Bohlender et al. [⁵⁶] gelang es am Max Delbrück Zentrum für molekulare Medizin in Berlin ein neues Rattenmodell der Hypertonie zu entwickeln. Dabei wurde durch Kreuzung ein doppelt transgener Rattenstamm erzeugt, der heterozygot für das komplette menschliche Angiotensinogen- und Renin-Gen ist. Dazu wurden männliche, normotensive Sprague-Dawley-Ratten, die homozygot für das humane Angiotensinogen-Gen waren mit weiblichen normotensiven TGR, homozygot für das menschliche Renin-Gen, gekreuzt. Die Nachkommen entwickelten einen Hypertonus mit systolischen Mitteldrücken um 220 mm Hg und starben unbehandelt im Mittel nach 55 Tagen. Bei den vorangegangenen Modellen produzierten die transgenen Ratten nur das menschliche Angiotensinogen. Da aber die Konversion von humanen Angiotensinogen zu Angiotensin I nur durch das humane Renin, nicht aber durch das Renin der Ratte erfolgen kann [⁵⁷], war es nötig den Tieren zur Auslösung und Aufrechterhaltung eines Bluthochdrucks kontinuierlich menschliches Renin per Infusion zuzuführen. Derartiger Aufwand machte dieses Modell ungeeignet für das Studium der kardialen Hypertrophie, hypertensiven Nephrosklerose und anderen Folgen. Mit der oben beschriebenen Methode gelang nun die Erzeugung eines neuen Stammes, bei dem die Ratten alle Komponenten des humanen Renin-Angiotensin-Systems zur Produktion von AngII und damit zur Entwicklung eines spontanen Hypertonus in sich tragen. Die Tiere erhielten über den gesamten Versuchszeitraum Standard-Pelletfutter und Wasser ad libidum.

Für die Untersuchungen des Sauerstoffradikalmetabolismus und der Creatinkinase wurden uns 14 Herzproben der doppelt transgenen Sprague-Dawley-Ratten (TGR) überlassen. Als Kontrollgruppe dienten 14 altersentsprechende nicht transgene Kontrolltiere, ebenfalls Sprague-Dawley-Ratten („wild type“ - WT).

Der Myokardinfarkt wurde entsprechend einer Vorschrift von Johns und Olson [⁵⁸] durch die Ligation der Arteria coronaria sinistra verursacht. Dazu wurden die 6 Wochen alten Wistar Ratten mit einem Gewicht von 250 bis 280 g durch intraperitoneale Injektion von 75 mg/kg Ketaminhydrochlorid (Ketanest^®, Sanovi-Ceva) mit 7,5 mg/kg Xylazinhydrochlorid (Rompun^®, Bayer) anästhesiert. Anschließend wurden sie intubiert und mit Luft ventiliert. Nach Thorakotomie und Freilegung des Herzens wurde die linke Koronararterie zwischen der Pulmonalarterie und dem linken Atrium ligiert. Die Okklusion wurde durch die regionale Zyanose des Myokards und die begleitenden Elevation des ST-Segments im EKG gesichert. Die Kontrollgruppe (Sham) wurde der identischen chirurgischen Prozedur unterzogen mit dem Unterschied, dass der Faden neben der Arterie geknüpft wurde. Die Tiere erhielten ebenfalls über den Versuchszeitraum Standard-Pelletfutter und Wasser ad libidum. Jede der beiden Gruppen MI (Myokardinfarkt) und Sham wurden dann randomisiert auf jeweils vier Untergruppen verteilt. Für vier unterschiedliche postoperative Zeitspannen (0, 3, 6, 9 Wochen) entstanden so vier mal zwei Tiergruppen. Für den Zeitpunkt 0 Wochen wurden die Herzen nach 14-16 Stunden nach Operation entnommen.

Nach Anästhesie der Ratten durch Äther wurde der Thorax geöffnet und durch Herzpunktion das Blut gewonnen. Aus diesem wurde nachfolgend Plasma abzentrifugiert, welches bei –80° C bis zur Messung gelagert wurde. Das Herz wurde entnommen und gewogen, ebenso wie nach erfolgter Präparation die Vorhöfe, Ventrikel und Papillarmuskeln. Für die biochemische Analytik wurden anschließend jeweils rund 50 mg Gewebe aus dem rechten und linken Ventrikel (nicht infarziertes Areal), portioniert und ebenso wie ein separierter Papillarmuskel bis zur Analytik in flüssigem Stickstoff gelagert. Aufgrund der geringen Materialmenge beschränkten wir uns bei den biochemischen Untersuchungen des Papillarmuskels im ersten Tiermodell auf die GSH-Px und die Hsp-Analytik. Im zweiten Modell wurde im Papillarmuskel nur der Hsp-Status bestimmt. Ein zweiter Papillarmuskel wurde unmittelbar nach der Isolierung den Messungen zur Charakterisierung der Herzleistung zugeführt.

Von den tiefgekühlten Gewebeproben wurden jeweils 30 mg in gefrorenem Zustand eingewogen und in 1200 μl 0,9 %iger NaCl-Lösung mit dem Messerhomogenisator unter Eiskühlung homogenisiert. Dabei wurde nach folgendem Schema verfahren: 4 mal 15s Homogenisierung mit jeweils 10 s Pause. Anschließend wurden die Proben portioniert und bis zur weiteren Verwendung bei -80°C eingefroren. Die Aufarbeitung der Gewebe für die Bestimmung der Stressproteine ist in Kapitel 4.2.11. beschrieben.

Die Trennung der Isoenzyme erfolgt entsprechend ihrer elektrophoretischen Wanderungsfähigkeit im Agarosegel, bestimmt durch ihre isoelektrischen Punkte. Dabei wandert die BB-Fraktion am weitesten anodisch gefolgt von der MB-Fraktion; CK-MM bleibt nahezu an der Auftragstelle und die CK-Mi bewegt sich zur Katode hin. Nach Inkubation des Gels mit einem fluoreszierenden Farbstoff wird das gebildete und in den Banden lokalisierte NADPH₂ sichtbar gemacht und auf diese Weise die CK-Muster quantitativ densitometrisch auswertbar. Zur Bestimmung des CK-Isoenzymmusters wurde die Rapid-Elektrophorese-Technik der Firma Helena Laboratories genutzt. Die Zusammensetzung des CK-Isoformen-Kit ist in Tabelle 4 aufgeführt.

Inhalt

Konzentration im Test

Hexokinase

9000 U/l

G6P-DH

7500 U/l

ADP

12 mmol/l

AMP

15 mmol/l

NAD

6 mmol/l

Creatinphosphat

90 mmol/l

N-Acetylcystein

60 mmol/l

D-Glukose

60 mmol/l

Mg-Acetat

60 mmol/l

Tabelle 4:Zusammensetzung des CK-Isoformenkit der Firma Helena Laboratories

Das Gerät wurde mit folgenden Parametern programmiert:

Probenauftragsvolumen:

1 µl

Spannung:

1400 Volt

Elektrophoresedauer:

10 min

Temperatur:

15° C

Die auf der Basis eines gekoppelten optischen Test beruhende Aktivitätsbestimmung der GSH-Px wurde erstmalig von Paglia und Valentine beschrieben [⁵⁹]. Glutathionperoxidase katalysiert die Oxidation von Glutathion (Gleichung 20). In Gegenwart von Glutathionreduktase (GSSG-R) und NADPH wird das oxidierte Glutathiondisulfid (GSSG) wieder zu Glutathion reduziert, wobei gleichzeitig das NADPH zu NADP⁺ oxidiert wird (Gleichung 21). Gemessen wird die Abnahme der NADPH-Extinktion bei 340 nm.

Zur GSH-Px-Bestimmung wurde ein Test-Kit der Firma Randox Laboratories genutzt, der auf der Basis des obigen Reaktionsprinzip arbeitet. Tabelle 5 zeigt die Zusammensetzung des Tests. Nach dem Rehomogenisieren wurden die Proben , sowie die Reagenzien über den Zeitraum der Messungen auf Eis gelagert und entsprechend dem folgendem Pipettierschema der Analytik zugeführt.

Lösungen

Leerwert (in μl)

Probe (in μl)

unverdünnte Probe

-

10

aqua dest

50

40

Reagenz

500

500

Cumenhydroperoxid

20

20

Zur Aktivitätsbestimmung wurden folgende Parameter gewählt:

Wellenlänge:

340 nm

Schichtdicke der Küvette:

0,5 cm

Messtemperatur:

37 °C

Messzeit:

3,5 min

Die Glutathionperoxidase-Aktivität erhält man durch Abzug der nichtenzymatischen NADPH-Abnahme (Leerwert) von der Gesamtaktivität. Somit ergibt sich, dass 1 Unit genau der Menge GSH-Px entspricht, die notwendig ist um 1 μmol GSH bei pH 7,4 und 37 °C innerhalb einer Minute zu oxidieren. Die gemessenen Aktivitäten sind ebenfalls in U/mg Protein angegeben.

Inhalt

Konzentration im Test

1. Reagenz

Glutathion

4,0 mmol/l

Glutathionreduktase

≥ 0,5 U/l

NADPH

0,28 mmol/l

2. Puffer

Phosphatpuffer

0,05 mmol/l, pH = 7,2

EDTA

4,3 mmol/l

3. Cumenhydroperoxid

0,18 U/l

4. Verdünnungslösung

Tabelle 5: Zusammensetzung des GSH-Px-Test-Kits der Firma Randox-Laboratories

Die SOD-Bestimmung beruht auf einer Vorschrift von Beauchamp und Fridovich [⁶⁰]. Dabei werden mit Xanthin als Substrat durch Xanthinoxidase (XOD) Superoxidradikale produziert (Gleichung 22). In einer Folgeraktion wird durch die entstandenen Superoxidradikale ein roter Formazan-Farbstoff (I.N.T.) gebildet. Andererseits können die Superoxidradikale auch über die Dismutationsreaktion der SOD zu molekularem Sauerstoff und H₂O₂ metabolisiert werden (Gleichung 23). Die Enzymaktivität wird somit über die Hemmung der Formazan-Farbstoffbildung bestimmt.

Zur SOD-Aktivitätsbestimmung wurde ein dieses Reaktionsprinzip nutzender Test-Kit der Firma Randox Laboratories genutzt. Tabelle 6 zeigt die Zusammensetzung des Test-Kits.

Inhalt

Konzentration im Test

1. Substrat-Mix

Xanthin

0,05 mmol/l

I.N.T.

0,025 mmol/l

2. Puffer

CAPS

40 mmol/l, pH = 10,2

EDTA

0,94 mmol/l

3. Xanthinoxidase

80 U/l

Tabelle 6:Zusammensetzung des SOD-Test-Kits der Firma Randox-Laboratories

Die zu messenden Gewebehomogenate wurden wie oben beschrieben rehomogenisiert und zusammen mit den Reagenzien für die gesamte Dauer der Messung auf Eis gelagert. Da diese Methode indirekt ist, d.h. auf der Bildung von O• in einer vorgeschalteten Generatorreaktion beruht, besteht nur in einem bestimmten Bereich ein lineares Verhältnis zwischen Hemmung der Indikatorreaktion und Aktivität der SOD. In vorangegangenen Studien konnte für diese Methode eine lineare Beziehung im Bereich zwischen 24 und 55% Hemmung ermittelt werden. Die Verdünnung des Probenvolumens in der Küvette mit aqua dest wurde deshalb so angepasst, dass die gemessene Hemmung in diesem Bereich lag. Das Messen der Mn-SOD erfolgte aus dem reinen Herzhomogenat, während es für die Gesamt-SOD notwendig war, im Verhältnis 1:100 zu verdünnen.

Das Pipettierschema ist der folgenden Tabelle zu entnehmen (Angaben in μl):

Lösungen

Leerwert

Gesamt-SOD

Mn-SOD

Probe

-

x (< 100)

x (< 50)

aqua dest

100

100-x

50-x

Mixsubstrat

340

340

340

XOD

50

50

50

NaCN (0,02 M)

-

-

50

Nach Mixen der Lösungen in der Küvette wurde bei folgenden Parametern gemessen:

Wellenlänge:

505 nm

Schichtdicke der Küvette:

0,5 cm

Messtemperatur:

37 °C

Messzeit:

3,5 min

Gemessen wurde die zeitabhängigen Zunahme der Farbstoffintensität in ΔE/min. Es wurden Doppelbestimmungen durchgeführt. Die Hemmung der Farbstoffbildung durch die SOD wurde nach folgender Formel berechnet:

Zur Angabe der Aktivität in Units wurde eine 50%ige Hemmung der Indikatorreaktion definiert als 1 Unit/ml. In der Literatur angegebene SOD-Aktivitäten basieren neben dieser auch auf anderen Definitionen. Diese Unterschiede führen dazu, dass publizierte SOD-Werte nicht zwangsläufig miteinander verglichen werden können.

Zur Bestimmung der Lipidperoxid-Konzentration in den Herzhomogenaten wurde die von Ohkawa et al. [⁶¹] entwickelte Methode genutzt. Wie in Kapitel 2.2.1.3. beschrieben, entsteht bei der Lipidperoxidation Malondialdehyd (MDA). Mit Thiobarbitursäure (TBA) bildet MDA einen roten Polymethinfarbstoff, der fluorimetrisch gemessen werden kann. Unter den Testbedingungen (niedriger pH-Wert, hohe Temperatur) reagieren auch Vorstufen der MDA-Bildung mit TBA. Die Reaktionsprodukte werden demnach als Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS) bezeichnet. Tabelle 7 zeigt die genutzten Chemikalien und ihre Konzentrationen im Test.

Lösung

Konzentration

NaCl

0,154 mol/l

20%ige Essigsäure

mit NaOH auf pH 3,5 eingestellt

Natriumdodecylphosphat (SDS)

0,28 mol/l

2-Thiobarbitursäure (TBA)

0,049 mol/l

n-Butanol

-

Tabelle 7:Testzusammensetzung für die Bestimmung der TBARS

Die Leerwerte, Eichreihen und Proben wurde anhand folgendem Pipettierschema in Reagenzgläsern gemischt:

Lösungen

Leerwert (in μl)

Eichreihe (in µl)

Probe (in μl)

unverdünnte Probe

-

-

x

MDA-Lösung

-

5;10;15;20;30

-

aqua dest

150

150

150-x

Acetatpuffer (pH 7,4)

300

300

300

SDS

40

40

40

TBA

300

300

300

Die Testansätze wurden für 60 min bei 90 °C inkubiert und nachfolgend im Eisbad abgekühlt. Anschließend wurden 200 µl aqua dest und 1000 µl Butanol zugegeben und für 20 min geschüttelt. Nach 10minütiger Zentrifugation bei 3000 U/min konnte die Messung der Fluoreszenz in der überstehenden organischen Phase bei folgenden Parametern erfolgen:

Wellenlänge:

Exzitation:

515 nm

Temperatur:

25 °C

Emission:

553 nm

Schichtdicke der Küvette:

1 cm

Die Berechnung der Konzentration an TBARS-Konzentrationen erfolgte nach Subtraktion des Leerwertes anhand der Eichreihe mit Standartkonzentrationen an MDA, gebildet aus 1,1,3,3-Tetraethoxypropan in nmol/mg Protein.

Zur Analyse des Serum-Vitamin E-Gehalts wurde ein in der Labor-Routine gebräuchliches high-performance-liquid-chromatographie-(HPLC)-System der Firma ChromSystems verwandt.

Die Bestimmung der Hsp25- und 72-Konzentration im Ventrikelgewebe und im Papillarmuskel erfolgte nach einer Vorschrift von Lutsch et al. [⁶²].

Probenaufbereitung

Zur Probenaufbereitung wurden 5-10 mg Gewebe mit 100µl Puffer (pH 6,8: 62,5 mM Tris, 2% SDS, 10% Glycerin) inkubiert und anschließend nach Zugabe von weiteren 50µl Puffer homogenisiert. Das Homogenat wurde in Eppendorfröhrchen überführt und 5 min bei 15000 U/min zentrifugiert. Der entstandene klare Überstand wird für die Bestimmung abgenommen. Zunächst erfolgte die Proteinbestimmung mittels Bio-Rad DC Protein Assay in jedem Homogenat. Nachfolgend wird das Homogenat mit ß-Mercaptoethanol auf eine Endkonzentration von 5-6% und mit Bromphenolblau auf 0,001% eingestellt. Durch 3minütiges Kochen im Wasserbad werden die Proteine denaturiert und durch das Bromphenolblau markiert. 100µg Protein werden von jeder Probe der nachfolgenden Elektrophorese zugeführt.

Elektrophorese

Zum Auftrennen der Proteine wird ein Gradientengel aus 7,5% Acrylamid/0,2% N,N´-Methylen-bis-Acrylamid und 15% Acrylamid/0,6% N,N´-Methylen-bis-Acrylamid hergestellt. Weiterhin ist zur Verbesserung der Banden-Auflösung die Herstellung eines großporigen Sammelgels aus 3% Acrylamid/0,08% N,N´-Methylen-bis-Acrylamid nötig. Als Laufzeitende der Elektrophorese im Puffer (pH 6,8: 25mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 192mM Glycin, 0,1% SDS) wurde das Erreichen der Gelunterkante durch das Bromphenolblau festgelegt.

Western-Blotting

Durch das anschließende Semi-Dry-Elektro-Blotting bei 0.8 mA/cm² erfolgt ein Überführung der aufgetrennten Proteine auf die Nitrocellulose mittels eines Transferpuffers (pH 8,3: 25mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan, 150mM Glycin, 10% Methanol). Danach wurde mit einer 5%igen Magermilchlösung in TBS-Puffer (pH 7,3) + 0,05% Tween 20 geblockt (60´), um freie Bindungsstellen auf der Nitrocellulose mit Protein zu besetzen.

Quantitativer Nachweis

Der Antigen-spezifische erste Antikörper bindet an das Hsp-Protein und wird seinerseits durch den spezifischen Enzym-gekoppelten Sekundärantikörper gebunden. Durch das Enzym Alkalische Phosphatase wird nachfolgend ein Colorsubstrat unter Farbstoffbildung umgesetzt, was die Banden anfärbt und eine quantitative densitometrische Auswertung der Produktmenge ermöglicht. Nachfolgend die benutzten Antikörper im Einzelnen:

Hsp25:

1. Antikörper:

Anti-Hsp25

Berlin Buch

Kaninchen-Antikörper

2. Antikörper:

Anti-Rabbit IgG(Fc),

Promega, Mannheim (S 3731)

AP Conjugate

Hsp72:

1. Antikörper:

Anti-Hsp72

Sigma-Aldrich-Chemie GmbH (H 5147)

Mouse IgG

2. Antikörper:

Anti-Mouse IgG(H+L);

Promega, Mannheim (S 3721)

AP Conjugate

Aufgrund der Blotting-Technik mit unterschiedlichen Fixierungszeiten werden anstelle der absoluten Konzentrationen die Hsp-Konzentrationen in Prozent angegeben. Dafür wurden in jedem Blot die Kontrollen und Experiment-Tiere in gleicher Anzahl kombiniert. Die Konzentration der TGR wurde bezogen auf die Konzentration der WT im jeweiligen Blot angegeben, deren Mittelwert als 100% angenommen wird.

Die Analyse des Proteingehaltes erfolgte nach Lowry et al. [⁶³].

Nach gründlicher Mischung und 10minütiger Inkubation, der im nachfolgendem Pipettierschema zusammengefassten Reagenzien, mussten ebenso wie der Eichreihe mit humanem Serumalbumin (0,39 mg/ml) noch 150µl Folin-Lösung hinzugefügt und erneut für 60 min inkubiert werden. Die Messung der Extinktion erfolgte dann am UV-VIS Scanning Spektrophotometer bei 750 nm. Der Nullabgleich erfolgte gegen den Leerwert.

Lösungen

Leerwert (in μ l)

Eichreihe (in µl)

Probe (in μ l)

unverdünnte Probe

-

-

20

Serumalbuminlösung

-

x

-

aqua dest

200

200-x

180

NaOH (1N)

20

20

20

Gebrauchslösung

1500

1500

1500

Um Aussagen zur funktionellen Leistung des Myokards unter Hypoxie/Reoxygenierungsstress machen zu können, wurden - wie in Kapitel 2.2.5. - beschrieben, isometrischen Kontraktionen der Papillarmuskeln im Gewebe-Bad ausgelöst. Diese Blutersatzlösung war folgendermaßen zusammengesetzt (Angaben in mmol/l): NaCl 140,0; KCl 5,0; CaCl₂ 0,75; MgCl₂ 1,1; Tris/HCl 10,0; D-Glukose 11,1; pH 7,4. Zur Simulation der Hypoxie wurde das Gewebebad mit Stickstoff und im Fall der Reoxygenierung mit Sauerstoff durchströmt.