1 EINLEITUNG

1.1 DIE CHRONISCHE MYELOISCHE LEUKÄMIE (CML)

1.1.1 Historie

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Die chronische myeloische Leukämie (CML) wurde erstmals 1845 von Virchow, Bennett und Craigie beschrieben [1,2,3]. Es handelt sich bei der CML um eine myeloproliferative Erkrankung, die von der pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle ausgeht. Sie hat eine Inzidenz von 1-2 pro 100.000 und macht insgesamt 15% aller Leukämien bei Erwachsenen aus. Das mittlere Alter der Patienten bei Diagnosestellung beträgt 53 Jahre [4]. Als Risikofaktor gilt eine vorangegangene Strahlenbelastung.

1.1.2 Klinisches Erscheinungsbild der CML

Die CML wird unterteilt in drei Phasen: die chronische Phase, die akzelerierte Phase und die Blastenkrise. In der chronischen Phase der CML kann es zu einer Vielzahl von Symptomen kommen, in vielen Fällen ist sie jedoch symptomarm. Bei Erstdiagnose treten typischerweise Spleno- und Hepatomegalie, Abgeschlagenheit, Leistungs-minderung, Inappetenz, Fieber, Nachtschweiß, Infektionen, Blutungsneigung und Priapismus auf.

Im Verlauf der Therapie kann es zur kompletten Regredienz dieser Symptome kommen, ihr erneutes Auftreten ist jedoch im Rahmen eines Krankheitsprogresses möglich. Todesursachen sind vor allem Infektionen und hämorrhagische Diathesen.

1.1.3 Hämatologische und zytologische Charakteristika der CML

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Kennzeichnende Veränderungen im peripheren Blut in der chronischen Phase der CML sind eine Leukozytose, die >100.000 Zellen/μl betragen kann, sowie eine Linksverschiebung mit Auftreten von Blasten, Promyelozyten, Metamyelozyten und Myelozyten. Des Weiteren treten Basophilie, Eosinophilie und Anämien auf. Bei Erstdiagnose ist eine Thrombozytose typisch [5].

Im Knochenmark verschiebt sich das Verhältnis zwischen Granulopoese und Erythropoese von 3:1 bis gelegentlich 10:1. Es zeigt eine Hyperzellularität mit erhöhtem Anteil an Myeloblasten und Promyelozyten, später entwickelt sich eine nochenmarksfibrose. Mit Fortschreiten der Krankheit sind für die akzelerierte Phase und Blastenkrise eine weitere Vermehrung der Blasten und Promyelozyten, ein Thrombozytenabfall, sowie eine zunehmende Anämie und Basophilie im Knochenmark und peripheren Blut typisch. Weitere Merkmale für die akzelerierte Phase können eine klonale Evolution des leukämischen Klons und eine persistierende (über vier Wochen andauernde) Splenomegalie sein [6,7]. Unter klonaler Evolution versteht man das Auftreten zusätzlicher chromosomaler Aberrationen während der Evolution.

Neben einer Zunahme dieser Befunde, mit Präsenz von 30% Knochenmarksblasten im peripheren Blut oder im Knochenmark [8], ist ein extramedullärer Befall (so genannte „Chlorome“), wie z.B. in seltenen Fällen ein leukämischer Tumor in der Lunge oder dem Skelett, kennzeichnend für die Blastenkrise. Tab. 1 listet die kennzeichnenden hämatologischen Parameter der einzelnen Phasen der CML auf. Eine international gültige Stadieneinteilung liegt bisher nicht vor.

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Tabelle 1. Befunde der einzelnen Phasen der CML im peripheren Blut und Knochenmark.

Chronische Phase

Akzelerierte Phase

Blastenkrise

Peripheres Blut:

Blasten:

< 10 %

≥ 10% < 30 %

> 30 %

Basophilie:

< 20 %

≥ 20 %

 

Thrombozyten:

≥ 100.000/ μl

< 100.000/ μl

Knochenmark:

Blasten:

≥ 10% < 30 %

> 30 %

zusätzliche Merkmale:

Klonale Evolution des
leukämischen Klons,

Extramedullärer Befall

persistierende Splenomegalie

 

1.1.4 Pathomechanismus der CML

Das herausragende Charakteristikum der CML besteht in dem Auftreten des Philadelphia (Ph)-Chromosoms, das von Nowell et al. als erste zytogenetische Veränderung bei Malignomen entdeckt wurde [9].

1.1.5 Das Philadelphia-Chromosom

Das Ph-Chromosom ist bei 95% der CML Patienten zu finden. Es handelt sich dabei um eine reziproke, balancierte Translokation der langen Arme der Chromosomen 9 und 22 t(9;22)(q34;q11) [10]. Das daraus resultierende verkürzte Chromosom 22 wird in seiner veränderten Form als Ph-Chromosom bezeichnet.

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Bei einem geringen Anteil der Patienten (<5%) lässt sich das Ph-Chromosom mit zytogenetischen Methoden dennoch nicht nachweisen. Die biologische Relevanz dieser Konstellation ist unklar.

1.2 DAS CHIMÄRE BCR-ABL PROTEIN

Die molekulare Konsequenz aus der Translokation t(9;22)(q34;q11) ist eine Fusion des abl-Onkogens mit variablen Sequenzen des Chromosoms 22, den „break point cluster regions (bcr)“. Es entsteht das bcr-abl Fusionstranskript, welches für das chimäre BCR-ABL Protein kodiert. Dieses Protein ist für die krankheitsspezifische Klinik der CML verantwortlich.

Die spezifischen Bruchstellen im abl-Gen und den variablen bcr-Sequenzen werden schematisch in Abb. 1a und 1b gezeigt. Die Transkription des Translokations-Gens resultiert, abhängig von der Bruchstelle im bcr, in drei unterschiedlich schweren Onkoproteinen mit differierendem Molekulargewicht [11].

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Abbildung 1a: abl-Gen und korrespondierendes ABL-Protein.
Schematisch gezeigt wird das abl-Gen, wie auch das dazu korrespondierende ABL-Protein. Die einzelnen Rechtecke repräsentieren die Exons. Pfeile (↑) kennzeichnen die Bruchstellen. Das abl-Gen besitzt zwei alternative Exone. TK steht für Abbildung 1: die kennzeichnende Tyrosinkinasedomäne. Die Länge der Fusionsproteine variiert mit der Größe der BCR-Sequenz. Die ABL-Sequenz ist in allen Fusionsproteinen konstant. (Abbildung modifiziert aus [141, 142]).

Abbildung 1b: bcr-Gen und korrespondierendes BCR-Protein.
Schematisch gezeigt wird das bcr-Gen, wie auch das dazu korrespondierende BCR-Protein. Die einzelnen Rechtecke repräsentieren die Exons. Pfeile (↑) kennzeichnen die Bruchpunkt-Clusterregionen (break point cluster regions: mBCR, MBCR und μBCR), welche in den 190-kD, 210-kD oder 230-kD Onkoproteine resultieren. M = major, m = minor und μ = micro (Abbildung modifiziert aus [141, 142]).

Das 210 kD schwere BCR-ABL Protein P210BCR-ABL entsteht nach Fusion mit der Major-bcr-Region (MBCR). Die Bruchstelle auf dem abl-Gen liegt zwischen den Introns 1a und 1b oder zwischen den Introns 1a und a2 (Abb. 1a). Auf dem bcr-Gen kommt es in der MBCR zum Bruch (Abb. 1b). Die Transkription dieses Fusionsgens resultiert in b2a2 und/ oder b3a2 mRNS, die beide ein P210BCR-ABL kodieren. In den meisten Fällen findet man in den CML-Zellen entweder b2a2 mRNS oder b3a2 mRNS, nur in 5% der Fälle kommen beide Transkripte zusammen vor. P210BCR-ABL tritt bei 95% der Patienten mit CML auf [12].

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Das 190 kD schwere BCR-ABL Protein P190BCR-ABL, das nach Bruch in der minor-BCR-Region (mBCR) entsteht [13], wird bei der CML nur selten gefunden, tritt aber in 10% der Fälle einer akuten lymphatischen Leukämie bei Erwachsenen auf.

Die im Rahmen dieser Arbeit erfassten molekularbiologischen Daten bezüglich des bcr-abl Fusionstranskriptes konzentrieren sich ausschliesslich auf die mRNS, die das P210BCR-ABL kodiert.

Das BCR-ABL Protein P230BCR-ABL wird mit der seltenen Ph-positiven neutrophilen CML assoziiert [14].

1.2.1 Mechanismen der BCR-ABL vermittelten Transformation

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C-abl, das zelluläre Homolog des transformierenden Proteins v-abl, welches in der murinen Abelson-Leukämie gefunden wurde, kodiert eine Tyrosinkinase. Das c-ABL-Protein hat eine streng regulierte Kinaseaktivität und ist sowohl im Nukleus als auch im Zytoplasma der Zelle aktiv. Das BCR-ABL Protein dagegen ist überwiegend im Zytoplasma lokalisiert und durch eine konstitutiv gesteigerte Tyrosinkinaseaktivität gekennzeichnet, welche eine essentielle Bedeutung für die Transformation der Zelle hat [15,16,17].

Andere Domänen des BCR-ABL Proteins dienen zur Bindung von Adapterproteinen, wie dem Protein GRB2, das am Wachstumsfaktor-Rezeptor CRKL, das dem CRK-Protein ähnelt [18,19,20], dem casitas B-Linien lymphoma protein (CBL) und dem SHK-Protein, das SRC Homologien beinhaltet [21]. Über diese Adapterproteine läuft die Aktivierung spezifischer Signaltransduktionswege über das BCR-ABL Protein.

Für die Transformation der BCR-ABL positiven Zellen spielen die Reaktionen über das Ras-Protein, die JAK/STAT-Kinasen und die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI-3) [22,23,24,25] eine bedeutende Rolle. Somit wird die Inhibition der Apoptose der Aktivierung von Ras und PI-3 zugeschrieben [23,24,26].

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P210BCR-ABL phosphoryliert und interagiert ausserdem mit Proteinen, die eine wichtige Rolle bei der zellulären Adhäsion und Zellmotilität spielen, wie z.B. Talin, Tensin, Paxillin, Actin, Vinculin und fokale Adhäsionskinase (FAK). Dadurch kommt es zu Adhäsionsdefekten und Abnormalitäten des Zytoskeletts, die für die BCR-ABL positiven Zellen charakteristisch sind [27].

Die exakte Abfolge der Reaktionen und die Wichtigkeit jedes einzelnen Reaktionsweges ist noch nicht geklärt [28]. Sicher ist jedoch, dass das BCR-ABL Protein Signalkaskaden aktiviert, die auch von bestimmten zytokinstimulierten Rezeptoren zur Regulation der normalen Hämatopoese genutzt werden.

Zusammenfassend ist die BCR-ABL positive Zelle durch eine gesteigerte proliferative Aktivität bzw. eine Hemmung der Apoptose gekennzeichnet, was zum leukämischen Phänotyp führt.

1.2.2 Diagnostik der CML

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Die Diagnose der CML erfolgt durch körperliche Untersuchung, Blutbild, Laborchemie, Knochenmark (KM)-Aspiration, Biopsie und Molekularbiologie.

Das Differentialblutbild und auch das zytologische Bild zeigen krankheitsspezifische Verteilungen der Zellen, wie sie im Abschnitt 2.1.2 beschrieben sind. Im Rahmen der FISH-Technik kann mit Hilfe von bcr-abl spezifischen DNS-Sonden die typische Translokation t(9;22) in Interphasekernen detektiert werden.

Laborchemisch sind im Blut vor allem erhöhte Lactatdehydrogenase- und Harnsäure-Werte zu finden, während die alkalische Leukozytenphosphatase erniedrigt ist oder ganz fehlt.

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Das KM-Aspirat wird verwendet für zytologische und zytogenetische Analysen, sowie Fluoreszenz-in situ-Hybridisationsanalysen (FISH) und Polymerase-Kettenreaktionen (PCR). Zur Beurteilung der KM-Zytogenetik erstellt man ein Karyogramm an Metaphasekernen, das neben der Translokation t(9;22) auch andere chromosomale Aberrationen darzustellen vermag.

1.2.3 Bisherige Therapieoptionen bei der CML

Im Prinzip unterscheidet man in der Behandlung der CML drei therapeutische Ziele:

1. Symptomkontrolle

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2. Zytogenetisches Ansprechen:

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3. Molekulare Remissionen: Bcr-abl Fusionstranskripte sind nicht nachweisbar.

Bis zur Einführung von Zytostatika gab es verschiedene Therapieansätze wie die Splenektomie, die Arsenbehandlung und schliesslich die Radiotherapie [29].

Die ersten zytostatischen Therapieoptionen bestanden in der Gabe von Busulfan und später Hydroxyurea.Busulfan, ein Alkylanz, das auf Stammzellebene wirkt, wurde abgelöst von Hydroxyurea, einem zellzyklusspezifischen Ribonukleotidreduktase- inhibitor der DNS-Synthese, da in einer randomisierten, kontrollierten klinischen Studie gezeigt werden konnte, dass das mediane Überleben für Busulfan-behandelte Patienten kürzer war als das für Patienten, die mit Hydroxurea behandelt wurden [30].

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In den 80er Jahren gewann Interferon-α (IFNα) immer mehr an Bedeutung. Mit Hilfe von IFNα konnte auch das zweite Therapieziel zytogenetischer Remissionen erreicht werden [31]. Es kam zu zytogenetischen Remissionen bei 20-30% der Patienten [32]. Die einzige im Rahmen von Studien erwiesene kurative Therapieoption bei CML ist die allogene Stammzelltransplantation. Aufgrund der therapiebedingten Mortalität und der limitierten Spenderverfügbarkeit kommen nur 15 - 20% der CML-Patienten für eine allogene Transplantation von verwandten Spendern mit identischen „Human Leucocyte Antigen“ (HLA) in Frage. Zieht man zusätzlich HLA-identische, nicht-verwandte Spender heran, erhöht sich die Zahl der mit Knochenmarkstransplantation (KMT) behandelbaren Patienten auf 30%. Die Durchführung einer KMT ist ausserdem durch ein zu hohes Alter des Patienten vor Therapiebeginn limitiert. Die 5-Jahres-Überlebensrate (krankheitsfrei) bei CML-Patienten in chronischer Phase nach allogener KMT liegt in den meisten Studien zwischen 50% und 60% [33,34].

Die Indikationsstellung zu einer der oben erwähnten Therapieoptionen entscheidet sich anhand der etablierten Hasford- bzw. Gratwohl-Scores [35,36].

1.2.4 Prognose der CML

Bei dem Hasford-Score handelt es sich um einen Prognosescore für eine IFNα-Therapie. Dieser setzt neben Alter, Milzgrösse und Blastenanteil im Blut, auch die Anzahl an Basophilen, Eosinophilen und Thrombozyten in Korrelation zum Langzeitüberleben unter Therapie.

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Mit dem Gratwohl-Score lässt sich für jeden einzelnen Patienten ein Risikoscore für eine allogene Stammzelltransplantation errechnen. In diese Berechnung fliessen der Spendertyp, das Krankheitsstadium, das Alter des Patienten, die Geschlechterkombination von Spender und Patient und die Zeitdauer zwischen Diagnosestellung und Transplantation ein [35,36]. Bei Patienten, die eine medikamentöse Therapie erhalten, ist die zytogenetische Remission ein sogenannter Surrogatmarker für ein verbessertes Langzeitüberleben [37].

1.3 ECHTZEITFLUORESZENZ-POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

1.3.1 Das Prinzip der Methode

Die quantitative Echtzeitfluoreszenz-PCR basiert auf einer Detektion von Fluoreszenz-signalen, welche im Verlauf der Amplifikation eines PCR-Produktes kontinuierlich erzeugt werden. Den entscheidenden Fortschritt dieses Systems im Vergleich zur konventionellen PCR stellt die Einführung von fluorogenen Sonden dar [38]. Das Fluoreszenzmonitoring während der Amplifikation basiert auf dem Prinzip, dass es zu einem Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei benachbarten fluoreszenzmarkierten, sequenzspezifischen Oligonukleotiden kommt, die in einer bestimmten räumlichen Nähe zueinander an die Zielsequenz gebunden sind.

Diese Methode setzt einen fluoreszenzmarkierten Primer und eine fluoreszenzmarkierte Sonde voraus oder aber eine 3´-fluorochromtragende Sonde in Kombination mit einer 5´-fluorochromtragenden Sonde, die beide so konstruiert sind, dass sie auf demselben Strang zwischen einem Primerpaar an die DNA binden. Beide Primer tragen in diesem Falle keine Fluoreszenzfarbstoffe.

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Bei der quantitativen Echtzeitfluoreszenz-PCR handelt es sich somit um eine automatisierte Prozedur, die es einfach und schnell ermöglicht, 96 Proben gleichzeitig zu messen. Die PCR-Produkte werden im geschlossenen Gefäss detektiert. Durch das Fehlen notwendiger post-PCR-Schritte wird die Kontaminationsgefahr gesenkt. Zudem kann durch die Generation von Standardkurven die absolute Templatmenge bestimmt werden. Die Quantifizierung der Gensequenz wird während der exponentiellen Phase der PCR-Reaktion errechnet und nicht wie konventionell erst am Ende der PCR.

Eine gesteigerte Spezifität wird durch die Tatsache erzielt, dass drei Oligonukleotide (2 Primer und eine Sonde) spezifisch an die DNS binden. Insgesamt werden dadurch präzisere und zuverlässigere Ergebnisse erzielt.

1.3.2 Das Prinzip der Taqman-Hybridisierungssonden

Das Prinzip der Signalentstehung mit TaqMan-Hybridisierungssonden ist in Abb. 2 dargestellt. Ein Reporter-Fluorochrom (gewöhnlich 6-Carboxyfluorescein [6-FAM]) ist am 5´-Ende der DNS befestigt, und ein Quencher-Fluorochrom (z.B. 6-Carboxy-tetramethyl-Rhodamin [TAMRA]) ist an einer beliebigen T-Position oder am 3´-Ende angefügt. Zwischen Reporter und Quencher findet durch die räumliche Nähe ein Fluoreszens-Resonanz-Energietransfer (FRET) statt, bei dem das Fluoreszenzsignal des Reporters unterdrückt wird.

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Verlängert die Thermophilus aquaticus (Taq) DNA-Polymerase dann jedoch den Primer (Polymerisation), hydrolysiert die Polymerase die Sonde durch ihre intrinsische 5´-3´-Nukleaseaktivität. Der Abstand zwischen Quencher und Reporter verändert sich, so dass die Unterdrückung des Reporter-Fluoreszenzsignales wegfällt. Die Spezifität bleibt dadurch gewährleistet, dass nur gebundene Sonden von der Taq-Polymerase hydrolysiert werden und eine Extension gebundener Sonden, mittels Blockade des 3‘-Endes durch einen Phosphatrest, verhindert wird.

Die Menge an Fluoreszenz, die während des Amplifikationszyklus freigesetzt wird, steht im Verhältnis zu der Menge an PCR-Produkten, die in jedem Zyklus gebildet wird.

Abbildung 2: Prinzip der quantitativen Echtzeitfluoreszenz-PCR via TaqMan. Die Taq-Polymerase hydrolisiert die Sonde durch ihre intrinsische 5´-3´-Nukleaseaktivität. Die räumliche Nähe, und damit der Fluoreszenz-Energietransfer, zwischen Reporter und Quencher wird auf diese Weise unterbrochen. Der Reporter emittiert nun ein Fluoreszenzsignal. Bei Reporter und Quencher handelt es sich um zwei verschiedene Fluorochrome.
Forward Primer, Reverse Primer und die Sonde sind spezifische Oligonukleotide (Roche Handbuch).

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Zur Echtzeitfluoreszenz-Detektion der PCR dient das Abi Prism 7700 SDS-Detektionssystem. Es besteht aus einem 96 Reaktionsgefässe fassenden Thermocycler mit optischem Heizdeckel, der sowohl mit einem Argonlaser (488nm) als auch mit einer charge-coupled device (CCD) Kamera – einem optischen System mit ladungsträger-gekoppelter Schaltung – verbunden ist. Der Strahl des Lasers wird über einen dichroidischen Spiegel zu einem Multiplexer umgeleitet und von dort über Glasfasern und durch Linsen, die über jedem einzelnen Reaktionsgefäss positioniert sind, zu den Proben gesandt. Die Fluoreszenzemissionen des Reporterfarbstoffes werden durch dieselbe Faser über einen Spektrographen geleitet und zur CCD-Kamera geschickt, wo sie analysiert und in ein digitales Signal umgewandelt werden. Die Emissionen werden alle 7 Sekunden gemessen.

Die Sensitivität der Detektion ermöglicht die Messung der Daten noch während der exponentiellen Phase der PCR. Dabei wird der Zyklus bestimmt, bei dem die Emissionsintensität des Reporterfarbstoffes das Hintergrundrauschen übersteigt. Dieser wird als „threshold cycle (Ct)“ bezeichnet. Der Ct liegt mitten in der exponentiellen Phase der Reaktion und ist zuverlässiger als eine End-Punkt-Messung von angehäuften PCR-Produkten, wie es bei der herkömmlichen PCR-Methode der Fall ist.

Die quantitative Echtzeitfluoreszenz-PCR ist eine akkurate Methode zur Detektion spezifischer Gensequenzen mit hoher Sensitivität und Präzision. Dieses Detektionssystem ermöglicht eine Quantifizierung von DNS und RNS ohne arbeitsaufwändige „post-PCR“ Schritte. Das System ermöglicht die Detektion von spezifischen Gensequenzen innerhalb einer breiten Spannweite (mind.
5 Grössenordnungen an Kopien-Zahlen).

1.3.3 Das Prinzip der HybProbe®-Hybridisierungssonden mittels Lightcycler

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Der LightCycler© ist ein Mikrovolumen-Fluorometer mit integriertem Thermocycler, das eine Schnellzyklus-DNS-Amplifikation infolge von sehr hohen Heiz- und Kühlraten mit einem Echtzeit-Monitoring der Fluoreszenz kombiniert [39].

Hier basiert das Fluoreszenzmonitoring während der Amplifikation auf dem Prinzip, dass ein Fluoreszenzsignal entsteht, wenn es zu einem Fluoreszenzresonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei fluoreszenzmarkierten, sequenzspezifischen Oligonukleotiden kommt, die nach der Hybridisierung auf demselben Strang benachbart gebunden vorliegen (Abb. 3) [40]. Der Donor-Fluoreszenzfarbstoff wird angeregt von einer Lichtquelle im LightCycler©. Ein Teil dieser Lichtenergie wird vom Donor- auf das Akzeptorfluorochrom übertragen. Die dann emittierende Fluoreszenz wird gemessen und ist proportional zur Menge an spezifischen Zielsequenzen im Reaktionsmix.

Abbildung 3: Energieübertragung im LightCycler©.
Im Gegensatz zur Real-time PCR via TaqMan kommt es hier gerade nur dann zu Fluoreszenzemission, wenn sich Donor und Akzeptor in räumlicher Nähe befinden. Donor und Akzeptor stellen zwei verschiedene Fluorochrome dar. Hv ist die Lichtenergie, die den Donor anregt. Dadurch kommt es zu einem Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) [www.unizh.ch/ wwwikc/ md2003/landt_2003.pdf].

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Der Transfer der Resonanzenergie zwischen beiden Fluoreszenzen verstärkt sich durch Abkühlung, mit deren Hilfe Primer/Sonde oder Sonde1/Sonde2 an den DNS-Strang binden, und die Donor- und Akzeptorfluoreszenz in enge Nachbarschaft gebracht werden. Ein Erhöhen der Temperatur führt dann umgekehrt zum Lösen von Primer und Sonden, was einen Abbruch des Energietransfers zur folge hat.

1.3.4 DNA-Schmelzpunktanalysen

Während in der Echtzeitfluoreszenz-PCR die Fluoreszenzmessung mit jedem Zyklus eine Schätzung über die Kopien-Zahl am Anfang ermöglicht und demnach eine quantitative Aussage gemacht werden kann, ist es möglich, im Anschluss an eine PCR durch Schmelzen – langsames Aufheizen von 45°C bis zu 85°C – eine qualitative Information über das Amplikon zu erzielen.

Diese Methode eignet sich zur Genotypisierung und Mutationsdetektion. Durch die unterschiedlichen Schmelztemperaturen der kurzen spezifischen Doppelstränge, wie es bei den fluoreszenzmarkierten Primern und Hybridisierungssonden der Fall ist, ist es möglich, einzelne Basenveränderungen im Amplikon zu identifizieren (Abb. 4) [41,42].

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Im Rahmen einer Mutationsanalyse muss ein fluoreszenzmarkierter Primer nahe der Mutationsstelle positioniert sein und die Sonde den umschriebenen Mutationslokus überspannen. Arbeitet man mit zwei Hybridisierungssonden, müssen diese so konzipiert sein, dass eine davon den umschriebenen Mutationslokus überspannt und die andere in enger Nachbarschaft zur ersten an den selben Strang bindet.

Die Schmelztemperatur (Tm) eines bestimmten Oligonukleotids (Primer bzw. Hybridisierungssonden) beschreibt die Temperatur, bei der 50% des Oligonukleotids nicht hybridisiert vorliegen. Tm wird abgeleitet vom Wendepunkt oder vom maximalen Amplitudenwert der 1. Ableitung einer Kurve in einem Diagramm, das die Fluoreszenz gegen die Temperatur abbildet. Sie ist für jedes Oligonukleotid charakteristisch und hängt von der Länge, dem G:C-Gehalt, der Sequenzreihenfolge und der Watson-Crick-Paarung ab [43]. Liegt ein „Basenpaar-Mismatch“ vor, vermindert sich die Stabilität der Bindung zwischen DNS und Oligonukleotiden. Die „Mismatch-Oligonukleotide“ lösen sich im Vergleich zu komplett komplementären Oligonukleotiden beim Schmelzen schon bei einer niedrigeren Temperatur und es kommt zu einer Verschiebung der Schmelzkurve. Die Richtung der Verschiebung hängt davon ab, ob man eine mutations- oder wildtypspezifische Sonde verwendet.

Abbildung 4: Mutationsanalyse durch Erstellen von Schmelzkurven.
Ein Mismatch oder Match zwischen Oligonukleotiden und spezifischer Gensequenz lässt sich durch eine Verschiebung in der ersten Ableitung der Schmelzkurve (dF/dt) unterscheiden. Spezifische Oligonukleotide, die 1-5 Nukleotide (nt) auseinander liegen, tragen den Fluoreszenz-Donor und den Fluoreszenz-Akzeptor [www.unizh.ch/wwwikc/ md2003/landt_2003.pdf].

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Hybridisierungssonden werden in der Humangenetik zur Detektion von Sequenzvariationen genutzt. So sind Mutationen im Faktor V (Resistenz gegen aktiviertes Protein C) [42], HFE (vererbte Hämatochromatose) [44] und CFTR (zystischer Fibrose) [45] mit Hilfe von Hybridisierungssonden detektiert worden.

1.4 PEPTIDE NUCLEIC ACID (PNA)-ASSAY

Der Peptide Nucleic Acid (PNA)-Assay kombiniert das PNA-vermittelte PCR-Clamping mit der Sequenz-sensitiven Identifikation durch Hybridisierungssonden.

Bei der PNA handelt es sich um eine DNS-Imitierung, bei der das für die DNS typische Phosphoribose-Rückgrat durch eine peptidähnliche Aneinanderreihung von (2-Aminoethyl)-Glycin-Einheiten ersetzt wird [46]. Dieser chemische Unterschied ist der Grund dafür, dass die PNA komplementären Sequenzen in einer Watson-Crick-Hydrogenbindung mit einer höheren thermalen Stabilität als die korrespondierenden Desoxyribonukleotide bindet [47,48].

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Bei nicht-komplemetärer Bindung auf Einzelbasenpaar-Ebene sind die PNA/DNS-Hybride instabiler als die korrespondierenden DNS/DNS-Hybride. Ausserdem kann die PNA nicht als Primer für die DNS-Polymerase fungieren und wird damit durch sie nicht verlängert. Der Gebrauch von PNA verbessert die Allel-spezifische PCR durch Unterdrückung der Amplifikation der Hintergrundvariante [49]. Eine spezifische PNA klammert an eine Zielsequenz, so dass deren Amplifikation während der PCR blockiert wird.

Thiede et al. und Behn et al. etablierten Assays, in denen sie Wildtyp-spezifische PNA und mutationsspezifische Primer benutzten [50,51]. Eine Wildtyp-spezifische PNA vermindert demzufolge die Amplifikation des Wildtyps. Bei Kombination einer Wildtyp-spezifischen PNA mit einer mutationsspezifischen Hybridisierungssonde, wird das Fluoreszenzsignal des Wildtypproduktes durch die PNA unterdrückt und somit eine exakte Quantifizierung des mutierten Allels trotz Überschuss an Wildtyp-DNS im Hintergrund ermöglicht.

1.5 DER BCR-ABL SPEZIFISCHE TYROSINKINASEINHIBITOR IMATINIB (STI 571)

Mit zunehmender Kenntnis der Pathogenese der CML wurde versucht, spezifische Therapieverfahren zu entwickeln wie z.B. spezifische Antikörper gegen BCR-ABL. Dieser Versuch scheiterte aber genauso wie der Versuch, bcr-abl spezifische Antisense-Oligonukleotide zu benutzen.

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Als dritte Möglichkeit stand theoretisch der Einsatz kleiner Moleküle zur Verfügung, die beispielsweise zu einer Hemmung spezifischer Signaltransduktionskaskaden führen könnten. In der Praxis war die Durchführung dieser Methode zu jener Zeit jedoch nicht möglich.

1996 beschrieben Druker et al. zum erstenmal die Hemmung der Abl-Tyrosinkinase durch einen selektiven Inhibitor [52].

1.5.1 Imatinib – Struktur und Wirkungsmechanismus

Das 2-Phenylaminopyrimidinderivat Imatinib (C30H35N7SO4, früher benannt als CGP57148B oder STI571, auch bekannt als Glivec) ist ein potenter Inhibitor der BCR-ABL Tyrosinkinase. Imatinib hat ein Molekulargewicht von ~590 kD und hemmt relativ spezifisch die Proliferation v-abl- und bcr-abl exprimierender Zellen. Der Wirkungsmechanismus dieses Inhibitors besteht in der selektiven und kompetitiven Hemmung sowohl der c-Abl als auch der BCR-ABL Tyrosinkinase durch Verhindern der Bindung des Adenosintriphosphats (Abb. 5). Auf molekularer Ebene kommt es hierbei zur Hemmung der Autophosphorylierung [53].

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Abbildung 5: Schema der Struktur des Wirkungsmechanismus von Imatinib (STI 571).
Imatinib blockiert die Adenosintriphosphatbindungsstelle und hemmt somit kompetitiv sowohl die ABL- als auch BCR-ABL Tyrosinkinase [aus dem Editorial, NEJM, 2001, 344, April 5, S. 1084].

1.5.2 Untersuchung zur Wirkung im zellfreien System

Imatinib hemmte die Substratphosphorylierung der v-Abl-Tyrosinkinase um 50% mit einer Konzentration (IC50) von 0,038μM und die der BCR-ABL und c-Abl-Tyrosinkinase mit einer Konzentration (IC50) von 0,025μM. Bei anderen Proteintyrosinkinasen und Serin-/Threoninkinasen, wie z. B. Proteinkinase A und C, Phosphorylasekinase und Caseinkinasen kam es zu keiner signifikanten Hemmung (IC50-Wert >100). Lediglich der platelet derived growth factor (PDGF)-Rezeptor und c-kit wiesen eine ähnliche Hemmungssensibilität gegenüber Imatinib wie c-Abl oder BCR-ABL auf [52,54].

1.5.3 In vitro-Untersuchung zur Wirkung

Ausgehend von diesen zellfreien Untersuchungen zeigte Imatinib in vitro in Zelllinien eine Hemmung der Autophosphorylierung von BCR-ABL und c-Abl mit einer IC50 von 0,25μM. Die Selektivität von Imatinib in intakten Zellen zeigte sich durch einen proliferationshemmenden Effekt auf v-abl-transformierte PB-3c Zellen mit einer IC50 von 0,1μM [55]. Diese ersten Ergebnisse wurden ergänzt durch die Feststellung einer spezifischen Hemmung der proliferativen Aktivität bei bcr-abl transformierten Zellen [52].Weitere Experimente zeigten, dass durch den Tyrosinkinaseinhibitor eine Proliferation von BCR-ABL positiven, humanen (KCL22, BV173, K562, KU812, LAMA84 und MC3) und BCR-ABL negativen, nicht humanen Zelllinien (Daudi, NB4, NB4.306, U937, KG1 und DHL1) und Stammzellen von CML-Patienten anhaltend gehemmt werden konnte, ohne Kontrollzellen zu beeinflussen. Durch Westernblot-Experimente wurde eine Phosphorylierungshemmung bestätigt und mit durchflußzytometrischen Unter-suchungen erwiesen, dass Imatinib zu einer Induktion der Apoptose führt [56].

1.5.4 In vivo-Untersuchung zur Wirkung

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Druker et al. zeigten weiterhin die Effektivität Imatinibs an syngenen C3H/HEJ-Mäusen, die mit BCR-ABL exprimierenden Zellen inokuliert wurden [52]. Bei diesen Versuchen konnte zunächst eine konzentrationsabhängige Hemmung des Tumorwachstums – im Vergleich zu Kontrolltieren – gezeigt werden, die jedoch nicht zur kompletten Tumorzelleradikation führte. Eine 100%ige Tumoreradikation wurde bei nu/nu-Mäusen, T-Zellen defizienten Mäusen, nach oraler Gabe von Imatinib alle 8h über 11 Tage erreicht. Diesen Mäusen wurden vorher bcr-abl positive Zellen subkutan inokuliert, die daraufhin als solider bcr-abl positiver Tumor wuchsen. Es bestand ein Zusammenhang zwischen steigender initialer Tumormasse und abnehmender Effektivität der Wirkung des Imatinib [57].

1.5.5 Klinische Studien mit Imatinib

Aufgrund der vielversprechenden experimentellen Ergebnisse wurden 1998 die ersten klinischen Phase I -Studien durchgeführt. Druker et al. 2001 rekrutierte 83 Patienten in chronischer Phase in eine Phase I- Studie, die auf eine IFNα-haltige Therapie nicht mehr ansprachen [58].

Die Patienten wurden in 14 Dosiskohorten von 25-1000mg Imatinib, oral, 1x/d eingeteilt. Die Nebenwirkungen waren gering. Am häufigsten traten Nausea, Myalgien, Ödeme, besonders Periorbitalödeme, und Diarrhoen auf. Ein hämatologisches Ansprechen im Sinne einer Reduktion leukämischer Zellen im peripheren Blut zeigte sich bei allen Patienten, die >140mg/d Imatinib erhielten. Bei Dosen >300mg zeigten 53/54 Patienten (98%) ein komplettes hämatologisches Ansprechen mit Normalisierung des peripheren Blutbildes. Von diesen 54 Patienten, die 300mg und mehr Imatinib bekamen, hatten 29 (53%) ein zytogenetisches Ansprechen, darunter waren 7 Patienten mit kompletter zytogenetischer Remission.

↓26

Zur Beurteilung der Aktivität von Imatinib bei CML in Blastenkrise und Ph-positiver Akuter Lymphozytärer Leukämie (ALL) wurden 58 Patienten in eine Pilotstudie mit Dosiseskalation eingeschlossen [59]. Während dieser Studie traten infolge der Progredienz der Krankheit 16 Todesfälle auf. Kein Todesfall wird im Zusammenhang mit der Imatinib-Gabe gesehen. Hauptnebenwirkungen waren Übelkeit, Erbrechen und Ödembildung. Der Anteil peripherer Blasten nahm innerhalb der ersten Woche nach Beginn der Therapie bei 79% der Patienten ab.

Zur Prüfung von Wirksamkeit des Imatinib gab es zentrale Phase II-Studien, die man als Studie CSTI571-0113, Studie CSTI571-0114 und CSTI571-0115 bezeichnet.

In Studie CSTI571-0113 wurden 532 Patienten in chronischer Phase rekrutiert, bei denen eine Therapie mit IFNα gescheitert war. Verabreicht wurde eine tägliche orale Dosis von 400 mg Imatinib. Von den 454 Patienten mit bestätigter Diagnose einer CML in chronischer Phase zeigten 60% ein Major-zytogenetisches Ansprechen und 95% ein komplettes hämatologisches Ansprechen. Nach 18 Monaten war die CML in 89% der Patienten nicht in eine akzelerierte Phase oder Blastenkrise fortgeschritten und 95% der Patienten lebten noch. Nicht hämatologische Nebenwirkungen entsprachen denen der Phase I-Studie. Hämatologische Nebenwirkungen waren Neutropenien (35,1%), Leukopenien (23,7%), Anämien (7,7%) und Thrombozytopenien (19,9%) [60].

↓27

In einer zweiten Phase II -Studie (CSTI571-0114) wurden 181 Patienten mit akzelerierter Phase rekrutiert. Die Patienten wurden täglich mit 400 oder 600 mg Imatinib behandelt. Ein hämatologisches Ansprechen war bei 82% der Patienten zu verzeichnen, wobei es sich in 34% der Patienten um ein komplettes Ansprechen handelte. Die Rate des Major-zytogenetischen Ansprechens betrug 24% und die des kompletten 17%. Nebenwirkungen waren vergleichbar mit denen in der Studie der chronischen Phase-Patienten. Eine tägliche Dosis von 600 mg war im Vergleich zu einer täglichen Dosis von 400 mg noch effektiver. Dabei lag die Rate des zytogenetischen Ansprechens vergleichsweise höher (28% statt 16%), die Dauer des Ansprechens war verlängert (79% statt 57% nach 12 Monaten), und die Überlebensrate (78% statt 65% nach 12 Monaten) war ebenso gestiegen [61].

In einer dritten Studie (CSTI571-0115) wurden 229 Patienten mit CML in Blastenkrise untersucht. Verabreicht wurde eine tägliche orale Dosis von 600 mg Imatinib. 52% der Patienten zeigten ein hämatologisches Ansprechen, das bei 31% der Patienten mindestens vier Wochen andauerte und bei davon 8% komplett war. 16% der Patienten zeigten ein major-zytogenentisches Ansprechen, davon 7% ein komplettes zytogenetisches Ansprechen. Nebenwirkungen sind bei 47 Patienten (18%) berichtet worden, wobei es sich hierbei meist um hämatologische Toxizitäten handelte, wie Neutropenie oder Thrombozytopenie. Bei 5% der Patienten kam es zum Abbruch der Therpie mit Imatinib meist aufgrund von Zytopenie, dermatologischen Toxizitäten und gastrointestinalen Reaktionen. Die mittlere Überlebenszeit lag bei 6,9 Monaten [62].

Die primäre Monotherapie mit Imatinib in neu diagnostizierter CML wird in einer multizentrischen, randomisierten Phase III -Studie mit der Standardtherapie, bestehend aus IFNα und Arabinosylcytosin (AraC) verglichen. 553 Patienten wurden mit Imatinib und 553 Patienten mit einer Kombination aus IFNα und AraC behandelt. Es gab die Möglichkeit eines Crossovers von einem Therapiearm in den anderen bei inadäquatem Ansprechen. Bislang wechselten 318 Patienten (57,5%) von einer IFNα-Kombinationstherapie zu einer Behandlung mit Imatinib. Demgegenüber tauschten nur 11 Patienten (2,0%) vom Imatinib-Arm zum IFNα-Arm. Primäres Studienziel stellte die Evaluierung des hämatologischen und zytogenetischen Ansprechens (Tab. 2), der Progressionsraten und der Nebenwirkungen dar [63].

↓28

Tabelle 2. Hämatologische und zytogenetische Ansprechraten unter Therapie mit Imatinib und IFN+AraC nach einem mittleren Follow-up von 19 Monaten [63]. 95%-Konfidenzintervall in runden Klammern. Definitionen des zytogenetischen Ansprechens: siehe Abschnitt 2.1.4.

Therapieschema
(n=Anzahl der Patienten)

Imatinib(553)

IFNα+Ara C(553)

Komplettes hämatologisches Ansprechen [%]:

95,3 (93,2-96,9)

55,5 (51,3-59,7)

Zytogenetisches Ansprechen [%]:

Major [%]

85,2 (81,9-88,0)

22,1 (18,7-25,8)

Komplett [%]

73,8 (69,9-77,4)

8,5 (6,3-11,1)

Partiell [%]

11,4 (8,9-14,3)

13,6 (10,8-16,7)

Imatinib induzierte bei Patienten, die von der Kombinationstherapie IFNα-AraC wechselten, ein komplettes hämatologisches Ansprechen bei 82,4% und ein komplettes zytogenetisches Ansprechen bei 39,6% [63].

1.6 RESISTENZMECHANISMEN GEGEN IMATINIB UND PROGNOSTISCHE PARAMETER

Bereits vor der Therapiemöglichkeit mit Imatinib konnte gezeigt werden, dass es im Krankheitsprogress von CML gehäuft zum Auftreten zusätzlicher chromosomaler Veränderungen kommt, die letztendlich durch die genetische Instabilität der bcr-abl positiven Zellen erklärt werden kann.

↓29

Verändert sich der leukämische Klon in solcher Weise, dass das Therapeutikum nicht mehr wirksam ist, spricht man von einem Resistenzmechanismus intrinsischer Art. Diese Zellen sind dann auch ex vivo resistent. Von den intrinsischen Resistenzmechanismen sind die extrinsischen Resistenzmechanismen zu unterscheiden. Im Rahmen extrinsischer Resistenzmechanismen bleibt die Sensitivität der Zielzelle unbeeinflusst, sie weist eine ex vivo-Resistenz auf. Ein gutes Beispiel wäre in diesem Falle eine Induktion von spezifischen Antikörpern oder Enzymen wie auch eine erhöhte Plasma-Eiweissbindung.

Mit der Entwicklung Imatinib-resistenter bcr-abl positiver Zelllinien fokussierten aktuelle Arbeiten das Thema der Resistenzentstehung gegenüber Imatinib. Im Falle von Imatinib werden Genamplifikation, eine Expression des Multidrug-Resistance-Proteins (MDR1), das als Drug-Effluxpumpe funktioniert, Mutationen und klonale Evolution als intrinsische Resistenzmechanismen und das Plasmaprotein 1-saures Glykoprotein (AGP) als extrinsischer Resistenzmechanismus diskutiert.

1.6.1 Intrinsische Resistenzmechanismen

1.6.1.1 Amplifikation des bcr-abl Gens

Die Amplifikation des bcr-abl Gens ist der erste beschriebene Resistenzmechanismus gegenüber Imatinib. Die erste Zelllinie, die gegenüber Imatinib als resistent beschrieben wurde, war die humane Zelllinie LAMA84 R, die ursprünglich von einem CML-Patienten in Blastenkrise stammt. Durch Inkubation der bcr-abl positiven LAMA84-Zelllinie mit langsam steigender Konzentration an Imatinib entstand nach 7 Monaten LAMA84 R, die auch bei Konzentrationen von 3μM Imatinib noch proliferierte. LAMA84 R unterschied sich von der nicht resistenten LAMA84 durch eine signifikante Reduktion der apoptotischen Zellen und durch vierfach erhöhte Expression des BCR-ABL Fusionsproteins [64].

↓30

Zytogenetischen Untersuchungen zeigten dann in Zelllinien, dass die Überexpression des BCR-ABL Fusionsproteins auf eine Amplifikation des bcr-abl Fusionstranskriptes zurückzuführen ist [64,65,66]. Die klinische Relevanz dieses Resistenzmechanismus wurde später von Gorre et al. beschrieben, die bei Imatinib-behandelten Patienten im Rezidiv eine bcr-abl Genamplifikation nachweisen konnten [67,68].

1.6.1.2 Multidrug Resistance 1 (MDR1) Protein

Das MDR1 Gen kodiert das P-Glykoprotein (Pgp, Synonym: MDR1 Protein) [69]. Es handelt sich um ein 170 kd-Protein, das transmembranös lokalisiert ist. Beim MDR1 Proteinmolekül handelt es sich um eine hydrophobe, porenähnliche Struktur [70]. Das MDR1 Protein bindet und transportiert neutrale oder positiv geladene, hydrophobe Verbindungen. Die biologische Funktion des Proteins ist jedoch nicht bekannt. Es wird in einigen normalen Geweben z.B. der Nebennierenrinde, den proximalen renalen Tubuli und den intrahepatischen Gallengängen, vor allem aber auch in zytologisch-resistenten malignen Zellen exprimiert [71].

In Zytostatika-resistenten Zellen agiert das MDR1 Protein als Drug-Efflux-Pumpe. Die Fähigkeit, verschiedene Medikamente aus der Zelle zu exportieren bevor sie ihre kritische zytotoxische Konzentration erreicht haben, ist auf die Hydrolyseaktivität des MDR1 Proteins und der damit verbundenen Transportfähigkeit zurückzuführen [72]. Dieses Schema einer Effluxpumpe wurde durch Sequenzanalysen [73] und durch Transfektionsversuche in verschiedenen Typen von Zellen bestätigt [74,75,76].

↓31

Resistenz durch MDR1 Proteinüberexpression ist z.B. beim myelodysplastischen Syndrom (MDS) und der akuten myeloischen Leukämie (AML) beschrieben worden [77,78,79,80,81]. Klinische Daten zeigten, dass eine MDR1 Proteinüberexpression bei AML mit einer schlechten Prognose einhergeht [81,82]. Bei CML-Patienten in Blastenkrise wurde in mehreren Studien ebenfalls eine gesteigerte MDR1 Proteinexpression detektiert werden [83,84,85,86].

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der MDR1 RNS-Gehalt im Krankheitsverlauf von CML-Patienten unter Imatinib-Therapie untersucht, um die Bedeutung des MDR1 Proteins als Resistenzmechanismus gegenüber Imatinib zu prüfen.

1.6.1.3 bcr-abl Genmutation

Das Auftreten von Punktmutationen an unterschiedlichen Lokalisationen in der Tyrosinkinasedomäne stellt den bedeutensten Mechanismus intrinsischer Resistenz dar. Gleichzeitig erweist sich, dass das Auftreten von Punktmutationen die wichtigste klinische Relevanz hat.

↓32

Gorre et al. beschreiben als erste Punktmutationen in bcr-abl positiven Zellen von Patienten, die zu einer intrinsischen Resistenz gegenüber Imatinib führten [67]. Ein Aminosäurenaustausch (T315I-Mutation, Austausch von Threonin gegen Isoleucin) in der 579-Basenpaarregion, die die ATP-Bindungsstelle und die Aktivierungsschleife der Kinasedomäne des BCR-ABL Proteins bildet, führt zu einer sterischen Veränderung der Imatinib-Bindungsstelle, die die Bindung von Imatinib verhindert. In Tab. 3 sind weitere Mutationen aufgelistet, die von verschiedenen Forschungsgruppen im laufe der Zeit identifiziert wurden und sich entweder im Bereich der Bindungsstelle oder des Aktivierungsloops befinden. Die häufigsten Mutationen betreffen die Aminosäuren E255 und T315. In Position 255 wird Glutamin durch Lysin (E255L) oder Valin (E255V) ersetzt.

mrs:

Tabelle 3. bcr-abl – Genmutationen, die bereits beschrieben und lokalsiert worden sind.

Mutation

Position der Mutation

M244V [87]

G250E [88]

Nukleotidbindungsloop

Q252H [87]

Nukleotidbindungsloop

Q252R [87]

Nukleotidbindungsloop

Y253H [89]

Nukleotidbindungsloop

Y253F [90]

Nukleotidbindungsloop

E255K [91]

Nukleotidbindungsloop

E255V [68]

Nukleotidbindungsloop

V289A [92]

Imatinib-Bindungsstelle

F311T [93]

T315I [67]

Imatinib-Bindungsstelle

F317L [88]

Imatinib-Bindungsstelle

M343T [87]

M351T [88]

C-terminaler Bereich

E355G [87]

C-terminaler Bereich

F359V [87]

Imatinib-Bindungsstelle

V379I [87]

C-terminaler Bereich

F382L [87]

L387M [87]

H396P [89]

Aktivierungsloop

H396R [87]

Aktivierungsloop

F486S [94]

C-terminaler Bereich

1.6.1.4 Klonale Evolution

Neben der Einteilung in intrinsische und extrinsische Resistenzmechanismen muss für einen erfolgreichen Therapieansatz auch zwischen einem BCR-ABL abhängigen und einem BCR-ABL unabhängigen Resistenzmechanismen unterschieden werden. Die Akkumulation zusätzlicher chromosomaler Aberrationen neben dem Ph-Chromosom wird als klonale Evolution bezeichnet. Chromosomale Aberrationen wie z.B. Trisomie 8 und Veränderungen der Chromosomen 7 und 9 (Mutationen oder Deletionen in p53 und p16 [95] treten in der Akzelerationsphase typischerweise auf. Eine klonale Evolution des leukämischen Klons führt durch weitere chromosomale Veränderungen in den Zellen dazu, dass die Bedeutung des BCR-ABL Protein als Pathomechanismus verloren geht.

↓33

Der Progress der Krankheit hängt dann nicht mehr primär von BCR-ABL ab, sondern nimmt seinen Verlauf als Konsequenz anderer sekundärer, onkogener Veränderungen in der Zelle.

1.6.2 Extrinsische Resistenzmechanismen

1.6.2.1 α1-saures-Glykoprotein (α1sGP, AGP)

Im Rahmen von in vivo-Untersuchungen an Nacktmäusen, die mit BCR-ABL positiven Zelllinien inokuliert wurden, konnte im Anschluss an eine orale Therapie mit Imatinib die Entstehung resistenter Tumore beobachtet werden [64,65].

Die in den in vivo-Experimenten aufgetretene Resistenz gegenüber Imatinib stellte sich nicht als zellulär vermittelt dar, sondern vielmehr durch den Organismus der Mäuse vermittelt dar [96]. Eine derartige Resistenz könnte beispielsweise durch die Induktion neutralisierender Antikörper gegen Imatinib oder aber auch durch eine gesteigerte Plasmaproteinbindung des Tyrosinkinaseinhibitors zustande kommen. Dementsprechend wurden gezielt in Frage kommende Plasmaproteine hinsichtlich ihrer Bindungsaffinität geprüft, und das hepatisch sezernierte AGP identifiziert.

↓34

Das humane AGP, auch als Orosomukoid bezeichnet, ist ein stabiles Plasmaprotein, das hauptsächlich in der Leber synthetisiert wird . Als einzelkettiges Glykoprotein hat es in nativer Form ein Molekulargewicht von 40 kD. Während Albumin, ein in der Leber synthethisiertes, globuläres Protein, eher für die Plasmabindung von sauren Substanzen verantwortlich ist, bindet AGP eher basische und neutrale Substanzen. Mit unterschiedlicher Affinität ist AGP in der Lage, eine Bandbreite verschiedener Substanzen, von Steroiden über Antibiotika bis hin zu Antidepressiva zu binden [97]. Der Plasmaspiegel variiert sehr stark in Abhängigkeit zu verschiedenen physiologischen und pathologischen Bedingungen.

AGP gehört, wie auch das C-reaktive Protein, zu den sogenannten Akute-Phase-Proteinen. Der Plasmaspiegel steigt z.B. als Konsequenz von akuten Infektionen oder Entzündungen und ist erhöht bei Schwangerschaft, nach Myokardinfarkt, bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (z.B. Colitis ulcerosa oder Morbus Crohn) sowie bei Patienten mit Tumorleiden oder bei hämatologischen Malignitäten [98]. Ganz et al. demonstrierten auch einige Fälle von CML-Patienten in Blastenkrise, die einen erhöhten Plasmaspiegel an AGP aufwiesen. Genauere Daten über eine Korrelation zwischen klinischen Stadien der CML und der stadienabhängigen Expression von AGP liegen bis dato allerdings nicht vor.

Nach der Entstehung einer intrinsischen Resistenz gegenüber Imatinib auf in vitro-Ebene in LAMA84-Zellen [64] wurden bei Mäusen mit rezidivierten Tumoren nach Schnittinzision des subkutan gelegenen Tumors bcr-abl positive Zellen entnommen und hinsichtlich ihrer Sensibilität gegenüber Imatinib untersucht. Interessanterweise zeigte sich im Rahmen dieser Untersuchung kein Unterschied der IC50 im Vergleich zur parenteralen KU812-Zelllinie. Die resistenten Tiere zeigten im Vergleich zu Kontrolltieren trotz oraler Gabe von Imatinib keine Imatinib-vermittelte Inhibition der Phosphorylierung in ihren Tumorzellen. Diese Ergebnisse wiesen auf eine in vivo-Resistenz hin, die nicht zellulär, sondern vielmehr durch den Organismus selbst verursacht wurde. Auf der Suche nach einer nicht zellulär-vermittelten, sondern einer vielmehr humoralen Resistenz, zeigten Experimente eine signifikante Hemmung der Imatinib-Aktivität durch Bindung an AGP. Nach einer Ko-Inkubation der bcr-abl positiven KU812-Zellen mit AGP (2,0mg/ml) erfolgte ein Anstieg der IC50 von initial 0,05 M auf über 3,0 M. Dieser Anstieg der IC50 könnte mit einer Senkung des freien wirksamen Plasmaanteils von Imatinib vereinbar sein. Ein vergleichbares Resultat mit Albumin anstelle von AGP konnte jedoch nicht erzielt werden.

↓35

Unter der Fragestellung, ob in Nacktmäusen das Serumprotein AGP durch bcr-abl positive Zellinokulation oder durch Gabe von Imatinib induziert wird, wurden Versuchstiere entweder mit KU812-Zellen inokuliert oder, ohne vorherige Tumorzellinokulation, mit Imatinib behandelt. Anschliessend wurde in einem single radial immunodiffusion test (SRID) die AGP Plasmakonzentration bestimmt. Hierbei zeigte sich ein signifikanter Anstieg des AGP in Abhängigkeit zur Tumorlast [96]. Bei Vorbehandlung mit Imatinib wurde ein deutlich geringerer Anstieg des AGP beobachtet.

Somit beeinflusst Imatinib in diesem Mausmodell die Plasmakonzentration des AGP direkt durch Induktion der AGP Expression und indirekt durch Reduktion des Tumors unter Imatinib-Therapie, die zu einer Senkung des AGP Spiegels im Blut führt.

Um diesen inhibitorischen Effekt des physiologisch vorhandenen AGP auf Imatinib zu überwinden, wurde nach potentiellen Bindungspartnern von AGP gesucht, die durch eine entsprechend höhere Bindungsaffinität Imatinib aus der Plasmaproteinbindung verdrängen könnten. Hierbei stellten sich Erythromycin und Clindamycin als potentielle Substanzen heraus. Erythromycin verdrängte in Versuchstieren mit inokulierten bcr-abl positiven KU812-Zellen Imatinib aus der Proteinbindung mit AGP, steigerte auf diese Weise den freien Anteil und stellte somit die Effektivität des Imatinibs wieder her. Eine Interaktion zwischen Imatinib und Erythromycin konnte ausgeschlossen werden [96].

↓36

Diese präklinischen Maus-Experimente validierten die Hypothese einer Hemmung der Aktivität des Imatinib durch AGP bzw. die Aufhebung der Hemmung durch zusätzliche Gabe von Erythromycin.

Die Bestätigung dieses Models im Patienten steht jedoch noch aus.

1.6.3 Molekulare Verlaufs- und Prognoseparameter

1.6.3.1 bcr-abl mRNA

Die Bestimmung der bcr-abl Transkriptkinetik mit Hilfe von bcr-abl spezifischen PCR-Verfahren ermöglicht nicht nur eine Evaluation des Krankheitsverlaufes und der Effizienz der Behandlung sondern auch das Bestimmen einer minimalen Resterkrankung [99]. Die Echtzeitfluoreszenz-PCR-Technik wurde in unserer Arbeitsgruppe für bcr-abl mRNS etabliert und standardisiert [100].

1.6.3.2 Wilms Tumor-Gen 1 (WT1) mRNA

↓37

Das WT1 Gen ist auf dem Chromosom 11p13 lokalisiert und besteht aus zehn Exons. Exon 7-10 kodieren vier Zinkfinger des Cys2-His2-Typs am C-terminalen Ende des WT1 Proteins während in der Nähe des N-terminalen Endes eine prolin- und glutaminreiche Aktivator/Repressor-Domäne existiert. Durch differentielles Splicen werden 32 verschiedene Isoformen exprimiert [101,102].

Die Funktion von WT1 besteht bei der transkriptionellen Regulation aus der Fähigkeit, die Transkription bestimmter Zielgene zu aktivieren oder zu unterdrücken – abhängig vom zellulären Kontext – dem Zielpromotor und der WT1 Isoform. Als Zielgene wurden bislang u.a. identifiziert: epidermal growth factor-1 (EGF1) [103], platelet derived growth factor-A (PDGF-A) [104], retinoic acid receptor-α (RARα) [105], bcl-2 und c-myc [106] sowie p53 [107].

Während der Embryogenese ist das WT1 Protein an der Regulation von Wachstum und Differenzierung beteiligt (zeit- und gewebsspezifische Expression). Beim Erwachsenen findet sich das WT1 Protein nur noch in geringen Mengen in den Zellkernen einiger normaler Gewebe wie z.B. in den Nieren.

↓38

Zur physiologischen und pathologischen Bedeutung ist bislang wenig bekannt. In den normalen hämatopoetischen Zellen wird WT1 mRNS nur in sehr geringen Mengen nachgewiesen im Gegensatz zu leukämischen Zellen, bei denen WT1 Transkripte stark erhöht sind [108,109]. Der Nachweis der WT1 Expression in CD34+-Vorläuferzellen (Knochenmark und Nabelschnurblut) legt den Verdacht einer Rolle während der frühen Hämatopoese nahe. Es gibt ausserdem unterschiedliche Auffassungen darüber, ob die deutliche Expression des WT1 Proteins in leukämischen Blasten ein Epiphänomen darstellt oder eine pathokausale Rolle einnimmt – gleichermassen bei akuten lymphatischen (ALL), akuten myeloischen (AML) und chronischen myeloischen (CML) Leukämien. In Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der WT1 RNS-Gehalt in peripheren Blutzellen mit der Progression akuter Leukämien korreliert und sich zur Verlaufsbeobachtung minimaler Resterkrankungen (MRD) eignet [110].

Im Rahmen dieser Arbeit wurde der WT1 RNS-Gehalt im Krankheitsverlauf der CML-Patienten unter Imatinib-Therapie untersucht und in Zusammenhang mit den anderen Messparametern gesetzt. Die Echtzeitfluoreszenz-PCR-Technik wurde in unserer Arbeitsgruppe für WT1 mRNS etabliert und standardisiert [111].


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07.06.2005