Tierexperimentelle Untersuchungen zu antioxidativen Enzymen und Hitzeschockproteinen als endogene Schutzsysteme bei HerzinsuffizienzKarsten Mydlak 1.12607#2312.32.1.624#286452.1.1.62.1.2.2.1.2.1.7558#3512.1.2.2.82.2.2.2.1.912#282.2.1.1.653#63627#6410627#6412#282.2.1.2.1112#29627#52122.2.1.3.605#43813627#69627#76604#78142.2.2.152.2.2.1.16627#56627#55604#63172.2.2.2.18192.2.3.202.2.4.212.2.5.22488#4403.234.244.1.4.1.1.4.1.2.254.2.264.2.1.4.2.2.274.2.3.4.2.4.4.2.5.28294.2.6.304.2.7.314.2.8.3212#28#4.2.8.1.33607#27834607#2904.2.9.354.2.10.4.2.11.36374.2.12.4.2.13.4.2.14.385.395.1.5.1.1.405.1.2.41425.1.3.43445.1.4.5.1.5.455.1.6.465.1.7.47583#27648583#294583#2815.2.495.2.1.5.2.2.50515.2.3.5253608#31154604#312607#31655607#303606#30756606#304607#30357624#307636#3185.2.4.58586#29859607#2996061607#303639#3185.2.5.62607#303607#311635.2.6.604#30264605#30265603#318600#3175.2.7.6667590#86968591#82369592#8466.706.1.716.1.1.6.1.2.726.1.3.73746.1.4.756.1.5.766.1.6.776.2.786.2.1.796.2.1.1.6.2.1.2.806.2.1.3.816.2.1.4.826.2.2.836.2.2.1.84856.2.2.2.86876.2.2.3.88896.2.2.4.6.3.906.4.9192937.94959697LITERATUR9899100101102103104105106107108109 ABKÜRZUNGSVERZEICHNISEIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNGLEBENSLAUFPUBLIKATIONENDANKSAGUNGdeInhaltsverzeichnisHilfeAus der Medizinischen Klinik und Poliklinik I,
der Medizinischen Chemie und Pathobiochemie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu BerlinDissertationTierexperimentelle Untersuchungen zu antioxidativen Enzymen und Hitzeschockproteinen als endogene Schutzsysteme bei HerzinsuffizienzZur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlinvon
Karsten Mydlak aus Cottbus Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen Prof. Dr. med. Schimke Priv. Doz. Dr. med. Siems Prof. Dr. med. Richter Datum der Promotion: 16. September 2002 Zusammenfassung

Gesteigerter oxidativer Stress ist ein typisches Zeichen in der Pathogenese der Herzinsuffizienz. Anhand von 2 Rattenmodellen sollen charakteristische Veränderungen des enzymatischen antioxidativen Systems, repräsentiert durch die Glutathionperoxidase (GSH-Px) und Superoxiddismutase (SOD) sowie Änderungen im Hitzeschockproteinsystem (Hsp) untersucht werden, für das stellvertretend Hsp25 und Hsp72 bestimmt wurden. Daneben wurde die Lipidperoxidation durch die Konzentration von Thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen (TBARS) quantifiziert. Im ersten Rattenmodell, der Hypertonie-induzierten Herzinsuffizienz durch permanente Renin-Angiotensin-System-Aktivierung in doppelt transgenen Ratten konnte eine linksventrikuläre Hypertrophie mit CK-Isoenzym-Shift mit vermehrter Expression von CK-MB und -BB beobachtet werden. Es kam in beiden Ventrikeln der transgenen Tiere zu einer Zunahme der Lipidperoxidation begleitet von einer Erniedrigung der Serum-Vitamin E-Konzentration durch Verbrauch. SOD und Hsp72 blieben unverändert. Durch die biventrikuläre Zunahme der GSH-Px-Aktivität bei linksventrikulär erhöhtem Hsp25-Gehalt konnte die Toleranz gegenüber Hypoxie/Reoxygenierungsstress erhöht werden. In der 2. Teilstudie - der Myokardinfarkt-induzierten Herzinsuffizienz - wurden die Parameter oxidativer Schädigung und antioxidativen Schutzes im Akutstadium (14-16h) und 3, 6 und 9 Wochen nach experimentellem Infarkt (MI) bestimmt. In der Akutphase zeigten sich in beiden Ventrikeln und im Papillarmuskel gesteigerte GSH-Px- und SOD-Aktivitäten, ohne dass kardiale Hypertrophie vorlag. Hsp72 und Hsp25 waren während der Akutphase nach MI im Papillarmuskel und im linken Ventrikel erhöht. In der Folge resultiert eine verbesserte kontraktile Funktion bei experimentellem Hypoxie/Reoxygenierungsstress. Damit gelang es erstmals eine Selbstprotektion des Myokards während eines akuten MI nachzuweisen. Erst ab der 6. Woche trat kardiale Hypertrophie auf, begleitet vom charakteristischen CK-Isoenzym-Shift. Während die SOD und die Hitzeschockproteine nach der akuten Phase auf das Niveau der Kontrollen absanken, blieb die hohe GSH-Px-Aktivität im linken Ventrikel über den gesamten Untersuchungszeitraum bestehen, bei zunehmender Toleranz des Herzens gegenüber Hypoxie/Reoxygenierungsstress. Die vorgelegten tierexperimentellen Untersuchungen zeigen, dass das Herz sowohl unter akut als auch unter chronisch gesteigertem oxidativen Stress Mechanismen zur Selbstprotektion aktivieren kann, die eine Prävention bzw. Minimierung von Schädigungsreaktionen durch Sauerstoffradikale ermöglichen.

 Herzinsuffizienz Sauerstoffradikale antioxidative Enzyme Hitzeschockproteine Abstract

Elevated oxidative stress is typical in the pathogenesis of heart failure. Characteristical changes in antioxidant enzyme status, represented by glutathionperoxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD), and changes in heat shock protein status (Hsp), denoted by Hsp25 and Hsp72, have been revealed in two different rat-models. Lipidperoxidation was quantified by the concentration of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). In the first model of heart failure caused by permanent activation of renin-angiotensin system in double transgenic rat, leftventricular hypertrophy accompanied by a shift of creatine kinase (CK) isoenzyme pattern to higher concentration of fetale CK-MB an -BB-isoforms was found. Higher TBARS concentrations and lower alpha-tocopherol levels caused by consumption have been measured. SOD and Hsp72 remained unchanged. The tolerance against experimental hypoxia/reoxygenation was improved by higher levels of GSH-Px and Hsp25 in both right and left ventricular tissue.

In the second study of heart failure caused by experimental myocardial infarction (MI) the parameters of oxidant demolishing and antioxidant defence were evaluated under acute conditions (14-16h) and 3, 6 and 9 weeks after infarction. In the acute period higher activities of GSH-Px and SOD in non-hypertrophied left and right ventricular tissue and papillary muscle have been reported. Leftventricular and papillary muscle Hsp25 and Hsp72 content showed higher levels 14-16 hours after MI compared with controls, improving the contractile function in hypoxia/reoxygenation experiments. These findings suggest for the first time a myocardial self-protection after acute myocardial infarction. 6 and 9 weeks after MI leftventricular hypertrophy occurred attended by the characteristic CK-isoenzymeshift. While SOD-activity and Hsp-content decreased to the levels of the controls, GSH-Px remained on higher altitude in leftventricular tissue in all examined periods after MI. This was accompanied by better tolerance against hypoxia/reoxygenation stress.

These findings of experimental-induced heart failure show the activation of myocardial self protecting mechanisms under acute and chronic oxidative stress conditions, minimizing or even preventing demolishing reactions of oxygen radicals.

 remodeling oxygen radicals antioxidant enzymes heat shock proteins Inhaltsverzeichnis

  • 1.  Einleitung

  • 2.  Theoretische Grundlagen

    • 2.1. Herzinsuffizienz

      • 2.1.1.  Herzhypertrophie

      • 2.1.2. Das Creatinkinase (CK)-System

        • 2.1.2.1.  Die CK und ihre Isoenzyme

        • 2.1.2.2.  Die CK bei kardialer Hypertrophie

    • 2.2. Sauerstoffradikale in der Pathogenese der Herzinsuffizienz

      • 2.2.1. Sauerstoffradikale

        • 2.2.1.1. Charakteristika ausgewählter reaktiver Sauerstoffspezies

        • 2.2.1.2. Sauerstoffradikale als physiologische und pathophysiologische Stoffwechselprodukte

        • 2.2.1.3.  Sauerstoffradikalinduzierte Schädigungsreaktionen

      • 2.2.2.  Das antioxidative System

        • 2.2.2.1. Das enzymatische System

        • 2.2.2.2.  Das nichtenzymatische System

      • 2.2.3. Hitzeschockproteine (Hsp)

      • 2.2.4. Sauerstoffradikale, Antioxidatives System, Stressproteine und Herzinsuffizienz

      • 2.2.5.  Funktionelle Parameter zur Charakterisierung der Herzleistung

  • 3.  Problemstellung

  • 4.  Materialien und Methoden

    • 4.1. Materialien

      • 4.1.1. Geräte

      • 4.1.2.  Chemikalien

    • 4.2.  Methoden

      • 4.2.1. 1.Tiermodell: Hypertonie-induzierte Herzhypertrophie bei transgenen Ratten (TGR)

      • 4.2.2. 2.Tiermodell: Myokardinfarkt-induzierte Herzhypertrophie bei Ratten

      • 4.2.3. Proben- und Plasmagewinnung

      • 4.2.4. Aufarbeitung der Gewebeproben für die biochemischen Untersuchungen

      • 4.2.5.  Aktivitätsbestimmung der Creatinkinase

      • 4.2.6. Elektrophoretische Bestimmung des Creatinkinase-Isoenzymmusters

      • 4.2.7. Aktivitätsbestimmung der Glutathionperoxidase (GSH-Px)

      • 4.2.8. Aktivitätsbestimmung der Superoxiddismutase (SOD)

        • 4.2.8.1.  Differenzierung der SOD-Isoenzyme

      • 4.2.9. Bestimmung der Lipidperoxid-Konzentration

      • 4.2.10. Bestimmung der Vitamin E-Konzentration im Serum

      • 4.2.11.  Bestimmung von Hsp25 und Hsp72

      • 4.2.12. Proteinbestimmung

      • 4.2.13. Funktionelle Parameter zur Charakterisierung der Herzleistung

      • 4.2.14.  Statistische Auswertung

  • 5.  Ergebnisse

    • 5.1. Ergebnisse 1.Tiermodell: Hypertonie-induzierte Herzhypertrophie bei transgenen Ratten (TGR)

      • 5.1.1. Körpergewicht, Ventrikelgewicht und Hypertrophieindex

      • 5.1.2.  Myokardialer CK-Gehalt und CK-Isoenzymmuster

      • 5.1.3.  Myokardiale antioxidative Enzyme

      • 5.1.4. Serum-Vitamin E-Gehalt

      • 5.1.5.  Lipidperoxidation

      • 5.1.6. Stressproteine

      • 5.1.7. Funktionelle Parameter zur Charakterisierung der Herzleistung

    • 5.2.  Ergebnisse 2.Tiermodell: Myokardinfarktinduzierte Herzhypertrophie bei Ratten

      • 5.2.1. Charakterisierung der Myokardinfarktphasen

      • 5.2.2.  Körpergewicht, Ventrikelgewicht und Hypertrophieindex

      • 5.2.3.  Myokardialer CK-Gehalt und CK-Isoenzymmuster

      • 5.2.4.  Myokardiale antioxidative Enzyme

      • 5.2.5.  Lipidperoxidation

      • 5.2.6. Stressproteine

      • 5.2.7.  Funktionelle Parameter zur Charakterisierung der Herzleistung

  • 6.  Diskussion

    • 6.1. 1.Tiermodell: Hypertonie-induzierte Herzhypertrophie bei transgenen Ratten (TGR)

      • 6.1.1.  Herzhypertrophie bei TGR

      • 6.1.2. CK-Remodeling bei TGR

      • 6.1.3. Antioxidative Enzyme und Lipidperoxidation bei TGR

      • 6.1.4. Hitzeschockproteine bei TGR

      • 6.1.5. Ursachen für Hypertrophie, CK-Remodeling und Induktion von antioxidativen Enzymen und Hsp bei TGR

      • 6.1.6.  Kardiale Funktion bei TGR

    • 6.2.  2.Tiermodell: Myokardinfarkt-induzierte Herzhypertrophie bei Ratten

      • 6.2.1.  Akute Myokardinfarktphase (14-16 nach MI)

        • 6.2.1.1. Hypertrophieparameter und Creatinkinase

        • 6.2.1.2. Lipidperoxidation und antioxidative Enzyme

        • 6.2.1.3. Hitzeschockproteine

        • 6.2.1.4.  Kontraktile Funktion

      • 6.2.2.  Chronische Phase nach Myokardinfarkt (3-9 Wochen nach MI)

        • 6.2.2.1. Hypertrophieparameter und Creatinkinase

        • 6.2.2.2. Lipidperoxidation und antioxidative Enzyme

        • 6.2.2.3. Hitzeschockproteine

        • 6.2.2.4. Kontraktile Funktion

    • 6.3.  Schlussfolgerungen

    • 6.4. Therapeutische Konsequenzen

  • 7.  Zusammenfassung

  • LITERATUR

  • ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

  • EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG

  • LEBENSLAUF

  • PUBLIKATIONEN

  • DANKSAGUNG

Tabellen

  • Tabelle 1:Reaktive Sauerstoffspezies (unter Verwendung von [18] )

  • Tabelle 2:Antioxidantien (modifiziert nach [25])

  • Tabelle 3: Zusammensetzung des CK- Test-Kits der Firma Lehmann

  • Tabelle 4:Zusammensetzung des CK-Isoformenkit der Firma Helena Laboratories

  • Tabelle 5: Zusammensetzung des GSH-Px-Test-Kits der Firma Randox-Laboratories

  • Tabelle 6:Zusammensetzung des SOD-Test-Kits der Firma Randox-Laboratories

  • Tabelle 7:Testzusammensetzung für die Bestimmung der TBARS

Bilder

  • Abbildung 1:Umverteilung der Herzinsuffizienz-Ätiologie

  • Abbildung 2: Doppelter Circulus vitiosus der Herzinsuffizienzentwicklung

  • Abbildung 3: Wirkungsorte und –mechanismen der Creatin-Kinase (CK)

  • Abbildung 4:Wirkung von Sauerstoffradikalen auf unterschiedliche Strukturen und deren Folgen

  • Abbildung 5:Abbauwege der reaktiven Sauerstoffspezies durch die antioxidativen Enzyme der Zelle

  • Abbildung 6:Antioxidativer Synergismus von α -Tocopherol, Ascorbinsäure (Asc) und Glutathion (GSH)

  • Abbildung 7:Das Kraftsignal und dessen 1.Ableitung zur Charakterisierung der myokardialen Kontraktions- und Relaxationsfähigkeit

  • Abbildung 8:NaCN-Wirkung auf die SOD-Aktivität im Rattenherzhomogenat (Gesamt-SOD = 1,34 U/l)

  • Abbildung 9:NaCN-Wirkung auf den Leerwert bei der SOD-Bestimmung

  • Abbildung 10: Körpergewichte(KG) der TGR und WT. *p < 0,05

  • Abbildung 11: Gesamt-Ventrikelgewichte (VG) der TGR und WT. *p < 0,05

  • Abbildung 12:Gewichte des linken (LV) und rechten (RV) Ventrikels der TGR und WT. **p < 0,01

  • Abbildung 13:Ventrikel/Körpergewichtquotienten von TGR und WT. **p < 0,01 (Abkürzungen im Text erläutert)

  • Abbildung 14:Gesamt-CK-Aktivität in den Herzhomogenaten der linken (LV) und rechten (RV) Ventrikel von TGR und WT. *p < 0,05

  • Abbildung 15:Myokardiale CK-Isoenzymmuster der linken Ventrikel (LV) von TGR und WT. *p < 0,05; **p < 0,01

  • Abbildung 16:Myokardiale CK-Isoenzymmuster der rechten Ventrikel (RV) von TGR und WT.

  • Abbildung 17:Myokardiale CK-Isoenzymmuster des linken (LV) und rechten (RV) Ventrikels von TGR. **p < 0,01

  • Abbildung 18:GSH-Px-Aktivitäten im linken (LV) und rechten (RV) Ventrikel, sowie im Papillarmuskel (PM) von TGR und WT. *p < 0,05; **p < 0,01

  • Abbildung 19:Gesamt-SOD-Aktivitäten im Herzgewebe der linken (LV) und rechten (RV) Ventrikel von TGR und WT.

  • Abbildung 20:CuZn-SOD-Aktivitäten im Herzgewebe der linken (LV) und rechten (RV) Ventrikel von TGR und WT.

  • Abbildung 21:Vitamin E-Gehalt im Serum von TGR und WT. *p < 0,05

  • Abbildung 22:Myokardialer Gehalt an TBARS in den linken (LV) und rechten (RV) Ventrikeln der TGR und WT. *p < 0,05; **p < 0,01

  • Abbildung 23:Konzentrationen von Hsp25 im linken (LV) und rechten (RV) Ventrikel, sowie im Papillarmuskel von TGR und WT. *p < 0,05;

  • Abbildung 24:Konzentrationen von Hsp72 in den linken (LV) und rechten (RV) Ventrikeln von TGR und WT.

  • Abbildung 25:Peak force (PF) der Papillarmuskeln von TGR und WT während Hypoxie und Reoxygenierung. *p < 0,05

  • Abbildung 26:Maximale Kontraktionsgeschwindigkeit (dF/dt max ) der Papillarmuskeln von TGR und WT während Hypoxie und Reoxygenierung. *p < 0,05

  • Abbildung 27:Maximale Relaxationsgeschwindigkeit (dF/dt min ) der Papillarmuskeln von TGR und WT während Hypoxie und Reoxygenierung. *p < 0,05

  • Abbildung 28:Muster-Diagramm zur Erläuterung der Ergebnis-Darstellung

  • Abbildung 29:Gesamt-CK-Aktivität in den linken Ventrikel (LV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); +p<0,1, **p<0.01

  • Abbildung 30:Gesamt-CK-Aktivität in den rechten Ventrikeln (RV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05, **p<0.01

  • Abbildung 31:CK-Mi-Fraktionen in den linken Ventrikeln (LV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05

  • Abbildung 32:CK-Mi-Fraktionen in den rechten Ventrikeln (RV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05

  • Abbildung 33:CK-MM-Fraktionen in den linken Ventrikeln (LV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05, **p<0.01

  • Abbildung 34:CK-MM-Fraktionen in den rechten Ventrikeln (RV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05, **p<0.01

  • Abbildung 35:CK-MB-Fraktionen in den linken Ventrikeln (LV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham);+ p<0,1; *p<0,05; **p<0,01

  • Abbildung 36:CK-BB-Fraktionen in den linken Ventrikeln (LV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); +p<0,1; *p<0,05; **p<0,01

  • Abbildung 37:CK-MB-Fraktionen in den rechten Ventrikeln (RV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05; **p<0,01

  • Abbildung 38:CK-BB-Fraktionen in den rechten Ventrikeln (RV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05; **p<0,01

  • Abbildung 39:GSH-Px-Aktivitäten im linken Ventrikel (LV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05, **p<0,01

  • Abbildung 40:GSH-Px-Aktivitäten im rechten Ventrikel (RV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); +p<0,1, *p<0,05, **p<0,01

  • Abbildung 41:Gesamt-SOD im linken Ventrikel (LV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); +p<0,1; *p<0,05; **p<0,01

  • Abbildung 42:Gesamt-SOD im rechten Ventrikel (RV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05; **p<0,01

  • Abbildung 43:CuZn-SOD im linken Ventrikel (LV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05; **p<0,01

  • Abbildung 44:CuZn-SOD im rechten Ventrikel (RV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); +p<0,1; *p<0,05

  • Abbildung 45:Gehalt an TBARS in den linken Ventrikeln (LV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05

  • Abbildung 46:Gehalt an TBARS in den rechten Ventrikeln (RV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05, **p<0,01

  • Abbildung 47:Hsp25-Konzentrationen in den linken Ventrikeln (LV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); +p<0,1, *p<0,05

  • Abbildung 48:Hsp72-Konzentrationen in den linken Ventrikeln (LV) der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05

  • Abbildung 49:Hsp25-Konzentrationen im Papillarmuskel der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); *p<0,05, **p<0,01

  • Abbildung 50:Hsp72-Konzentrationen im Papillarmuskel der infarzierten Herzen (MI) und der Kontrollgruppe (Sham); +p<0,1, *p<0,05, **p<0,01

  • Abbildung 51: Peak force (PF) der Papillarmuskeln von MI und Sham 0-9 Wochen nach OP während Hypoxie und Reoxygenierung.

  • Abbildung 52:Maximale Kontraktionsgeschwindigkeit normiert auf PF ((dF/dt max )/PF) der Papillarmuskeln von MI und Sham 0-9 Wochen nach OP während Hypoxie und Reoxygenierung. *p<0,05

  • Abbildung 53:Maximale Relaxationsgeschwindigkeit normiert auf PF ((dF/dt min )/PF) der Papillarmuskeln von MI und Sham 0-9 Wochen nach OP während Hypoxie und Reoxygenierung. *p<0,05