
Der Myokardinfarkt wurde entsprechend einer Vorschrift von Johns und Olson [58] durch die Ligation der Arteria coronaria sinistra verursacht. Dazu wurden die 6 Wochen alten Wistar Rat
Nach Anästhesie der Ratten durch Äther wurde der Thorax geöffnet und durch Herzpunktion das Blut gewonnen. Aus diesem wurde nachfolgend Plasma abzentrifugiert, welches bei –80° C bis zur Messung gelagert wurde. Das Herz wurde entnommen und gewogen, ebenso wie nach erfolgter Präparation die Vorhöfe, Ventrikel und Papillarmuskeln. Für die biochemische Analytik wurden anschließend jeweils rund 50 mg Gewebe aus dem rechten und linken Ventrikel (nicht infarziertes Areal), portioniert und ebenso wie ein separierter Papillarmuskel bis zur Analytik in flüssigem Stickstoff gelagert. Aufgrund der geringen Materialmenge beschränkten wir uns bei den biochemischen Untersuchungen des Papillarmuskels im ersten Tiermodell auf die GSH-Px und die Hsp-Analytik. Im zweiten Modell wurde im Papillarmuskel nur der Hsp-Status bestimmt. Ein zweiter Papillarmuskel wurde unmittelbar nach der Isolierung den Messungen zur Charakterisierung der Herzleistung zugeführt.
Von den tiefgekühlten Gewebeproben wurden jeweils 30 mg in gefrorenem Zustand eingewogen und in 1200 μl 0,9 %iger NaCl-Lösung mit dem Messerhomogenisator unter Eiskühlung homogenisiert. Dabei wurde nach folgendem Schema verfahren: 4 mal 15s Homogenisierung mit jeweils 10 s Pause. Anschließend wurden die Proben portioniert und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C eingefroren. Die Aufarbeitung der Gewebe für die Bestimmung der Stressproteine ist in Kapitel 4.2.11. beschrieben.
Grundlage für die Bestimmung der CK-Aktivität bildet ein gekoppelter optischer Test, mit dem alle CK-Isoenzyme erfasst werden. Die Creatinkinase katalysiert den Transfer des energiereichen Phosphatrests vom Creatinphosphat auf ADP (Gleichung 17). Anschließend wird Glukose mit ATP in Gegenwart von Hexokinase (HK) zu Glukose-6-Phosphat phosphoryliert (Gleichung 18). Dieses reagiert mit NADP+ unter Bildung von Gluconolacton-6-Phosphat und NaDPH2, katalysiert durch die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH) (Gleichung 19). Die CK-Aktivität ist proportional zu der pro Zeiteinheit gebildeten Menge NADPH2.
Es wurde der Test-Kit CK-NAC opt. der Firma Lehmann Labor und Technik, Berlin verwand, dessen Zusammensetzung in Tabelle 3 aufgeführt ist.
Die Homogenate wurden vor der Messung für 3 s mit dem Ultraschallstab rehomogenisiert und aus Stabilitätsgründen ebenso wie die Reagenzien über die Zeit der Messungen auf Eis gelagert. Die Proben wurden im Verhältnis 1:20 mit einem Phosphatpuffer verdünnt, um im zuvor be
Die Berechnung erfolgte auf der Grundlage des Lambert-Beerschen Gesetzes: ΔΕ = ε • c • d, wobei ΔΕ die Extinktionsänderung, c die Konzentration, d die Schichtdicke der Küvette und ε den molaren Extinktionskoeffizienten bezeichnet. Die Aktivität der CK wurde zum Vergleich der Ergebnisse auf den Eiweißgehalt bezogen in U/mg Protein angegeben.
Die Trennung der Isoenzyme erfolgt entsprechend ihrer elektrophoretischen Wanderungsfähigkeit im Agarosegel, bestimmt durch ihre isoelektrischen Punkte. Dabei wandert die BB-Fraktion am weitesten anodisch gefolgt von der MB-Fraktion; CK-MM bleibt nahezu an der Auftragstelle und die CK-Mi bewegt sich zur Katode hin. Nach Inkubation des Gels mit einem fluoreszierenden Farbstoff wird das gebildete und in den Banden lokalisierte NADPH2 sichtbar gemacht und auf diese Weise die CK-Muster quantitativ densitometrisch auswertbar. Zur Bestimmung des CK-Isoenzymmusters wurde die Rapid-Elektrophorese-Technik der Firma Helena Laboratories genutzt. Die Zusammensetzung des CK-Isoformen-Kit ist in Tabelle 4 aufgeführt.
Das Gerät wurde mit folgenden Parametern programmiert:
Die auf der Basis eines gekoppelten optischen Test beruhende Aktivitätsbestimmung der GSH-Px wurde erstmalig von Paglia und Valentine beschrieben [59]. Glutathionperoxidase katalysiert die Oxidation von Glutathion (Gleichung 20). In Gegenwart von Glutathionreduktase (GSSG-R) und NADPH wird das oxidierte Glutathiondisulfid (GSSG) wieder zu Glutathion reduziert, wobei gleichzeitig das NADPH zu NADP+ oxidiert wird (Gleichung 21). Gemessen wird die Abnahme der NADPH-Extinktion bei 340 nm.
Zur GSH-Px-Bestimmung wurde ein Test-Kit der Firma Randox Laboratories genutzt, der auf der Basis des obigen Reaktionsprinzip arbeitet. Tabelle 5 zeigt die Zusammensetzung des Tests. Nach dem Rehomogenisieren wurden die Proben , sowie die Reagenzien über den Zeitraum der Messungen auf Eis gelagert und entsprechend dem folgendem Pipettierschema der Analytik zugeführt.
Zur Aktivitätsbestimmung wurden folgende Parameter gewählt:
Die Glutathionperoxidase-Aktivität erhält man durch Abzug der nichtenzymatischen NADPH-Abnahme (Leerwert) von der Gesamtaktivität. Somit ergibt sich, dass 1 Unit genau der Menge GSH-Px entspricht, die notwendig ist um 1 μmol GSH bei pH 7,4 und 37 °C innerhalb einer Minute zu oxidieren. Die gemessenen Aktivitäten sind ebenfalls in U/mg Protein angegeben.
Die SOD-Bestimmung beruht auf einer Vorschrift von Beauchamp und Fridovich [60]. Dabei werden mit Xanthin als Substrat durch Xanthinoxidase (XOD) Superoxidradikale produziert (Gleichung 22). In einer Folgeraktion wird durch die entstandenen Superoxidradikale ein roter Formazan-Farbstoff (I.N.T.) gebildet. Andererseits können die Superoxidradikale auch über die Dismutationsreaktion der SOD zu molekularem Sauerstoff und H2O2 metabolisiert werden (Gleichung 23). Die Enzymaktivität wird somit über die Hemmung der Formazan-Farbstoffbildung bestimmt.
Zur SOD-Aktivitätsbestimmung wurde ein dieses Reaktionsprinzip nutzender Test-Kit der Firma Randox Laboratories genutzt. Tabelle 6 zeigt die Zusammensetzung des Test-Kits.
Das Pipettierschema ist der folgenden Tabelle zu entnehmen (Angaben in μl):
Nach Mixen der Lösungen in der Küvette wurde bei folgenden Parametern gemessen:
Zur Angabe der Aktivität in Units wurde eine 50%ige Hemmung der Indikatorreaktion definiert als 1 Unit/ml. In der Literatur angegebene SOD-Aktivitäten basieren neben dieser auch auf anderen Definitionen. Diese Unterschiede führen dazu, dass publizierte SOD-Werte nicht zwangsläufig miteinander verglichen werden können.
Durch Zugabe von Zyanid wird ein Teil der SOD-Aktivität gehemmt. In ausreichender Konzentration zugeführtes Zyanid vermag nur das Kupfer-Zink-Isoenzym zu blockieren, während die Mangan enthaltende SOD unbeeinflusst bleibt. Da in den Gewebehomogenaten nur ein relativ geringer Anteil des Proteingehalts auf die SOD entfällt und auch andere Proteine durch Bindung die Konzentration freier CN-Moleküle im Test verringern, ist es von Bedeutung die notwendige Menge CN auszutitrieren, die eine selektive Hemmung der CuZn-SOD gewährleistet. In Abbildung 8 wird der Zusammenhang zwischen der SOD-Aktivität und der CN-Konzentration dargestellt. Daraus wird ersichtlich, dass im Rattenherzhomogenat erst ab einer Konzentration von ≥1,0 mmol/l im Testansatz eine ausreichende Hemmung der CuZn-SOD erreicht wird. Allerdings ist auch zu erkennen, dass es ab Konzentrationen ≥2,0 mmol/l zu einem weiteren Aktivitätsverlust kommt, der sich durch die Hemmung von im Test-Kit vorhandenen Komponenten, am ehesten der Xanthinoxidase, erklären lässt. Diese Vermutung ließ sich durch das Verhalten des Leerwertes bei Zugabe steigender CN-Konzentrationen bestätigen. Abbildung 9 zeigt die Verminderung der Formazan-Farbstoffbildung und damit auch der Sauerstoffradikalgenerierung ab 2,0 mmol/l NaCN unter diesen Bedingungen. Folglich wurde zur Bestimmung der Mn-SOD die Hemmung der Farbstoffbildung in Anwesenheit von 1,0 mmol/l NaCN im Testansatz gemessen und die Konzentration analog der Gesamt-SOD berechnet. Durch Subtraktion der Mn-SOD von der Gesamt-SOD lässt sich nachfolgend die CuZn-SOD berechnen. Die Aktivität der SOD und ihrer Isoenzyme wurde zum Vergleich der Ergebnisse ebenfalls auf den Eiweißgehalt bezogen in U/mg Protein angegeben.
Zur Bestimmung der Lipidperoxid-Konzentration in den Herzhomogenaten wurde die von Ohkawa et al. [61] entwickelte Methode genutzt. Wie in Kapitel 2.2.1.3. beschrieben, entsteht bei der Lipidperoxidation Malondialdehyd (MDA). Mit Thiobarbitursäure (TBA) bildet MDA einen roten Polymethinfarbstoff, der fluorimetrisch gemessen werden kann. Unter den Testbedingungen (niedriger pH-Wert, hohe Temperatur) reagieren auch Vorstufen der MDA-Bildung mit TBA. Die Reaktionsprodukte werden demnach als Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS) bezeichnet. Tabelle 7 zeigt die genutzten Chemikalien und ihre Konzentrationen im Test.
Die Leerwerte, Eichreihen und Proben wurde anhand folgendem Pipettierschema in Reagenzgläsern gemischt:
Die Testansätze wurden für 60 min bei 90 °C inkubiert und nachfolgend im Eisbad abgekühlt. Anschließend wurden 200 µl aqua dest und 1000 µl Butanol zugegeben und für 20 min geschüttelt. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 3000 U/min konnte die Messung der Fluoreszenz in der überstehenden organischen Phase bei folgenden Parametern erfolgen:
Die Berechnung der Konzentration an TBARS-Konzentrationen erfolgte nach Subtraktion des Leerwertes anhand der Eichreihe mit Standartkonzentrationen an MDA, gebildet aus 1,1,3,3-Tetraethoxypropan in nmol/mg Protein.
Zur Analyse des Serum-Vitamin E-Gehalts wurde ein in der Labor-Routine gebräuchliches high-performance-liquid-chromatographie-(HPLC)-System der Firma ChromSystems verwandt.
Die Bestimmung der Hsp25- und 72-Konzentration im Ventrikelgewebe und im Papillarmuskel erfolgte nach einer Vorschrift von Lutsch et al. [62].
Probenaufbereitung
Zur Probenaufbereitung wurden 5-10 mg Gewebe mit 100µl Puffer (pH 6,8: 62,5 mM Tris, 2% SDS, 10% Glycerin) inkubiert und anschließend nach Zugabe von weiteren 50µl Puffer homogenisiert. Das Homogenat wurde in Eppendorfröhrchen überführt und 5 min bei 15000 U/min zentrifugiert. Der entstandene klare Überstand wird für die Bestimmung abgenommen. Zunächst erfolgte die Proteinbestimmung mittels Bio-Rad DC Protein Assay in jedem Homo
Elektrophorese
Zum Auftrennen der Proteine wird ein Gradientengel aus 7,5% Acrylamid/0,2% N,N´-Methylen-bis-Acrylamid und 15% Acrylamid/0,6% N,N´-Methylen-bis-Acrylamid hergestellt. Weiterhin ist zur Verbesserung der Banden-Auflösung die Herstellung eines großporigen Sammelgels aus 3% Acrylamid/0,08% N,N´-Methylen-bis-Acrylamid nötig. Als Laufzeitende der Elektrophorese im Puffer (pH 6,8: 25mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 192mM Glycin, 0,1% SDS) wurde das Erreichen der Gelunterkante durch das Bromphenolblau festgelegt.
Western-Blotting
Durch das anschließende Semi-Dry-Elektro-Blotting bei 0.8 mA/cm2 erfolgt ein Überführung der aufgetrennten Proteine auf die Nitrocellulose mittels eines Transferpuffers (pH 8,3: 25mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 150mM Glycin, 10% Methanol). Danach wurde mit einer 5%igen Magermilchlösung in TBS-Puffer (pH 7,3) + 0,05% Tween 20 geblockt (60´), um freie Bindungsstellen auf der Nitrocellulose mit Protein zu besetzen.
Quantitativer Nachweis
Der Antigen-spezifische erste Antikörper bindet an das Hsp-Protein und wird seinerseits durch den spezifischen Enzym-gekoppelten Sekundärantikörper gebunden. Durch das Enzym Alkalische Phosphatase wird nachfolgend ein Colorsubstrat unter Farbstoffbildung umgesetzt, was die Banden anfärbt und eine quantitative densitometrische Auswertung der Produktmenge ermöglicht. Nachfolgend die benutzten Antikörper im Einzelnen:
Aufgrund der Blotting-Technik mit unterschiedlichen Fixierungszeiten werden anstelle der absoluten Konzentrationen die Hsp-Konzentrationen in Prozent angegeben. Dafür wurden in jedem Blot die Kontrollen und Experiment-Tiere in gleicher Anzahl kombiniert. Die Konzentration der TGR wurde bezogen auf die Konzentration der WT im jeweiligen Blot angegeben, deren Mittelwert als 100% angenommen wird.
Die Analyse des Proteingehaltes erfolgte nach Lowry et al. [63].
Nach gründlicher Mischung und 10minütiger Inkubation, der im nachfolgendem Pipettierschema zusammengefassten Reagenzien, mussten ebenso wie der Eichreihe mit humanem Serumalbumin (0,39 mg/ml) noch 150µl Folin-Lösung hinzugefügt und erneut für 60 min inkubiert werden. Die Messung der Extinktion erfolgte dann am UV-VIS Scanning Spektrophotometer bei 750 nm. Der Nullabgleich erfolgte gegen den Leerwert.
AG Prof. Dr. Scholz; Institut für Physiologie der Medizinischen Fakultät der HU-Berlin
Um Aussagen zur funktionellen Leistung des Myokards unter Hypoxie/Reoxygenierungsstress machen zu können, wurden - wie in Kapitel 2.2.5. - beschrieben, isometrischen Kontraktionen der Papillarmuskeln im Gewebe-Bad ausgelöst. Diese Blutersatzlösung war folgendermaßen zusammengesetzt (Angaben in mmol/l): NaCl 140,0; KCl 5,0; CaCl2 0,75; MgCl2 1,1; Tris/HCl 10,0; D-Glukose 11,1; pH 7,4. Zur Simulation der Hypoxie wurde das Gewebebad mit Stickstoff und im Fall der Reoxygenierung mit Sauerstoff durchströmt.
Die Verwaltung und Auswertung der erhobenen Daten erfolgte unter Nutzung des Computerprogramms Excel 97. Zur statistische Auswertung wurde die Software SPSS unter Anwendung des t-Tests für abhängige und unabhängige Stichproben genutzt. Für die Mehrfachvergleiche 0,3,6,9 Wo nach MI wurde der ANOVA-Test durchgeführt ebenfalls unter Nutzung des Computerprogramm SPSS.
Alle angeführten und dargestellten Daten sind als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM = Standard error of mean) angegeben.
Zur Beurteilung des Hypertrophiegrades wurden die Körper- und Ventrikelgewichte der Tiere bestimmt und die Hypertrophieindizes berechnet. Das Körpergewicht (KG) der TGR war verglichen mit der Kontrollgruppe um 14% (188,29±9,15 vs. 219,21±10,88 g) niedriger (Abbildung 10), das Gesamt-Ventrikelgewicht (VG) um 16% (0,88±0,03 vs. 0,76±0,04 g) größer (Abbildung 11).
Abbildung 12 zeigt, dass die Erhöhung des VG bei den TGR aus der Zunahme des linksventrikulären Gewichts (LVG) resultiert (0,72±0,02 vs. 0,60±0,03 g). Hinsichtlich der Gewichte des rechten Ventrikels (RVG) wurden keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen gefunden (0,16±0,01 vs. 0,16±0,01 g).
Abbildung 13 stellt die Hypertrophieindizes zusammen. Das relative, auf das Körpergewicht bezogene Ventrikelgewicht (VG/KG x 1000) war bei den TGR vs. WT um 37% erhöht (4,74±0,18 vs. 3,47±0,06). Der Quotient LVG/KG x 1000 war ebenfalls höher als in der Kontrollgruppe (3,88±0,15 vs. 2,73±0,06). Beim Quotient RVG/KG x 1000 fand sich kein signifikanter Unterschied zwischen Experiment- und Kontrollgruppe (0,86±0,04 vs. 0,74 ±0,03).
In beiden Herzkammern der TGR lag der Mittelwert der Gesamt-CK-Aktivität verglichen mit der Kontrollgruppe niedriger; im linken Ventrikel: 14,27±0,72 vs. 16,23±053 U/g Protein, im rechten: 15,37±0,69 vs. 16,48±0,61 U/g Protein. Signifikant war der Unterschied nur im linken Ventrikel (Abbildung 14). Nach elektrophoretischer Auftrennung der Creatinkinase in ihre Isoenzyme konnten folgende Beobachtungen gemacht werden: Im linken Ventrikel der TGR verglichen mit den Kontrollherzen wurde eine signifikanten Erhöhung der CK-MB (16,54±0,61 vs. 14,03±0,51%) und CK-BB (1,50±0,11 vs. 1,16±0,09%) und ein Verlust der CK-MM (56,78±0,76 vs. 59,22±0,72%) festgestellt (Abbildung 15). Im rechten Ventrikel waren keine derartigen Unterschiede zu verzeichnen (Abbildung 16). In der TGR-Gruppe wurde eine Differenz zwischen den Isoenzymmustern des linken und rechten Ventrikel festgestellt (Abbildung 17). Die CK-MB war bei den TGR im linken Ventrikel vs. rechten signifikant erhöht (16,54±0,61 vs. 14,39±0,59%). Der Anteil der CK-MM war im linken Ventrikel vermindert (56,78±0,76 vs. 59,75±0,64%). Bei der CK-Mi und der CK-BB und bei den Mustern der Kontrollgruppe traten keine Veränderungen auf.
Wie Abbildung 18 zeigt, war die GSH-Px-Aktivität im linken und im rechten Ventrikel, sowie auch im Papillarmuskel der TGR signifikant höher als bei den WT. In der linken Kammer war sie um 14,5% ( 404,96±17,32 vs. 353,73±10,58 U/g Protein), in der rechten um 22% (413,42±15,41 vs. 337,79±10,82 U/g Protein) erhöht. Es bestand in keiner Gruppe ein signifikanter Unterschied zwischen linkem und rechten Ventrikel. In den Papillarmuskeln der TGR war die GSH-Px-Aktivität um 50,5% höher als im Papillarmuskeln der Kontrollen (291,94±32,04 vs. 193,99±8,08 U/g Protein). Die Mittelwerte der Gesamt-SOD-Aktivität war bei den TGR vs. WT in beiden Ventrikeln geringgradig vermindert, allerdings ohne statistische Signifikanz (Abbildung 19).
Auch bei der Mn-SOD-Aktivität konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen festgestellt werden.
Der Gehalt an Vitamin E im Serum der transgenen Ratten war verglichen mit der Kontrollgruppe signifikant erniedrigt, (17,94±0,67 vs. 19,70±0,43 µmol/l) (Abbildung 21).
Abbildung 22 zeigt die Konzentration der Lipidperoxidationsprodukte in den Herzhomogenaten. In beiden Ventrikeln der TGR zeigte sich eine signifikante Erhöhung der TBARS im Vergleich zur Kontrollgruppe; im linken um 56% (3,61±0,42 vs. 2,31±0,20 nmol/mg Protein) und im rechten um 44,5% (2,89±0,29 vs. 2,00±0,14 nmol/mg Protein). Außerdem wurde ein signifikanter Unterschied zwischen linkem und rechtem Ventrikel der TGR gefunden. Die Konzentration der TBARS im linken Ventrikel war um 25% höher als im rechten (3,61±0,42 vs. 2,89±0,29 nmol/mg Protein). Dieser Unterschied wurde bei der Kontrollgruppe nicht beobachtet (2,31±0,20 vs. 2,00+0,14 nmol/mg Protein)
In Abbildung 23 und Abbildung 24 sind die Hsp25- und 72-Konzentrationen im linken und rechten Ventrikel sowie im Papillarmuskel von TGR- und WT-Tieren gegenübergestellt. Dabei zeigte sich im linken Ventrikel von TGR verglichen mit den WT eine um 37,1±10,5% höhere Hsp25-Konzentration. Im rechten Ventrikel zeigte sich keine statistisch belegbare Differenz. Im Papillarmuskel der TGR war das Hsp25 um 98,44±31,9% höher als bei den Kontrollen. Für das Hsp72 konnten weder im linken noch im rechten Ventrikel signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen gefunden werden. Auch im Papillarmuskel unterschied sich die Hsp72-Konzentration zwischen TGR und WT nicht.
In den Abbildungen 25, 26 und 27 sind die funktionellen Parameter zur Charakterisierung der Herzleistung in Gestalt der Peak force (PF), der maximalen Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit zusammengestellt. Unter aeroben Bedingungen, vor Beginn der Hypoxie (0 Minuten) war die PF, die maximale Kontraktionsgeschwindigkeit und die maximale Relaxationsgeschwindigkeit der isometrischen Kontraktion in beiden Gruppen vergleichbar. Mit Einsetzen der Hypoxie kommt es in beiden Gruppen zur Verminderung der PF, allerdings stärker bei den WT als bei den TGR, was in einer signifikanten Differenz nach 5 (0,919±0,044 vs. 0,809±0,021) und 10 Minuten (0,468±0,056 vs. 0,302±0,013) resultiert. Nach 15 Minuten
Die maximalen Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeiten nahmen in beiden Gruppen während der hypoxischen Phase erwartungsgemäß ab. Dabei fiel die Abnahme bei den TGR zunächst geringer aus (nach 10 Minuten dF/dtmax: 0,584±0,078 vs. 0,372±0,020; dF/dtmin: 0,555±0,079 vs. 0,393±0,037), glich sich aber zum Ende der 15minütigen Hypoxiephase wieder den Kontrollen an (Abbildung 26 und 27).
Während der Reoxygenierungsphase zeigte sich, ähnlich der PF, eine schnellere Erholung der dF/dtmax und der dF/dtmin in der TGR-Gruppe. So ergab sich bei der maximalen Kontraktionsgeschwindigkeit nach 60 Minuten eine signifikante Differenz zwischen den, zum Ausgangslevel zurückkehrenden TGR (1,104±0,135) und der nur 69%igen Erholung bei den WT (0,686±0,073) (Abbildung 26) Auch bei der maximalen Relaxationsgeschwindigkeit verläuft die Erholung bei den TGR schneller und vollständig im Vergleich zu den Kontrollen. Hier treten schon nach 45 Minuten signifikante Unterschiede zwischen TGR und WT auf (0,887±0,113 vs. 0,536±0,077). Am Ende der 60minütigen Reoxygenierungszeit liegen die TGR über dem aeroben Ausgangswert (1,126±0,136), wohingegen die WT nur 64% erreichen (0,642±0,083) (Abbildung 27).
Zur Auswertung der gewonnen Daten erwies es sich als günstig in eine akute und postakute Phase nach Myokardinfarkt (MI) zu unterteilen. In der akuten Myokardinfarktphase wurden Tiere mit MI und scheinoperierte Tiere 1.) 14-16 h nach Ligatur-Infarkt verglichen und 2.) die Situation nach 14-16 h in Relation zum Zustand nach 3 Wochen betrachtet. Als postakute Myokardinfarktphase wird der Zeitraum der 3. bis 9. Woche nach Infarkt angesehen.
Zur Darstellung der Daten wurde die in Abbildung 28 gezeigte Diagramm-Form gewählt: unter dem Graphen sind immer die signifikanten Unterschiede der Kontrollen über die Zeit gekennzeichnet. Oberhalb des Graphen sind die signifikanten Veränderungen in der Infarktgruppe über die entsprechende Zeitspanne dargestellt. Direkt am Messpunkt sind die signifikanten Verschiedenheiten zwischen der Infarkt- und Kontrollgruppe ausgewiesen.
In Tabelle 8 sind die Körpergewichte, die Ventrikelgewichte, und wichtige Hypertrophieindizes zusammengefasst. Zusätzlich ist der Lungengewicht/Körpergewicht-Quotient als Insuffizienzparameter aufgeführt.
Das Körpergewicht (KG) der Infarkt-, als auch der Kontrolltiere stieg kontinuierlich mit zunehmenden Alter der Tiere an, ohne dass sich ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Gruppen abzeichnete.
Das Gesamt-Ventrikelgewicht (VG) zeigte während der akuten Myokardinfarktphase einen gleichartigen Anstieg bei beiden Tiergruppen, ohne das sich die beiden Gruppen signifikant voneinander unterschieden. Im postakuten Verlauf kam es zu einer größeren Zunahme des VG bei den MI-Tieren, woraus ein signifikanter Unterschied zwischen MI- und Sham-Gruppe nach 6 und 9 Wochen resultiert. Dieser Unterschied der Gesamt-Ventrikelgewichte lässt sich in erster Linie auf Änderungen des linksventrikulären Gewichts (LVG) zurückführen. Während das rechtsventrikuläre Gewicht (RVG) nur nach 9 Wochen die Tendenz einer Gewichtszunahme nach MI zeigte, kam es beim linksventrikulären Ventrikelgewicht der MI-Tiere zu einem Anstieg in der postakuten Phase mit der Konsequenz signifikant verschiedener Werte nach 6 und 9 Wochen.
Beim Vergleich der Hypertrophiegrade (VG/KG, LVG/KG, RVG/KG) ergibt sich der signifikante Unterschied im Herzgewicht/Körpergewicht-Quotienten zwischen MI-Tieren und scheinoperierten Kontrollen, nach 6 und 9 Wochen ebenfalls aus den Veränderungen des linken Ventrikels, da nur LVG/KG bei den MI-Tieren signifikant größer war.
Bei der Untersuchung des Lungengewicht/Körpergewicht-Quotienten (LG/KG), der als Marker für die mit Lungenstauung einhergehende kardiale Insuffizienz gilt, ließ sich zu keinem Zeitpunkt ein signifikanter Unterschied zwischen Infarkt- und scheinoperierten Tieren nachweisen.
In der akuten Myokardinfarktphase wurde keine Beeinflussung des myokardialen CK-Systems beobachtet. Nach 3 Wochen (p<0,1) und nach 9 Wochen (p<0,01) wurden im linken Ventrikel der MI-Tiere niedrigere Gesamt-CK-Aktivitäten beobachtet. Nach 6 Wochen war der Unterschied zwischen MI- und Kontrolltieren statistisch nicht zu sichern, obwohl auch zu diesem Zeitpunkt der Mittelwert der MI-Tiere unter dem der Kontrollen lag. Ein derartiger Unterschied wurde für den rechten Ventrikel nicht gefunden. (Abbildung 29)
Auffällig war, dass im rechten Ventrikel beider Versuchsgruppen die Gesamt-CK-Aktivität bis zur 6. Woche anstieg, ohne dass ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen zu den einzelnen Zeitpunkten vorlag. Dabei war in der Infarktgruppe, im Gegensatz zu den Kontrollen die Gesamt-CK-Aktivität auch nach 9 Wochen noch signifikant höher als zum Zeitpunkt 0 Wochen (Abbildung 30).
Bei den CK-Isoenzymen unterschieden sich die CK-Mi- und CK-MM-Anteile sowohl in der Akutphase, als auch in der postakuten Phase (3.-9. Woche) in beiden Ventrikeln der MI-Tiere verglichen mit den Sham-Tieren nicht voneinander. Ab der 3. postoperativen Woche nehmen bei den Sham-Tieren die CK-Mi-Fraktionen sowohl im linken als auch im rechten Ventrikel der Kontrolltiere kontinuierlich ab (Abbildung 31 und 32), wohingegen in diesem Zeitraum die CK-MM-Anteile steigen (Abbildung 33 und 34). Daraus resultierten nach 9 Wochen - verglichen mit dem 3-Wochen-Wert - signifikant niedrigere CK-Mi bzw. höhere CK-MM-Werte. Mit Ausnahme der CK-Mi im rechten Ventrikel konnten diese Beobachtungen auch bei den Infarkt-Tiere gemacht werden.
Die Abbildungen 35 bis 38 zeigen den Verlauf der CK-MB- und CK-BB-Aktivitäten. Erste Veränderungen im CK-Isoenzymmuster, die sich in einer signifikanten Verschiebung des myokardialen Isoenzymmusters zu höheren CK-MB und CK-BB-Anteilen zeigten, wurden erst ab 3 Wochen nach OP sichtbar und beschränkten sich auf den linken Ventrikel. Dort wurde die höchste CK-MB-Aktivität in der 3. Post-Infarkt-Woche gemessen und lag damit deutlich über dem Wert der Kontrollen. Aber auch nach 6 (p < 0,1) und 9 Wochen (p < 0,05) waren in der Infarktgruppe höhere CK-MB-Werte nachweisbar (Abbildung 35). Die CK-BB-Aktivität erreichte im linken Ventrikel ebenfalls ihren höchsten Wert 3 Wochen nach Infarkt und lag 6
In der Akutphase nach MI lag die Aktivität der GSH-Px im linken Ventrikel signifikant (p < 0,01) und im rechten Ventrikel mit Borderline-Signifikanz (p < 0,1) über der der scheinoperierten Tiere. Die gesteigerte GSH-Px-Aktivität war auch 3 Wochen nach Infarkt im Vergleich zu den Kontrollen vorhanden (Abbildung 39 und 40).
Postakut kam es im linken Ventrikel der Infarkt-Tiere bis zur 6. Woche nach MI zu einem weiteren kontinuierlichen Anstieg der GSH-Px-Aktivität; danach bleibt das hohe Niveau bis zur 9 Woche erhalten. Die scheinoperierten Tiere wiesen bis zur 6. bzw. 9. Woche einen vergleichbaren zeitabhängigen Verlauf auf ohne jedoch die Aktivitätszunahmen in den infarzierten Tieren zu erreichen, so dass nach 6 und 9 Wochen die MI-Tiere - im Vergleich zu den scheinoperierte Tieren - durch signifikant höhere GSH-Px-Aktivitäten im linken Ventrikel gekennzeichnet sind (Abbildung 39).
Im rechten Ventrikel lag die GSH-Px-Aktivität 3 Wochen nach MI noch mit Borderline-Signifikanz (p < 0,1) über der Aktivität der Kontrollen. 6 und 9 Wochen nach OP sind im rechten Ventrikel keine Unterschiede mehr zwischen den myokardialen GSH-Px-Leveln von MI- und Sham-Gruppe nachweisbar (Abbildung 40).
In der Akutphase liegt die SOD-Aktivität im linken (p<0.1) und im rechten (p<0.01) Ventrikel der infarzierten Tiere jeweils über denen der scheinoperierten Tiere. Nachfolgend verminderte sich die SOD-Aktivität wieder, so dass 3 Wochen nach MI keine Aktivitätsunterschiede zu den scheinoperierten Tieren existieren (Abbildung 41 und 42).
In der postakuten Phase ließen sich für den rechten Ventrikel sowohl der MI-Tiere als auch der Kontrollen keine signifikanten Gesamt-SOD-Aktivitätsänderungen in Abhängigkeit von der Versuchsdauer nachweisen (Abbildung 42).
Wie die Abbildungen 43 und 44 zeigen, scheinen die Aktivitätsänderungen der CuZn-SOD für den zeitabhängigen Verlauf der Gesamt-SOD-Aktivität verantwortlich zu sein. Es kommt ausgehend von den, ähnlich der Gesamt-SOD erhöhten Werten in der MI-Gruppe (mit Borderline-Signifikanz im rechten Ventrikel verglichen mit den Kontrollen) zu einem Abfall der Aktivität nach 3 Wochen und einem neuerlichen Anstieg nach 6 Wochen, signifikant dabei nur im linken Ventrikel.
Bei den Mn-SOD-Aktivität wurden weder gruppen- noch zeitabhängige Unterschiede beobachtet.
Während der akuten Myokardinfarktphase (14-16 h nach Ligatur) wurden sowohl im linken als auch rechten Ventrikel der infarzierten Tiere, im Vergleich zu den scheinoperierten Tieren, keine erhöhten TBARS-Konzentrationen gefunden (Abbildung 45 und 46). Auch beim Vergleich zur Situation nach 3 Wochen ergaben sich keine signifikanten Unterschiede.
Im Verlauf der Post-Infarktphase ließen sich bei den MI-Tieren im linken Ventrikel keine signifikanten Veränderungen in der TBARS-Konzentration nachweisen, wohingegen die
In den rechten Ventrikeln von Infarkt- und scheinoperierten Tieren wurde zu keinem Zeitpunkt nach MI eine signifikant verschiedene Hsp25- und 72-Konzentration beobachtet Dagegen zeigen die Abbildungen 47 und 48 für den linken Ventrikel in der akuten Infarktphase (14-16h nach MI) in der Tendenz (p < 0.1) höhere Hsp25 und 72-Konzentration in den MI-Tieren verglichen mit den scheinoperierten Kontrollen. Nach 3 Wochen sind vergleichbare Unterschied zwischen Infarkt- und scheinoperierten Tieren in den linken Ventrikeln nicht mehr zu beobachten. Daraus ergab sich ein signifikanter Abfall (p < 0.05) von Hsp25 und 72 in der Infarkt-Gruppe zur 3. Woche hin.
Postakut steigen ab der 3. Woche die Hsp25- und Hsp72-Konzentrationen in den linken Ventrikeln der infarzierten Tiere im Vergleich zu den Kontrollen an, so dass für Hsp25 zwischen der 3. und 9. Woche und für Hsp72 zwischen der 3 und 6 bzw. 9 Woche eine signifikante Konzentrationszunahme statistisch gesichert werden konnte.
In den Abbildungen 49 und 50 sind die Hsp-Konzentrationen im Papillarmuskel dargestellt. Es zeigte sich für die MI-Tiere prinzipiell ein dem linken Ventrikel vergleichbares, für die Akutphase jedoch deutlicher ausgeprägtes Verhalten von Hsp25 und 72. Bereits 14-16 h nach MI sind Hsp25 und 72, verglichen mit den scheinoperierten Tieren, im Papillarmuskel signifikant erhöht. Hsp25 vermindert sich anschließend (p < 0,01), so dass sich MI- und scheinoperierte Tiere 3 Wochen nach OP nicht mehr unterschieden. Mit Borderline-Signifikanz (p < 0,1) nahm auch die Hsp72 Konzentration im Papillarmuskel in den MI-Tieren zur 3. Woche hin ab. Dennoch existierten nach 3 Wochen noch signifikant höhere Hsp72-Konzentrationen im Papillarmuskel der Infarkt-Tiere verglichen mit den scheinoperierten Kontrollen.
Hsp25 stieg, wie schon für den linken Ventrikel gezeigt, in der Postakutphase wieder an (p < 0.01), so dass im Papillarmuskel der MI-Tiere nach 6 Wochen im Vergleich zu den altersentsprechenden Kontrollen Hsp25 signifikant erhöht war. Aus den Mittelwerten der MI-Tiere 3 und 6 Wochen nach OP kann auch für Hsp72 ein Anstieg vermutet werden, der sich auf Grund der großen Streuung der Hsp72-Konzentrationen nach 6 Wochen jedoch nicht statistisch sicher ließ. Im Vergleich zu den altersgerechten Kontrollen wiesen die Infarkt-Tiere 6 Wochen nach MI signifikant höhere Hsp72-Konzentrationen auf. Nach 9 Wochen waren für beide Stressproteine keine Unterschiede zu den scheinoperierten Kontrollen mehr nachweisbar. Dieser Befund gemeinsam mit dem Vergleich der Mittelwerte der MI-Tiere 6 und 9 Wochen nach Operation lässt auf einen Abfall der Hsp-Konzentrationen zwischen der 6. und 9. Woche schließen.
Die maximale Kraftamplitude PF (Abbildung 51) fiel bei Einsetzen der Hypoxie in allen Gruppen vergleichbar schnell ab und erreichte nach 20 min Hypoxiedauer ca. 10% des normoxischen Kontrollwertes wobei keine signifikanten Unterschiede zwischen der MI- und Sham-Gruppe auftraten. Während der nachfolgenden Reoxygenierung fand in allen Gruppen ein vergleichbarer kontinuierlicher Wiederanstieg der PF statt. Es kam nicht zu signifikanten Unterschieden zwischen MI- und Sham-Tieren. In der Akutphase nach OP (14-16h) wurden in beiden Gruppen am Ende der Reoxygenierung lediglich etwa 40-50% des normoxischen Kontrollwertes erreicht, während es zu den späteren Zeitpunkten 60-80% waren. Die auf die PF normierte maximale Kontraktionsgeschwindigkeit ((dF/dtmax)/PF) (Abbildung 52) nahm während der Hypoxiephase zu, was bedeutet, dass PF stärker abnahm als die zugehörige Kontraktionsgeschwindigkeit. In der Phase der Reoxygenierung war in allen Gruppen nach einem schneller Abfall von (dF/dtmax)/PF ein langsamer Wiederanstieg zu beobachten, der bedeutet, dass einen Zunahme der Kontraktionsrate vorlag, die die Zunahme der PF überstieg. Lediglich am ersten Tag nach MI war die Kontraktion deutlich weniger verlangsamt. Hier blieb die Kontraktion dann auch in der zweiten Phase des Wiederanstiegs der (dF/dtmax)/PF signifikant schneller im Vergleich zu den scheinoperierten Kontrollen. Zu den späteren Zeitpunkten nach MI war der Verlauf in beiden Gruppen ähnlich. Die Abnahme der (dF/dtmin)/PF (Abbildung 53) in Hypoxie kommt durch eine die Abnahme der PF übertreffende Abnahme der Relaxationsrate zustande. Dies war bei den scheinoperierten Tieren immer der Fall, bei den MI-Tieren deutlich nur in der Akutphase (14-16h) nach Infarkt. Nach 9 Wochen war die (dF/dtmin)/PF bei den Infarkt-Tieren am Ende der Hypoxie signifikant größer als bei den Sham, was für die Entwicklung einer Resistenz gegenüber hypoxischen Einflüssen spricht. Die Reoxygenierung löste in allen Gruppen eine stark verlangsamte Relaxation aus, von der aus eine langsame Erholung stattfand. Der deutliche Anstieg der (dF/dtmin)/PF während der Reoxygenierung entsteht durch einen die Zunahme der PF übertreffende Zunahme der Relaxationsrate. Die akut nach Infarkt entnommenen Papillarmuskeln erholten sich deutlich früher als die der entsprechenden Kontrollen und relaxierten bis zum Ende der Reoxygenierung signifikant schneller. Insgesamt konnte im folgenden Zeitverlauf (3, 6, 9 Wochen) bei den MI-Tieren eine stetige Annäherung an die vollständige Wiederherstellung (1,0) beobachtet werden. Dadurch entwickelte sich ein zunehmender Unterschied zwischen MI-Tieren und Sham (signifikant nach 6 und 9 Wochen).
Ein zentrales Ereignis im Rahmen der Herzinsuffizienzgenese ist die Aktivierung von Kompensationsmechanismen, die - allerdings zeitlich begrenzt - eine Steigerung bzw. Stabilisierung der Herzleistung ermöglichen. Auf zellulärer Ebene werden dabei strukturelle und funktionelle Umbauprozesse im Myokard beobachtet, die - makroskopisch als Herzhypertrophie sichtbar - unter Myokardremodeling zusammengefasst werden. Bisher vorliegende tierexperimentelle Untersuchen lassen vermuten, dass zum Myokardremodeling auch Veränderungen im enzymatischen antioxidativen Potential sowie im Hsp-System gehören. Dadurch sollte der Schutz des Herzens gegenüber der für die Herzinsuffizienz als typisch ausgewiesenen zunehmenden Sauerstoffradikal-induzierten Schädigung ermöglicht werden.
Im Rahmen dieser Arbeit, werden die in zwei Rattenmodellen:
der Hypertonie-induzierte Herzinsuffizienz und
der Myokardinfarkt-induzierten Herzinsuffizienz,
beobachteten Veränderungen im antioxidativen System und im Hsp-System beschrieben, deren funktionelle Bedeutung dargestellt sowie die Assoziation zum Myokardremodeling, das parallel durch Hypertrophieparameter und Veränderungen im CK-Isoenzym-System charakterisiert wurde, diskutiert.
Vor Eintritt der manifesten Herzinsuffizienz gilt Hypertrophie als Kompensationsmechanismus, dessen Aktivierung zu einem wesentlichen Teil auf die autokrin/parakrine Wirkung des Renin-Angiotensin-Systems zurückzuführen ist. Es ist mehrfach nachgewiesen worden, dass AngII direkt zur Hypertrophie von Kardiomyozyten führt [64,65]. Neuere Forschung in dieser Richtung ergaben, dass radikalische Sauerstoffverbindungen eine entscheidende Rolle bei der Gen-Induktion und nachfolgender Zell-Proliferation spielen [66]. Das zeigen auch die schon im Kapitel 2.1.1.beschriebenen Studien zur Ang II-induzierten Hypertrophie von Nakamura et al. [11]. Basierend auf diesen Versuchsergebnissen wird eine enge Assoziation von Hypertrophieentwicklung, Sauerstoffradikalbildungen und Induktion entsprechender Schutzsysteme (antioxidative Enzyme, Hsp) vermutet. Durch makroskopische (Hypertrophiemarker) und zelluläre (CK-Isoenzymmuster) Beschreibung des Remodelingprozesses parallel zur Charak
Bei den TGR kam es, erkennbar an der Zunahme des Herzgewichtes im Vergleich mit der Kontrollgruppe zur Herzhypertrophie. Die nachgewiesene direkt wachstumsinduzierende Wirkung von AngII über den AT2-Rezeptor könnte dafür verantwortlich sein [64]. Die Hypertrophie betraf jedoch isoliert den linken Ventrikel, wie durch die Hypertrophiemarker LV/KG und RV/KG ausgewiesen wurde. Bei spontan hypertensiven Ratten (SHR) wurde ebenfalls eine linksventrikuläre Hypertrophie gefunden, deren RAS-Abhängigkeit sich durch Reduktion der linksventrikulären Masse nach ACE-Hemmung belegen ließ [67,68]. Das bestätigten auch Untersuchungen, die zeigten, dass eine signifikante Regression der Hypertonus-induzierten Hypertrophie nur durch Blutdrucknormalisierung mit ACE-Hemmern, nicht aber mit Sympatholytika oder Vasodilatatoren erreicht wurde [69]. Warum, wie in unseren Untersuchungen gezeigt, der rechte Ventrikel nicht oder zumindest weniger auf die RAS-Aktivierung mit Hypertrophie reagiert, ist gegenwärtig unbekannt. Eine mögliche Erklärung wäre der isoliert im linken Ventrikel alternder Ratten gefundene höhere mRNA-Gehalt von Angitensinogen und Angiotensin-Converting-Enzym [70], der demzufolge vor allem dort und weniger im rechten Ventrikel die Hypertrophie begünstigt.
Die Gesamt-CK Erniedrigung im linken, nicht aber im rechten Ventrikel der TGR weist auf die stärkere Schädigung des linken Ventrikels hin. Derartige, durch CK-Abfall demonstrierte, unterschiedliche Schädigungsmuster im linken und rechten Ventrikel sind auch in anderen Insuffizienzmodellen beobachtet worden. Laser et al. [71] zeigten in der chronischen Phase nach Myokardinfarkt eine Gesamt-CK Erniedrigung im intakten linken Ventrikel und Septum, nicht jedoch in anderen Herzbereichen. Auch im 2. Tiermodell dieser Arbeit fanden wir 9 Wochen nach MI eine Gesamt-CK Erniedrigung isoliert im linken Ventrikel.
Im Kontrast zu den Hypertrophie-assoziierten und damit auf den linken Ventrikel begrenzten
Für die Isoenzyme der SOD konnten signifikante Unterschiede weder zwischen den TGR und den normotensiven Kontrollen noch zwischen rechtem und linken Ventrikel nachgewiesen werden. Allerdings lagen die Mittelwerte bei den TGR sowohl im rechten als auch linken Ventrikel jeweils unter denen der Kontrollen. Dies scheint im Kontrast zu den Ergebnissen anderer Studien zu stehen. So zeigten sich im kompensatorisch hypertrophierten Ratten-Myokard nach Herzinfarkt [41] und bei kardialer Hypertrophie aufgrund exzessiven Trainings [77] SOD-Steigerungen. Andererseits berichteten Tokoro [78] und Ito [79] bei der nach der Ursache am ehesten vergleichbaren kardialen Hypertrophie bei spontan hypertensiven Ratten (SHR) von einer Verminderung des SOD Gehalts. Diese heterogenen SOD-Veränderungen in den verschiedenen Herzinsuffizienzmodellen, die von adaptiver SOD-Zunahme über anschei
Hinsichtlich des Hsp72 wurde keine höhere Konzentration bei TGR im Vergleich zu WT beobachtet. Dies steht in Einklang mit den Untersuchungen von Comini et al. [81], die bei Herzinsuffizienz im Rattenmodell feststellten, dass im kompensierten Stadium der Herzinsuffizienz (reine Hypertrophie) das Myokard nicht durch erhöhte Hsp72-Konzentrationen gekennzeichnet ist, es bei manifester Herzinsuffizienz jedoch zu gesteigerter Hsp72-Expression kommt. Sie sehen in der Zunahme der Hsp72-Expression im Stadium der dekompensierten Herzinsuffizienz einen intrazellulären Adaptationsmechanismus zum Schutz beispielsweise
Im Gegensatz zu Hsp72 fanden wir bei den TGR eine gesteigerte Hsp25-Konzentration im linken Ventrikel und im Papillarmuskel, nicht jedoch im rechten Ventrikel. Dies könnte auf eine Assoziation mit der Hypertrophie hinweisen. Hsp25 ist in den I-Banden zusammen mit dem Aktin lokalisiert und könnte aufgrund seiner Chapronwirkung die Myofilamente schützen, was seine gesteigerte Expression bei Hypertrophie erklären würde. Hsp25 verhindert dabei vermutlich die Aktin-Polymerisation bei der Einwirkung unterschiedlicher Noxen [83]. Nach einem Konzept von Dillmann [84] hat das Hsp25 einen protektiven Effekt gegenüber Hypoxie/Ischämie. Wie bereits diskutiert, kann die beobachtete Verschiebung des CK-Musters im linken Ventrikel als Zeichen für partielle Hypoxie/Ischämie angesehen werden, was damit die gesteigerte Hsp25-Expression isoliert im linken Ventrikel begünstigt. Der protektive Effekt der Gruppe der kleinen Hsp konnte nach Überexpression von Hsp25 im Rattenmodell anhand der Schutzwirkung gegenüber ischämischen Zellschäden gesichert werden [85]. Als Ursache für die Schutzwirkung von Hsp25 ist die schon mehrfach angesprochene Wechselwirkung mit dem Aktin der Myofibrillen anzunehmen. Darüber hinaus wurde auch über eine Erhöhung des antioxidativen Potentials durch das Hsp25 berichtet, einerseits durch Erhöhung des Gehaltes an reduziertem Glutathions (GSH), andererseits durch Neutralisation der toxischen Wirkung oxidierter Proteine [86, 87].
Auf welchem Weg die RAS-Aktivierung bei den TGR unabhängig von der Hypertrophieentwicklung zur Induktion von GSH-Px ist bisher nicht bekannt. Da jedoch die TBARS-Konzentration als Marker für das Ausmaß an oxidativem Stress sowohl im linken als auch im nichthypertrophierten rechten Ventrikel gesteigert war, könnte eine direkt mit der RAS-
Dass der Vitamin E-Gehalt im Plasma der TGR erniedrigt war, deutet auf einen vermehrten Verbrauch des Radikalfängers in dieser Gruppe hin. Zum einen könnte der Effekt in der Hypertrophie begründet sein, die mit einer vermehrten Lipidperoxidation einhergeht; zum anderen ist auch die direkte AngII-Wirkung, die über vermehrte Sauerstoffradikalbildung vermittelt wird, als Ursache des vermehrten Tocopherolverbrauchs bei den transgenen Tieren denkbar. Für Letzteres spricht, dass auch im Plasma von SHR niedrigere Vitamin E-Konzentrationen gefunden wurden, die bei Behandlung durch ACE-Hemmung erhöht werden konnten [92]. Von Russo et al. [80] wurde auch im Plasma von Patienten mit essentieller Hypertonie eine verminderte Vitamin E-Konzentration bei erhöhten Lipidperoxidationsprodukten gefunden. Interessanterweise fiel in dieser Studie außerdem eine Zunahme der GSH-Px bei gleichzeitigem Abfall der SOD im Vergleich zu normotensiven Patienten auf. Dies zeigt einerseits, dass oxidativer Stress eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Hypertonie einnimmt (möglicherweise als Signaltransduktion der RAS-Aktivierung) und andererseits, dass Vitamin E und GSH-Px als Antioxidantien bei Hypertonie eine größere Rolle zu spielen scheinen als die SOD.
Um den Einfluss der oben angeführten biochemischen Veränderungen auf die funktionelle Herzleistung zu überprüfen, wurden Untersuchungen zur Kontraktionsfunktion der Papillarmuskeln unter Hypoxie/Reoxygenierungsstress durchgeführt. Um die Messungen der funktionellen Parameter am Papillarmuskel auf die biochemischen Veränderungen im Ventrikelmyokard bezogen diskutieren zu können, wurden zusätzlich die GSH-Px-Aktivität und der Hsp-Status im Papillarmuskel bestimmt. Die gefundenen Veränderungen entsprachen weitestgehend den Ergebnissen des linken Ventrikels. Es zeigten sich unter aeroben Bedingungen zunächst keine Unterschiede zwischen TGR und WT. Unter Hypoxie war die PF in beiden Gruppen erwartungsgemäß stark erniedrigt, da es aufgrund des schnellen Verbrauchs energiereicher Phosphate zur Anhäufung von anorganischem Phosphat kam, mit nachfolgendem Abfall der Sensibilität der Myofilamente auf Ca2+ [93]. Die nachgewiesene Erhöhung der CK-MB- und CK-BB-Konzentrationen bei TGR bewirken eine schnellere Rephosphorylierung von ADP zu ATP, was zur insgesamt besseren Hypoxie-Resistenz beitragen könnte. Bei der nachfolgenden Reoxygenierung erfolgte die Erholung der PF nicht synchron zur pO2-Steigerung. Die Ursache der schnelleren Regeneration bei den transgenen Tieren ist in der geringeren Schädigung oder besseren Erholungsfähigkeit des Sarkoplasmatischen Retikulums (SR) zu suchen, welches als Hauptdeterminante in der Kontraktionsregulation im Rattenmyokard angesehen wird [94]. Da die Schädigung des SR, wie von Rowe et al. [95] bewiesen, in erster Linie auf die vermehrte Formation von Sauerstoffradikalen (z.B. H2O2) und deren Folgeprodukte (Lipidperoxide) zurückzuführen ist, könnten diese als Folge der gesteigerten GSH-Px-Aktivität besser metabolisiert werden, was die Myokardprotektion bei den TGR erklären würde. Auf die Möglichkeit des Hsp25, über Interaktionen mit dem Aktin der Myofibrillen, durch Erhöhung des nichtenzymatischen antioxidativen Potentials (GSH) und durch die Metabolisierung oxidierter Proteine protektiv im Myokard zu wirken [86, 87], wurde bereits hingewiesen. Vermutlich wirken beide Systeme synergistisch bezüglich der insgesamt besseren Hypoxie/Reoxygenierungsresistenz bei den TGR.
Es ist heute allgemein akzeptiert, dass es in der akuten Phase des Myokardinfarktes zur gesteigerten Bildung von Sauerstoffradikalen kommt, deren Reaktionen mit Biomolekülen wesentlich zur strukturellen und funktionellen Myokardschädigung beitragen (siehe Kapitel 2 Theoretische Grundlagen). Als Folge der myokardialen Dysfunktion werden Kompensationsmechanismen aktiviert, deren Ziel die Stabilisierung der Herzleistung ist. Eine entscheidende Bedeutung kommt dabei der Aktivitätssteigerung des neuronal/autokrin-parakrinen Systems und dabei insbesondere des adrenergen Systems und Renin-Angiotensin-Systems zu. Die Aktivierung beider Systeme und die als Folge einsetzende Herzhypertrophie führt jedoch zu weiterer und jetzt chronischer Steigerung der Sauerstoffradikalbildung. Theres et. al. [96] hat Mechanismen, die nach Aktivierung des adrenergen Systems und Renin-Angiotensin-Systems zur Bildung von Sauerstoffradikalen führen können, zusammenfassend dargestellt. Die so gebildeten Sauerstoffradikale spielen - wie bereits in Kapitel 6.1.1. ausgeführt - eine entscheidende Rolle beim Übergang von der kardialen Hypertrophie als kompensierte Phase im Verlauf der Herzinsuffizienzgenese zur dekompensierten manifesten Herzinsuffizienz. Entsprechend dieser Hypothese von Singal und Kirshenbaum [50] besteht in der kompensierten Phase der Herzinsuffizienz trotz Aktivierung Sauerstoffradikal-bildender Mechanismen ein Gleichgewicht zwischen Radikal-Formation und Entgiftung. Die vermehrte Generierung radikalischer Sauerstoffverbindungen wird von Myokard durch eine Steigerung des endogenen enzymatischen antioxidativen Schutzsystems kompensiert. Diese kompensatorische Steigerung des antioxidativen Schutzes im Myokard ist jedoch begrenzt. Zeitabhängig oder als Folge zunehmender Intensität der Herzschädigung entstehen Imbalancen in diesem Gleichgewicht von Radikalbildung und Inaktivierung. Dadurch kommt es zur oxidativen Schädigung und nachfolgend zur Dysfunktion des Myokards mit dem Übergang zur dekompensierten Phase der Herzinsuffizienz. Um die Aktivitätskinetik des enzymatischen antioxidativen Systems und des Hsp-Systems - das als ein weiteres endogenes Protektionssystem im Rahmen der Herzinsuffizienzgenese von Bedeutung sein könnte - verfolgen zu können, wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Myokardinfarkt die Aktivität des enzymatischen antioxidativen Systems, die Lipidperoxidation sowie der Gehalt an Hsp 25 und 72 gemessen und Parametern zur Charakterisierung der Herzhypertrophie und der kontraktilen Herzfunktion gegenübergestellt.
Im Vergleich zu den scheinoperierten Kontrolltieren ließen sich in der akuten Phase nach MI (14-16 h) keine Unterschiede im Körpergewicht, Gesamt-Ventrikelgewicht, links- und rechtsventrikulären Gewicht und Hypertrophieindex nachweisen. Auch Veränderungen in der Gesamt-CK-Aktivität und im Isoenzymmuster waren 14-16 h nach MI im nichtinfarzierten Anteil des linken sowie des rechten Ventrikels nicht nachweisbar. Dies ist nicht überraschend, da CK-Verminderung während des akuten Myokardinfarkt hauptsächlich im infarzierten Gewebe bzw. in der "Borderline Zone" zu erwarten sind [97].
Auch im Hinblick auf die TBARS-Konzentration als Marker für Lipidperoxidation ließen sich keine Unterschiede zwischen nichtinfarziertem Ventrikelgewebe der MI-Tiere und dem Myokard der Kontrollen aufzeigen. Das Auftreten vermehrter Lipidperoxidation in der akuten Phase nach MI wird auch vorrangig im infarzierten Gewebe und in der "Borderline-Zone" beschrieben [98]. Allerdings gibt es auch Untersuchungen, die in der Akutphase nach experimentellem MI gesteigerte Lipidperoxidation im nichtinfarzierten Myokard aufgezeigt haben [99]. Möglicherweise sind unterschiedliche Untersuchungszeitpunkte und Infarktgrößen die Ursachen für derartig unterschiedliche Resultate. Für die antioxidativen Enzyme und die Stressproteine haben wir nach MI im nichtinfarzierten Myokard deutliche Zunahmen gefunden. Während für den Infarktbereich in der Literatur ein Verlust an GSH-Px und SOD ausgewiesen wurde [98], fanden wir 14-16 h nach MI im nichtinfarzierten Teil des linken Ventrikels eine signifikant gesteigerte GSH-Px-Aktivität. Im rechten Ventrikel ist diese GSH-Px-Zunahme als Tendenz sichtbar. Begleitet ist die GSH-Px-Erhöhung von einer Steigerung der Gesamt-SOD-Aktivität, die jedoch im Kontrast zur GSH-Px eher den rechten Ventrikel betraf. Derartige Aktivitätserhöhungen im nichtinfarzierten Myokard in der akuten MI-Phase sind bisher nicht beschrieben worden. Denkbar ist, dass die Zunahme der Aktivität enzymatischer Antioxidantien als Kompensationsmechanismus anzusehen ist, den das überlebende Myokard im Verlauf des akuten MI aktiviert, um sich dadurch vor einer Ausweitung der im Infarktgebiet ablaufenden Sauerstoffradikal-abhängigen Schädigungsreaktionen zu schützen. Die deutlichere GSH-Px-Zunahme im linken Ventrikel im Vergleich zur t-SOD könnte ein weiteres Indiz für die postulierte hervorgehobene Funktion der GSH-Px in der Myokardprotektion un
Mit der Induktion von Hitzeschockproteinen (Hsp) steht dem Herzmuskel ein weiterer endogener Schutzmechanismus zur Verfügung. Auf die Ursachen des protektiven Effektes von Hsp25 wurde schon eingegangen. Auch der protektive Effekt der Hsp72-Induktion auf die kontraktile Myokardfunktion konnte in zahlreichen Studien bewiesen werden, so beispielsweise für die Hitzeschock-induzierte Hsp72-Erhöhung beim Kaninchen [102] oder auch bei Überexpression von Hsp72 in transgenen Mäusen [103]. Die genauen Mechanismen der Protektion durch das Hsp72 sind zum jetzigen Zeitpunkt als spekulativ anzusehen. Sauerstoffradikale und die Ca2+-Überladung des Sarkoplasmatischen Retikulums führen möglicherweise zu einem intrazellulären Milieu, dass zur Schädigung der Tertiärstruktur von Proteinen führt und auf diesem Weg zu funktionellen Veränderungen beiträgt. Hsp72 könnte diese Konformationsänderungen entweder verhindern, und/oder über gezielte Reparatur von geschädigten Proteinen durch die Chapronwirkung oxidative Schäden wieder beheben.
Im Rattenmyokard werden Hitzeschockproteine als Antwort auf kurzzeitige Ischämie aber auch auf permanente Koronarokklusion gebildet. Yu et al. [104] haben gezeigt, dass die Ligatur der linken Koronararterie 4 Stunden nach dem Ereignis ein Maximum an Hsp72 mRNA in der Ischämiezone erzeugte Nur dort konnte nach 4 bis 24 Stunden immunhistochemisch Hsp72 nachgewiesen werden. Die gleichen Autoren haben auch 4 bis 24 h nach Ischämie/Reperfusionsstress eine immunhistochemische Zunahme der Hsp72-Konzentration nachgewiesen. Kilgore et al. [105] konnten dagegen keine derartige akute Hsp72-Induktion zeigen, wohl aber 5-7 Tagen nach MI im nichtinfarzierten septalen Myokard. Weitere Belege für eine
Wir fanden die stärkste Hsp72-Zunahme akut nach MI im Papillarmuskel, im nichtinfarzierten Areal des linken und rechten Ventrikels jedoch nur mäßig gesteigerte bzw. unveränderte Hsp72-Konzentration. Dieses regional unterschiedlichen Expressionsmuster 14 bis 16 Stunden nach MI könnten auf der Grundlage der engen Beziehung zwischen Ischämie und Hsp72-Expression erklärt werden [104]. Wir gehen davon aus, dass eine Minderperfusion bzw. "Borderline-Ischämie" im Papillarmuskel verantwortlich ist für die hohe Hsp72-Konzentration. Obwohl makroskopisch im Papillarmuskel keine Ischämie sichtbar war, ist eine Minderperfusion und damit partielle Ischämie wahrscheinlich, da bei Nutzung des gleichen Infarktmodells [104] die Ursprungsregion der Papillarmuskeln im linken Ventrikel als ischämisch ausgewiesen wurde. In den Gebieten, aus denen die Proben zur Analyse der Verhältnisse im rechten und linken Ventrikel entnommen wurden waren jedoch keine Zeichen für Ischämie beschrieben. Über welchen genauen Mechanismus die Hsp72-Induktion erfolgt ist nur teilweise bekannt. Belegen lässt sich eine Verbindung zwischen Hsp72-Induktion und Proteinkinase A- und C-Aktivierung [107].
Bislang lagen keine Daten zur myokardialen Hsp25-Expression während eines akuten Infarkts vor. Lediglich erhöhte Hsp27-mRNA nach kurzzeitiger Koronarokklusion und Reperfusion am Schweineherzen konnten nachgewiesen werden, jedoch ohne nachfolgende Steigerung des Hsp27-Proteingehalts [108]. Andererseits lösten in der Ratte sowohl akute renale Ischämie als auch lokaler Ischämie im Gehirn die Expression von Hsp25 aus. Wir haben nun parallel zur gesteigerten Hsp72-Expression auch eine Expressionssteigerung für Hsp25 im Papillarmuskel in der akuten Myokardinfarktphase beobachtet. Wie für Hsp72 zuvor beschrieben, war die Hsp25-Expression im nichtinfarzierten linken Ventrikel im Vergleich zum Papillarmuskel geringer. Die im Papillarmuskel initial sehr hohe Hsp25-Konzentrationen lässt sich auch auf die ischämischen Bedingungen in dieser Region zurückführen, da gerade die Lokalisation des Hsp25 in den I-Banden als wesentlich für den protektiven Effekt von Hsp25 im Rahmen ischämische Vorgange im Myokard angesehen wird [47].
Dass die von uns beobachtete myokardiale Zunahme von enzymatischen Antioxidantien und Stressproteinen nach experimentellem MI als eine Selbstprotektion des Myokards angesehen werden kann, konnte durch Hypoxie/Reperfusionsexperimente an den Papillarmuskeln bestätigt werde. Der protektive Effekt betraf vor allem die Reperfusionsphase. Unter Hypoxie zeigten sowohl die MI-Tiere als auch die Kontrollen ein vergleichbares Schädigungsmuster, sichtbar am Abfall der PF und (dF/dtmin)/PF. Als Ursache kann der Abfall der Ca2+-Sensibilität der Myofilamente aufgrund des raschen Abbaus energiereicher Phosphate zu anorganischem Phosphat [93] angesehen werden. Während der Reoxygenierungsphase konnten wir dagegen bei den MI-Tieren eine bessere Wiederherstellung der kontraktilen Funktion als Zeichen geringerer Schädigung durch den Hypoxie/Reoxygenierungszyklus ausmachen. Sichtbar wurde dies anhand höherer (dF/dtmax)/PF und (dF/dtmin)/PF in den MI-Tieren verglichen mit den Kontrollen. Da die Schädigung des Sarkoplasmatischen Retikulums (SR) durch reaktive Sauerstoffspezies als eine entscheidende Determinante für die Einschränkung der kontraktilen Funktion angesehen wird [95], vermuten wir, dass die von uns gefundenen Zunahme von antioxidativen Enzymen und Stressproteinen nach MI einen besseren Schutz des SR gegenüber Schädigung durch Sauerstoffradikal-abhängige Reaktionen ermöglicht. Unterstützt wird diese Hypothese dadurch, dass die verbesserte Wiederherstellung von (dF/dTmin)PF eng an die gesteigerten myokardialen GSH-Px-Aktivitäten und Hsp25-Konzentrationen gebunden ist.
Ein ausgeprägter protektiver Effekt der GSH-Px auf die kardiale Funktion konnte auch schon in anderen Modellen gezeigt werden. So wurde beispielsweise bei Gene-Knockout-Mäusen, die nur zu insuffizienter GSH-Px Produktion fähig waren eine verringerte Ischämie-Reperfusionstoleranz bei vermehrter Zellschädigung dokumentiert [109]. Auch war das Myokard transgener, GSH-Px-überexprämierender Mäuse resistenter gegenüber gleichartigem Stress [110]. Ähnlich der GSH-Px wurde auch für die SOD eine Protektion des Myokards gegenüber Ischämie/Reperfusion demonstriert [111]. Über mögliche Mechanismen zur Myokardprotektion durch Hitzeschockproteine ist schon berichtet worden.
Auch in der 3. Woche nach Infarkt ließen sich keine Unterschiede zu den Kontrollen hinsichtlich Körpergewicht, Herzgewicht, Ventrikelgewicht und Hypertrophieindex nachweisen. Ab der 6. postoperativen Woche konnte in der MI-Gruppe eine isoliert linksventrikuläre Hypertrophie nachgewiesen werden, die damit mit dem Ort der Schädigung identisch ist. Im rechten Ventrikel kam es zu keinen signifikanten Unterschieden zwischen Infarkt-Tieren und Kontrollen. Im Vergleich dazu haben Theres et al. [112] und Wagner et al. [41] 6 Wochen nach MI auch eine rechtsventrikuläre Hypertrophie beschrieben. Darüber hinaus war die linksventrikuläre Hypertrophie in diesen Studien erheblich stärker ausgeprägt als in unserer Untersuchung. So war das linksventrikuläre Gewicht im Verhältnis zum Körpergewicht (LVG/KG) 6 Wochen nach MI bei Theres et al. [96] um 21 % gegenüber den Kontrollen gesteigert, während in unserer Studie die Erhöhung mit 9% deutlich geringer ausfiel. Es wird angenommen, dass der Schweregrad der Hypertrophie eine wichtige Determinante ist, die den Übergang von der kompensierten kardialen Funktion zur funktionellen Dekompensation bestimmt [8]. Unsere Ergebnisse weisen auf eine vergleichsweise milde kardiale Hypertrophie 6 Wochen und auch noch 9 Wochen nach MI hin. Demnach kann davon ausgegangen werden, dass sich die in unserer Studie untersuchten Tiere im Gegensatz zu anderen Studien auch 9 Wochen nach MI noch nicht im Zustand der kardialen Dekompensation befanden. Dies lässt sich auch mit dem Lungengewicht/Körpergewicht-Quotienten belegen, der zu keinem Zeitpunkt signifikant verschiedenen zwischen den Gruppen war. Damit bestand auch 9 Wochen nach MI keine Lungenstauung als Zeichen einer schweren myokardialen Insuffizienz.
Die zeitabhängigen Veränderungen der Creatinkinase-Aktivität in der chronischen Phase nach MI betrafen ausschließlich den durch Hypertrophie geprägten linken Ventrikel. Im rechten hypertrophiefreien Ventrikel wurde kein CK-Verlust beobachtet. Bereits in der 3. Postinfarkt-Woche fanden wir im linken Ventrikel der MI-Tiere eine Tendenz zur CK-Abnahme. Diese Abnahme ist aber erst nach neun Wochen signifikant. Damit weist auch diese Studie - wie wir dies schon anhand der TGR-Studie gezeigt haben - auf eine enge Beziehung von Hypertrophie und CK-Verlust hin. Allerdings war der linke Ventrikel bereits 6 Wochen nach MI hypertrophiert, die CK-Erniedrigung wurde jedoch erst nach 9 Wochen signifikant. Dies könnte darauf hinweisen, dass der CK-Verlust der Hypertrophieentwicklung folgt und den Zeitpunkt in der Herzinsuffizienzentwicklung dokumentiert - und möglicherweise auch kausal mitbe
Hinsichtlich des CK-Isoenzymmusters kam es in unserem Tiermodell ab der 3. Woche nach MI im linken, nicht aber im rechten Ventrikel zum Anstieg von CK-MB und CK-BB, der auch schon in anderen Studien nachgewiesen wurde [14, 15, 16]. Auch bei Wagner et al. [41] und Neubauer et al. [114] fanden sich 6 bzw. 8 Wochen nach MI im linken Ventrikel, vergleichbar mit unseren Ergebnissen nach 6 und 9 Wochen, ein Isoenzym-Shift zu erhöhter CK-MB und CK-BB. Im nichthypertrophierten rechten Ventrikel konnte in unseren Experimenten zu keinem Zeitpunkt eine signifikante Veränderungen des CK-Isoenzymmusters gefunden werden. Damit scheint eine sehr enge Beziehung zwischen Hypertrophie und CK-Isoenzym-Shift in Richtung auf gesteigerte Expression von CK-MB und CK-BB zu existieren. Unserer Studie nach wird dabei der CK-Isoenzym-Shift bereits zu einem Zeitpunkt (3 Wochen nach MI) sichtbar, zu dem die von uns genutzten relativ groben Parameter zur Hypertrophiecharakterisierung noch negativ waren. Da Laser et al. [71] nach MI eine biventrikuläre Hypertrophie fand, überrascht auch der von ihnen beobachtete CK-Isoenzym-Shift in beiden Ventrikeln nicht. Trotz des signifikanten Anstiegs von CK-MB und CK-BB konnten wir in unserem Infarktmodell die im Mittel niedrigeren CK-Mi-Aktivitäten in der Postinfarktphase nicht als signifikanten CK-Mi-Verlust sichern. Möglicherweise ist die im Vergleich zu anderen Studien [71,
115] geringere Zunahme von CK-MB und CK-BB die Ursache. Auch dies könnte ein
Mögliche Ursachen für den Isoenzym-Shifts zu fetalen B-Untereinheiten im hypertrophierten Myokard sind bereits im Abschnitt zum CK-Isoenzym-Shift im TGR-Modell diskutiert worden. Aus der Beobachtung, dass die CK-Erniedrigung und der begleitende CK-Isoenzym-Shift durch ß-Blocker-Gabe zu verhindern ist, wurde oft die Schlussfolgerung gezogen, dass ursächlich für diese CK-Veränderungen in erster Linie adrenerge Reize in Frage kommen. Die globale Wirkung adrenerger Reize würden die in unseren Experimenten beobachteten, lokalen CK-Veränderungen (isoliert im linken Ventrikel) allerdings nicht erklären, es sei denn man geht von einer unterschiedlichen Stimulierbarkeit von rechtem und linkem Ventrikel aus. Dergleichen konnte bei der ischämischer dilatativer Kardiomyopathie des Menschen, mit einer Verminderung der ß-adrenergen Stimulationsfähigkeit des rechten Ventrikels, gefunden werden [116]. Die Hypothese der alleinigen adrenergen Initiation der CK-Veränderungen im hypertrophierten Myokard wurde allerdings 1995 durch Ishikawa et al. [117] dadurch entkräftet, dass sich die Veränderungen im CK-Isoenzymmuster auch durch ACE-Hemmer verhindern ließen. Da sich also nachgewiesenermaßen durch ACE-Hemmung, ß-Blockade oder Kombination beider der CK-Isoenzym-Shift verhindern bzw. minimieren lässt [73, 115], sind sowohl direkte Wirkungen des adrenergen als auch des Renin-Angiotensin-Systems denkbar. Basierend auf den vorstehend diskutierten Ergebnisse, gehen wir davon aus, dass das von uns genutzte Tiermodell sich 6 und 9 Wochen nach MI im Zustand der linksventrikulären Hypertrophie ohne Dekompensation befand. Die CK-Erniedrigung 9 Wochen nach MI könnte als ein erstes Zeichen für eine beginnende Dekompensation gewertet werden.
Die in der Akutphase beobachtete Steigerung der myokardialen GSH-Px-Aktivität blieb im linken Ventrikel über den gesamten Versuchszeitraum bestehen, so dass 3, 6 und 9 Wochen nach MI im Vergleich zu den Kontrollen signifikant höhere Aktivitäten beobachtet wurden. Für den rechten Ventrikel war dies nicht der Fall. Die im Zeitraum von 3-9 Wochen nach MI gesteigerte GSH-Px gehört damit neben der Hypertrophie und dem CK-Remodeling zu den Kompensationsmechanismen des Myokards in der chronischen Phase nach MI. Die 14-16 h nach MI gesteigerte myokardiale SOD-Aktivität wurde 3 und 6 Wochen nach Infarkt nicht mehr beobachtet. 9 Wochen nach MI stellte sich die Gesamt-SOD isoliert im linken Ventrikel der MI-Tiere als signifikant erniedrigt - verglichen mit den Kontrollen - dar. Ähnliche Ergebnisse konnten auch in einer gleichartige angelegten Studie von Hill und Singal [118] im lin
Die inverse Beziehung zwischen GSH-Px-Aktivität und Lipidperoxidation wird auch durch den Altersgang von GSH-Px und TBARS-Bildung im Myokard der scheinoperierten Tiere dokumentiert. Die Aktivitäten der GSH-Px stiegen in beiden Ventrikeln dieser Gruppe zur 6. Woche hin an und blieben danach in etwa auf diesem Niveau. Zeitgleich nahm die myokardiale Lipidperoxidation bei den scheinoperierten Tieren ebenfalls nur bis zur 6. Woche ab und blieb bis zur 9. Woche auf diesem Level.
Da auch 9 Wochen nach MI der Protektionseffekt gegenüber der Lipidperoxidation trotz der niedrigen SOD-Aktivität erhalten blieb, gehen wir davon aus, dass die GSH-Px-Erhöhung - wie bereits in der Studie mit TGR diskutiert - entscheidend für diese Schutzwirkung ist, die SOD hingegen nur untergeordneten Einfluss hat. Es ist aber darauf hinzuweisen, dass entgegen den Befunden an den scheinoperierten Tieren bei den MI-Tieren kein signifikanter Altersgang mit letztlich abnehmender TBARS-Konzentration nachgewiesen werden konnte. Möglicherweise ist dies ein Anhaltspunkt dafür, dass es in der chronischen Postinfarktphase letztlich doch zu einer, wenn auch sehr moderaten, Steigerung der Lipidperoxidation kommt.
Im Kontrast zu den GSH-Px-Daten unserer Studie stehen Untersuchungen die 8 bzw. 16 Wochen nach MI einen Verlust an GSH-Px beschrieben haben [118]. Allerdings lag in diesen Modellen nachgewiesenermaßen zu den Untersuchungszeitpunkten bereits eine manifeste Herzinsuffizienz vor, die nach Dhalla et al. [76] durch Verlust der antioxidativen Kapazität gekennzeichnet ist. Es überrascht deshalb auch nicht, dass in dieser Studie neben der niedrigen GSH-Px-Aktivität ein Anstieg der Lipidperoxidation beschrieben wurde. Damit wird der zunächst gravierende Ergebnis-Kontrast zu unserem Befund erklärbar, da sich in unseren Experimenten das Herz im Stadium der kompensierten Hypertrophie befand, und kein anerkannter Marker der Insuffizienz - zumindest bis zur 6. Woche nach MI - spezifisch verändert war. Mehrfach ist auch gezeigt worden, dass ein SOD-Verlust eintritt obwohl die GSH-Px noch kompensatorisch gesteigert ist [40, 119]. Dies wird mit einer größeren Empfindlichkeit der SOD gegenüber Inhibition erklärt. Es ist zu vermuten, dass der von uns erstmals in der 9. Woche beobachtete SOD-Abfall eben dieser Dynamik folgt. Möglicherweise ist ein SOD-Verlust ein sehr frühes Zeichen für den beginnenden Übergang der kompensierten in die dekompensierte Phase der Herzinsuffizienz. Neben unserer Untersuchung liefert die Literatur weitere Belege für die Hypothese, dass ein signifikanter Abfall der GSH-Px mit einer Anstieg der Lipidperoxidation einhergeht, wohingegen hohe GSH-Px Aktivitäten - wie auch im vorlie
Die von uns vorgelegte Studie unterstützt die Hypothese von Singal und Kirshenbaum [50], nach der die Herzinsuffizienzentwicklung erstens durch eine biphasische Modulation enzymatischer Antioxidantien gekennzeichnet ist (Aktivitätssteigerung gefolgt von Aktivitätsverlust) und zweitens der Übergang von der Hypertrophie zur Insuffizienz mit dem Zeitpunkt korreliert, zu dem nach Ausschöpfung der antioxidativen Reserve der antioxidative Schutz des Myokards nicht mehr ausreicht Lipidperoxidation zu verhindern und dadurch eine Myokardschädigung durch vermehrte Membranschädigungen möglich wird.
Wie auch bei den anderen Parameter beschrieben, wurden bei den Hsp72- und Hsp25-Konzentrationen im nichthypertrophierten rechten Ventrikel keine Unterschiede zwischen scheinoperierten Tieren und Tieren mit MI beobachtet. Entsprechend den Untersuchungen von Delcayre et al. [44] wird Hsp72 nur in Phasen der akuten Stressadaptation vermehrt exprimiert und ist bei stabiler kardialer Funktion häufig nicht nachweisbar. In Übereinstimmung damit sank im nichtinfarzierten Anteil des linken Ventrikels die akut gesteigerte Hsp72-Konzentration bis zur 3. Woche auf das Niveau der scheinoperierten Tiere. Für die im Papillarmuskel in der Akutphase erheblich stärker als im linken Ventrikel gesteigerte Hsp72-Konzentration haben wir ebenfalls im Anschluss an die Akutphase einen Abfall beobachtet. Allerdings lag der Hsp72-Gehalt bei den MI-Tieren auch 3 Wochen und 6 Wochen nach MI noch signifikant über dem der Kontrollen. Erst nach 9 Wochen unterschieden sich MI-Tiere und Kontrollen nicht mehr. Diese im Papillarmuskel auch nach 3 und 6 Wochen noch signifikant erhöhten Werte würden demnach auf das Fortbestehen der Stresssituation im Papillar
Eine Verminderung der Hsp72-Konzentration nach einer MI-induzierten Expressionssteigerung mit dem Erreichen des Bereiches der Kontrollwerte etwa 2 bis 3 Wochen nach MI wurde auch von Kilgore et al. [105] beschrieben. Allerdings erfolgte in dieser Untersuchung die MI-induzierte Hsp72-Erhöhung erst nach 5-7 Tagen im nichtinfarzierten septalen Myokard. Tanonaka et al. [121] fand ebenfalls gesteigerte Hsp72-Konzentration 1 Woche nach MI mit nachfolgendem Abfall bis zur 2. Woche. In dieser Studie ist allerdings die akute Phase nach MI (1. Tag) nicht untersucht worden. In unseren Untersuchungen beobachteten wir im linken Ventrikel 3 Wochen nach MI einen erneuten Anstieg der Hsp72-Konzentration, so dass sie 6 Wochen nach MI wieder signifikant gegenüber den Kontrollen gesteigert war. Bis zur 9. Woche blieb der Mittelwert der Hsp72-Konzentration im linken Ventrikel der MI-Tiere weiterhin über dem der scheinoperierten Kontrollen. Es ist wahrscheinlich, dass hinsichtlich des Hsp72 zwischen akut und chronisch gesteigerter Expression unterschieden werden muß. Während in einer akuten Stresssituation Hsp72 zur Selbstprotektion des Myokard beiträgt, sollte dagegen bei einer Hsp72-Zunahme in der chronischen Phase nach MI - wie in unserem Modell beobachtet - in Betracht gezogen werden, dass langanhaltend gesteigerte Hsp72-Expression, abgeleitet aus der Funktion als Target im Rahmen autoimmunologischer Reaktionen [122], möglicherweise als Promotor in der Herzinsuffizienzgenese fungieren könnte. Die Basis für den erneuten Anstieg von Hsp72 im linken Ventrikel der MI-Tiere könnte der ab der 3. Woche zunehmende CK-Isoenzym-Shift zu den fetalen B-Isoenzymen (CK-MB, -BB) als Zeichen chronisch-ischämischen Stoffwechselbedingungen im Myokard zusammen mit der wachsenden Hypertrophie darstellen.
Das Hsp25 zeigte verglichen mit dem Hsp72 ein nahezu identisches Verhalten. Auch dessen Konzentration vermindert sich von der akuten MI-Phase (14-16 h) zum Zeitpunkt 3 Wochen nach MI sowohl im linken Ventrikel als auch im rechten Ventrikel. Im Gegensatz zum Hsp72 sinkt der Hsp25-Gehalt 3 Wochen nach MI sowohl im linken Ventrikel als auch im Papillarmuskel auf das Niveau der Kontrollen. Auch für das Hsp25 beobachtete wir von der 3. zur 6. Woche einen erneuten Anstieg. Im Gegensatz zum Hsp72 betraf dieser jedoch ausschließlich den Papillarmuskel. Möglicherweise ist zur Hsp25-Expression verglichen mit Hsp72 ein stärkerer Stimulus notwendig, der unter den gegebenen Versuchsbedingungen nur im Papillar
Auch in diesem Tiermodell wurden Untersuchungen zur kontraktilen Funktion der Papillarmuskeln unter Hypoxie/Reoxygenierung durchgeführt, um den Einfluss der beobachteten biochemischen Veränderungen auf die funktionelle Herzleistung zu überprüfen. Insgesamt wirken sich die beschriebenen Veränderungen im hypertrophen Myokard protektiv auf die kontraktile Funktion nach MI aus. Dabei profitieren die Papillarmuskeln hauptsächlich in der Reoxygenierungsphase und dabei insbesondere hinsichtlich ihrer Relaxationsgeschwindigkeit.
Unter Hypoxie kam es in der chronischen Phase nach MI zu allen Untersuchungszeitpunkten (3, 6, 9 Wochen) zu einem vergleichbaren Abfall der PF bei MI-Tieren und Kontrollen. Der Grund dafür ist der schon oben erläuterte Abfall der Ca2+-Sensibilität der Myofilamente aufgrund des raschen Abbaus energiereicher Phosphate zu anorganischem Phosphat [93]. 3 Wochen nach MI unterschieden sich MI-Tiere und Kontrolle auch in der Reoxygenierungsphase hinsichtlich der Kontraktilität nicht. Im Zeitfenster 3. bis 9. Woche beobachteten wir jedoch in den MI-Tiere eine zunehmende Verbesserung der Relaxationsgeschwindigkeit verglichen mit den Kontrollen. Dies wurde am Parameter (dF/dtmin)/PF sichtbar.
Daraus lässt sich ableiten, dass die kontraktile Funktion des Myokards 6 und 9 Wochen nach MI weniger empfindlich ist gegenüber Hypoxie/Reoxygenierung als die der scheinoperierten Kontrollen und auch als die der Tiere 3 Wochen nach MI. Dieser protektive Effekt zeigte sich 9 Wochen nach MI ausgeprägter als 6 Wochen nach MI und war zu diesem Zeitpunkt mit der höchsten GSH-Px-Aktivität vergesellschaftet, während die Hsp-Konzentrationen nicht gesteigert waren. Daher kann als Hauptprotektionsfaktor der kontraktilen Funktion des Myokards in der chronischen Phase nach MI die GSH-Px verantwortlich gemacht werden. Da der protektive Effekt 9 Wochen nach MI trotz der verminderten SOD-Aktivität am stärksten war, ist dies ein erneuter Hinweis auf die bereits mehrfach betonte untergeordnete Bedeutung der SOD für die Myokardprotektion nach MI.
Unsere Untersuchungen zeigen, dass es in der akuten Phase nach MI zu einer parallelen Aktivierung des enzymatischen antioxidativen Systems und des Hsp-Systems im Myokard kommt. Damit können, wie in Kapitel 3 Problemstellung in Hypothese 1 formuliert, beide Systeme bei einer akuten Steigerung von oxidativem Stress im Herz zur Selbstprotektion des Myokards beitragen. Ob auch in der Akutphase, wie nachfolgend für die chronische Phase nach MI ausgewiesen, die GSH-Px das entscheidende myokardiale Protektionssystem ist, können wir gegenwärtig nicht entscheiden.
Dagegen scheint bei chronisch gesteigertem oxidativen Stress (chronische Phase nach MI, chronische Hypertonie) die Myokardprotektion hinsichtlich Hypoxie/Reoxygenierungsstress hauptsächliche Folge der kompensatorischen Steigerung der GSH-Px-Aktivität zu sein. Chronisch gesteigerte Expression von Stressproteinen sollte eher auf der Basis autoimmunologischer Reaktionen im Herz betrachtet werden. Während damit das enzymatische antioxidative System sowohl bei akut als auch bei chronisch gesteigertem oxidativen Stress als Protektionssystem wirksam wird, scheint die Schutzfunktion der Hitzeschockproteine auf Stoffwechselsituationen die durch akut gesteigerten oxidativen Stress gekennzeichnet sind, begrenzt zu sein (Hypothese 2). Unsere Untersuchungen zeigen darüber hinaus im Vergleich zur SOD die herausgehobene Bedeutung der GSH-Px in der Myokardprotektion sowohl bei akut als auch chronisch gesteigertem oxidativen Stress im Herz.
Remodeling stellt einen Umbauprozess des Myokards als Reaktion auf verschiedene Reize dar. Das Remodeling im Verlauf der Herzinsuffizienzgenese ist ein von den auslösenden Faktoren relativ unabhängiger, uniformer Prozess, dessen hervorstechendstes, makroskopisches Zeichen die Hypertrophie ist. Zum Remodeling gehören neben der Modulation des CK-Isoenzymmusters unserer Ansicht nach auch Aktivitätsänderungen bzw. Konzentrationsänderungen von myokardialen Schutzsystemen gegen Schädigungsreaktionen die durch oxidativen Stress ausgelöst werden. Myokardiales Remodeling stellt einen zeitlich begrenzten Kompensationsmechanismus im Verlauf der Herzinsuffizienzgenese dar. Eine Schlüsselrolle bei der Induktion des Remodelings könnten Sauerstoffradikale haben. Die im Verlauf des Remodelings auftretenden biochemischen Veränderungen im CK-, Hsp- und Antioxidatiensystem führen dabei in unterschiedlicher Ausprägung und zeitlicher Abfolge zu einer Protektion des
Ob erste Untersuchungen, in denen gezeigt wurde, dass ACE-Hemmung und ß-Blockade ihre protektiven Effekte nach MI möglicherweise auch über eine die Steigerung der myokardialen GSH-Px und SOD-Aktivität realisieren [96], einen entsprechenden Weg weisen, muß abgewartet werden. Für die Möglichkeit einer pharmakologische Induktion enzymatischer Antioxidantien sprechen auch Versuche, in denen es gelang mit Probucol, einem Lipidsenker, GSH-Px und SOD im Myokard zu induzieren, was einen vorteilhaften Einfluss auf die Adriamycin-induzierte Kardiomyopathie hatte [123]. Auch Quercetin, ein Bioflavonoid, ist in der Lage die Katalase- und GSH-Px-Aktivitäten im Ratten-Myokard bei Streptozotocin-induzierter, diabetischer Kardiomyopathie zu erhöhen [124]. Eine andere Möglichkeit der therapeutischen Beeinflussung des myokardialen antioxidativen Systems sollte sich durch die Supplementation mit nichtenzymatischen Antioxidantien und Spurenelementen ergeben. So ist die verstärkte Expression von GSH-Px immer an die ausreichende Verfügbarkeit von Selen gebunden. Bekannt sind auch die enge Wechselwirkungen von GSH-Px, Vitamin E und Vitamin C bei der Metabolisierung von Lipidperoxiden (Kapitel 2.2.2.2). Im Tierversuch konnte durch Zugabe von Antioxidantien in den kardiopulmonalen Bypass bei herzchirurgischen Eingriffen eine bessere postoperative, funktionelle Erholung mit verminderte Lipidperoxidation erreicht werden [125].
Trotz zahlreicher Studien, die den präventiven und therapeutischen Effekt von Vitamin E belegen, hält sich der klinische Einsatz in Grenzen. Der positive Einfluss von Vitamin E auf die Entstehung und Folgen der Koronaren Herzkrankheit kann als am besten gesichert gelten. Die umfassendsten Ergebnisse zum protektiven Effekt der pharmakologischen Vitamin E-Therapie beim Menschen wurden 1996 im Rahmen der CHAOS-Studie (Cambridge Heart Antioxidant Study) gesammelt. Dabei konnte die täglich Gabe von Vitamin E bei Patienten mit angiographisch nachgewiesener Koronarsklerose die Rate der nicht-tödlichen Myokardinfarkte signifikant reduzieren [126]. Tierexperimentell ließ sich sogar die Entstehung von arteriosklerotischen Plaques gänzlich verhindern [127]. Dies impliziert so auch einen präventiven Effekt. Deshalb ist auch bei Hypertonie, die als Risikofaktor bei der KHK-Entstehung eine wichtige Rolle spielt, durch therapeutische α-Tocopherol-Substitution ein präventiver Effekt zu erwarten, zumal, wie in dieser Arbeit zum Myokardremodeling bei chronischer Hypertonie im Rattenmodell, auch bei der essentiellen Hypertonie des Menschen reduzierte Serum-
Wie in dieser Arbeit gezeigt, spielen auch die Hitzeschockproteine eine wesentliche Rolle bei der Myokardprotektion. Seit diese Erkenntnisse vorliegen, wurde versucht präventive und therapeutische Einsatzmöglichkeiten am Menschen zu finden. So kann beispielsweise der prä- und postoperative Hsp-Gehalt prognostische Bedeutung für die Wiederherstellung der Funktion, das Langzeitüberleben bzw. die Transplantatabstoßung in der Herzchirurgie erlangen [129]. Da eine in-vivo Hitzestress-Exposition des Menschen zur myokardialen Präkonditionierung gegenüber ischämischen Ereignissen nicht durchführbar ist, müssen andere Wege zur Hsp-Induktion gefunden werden. So könnte beispielsweise in der Transplantationsmedizin eine kurzfristige präoperative Temperaturerhöhung des Transplantats zur besseren Hsp-vermittelten, postoperativen, funktionellen Leistung bei verminderten Nekrosen führen. Dies wurde bereits erfolgreich an Ratten demonstriert [130]. Andere Möglichkeiten könnten sich zukünftig durch die pharmakologische Induktion von Hitzeschockproteinen eröffnen. Hier sind jedoch bisher kaum Ansätze zu sehen.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass das geschädigte Myokard nach MI sowohl in der akuten Phase als auch im Rahmen der chronischen Schädigung Mechanismen zur Selbstprotektion gegenüber Sauerstoffradikal-induzierter Schädigung aktivieren kann. Durch therapeutische Einflussnahme kann, wie für die chronische Phase nach MI gezeigt [96], die Selbstprotektion des Myokards zeitlich ausgeweitet werden und so der Übergang zur dekompensierten Herzinsuffizienz verzögert werden.
Prävention: Würde es gelingen, beispielsweise bei Patienten mit instabiler Angina pectoris eine Induktion von Hitzeschockproteinen und antioxidativen Enzymen im Myokard zu bewirken, könnte so im Falle eines Myokardinfarktes eine geringere Ausdehnung resultieren und die Reperfusionstherapie könnte mit noch größeren Erfolgsaussichten angewandt werden. Bereits heute wird vermutet das mehrfache passagere Ischämien (Angina pectoris) zur Selbstprotektion des Myokards führen. Auch in der Transplantationsmedizin könnte durch präoperative Hsp- und GSH-Px-Induktion eine postoperative bessere Wiederherstellung der kontraktilen Myokardfunktion erreicht werden. Zur Prävention des MI hält auch die Vitamin E-Substitution therapeutische Möglichkeiten offen.
Therapie: Auch der Einsatz der Vitamin E-Substitution und damit möglicherweise Unterstützung der Selbstprotektion des Myokards bei bereits eingetretenem MI könnte die Infarktgröße reduzieren. Durch ACE-Hemmung und ß-Blockade lässt sich entweder direkt oder indirekt bereits heute Einfluss auf die myokardiale enzymatische antioxidative Kapazität nach MI nehmen.
Rezidivprophylaxe: Eine Induktion endogener antioxidativer Enzyme, und dabei in erster Linie der GSH-Px, könnte über eine verbesserte Ischämieresistenz die Prognose bei Reinfarkten verbessern und so die Mortalität des akuten MI erheblich senken.
Gesteigerter oxidativer Stress ist ein typisches Zeichen in der Pathogenese der Herzinsuffizienz. Es wird postuliert, dass der Übergang von der Herzhypertrophie ohne Insuffizienz-spezifische Funktionseinschränkung zur dekompensierten Herzinsuffizienz durch ein Missverhältnis zwischen oxidativem Stress im Myokard und der Aktivität bzw. Konzentration endogener Schutzsysteme gekennzeichnet ist. Zu diesen Schutzsystemen gehören das enzymatische antioxidative System und das System der Hitzeschockproteine (Hsp). Eine kompensatorische Aktivitäts- bzw. Konzentrationssteigerung beider Systeme wird als wesentlich für die Myokardprotektion angesehen. Denkbar ist, dass beide Systeme parallel zur Selbstprotektion des Myokards im Verlauf der Herzinsuffizienzgenese beitragen. Andererseits ist nicht auszuschließen, dass das enzymatische antioxidative System und das Hsp-System zeitlich differenziert als Protektionssysteme bei Herzinsuffizienz auftreten.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist das Auffinden von Herzinsuffizienz-typischen Veränderungen im enzymatischen antioxidativen System und im Hsp-System und ihre Zuordnung zu verschiedenen Stadien der Herzinsuffizienzentwicklung. Dazu untersuchten wir in zwei Rattenmodellen: 1. der Hypertonie- und 2. der Myokardinfarkt-induzierten Herzinsuffizienz, zum einen die Charakterisierung des Hypertrophiegrades und die Veränderungen im myokardialen Creatinkinase-System (CK). Zum anderen eruierten wir im Herzgewebe als Repräsentanten für das enzymatische antioxidative System die Glutathionperoxidase (GSH-Px) und Superoxiddismutase (SOD) und als Vertreter des Hsp-Systems das Hsp25 und Hsp72. Die auftretenden Änderungen in diesen Systemen prüften wir hinsichtlich ihres Einflusses auf die Hypoxie/Reoxygenierungsempfindlichkeit des Herzens.
In der ersten Teilstudie untersuchten wir doppelt transgene Ratten für humanes Renin und Angiotensinogen (TGR). Deren permanente Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems (RAS) führte zur Myokardhypertrophie, von der jedoch nur der linke Ventrikel betroffen war. Isoliert im linken Ventrikel wurde gleichzeitig ein Verlust an CK-Aktivität, verbunden mit einem Isoenzym-Shift zu höheren Anteilen an CK-MB und CK-BB beobachtet. Hinsichtlich der Stressproteine kam es isoliert im linken Ventrikel zur Hsp25-Zunahme. Das Hsp72 war unverändert. Im Gegensatz dazu waren beide Ventrikel von gesteigertem oxidativen Stress betroffen. Dies wird direkt durch die Zunahme der Lipidperoxidation in beiden Ventrikeln und der Erniedrigung der Serum-Vitamin E-Konzentration sowie indirekt durch die kompensatorische Zunahme der GSH-Px-Aktivität in beiden Ventrikeln und im Papillarmuskel angezeigt. Hinsichtlich der SOD wurden in diesem Modell der Herzinsuffizienzgenese keine Ver
Die Zunahme der GSH-Px-Aktivität und des Hsp25-Gehalts erhöhte in den transgenen Tieren die Toleranz gegenüber Hypoxie/Reoxygenierungsstress. Anhand der Ergebnisse für den linken Ventrikel, kann auf eine Assoziation von Hypertrophie, CK-Isoenzym-Shift und Hsp25-Expression geschlossen werden. Möglicherweise ist die, der Aktivierung des RAS folgende Hypertrophie das Bindeglied zum CK-Isoenzym-Shift und zur gesteigerten Hsp25-Expression. Es wird postuliert, dass die RAS-Aktivierung über die Steigerung von oxidativem Stress zur Hypertrophieentwicklung beiträgt. Die aus dem CK-Isoenzym-Shift zu vermutende, partiell hypoxische Stoffwechsellage als Konsequenz der Hypertrophie im linken Ventrikel könnte gemeinsam mit dem gesteigerten oxidativen Stress infolge der RAS-Aktivierung die Induktion von Hsp25 verursachen. Da die GSH-Px auch im rechten, nichthypertrophierten Ventrikel nach RAS-Aktivierung ansteigt, scheint dieser Effekt keine primär Hypertrophie-assoziierte Reaktion des Myokards zu sein. Denkbar ist, dass die GSH-Px hochsensitiv auf den durch die RAS-Aktivierung initiierten oxidativen Stress reagiert, der sich in beiden Ventrikeln als gesteigerte Lipidperoxidation feststellen lässt und nicht die zusätzlich im linken Ventrikel vorherrschende, partiell hypoxische Stoffwechsellage benötigt. Die unveränderte SOD-Aktivität ist trotz des gesteigerten oxidativen Stresses im Myokard nicht zwangsläufig als Nichtbeteiligung dieses Enzyms an den Remodelingvorgängen im Herz bei RAS-Aktivierung zu werten. Aufgrund von Literaturdaten ist es denkbar, dass die Phase der kompensatorische Aktivitätszunahme für die SOD zu dem von uns gewählten Untersuchungszeitpunkt bereits überschritten ist. Der nach dieser Phase folgende SOD-Verlust würde die im Vergleich zu den Kontrollen unveränderte Aktivität erklären und einen weiteren Hinweis auf die bereits mehrfach postulierte eingeschränkte Bedeutung der SOD als myokardialer Schutzfaktor bei chronisch gesteigertem oxidativen Stress liefern.
In der zweiten Teilstudie wurde im Rattenmodell ein Myokardinfarkt (MI) induziert. Unterschieden wurden die Untersuchungszeitpunkte 14-16 Stunden als Myokardinfarktphase sowie 3, 6 und 9 Wochen als chronische Phase nach MI. Hypertrophie und CK-Isoenzym-Shift mit vermehrter Expression von CK-MB und -BB wurden in der akuten Phase nicht beobachtet. Beide Prozesse zur Kompensation der Herzfunktion sind erst nach Wochen (3 bzw. 6 Wochen) sichtbar. In beiden Ventrikeln und im Papillarmuskel waren aber die GSH-Px- und SOD-Aktivität in der akuten Phase nach MI gesteigert. Dies weist erneut auf die Unabhängigkeit der kompensatorischen Aktivitätssteigerung der antioxidativen Enzyme von der Hypertrophieentwicklung hin. Hsp72 und Hsp25 waren während der Akutphase nach MI im Papillarmuskel und im linken, nicht jedoch im rechten Ventrikel erhöht. Dieser Unterschied zwi
Während sich die SOD und die Hitzeschockproteine nach der akuten Phase dem Niveau der scheinoperierten Kontrollen annäherten, blieb die hohe GSH-Px-Aktivität - allerdings nur im linken Ventrikel - über den gesamten Untersuchungszeitraum (3-9 Wochen) bestehen. Dies war von einem CK-Isoenzym-Shift zu fetalen B-Isoenzymen ab der 3. Woche und dem Auftreten kardialer Hypertrophie ab der 6. Woche begleitet. Beide Veränderungen wurden ebenfalls nur im linken Ventrikel mit - gegenüber anderen Studien - vergleichsweise geringer Ausprägung beobachtet. Ein gesteigerter Lungengewicht/Körpergewicht-Quotient als Zeichen des Überganges in die dekompensierten Herzinsuffizienz wurden auch nach 9 Wochen nicht beobachtet. Der nach 9 Wochen im linken Ventrikel nachgewiesene SOD-Verlust könnte zusammen mit der CK-Verminderung allerdings ein erstes Zeichen für beginnende Dekompensation sein.
Die gesteigerte GSH-Px-Aktivität in der chronischen Phase nach MI war mit einer zunehmender Toleranz des Herzens gegenüber Hypoxie/Reoxygenierungsstress vergesellschaftet. Die Protektion betraf dabei in erster Linie das Relaxationsverhalten in der Reoxygenierungsphase. Da diese Protektion auch in der 9. Woche nach MI trotz der zu diesem Zeitpunkt bereits linksventrikulär verminderten SOD-Aktivität sichtbar war, kann als ein weiterer Hinweis für die untergeordnete Rolle der SOD im Vergleich zur GSH-Px bei der Myokardprotektion gegenüber oxidativem Stress angesehen werden.
In der akuten Phase nach MI können - basierend auf den vorgelegten Ergebnissen - antioxidative Enzyme und Hitzeschockproteine gemeinsam zur Toleranz des Herzens bei Hypoxie/Reoxygenierung beitragen. Ob, wie nachfolgend für die chronische Phase nach MI ausgewiesen, die GSH-Px auch das entscheidende myokardiale Protektionssystem in der akuten Phase ist, kann anhand der von uns erbrachten Ergebnisse nicht entschieden werden.
Eine parallele Aktivierung beider Systeme zur Myokardprotektion zeigte sich auch im Tiermodell der chronischen RAS-Aktivierung (TGR). Es kann aber nicht ausgeschlossen werden, dass in diesem Modell das Hsp25 weniger zur Protektion sondern vielmehr im Rahmen auto
Die vorgelegten tierexperimentellen Untersuchungen zeigen, dass das Herz sowohl unter akut als auch unter chronisch gesteigertem oxidativen Stress Mechanismen zur Selbstprotektion aktivieren kann, die eine Prävention bzw. Minimierung von Schädigungsreaktionen durch Sauerstoffradikale ermöglichen. Die Beteiligung solcher Schädigungsreaktionen an der Pathogenese der Herzinsuffizienz, sollte Anlass geben, über Konzepte nachzudenken, die eine optimale Ausschöpfung der auf den oxidativen Stress gerichteten myokardialen Selbstprotektion ermöglichen, um über diesen Weg protektiv in die Initiation und Progredienz der Herzinsuffizienz einzugreifen.
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Hiermit versichere ich an Eides statt, dass die vorgelegte Arbeit von mir eigenständig und ohne die unzulässige Hilfe Dritter verfasst wurde, auch in Teilen keine Kopie anderer Arbeiten darstellt, und die benutzten Hilfsmittel, sowie die Literatur vollständig aufgeführt sind.
Karsten Mydlak
Gmehling G, Günther J, Schimke I, Mydlak K, Theres H, Scholz H, Wagner KD. Time dependent alterations in antioxidant defence and contractile function after myocardial infarction. Eur J Physiol: 2001, 441 (Suppl.) : R150
Wagner KD, Gmehling G, Günther J,. Stauss HM, Mydlak K, Theres H, Scholz H, Schimke I. Contractile Function of Rat Myocardium is Less Susceptible to Hypoxia/Reoxygenation After Acute Infarction. akzeptiert für Mol Cell Biochem.
Wagner KD, Eßmann V, Mydlak K, Wirth M, Gmehling G, Bohlender J, Günther J, Schimke I, Scholz H. Myocardial function of renin-angiotensinogen transgenic rats during hypoxia and reoxygenation. eingereicht beim Am J Physiol.
Mein Dank gilt in erster Linie Herrn Prof. Dr. I. Schimke für die umfassende fachliche und persönliche Betreuung bei der Planung der Experimente, der Auswertung der Ergebnisse und beim Verfassen der vorliegenden Arbeit. Er stand bei allen Fragen und Problemen als Ansprechpartner zur Verfügung und war so eine unverzichtbare Hilfe in allen Phasen der Arbeit. Ich danke Herrn Prof. I. Schimke für die kritischen und Durchsicht der Manuskripte und die damit verbundenen wertvollen Hinweise und Anregungen.
Fr. Chem.-Ing. Kruse danke ich für die geduldige Einweisung in die laborchemischen Untersuchungsmethoden und für die tägliche engagierte und freundliche Unterstützung bei der experimentellen Arbeit. Ich bedanke mich bei ihr ferner für die unkomplizierte Organisation der Laborarbeit und die hervorragende Verpflegung.
Weiterhin danke ich:
Herrn Thomas Körnicke und Herrn Dr. H. Stauß für die Überlassung der operierten Tiere,
der AG Prof. Dr. Scholz und hierbei insbesondere Herrn Dr. J. Günther und Herrn Gunnar Gmehling für die Erfassung der Daten zur kontraktilen Funktion der Papillarmuskeln,
Herrn Küstner für die ausgesprochen engagierte Kontrolle der Arbeit.
Mein besonderer Dank gilt meiner Freundin, Franziska Lilienthal für die moralische Unterstützung, die stetige Geduld und das Verständnis, das sie bis zur Fertigstellung dieser Arbeit aufbrachte.
Meinen Eltern danke ich für die finanzielle Unterstützung und das große Interesse, mit dem sie die Arbeit verfolgten und natürlich für die konstruktive Kritik bei der Durchsicht des Manuskripts.