3 PATIENTEN, MATERIAL UND METHODEN

3.1 PATIENTEN

3.1.1 Klinische Studien

↓40

Alle im Rahmen dieser Doktorarbeit untersuchten Patienten sind innerhalb sogenannter „advanced access“- Studien behandelt worden. Hierbei handelt es sich um drei multizentrische Phase II-Studien, CSTI571-0113/-0114/-0115.

↓41

In die Studie für CSTI571-0113-Patienten konnten ausschliesslich chronische Phase-Patienten rekrutiert werden, die bereits eine Therapie mit IFNα erhalten hatten. In die Studien für akzelerierte Phase bzw. Blastenkrise wurden sowohl Patienten mit vorangegangenen Therapien als auch Patienten mit neu diagnostizierter CML in akzelerierter Phase oder Blastenkrise aufgenommen. Im Folgenden sind die Ein- und Ausschlusskriterien der einzelnen Studien zusammengefasst.

Alle Studien umfassten nur Patienten mit einem Alter von mindestens 18 Jahren und mit Ph-Chromosom-positiver CML. Patienten, die Ph-Chromosom-negativ, aber BCR-ABL positiv waren, wurden ebenfalls eingeschlossen. Alle Studienteilnehmer mussten sich schriftlich einverstanden erklären.

Spezielle Einschlusskriterien für Patienten in chronischer Phase (CSTI571-0113):

Es wurden Patienten eingeschlossen, die entweder refraktär, resistent oder intolerant gegenüber einem IFNα-haltigen Therapieregimes waren. Die Kriterien waren folgendermaßen definiert:

↓42

  1. Hämatologische Resistenz: Fehlende komplette hämatologische Antwort, die mindestestens einen Monat lang anhielt trotz einer 6-monatigen oder länger andauenden Therapie mit IFNα.
  2. Zytogenetische Resistenz: Knochenmarkszytogenetik, die 65% Ph-Chromosom-positiver Zellen zeigt nach einer mindestens ein Jahr andauender Therapie mit IFNα.
  3. Zytogenetisch refraktär: Ein Wachstum von Ph-Chromosom-positiven Knochenmarkszellen um mindestens 30% (z.B. von 20% auf 50% oder von 30% auf 60%), bestätigt durch zwei Knochenmarkspunktate, die mindestens einen Monat auseinander lagen, oder aber ein Wachstum auf 65%.
  4. Hämatologisch refraktär: Ein Anstieg von Leukozyten (Zuwachs von 100% bis zu 20 x 109/L) während einer IFNα enthaltenen Therapie, bestätigt durch zwei Blutproben, deren Entnahmen mindestens zwei Wochen auseinander lagen.
  5. Intoleranz: Eine dokumentierte Grad 3 nicht hämatologische Toxizität, die länger als zwei Wochen bestand unter Therapie mit IFNα. Die Diagnosestellung bei Patienten, die gegenüber IFNα intolerant sind, muss mehr als drei Wochen zurückliegen.

Spezielle Einschlusskriterien für Patienten in akzelerierter Phase (CSTI571-0114):

1. Prozentsatz an Blasten in peripherem Blut oder Knochenmark 15% aber

↓43

2. 30%.

3. Prozentsatz an Blasten plus Promyelozyten im peripheren Blut oder Knochenmark 30% (vorausgesetzt, dass weniger als 30% Blasten im Knochenmark vorhanden sind).

4. Periphere Basophile 20%.

↓44

5. Thrombozytopenie < 100 x 109/L, unabhängig von der Therapie.

6. Klonale Evolution des leukämischen Klons.

7. Patienten, auf die die Kriterien für eine akzelerierte Phase zutreffen, dürfen vor Studienbeginn nicht in einer Blastenkrise gewesen sein.

↓45

Spezielle Einschlusskriterien für Patienten in Blastenkrise (CSTI571-0115):

8. Prozentsatz an Blasten in peripherem Blut oder Knochenmark > 30%.

9. Blastenkrise, definiert nach durchflusszytometrischen Kriterien.

↓46

10. Vorliegen extramedullärer Krankheit neben Milz, Lymphknoten und/oder Leberbeteiligung.

Für alle drei Studien galten folgende Ausschlusskriterien: eine mögliche Schwangerschaft, ein „Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) Performance Status Score“ größer als oder gleich 3, eine Kreatininkonzentration, die mehr als doppelt so hoch liegt wie der Höchstwert des Normalbereiches oder eine kardiale Erkrankung vom Grad 3 oder 4 (definiert nach den New York Heart Association (NYHA)-Kriterien).

Weitere Ausschlusskriterien waren speziell definierte pathologische Maximalwerte für Kreatinin, SGOT (AST), SGPT (ALT) und totales Serumbilirubin. Die Patienten mussten ausserdem zytotoxische Substanzen wie Hydroxyurea, AraC, Busulfan, IFNα, Homoharringtonin, Anthrazycline, Mitoxantron, Etoposid, Methotrexat oder Cyclophosphamid zu definierten Zeitpunkten vor dem Therapiebeginn mit Imatinib absetzen.

3.1.2 Klinische Charakteristika des Studienkollektivs

↓47

Im Rahmen dieser Arbeit wurden insgesamt 69 Patienten am Campus Virchow Charité, Humboldt Universität Berlin untersucht. Bei allen Patienten wurde die Diagnose einer BCR-ABL positiven CML durch Knochenmarksaspiration einschliesslich zellulärer, zytogenetischer und molekularer Analyse bestätigt. Zusätzlich zu dieser ersten Analyse wurde in wöchentlichen bzw. maximal monatlichen Abständen bei den Patienten eine Blutbildkontrolle mit Differentialblutbild und alle 12 Wochen eine Knochenmarkspunktion durchgeführt. Während der Studie wurde kein anderes zytoreduktives Medikament verabreicht. Tab. 4 und 5 fassen den klinischen Zustand vor Therapie mit Imatinib zusammen. Hierbei zeigt Tab. 4 die Verteilung des Geschlechtes und das mittlere Alter der Patienten, sowie die Therapiedauer vor Imatinib. Tab. 5 enthält Angaben über die mittlere Leukozytenzahl und die mittlere Thrombozytenzahl (A), sowie Angaben zur Zytogenetik (B) zu Beginn der Therapie mit Imatinib. Die mittleren Blutwerte repräsentieren jedoch nicht das Ergebnis einer vorangegangenen IFNα-Therapie, da laut Studienprotokoll die IFNα-Therapie zwei Wochen vor Beginn der Therapie mit Imatinib abgeschlossen sein musste.

Tabelle 4. Klinische Daten der Patienten vor Beginn der Imatinib-Therapie.

CSTI571-0113

CSTI571-0114

CSTI571-0115

insgesamt

Patientenzahl

37

21

11

69

Geschlecht (M : F)

18 : 19

10 : 11

4 : 7

32 : 37

Mittl. Alter [Jahre]

55,2 (23-80)

54,8 (29-73)

59,3 (32-82)

56,4 (23-82)

Mittl. Therapiedauer vor
Imatinib [Monate]

43,6 (7-184)

51,1 (1-149)

31,8 (7-74)

126,5 (1-184)

Tabelle 5. Hämatologische Daten (A) und zytogenetische Daten (B) der Patienten vor Beginn der Imatinib-Therapie.

A:

CSTI571-0113

CSTI571-0114

CSTI571-0115

insgesamt

Mittl. Leukozytenzahl [109/L]

12,1 (3,4-96)

56,1 (4,5-150)

42,4 (0,3-182)

36,7 (0,3-182)

Mittl. Thrombozyt.-Zahl [109/L]

420,8 (90-1134)

546 (20-1650)

217,3 (9-877)

394,7 (9-1650)

↓48

B:

CSTI571- Studie (Patienten in n)

0113 (n=37)

0114 (n=21)

0115 (n=11)

Ph-positive Metaphasen:

100% positiv

31 (83.8%)

18 (85,7%)

10 (90,9%)

weniger als 100% positiv

5 (13.5%)

2 (9,5%)

1 (9,1%)

Im Karyogramm zytogenetisch negativ
aber in der FISH-Analyse positiv


1 (2.7%)

Punctio sicca

1 (4,8%)

Andere chromosomale Aberrationen

4 (10,8%)

10 (48%)

6 (54,5%)

3.2 REAGENTIEN, OLIGONUKLEOTIDE UND GERÄTE

3.2.1 Chemikalien, Enzyme, Kits und Rezepte

Tabelle 6. Chemikalien, Enzyme und Kits, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden.

Reagenzien

Firma

10x PCR Puffer PE

Perkin Elmer Cetus, USA

10x PCR Puffer Gibco

Gibco BRL, Eggenstein

Agarose

Serva, Heidelberg

Ammoniumchlorid

Merck, Darmstadt

Ampli Taq DNS Polymerase (5U/µl)

Perkin Elmer Cetus

Aqua dest.

Braun, Melsungen

Bovine Serum Albumin (BSA)

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Freiburg

Chloroform

Merck, Darmstadt

DEPC- Wasser

Carl Roth Gmbh, Karlsruhe

Desoxynukleosidtriphosphate–Set (dNTPs) (10mM)

Gibco BRL, Eggenstein

Dextran

Roth, Karlsruhe

Dinatriumsalz-Dihydrat (EDTA-Titriplex)

Merck, Darmstadt

DNS-Leiter 123 bp

Gibco BRL, Eggenstein

DTT (0.1mM)

Gibco BRL, Eggenstein

EDTA

Merck, Darmstadt

Eisessig (Essigsäure 100%)

Merck, Darmstadt

Ethanol

Serva, Heidelberg

Ethidiumbromid

Serva, Heidelberg

Gibco Taq Polymerase Platinum (5U/µl)

Gibco BRL, Eggenstein

Glycerol

Gibco BRL, Eggenstein

Isoamylalkohol

Merck, Darmstadt

Kaliumhydrogencarbonat

Merck, Darmstadt

Magnesiumchlorid [MgCl2] (50mM)

Gibco BRL, Eggenstein

Na-Acetat

Merck, Darmstadt

Natriumchlorid [NaCl]

Merck, Darmstadt

Nusieve (GTG-Agarose)

FMC-Products

Paraffinöl

Merck, Darmstadt

PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x))

Gibco BRL, Eggenstein

Proteinase K

Merck, Darmstadt

Pd(N)6 Random Hexamer Primer

Amersham Biosciences GmbH, Freiburg

Reagenzien

Firma

RNSclean

Thermo Hybaid, Ashford, Middlesex, UK

SDS (Dodecylsulfat-NaCl)

Serva, Heidelberg

Saccharose

Serva, Heidelberg

Superscript

Invitrogen GmbH, Karlsruhe

Trishydroxymethylaminomethan (Tris)

Merck, Darmstadt

Kits:

Qiaquick Gel Extraktions Kit

Qiagen, Hilden

Topo-TA Cloning Kit

Invitrogen GmbH, Karlsruhe

└► M13 Primer forward/ reverse (siehe 3.2.2)

 

Rezepte

↓49

Dextranlösung:

20 g Dextran

(steril, 4°C, 5%)

3,504 g NaCl

400 ml Aqua dest.

10x Lysepuffer:

8,02 g 1,5M Ammoniumchlorid

1,0 g 0,1M Kaliumhydrogencarbonat

0,037 g EDTA mit 2H2O = Titriplex III

100 ml Aqua dest.

STE:

1 ml 1 M Tris (pH 8,0)

2 ml 5 M NaCl

0,2 ml 0,5M EDTA (pH 8,0)

96,8 ml Aqua dest.

Proteinase K:

100 mg gelöst in 5ml Aqua dest.

(20 mg/ml, 20°C)

Na-Acetat:

204,12 g ad 500 ml Aqua dest.

(3 M, 20°C)

TE-Puffer:

2ml 0,5M EDTA (pH 8,0)

(pH 8,0 / 20°C)

10ml 1M Tris (pH 8,0)

1000ml Aqua dest.

TAE-Puffer (1x):

2,42 g Tris

0,57 ml Eisessig

1 ml EDTA (pH=0,8 / 0,5M)

500 ml Aqua dest.

Gelladepuffer:

Succhrose (40%)

Bromphenolblau (0,05-0,25%)

10 ml Aqua dest.

3.2.2 Synthetische Oligonukleotide

Sämtliche in dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide wurden von TIB MOLBIOL, Berlin, synthetisiert. Tab. 7 listet die Oligonukleotide auf, die für die quantitative Echtzeitfluoreszenz-PCR verwendet wurden.

Tab. 8 stellt die Oligonukleotide zusammen, die im Rahmen der Mutationsanalyse und für den PNA-Clamping Assay verwendet wurden.

↓50

Tabelle 7. Synthetische Oligonukleotide, die im Rahmen der quantitativen Echtzeitfluoreszenz-PCR verwendet wurden. „FAM“ steht für ein 6-Carboxy-Fluorescein Phosphoramidit, „X“ für ein 6-Carboxy-Tetramethyl-Rhodamin und „p“ für eine Phosphatgruppe. Die M13-Primer wurden bei der Klonierung eingesetzt.

Funktion

Name

Primer-/ Sondensequenzen

Actin [forward]

RS-3

5´- AgCCTCgCCTTTgCCgA

Actin [reverse]

PS -Actin as

5´- CTggTgCCTggggCg

Actin- Sonde

QT -Actin 6-FAM

5´- 6FAM-CCgCCgCCCgTCCACACCCgCC XT p

AGP [forward]

α1 sGP

5'- CCACCCTggACCAgATCACT

AGP [reverse]

α1 sGP04 rev

5'- ATgTAggTCTTggTgTCCCTgA

AGP- Sonde

TM - α1 sGP01

5'- 6FAM-gCAAgTggTTTTTATATCgCATCggCCTT XT C p

bcr-abl [forward]

b2a2

5´- AgCATTCCgCTgACCATCA

bcr-abl [reverse]

abl 3 (78)

5´- gCgTgATgTAgTTgCTTgggAC

bcr-abl Sonde

TM abl 3

5´- 6FAM-TTTgggCT XT CACACCATTCCCCATTg p

MDR1 [forward]

MDR103

5'- CCCATCATTgCAATAgCAggA

MDR1 [reverse]

MDR103 rev

5'- gTTCAAACTTCTgCTCCTgAgTAC

MDR Sonde

TM- MDR101

5'- FAM-TTgTTgAAATgAAAATgTTgTCTggACAAgCACTgT XT- p

WT 1 [forward]

ET ex 6up

5´- ACAgggTACgAgAgCgATAACCA

WT 1 [reverse]

WT ex 67re

5´- CACACgTCgCACATCCTgAAT

WT 1 Sonde

TM WT fin

5´- 6FAM-CAACgCCCATCCTCTgCggAgCCCA XT p

M13- Primer [forward]

5’- gTAAAACgACggCCA - 3’

M13- Primer [reverse]

5’- CAggAAACAgCTATgAC - 3’

Tabelle 8. Synthetische Oligonukleotide, die zur Mutationsanalyse und für den PNA-Clamping Assay verwendet wurden. Bei LC Red 640 und 705 handelt es sich um Fluorochrome.

Funktion

Name

Primer-/ Sondensequenzen

Forward Primer Thr315Ile

ABLx4 F

5'- TggggTCTgCACCCgCgCgC

Forward Primer Glu255Lys und Tyr253His

ABLx56 FM

5'- CTATggTgTgTCCCCCAACTA

Reverse Primer Thr315Ile,

Glu255Lys und Tyr253His

ABLx6 R

R 5'- AgTggCCATgTACAgCAgCA

Sensor Sonde Thr315Ile

Sensor [T]s

5'- gTTCTATATCATCA T TgAgTTC -LC Red 705

Sensor Sonde Glu255Lys

Sensor 255

5'- CCCTCgTACACCA T CCCgTACT -LC Red 705

Sensor Sonde Tyr253His

Sensor Val

5'- CCCTCgTACACC A CCCCgTAC -LC Red 705

Anchor Sonde Thr315Ile

Anchor

5´- Red 640-gACCTACgggAACCTCCTggACTAC-p

Anchor Sonde Glu255Lys und Tyr253His

255 Anchor

5'- LC Red 640-CCCCCgCCCAgCTTgTgCTTCA-p

PNA Thr315Ile

STI-T315

5'- TTCTATATCATCACTgAgTT

PNA Glu255Lys und Tyr253His

Y253E255

5'- CgTACACCTCCCCgTACT

Abb. 6 zeigt schematisch die Positionen der einzelnen synthetischen Oligonukleotide zueinander, die in Tab. 8 aufgelistet sind.

↓51

Abbildung 6: Schematische Darstellung der Oligonukleotid-Positionen.
Die Primer sind als Pfeile dargestellt und überspannen Exon 4 bis 6 der c-abl cDNS-Sequenz. Die Anchorproben tragen das Fluorochrom LC Red 640 für den Energietransfer, wogegen die Sensorproben mit einem Akzeptorfluorochrom LC 705 markiert sind und komplementär zu den spezifischen Mutationen sind. Die Balken symbolysieren die PNA [143].

3.2.3 Technische Geräte

Tabelle 9. Technische Geräte, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden.

Gerät

Hersteller

ABI PRISM 7700 SDS®

Applied Biosystems, Foster CityUSA

Bio Doc CCD-Camera

Biometra, Göttingen

Gene Quant® II (Spektrophotometer)

Pharmacia Biotech

LightCycler®

Roche

Megafuge® 1.0

Heraeus Instruments

MicroAmp® Optical Caps

Perkin Elmer, Foster City, USA

MicroAmp® Optical Tubes

Perkin Elmer, Foster City, USA

Polyethylen-Reaktionsgefäße (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 ml)

Eppendorf, Hamburg

Polyethylenröhrchen (10 ml)

Falcon, New Jersey, USA

Reax® 2000

GFC

TRIO®-Thermoblock

Biometra

Video Graphik Printer UP-890 CE

Sony

WIDE MINI SUB CELL® (Gelelektrophoresekammer)

Biorad

Zentrifuge 5403

Eppendorf, Hamburg

3.2.4 Hard- und Software

Die Arbeit wurde auf einem IBM-kompatiblem Personal-Computer realisiert. Als Textverarbeitung kam MS Office 2000® (Microsoft Inc. Redmond, USA) zum Einsatz. Abbildungen wurden mit MS Excel®, Origin, Paint und Adobe Photoshop erstellt und bearbeitet. Die statistische Auswertung erfolgte durch das Programm SPSS, SPSS GmbH Software. Auf folgende Internetresourcen wurde zurückgegriffen: Medline/ Pubmed: http://www.ncbi.nlm.nih.govhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov

3.3 PROBENGEWINNUNG UND AUFARBEITUNG

3.3.1 Blutaufarbeitung

↓52

Blutproben wurden in sterile Heparinröhrchen entnommen und anschliessend sofort zur Weiterbearbeitung ins Labor gebracht.

3.3.2 Dextran-Separierung, Serum zur AGP Proteinspiegelbestimmung

10 ml Heparinblut wurden mit 2 ml Dextranlösung (steril, 4°C, 5%) versetzt und zur Sedimentation über 40 min bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Der daraufhin abgenommene Überstand wurde anschliessend über 6 min bei 1100 Umdrehungen/min (Upm) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand zur Bestimmung des AGP Proteinspiegels verwendet. Die Zellen wurden in 10 ml Lysepuffer (1x) suspendiert und über 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgte ein weiterer Zentrifugationsschritt für die Zellen in Lysepuffer (1x) über 6 min bei 1100 Upm. Der bei diesem Schritt entstandene Überstand wurde erneut verworfen und die resultierenden Zellen sogleich weiterverarbeitet.

Der AGP Proteinspiegel wurde in Zusammenarbeit mit Herrn Dr. Christian Müller im Institut für Labormedizin und Pathobiochemie, Campus Virchow, Charité, Humboldt Universität Berlin, durch immunoturbidimetrische Analyse im COBAS INTEGR400 System mit Hilfe einer COBAS INTEGRA AGP Kassette bestimmt. Dieser Assay basiert auf einer Mischung aus AGP Präzipitat mit spezifischem Antiserum, die turbidimetrisch bei 340nm analysiert wurde.

↓53

Die Blutproben der Studienpatienten wurden wöchentlich – vor und während der Therapie mit Imatinib – entnommen und direkt nach Dextran-Separierung analysiert. Der Assay war kalibriert für eine AGP Proteindetektion in einem Bereich von 16-400 mg/dl bei erwarteten Normalwerten von 50-120 mg/dl [112].

3.3.3 RNS-Extraktion

Die aus der Separierung resultierenden Zellen wurden in 1,5ml Reaktionsgefässen zunächst mit 900l RNSclean Detergenz und anschliessend mit beigefügtem 100l Chloroform-Isoamylalkohol resuspendiert. Nach 5 min auf Eis wurden die Reaktionsgefässe mit 13000-14000 Upm 30 min zentrifugiert. Der Überstand, max. 600 l, wurde sofort in ein neues Reaktionsgefäss überführt, welches schon 600 l gekühltes Isopropanol beinhaltete. Hierbei befanden sich in der Unter- und Interphase DNS und Proteine.

Um die somit gewonnene RNS zu präzipitieren, wurden die Reaktionsgefässe Weiterverarbeitung 15 min auf Eis gestellt. Anschliessend wurde 15 min auf höchster Stufe zentrifugiert, der Überstand abgehoben und verworfen. Es folgte eine Resuspendierung der RNS mit 500l Ethanol (steril, 4°C, 75%) und ein erneutes Zentrifugieren der Proben für nochmals 15 min bei 12000 Upm. Der Überstand wurde danach vollständig abgehoben und verworfen.

↓54

Nach Verdunsten des Restalkohols wurde die RNS in DEPC/H2O gelöst.

3.3.4 Reverse Transkriptase

Die Reverse Transkription wurde wie im folgenden beschrieben durchgeführt (Tab. 10 zeigt hierbei den Ansatz (Reaktionsmix) für 1000 ng RNS):

Tabelle 10. Ansatz für die Reverse Transkription

Reagenz

Konzentration

Menge

Random hex Primer

100 µM

1,0 µl

DNTP (ATP, CTP, TTP, GTP)

2,5 mM

5,0 µl

10x PCR-Puffer (Perkin Elkmer)

2,0 µl

DTT

0,1 M

2,0 µl

RNSase-Inhibitor

1,0 µl

Superscript

0,7 µl

↓55

  1. Zu den vorbereiteten Patientenproben von je 8,0 µl (1000 ng mRNS, aufgenommen in DEPC/ H2O) wurden 10µl Reaktionsmix hinzugefügt.
  2. Denaturierung für 3 - 5 min bei 85 - 95°C.
  3. Anschliessend wurden die Proben für 1 - 2 min. auf Eis gestellt.
  4. Zugabe von 1,0 µl RNSase-Inhibitor und 0,7 µl Superscript in alle Proben.
  5. Das Superscript schreibt die RNS in cDNS um.
  6. Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur.
  7. Inkubation für 40 min bei 42°C.
  8. Danach wurden die Proben für 5 min bei einer Temperatur von 95°C in den Hitzeblock gestellt.

Zum Schluss wurden die Proben erneut für 1-2 min auf Eis gestellt und zur Aufbewahrung der cDNS bei -20°C gelagert.

3.3.5 DNA-Konzentrationsbestimmung

Ein Aliquot der zu messenden DNS-Lösung wurde mit Aqua dest. oder TE-Puffer 1:50 verdünnt. Die Bestimmung der DNS-Konzentration erfolgte spektrophotometrisch (Quarzküvette, 1 cm Schichtdicke) durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 260 nm und 280 nm. Dabei entspricht die Extinktion von 1 bei doppelsträngiger DNS ungefähr einer Konzentration von 50 µg/ml (Sambrook et al. 1989). Um den Reinheitsgrad der DNS-Lösung zu ermitteln, wurde der Quotient der Extinktionen bei OD260/OD280 bestimmt.

3.4 KLONIEREN GENETISCHER FRAGMENTE

↓56

Zur Erstellung von Standardkurven wurde die cDNS der jeweiligen Gene (AGP, MDR1, bcr-abl und WT1) mit spezifischen Primern aus Normalblut-cDNS in einer konventionellen PCR amplifiziert und dann in einen pCR2.1 Vector (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen, Leek, Niederlande) kloniert.

Einem Restriktionsverdau durch HindIII und XbaI (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) folgte die Reamplifizierung mit M13-Primern und die anschliessende Aufreinigung der Plasmidfragmente (PCR Purification Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Molekülzahl wurde durch eine optische Dichtemessung in einem Photometer bestimmt.

3.5 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR)

3.5.1 Konventionelle PCR

Tab. 11 zeigt den Ansatz für eine konventionelle PCR, die im Rahmen der Klonierung genetischer Fragmente verwendet wird.

↓57

Tabelle 11. Ansatz für eine konventionelle PCR.

Reagenz

Konzentration

Menge

5` Primer

10 µM

1,25 µl

3` Primer

10 µM

1,25 µl

10x PCR-Puffer (Perkin Elmer)

5,0 µl

dNTP

2,5 mM

4,0 µl

Ampli-Taq-Polymerase (Perkin Elmer)

0,25 µl

CDNS

1,0/2,0 µl

Aqua dest.

bis zu einem Gesamtvolumen
von 50,0 µl

 

3.5.2 Echtzeitfluoreszenz-PCR

Die quantitative Echtzeitfluoreszenz-PCR für das Fusionstranskript des Major-bcr-abl und für das WT1 Transkript wurde in unserer Arbeitsgruppe durchgeführt und ist auch bereits publiziert [99,100]. Als quantitative Referenz benutzen wir das β-Actintranskript, das von Primern/ Sonde quantifiziert wird, ohne Pseudogene zu amplifizieren [100].

Tabelle 12. PCR-Ansatz für die Echtzeitfluoreszenz-PCR via Taqman.

Reagenz

Konzentration

Menge

5` Primer

10 µM

2,5 µl

3` Primer

10 µM

2,5 µl

Sonde

10µM

0,5 µl

dNTP

2,5 mM

4,0 µl

10x PCR-Puffer (Gibco GBR)

5,0 µl

TE-Puffer (pH 8,0)

0,8 µl

MgCl2

50 mM

4,5 µl

Gibco-Taq-Platinum-Polymerase

0,25 µl

DNS-Probe

2,0 l

Aqua dest.

27,95 µl

Gesamt

50,0 µl

↓58

Tab. 13 stellt die jeweiligen PCR-Bedingungen für die einzelnen Gene dar.

Tabelle 13. Zyklusbedingungen für die PCR mittels Taqman für die einzelnen Gene.

PROGRAMM

BCR-ABL

AGP

MDR1

WT1

ACTIN

1. Initiale Denaturierung

5 min bei 95°C

5 min bei 95°C

5 min bei 95°C

5 min bei 95°C

5 min bei 95°C

2. Denaturierung

1 min bei 95°C

1 min bei 95°C

1 min bei 95°C

1 min bei 95°C

1 min bei 95°C

3. Annealing/Extension

1 min bei 65°C

1 min bei 63°C

1 min bei

63 °C

1 min bei 62°C

1 min bei 67°C

Zyklen (für 2 und 3)

45

45

45

45

45

4. Abkühlung

4°C

4°C

4°C

4°C

4°C

3.5.3 Generierung von Standardkurven

Zur Quantifizierung der PCR-Produkte durch die Echtzeitfluoreszenz-PCR wird eine Standardkurve des jeweils zu bestimmenden Gens benötigt. Nach Aufreinigung und Konzentrationsbestimmung der klonierten Fragmente (siehe 3.3.4) wird eine Verdünnungsreihe hergestellt, die einen Bereich von 107 bis 100 Moleküle pro 100ng DNS in TE-Puffer, pH 8.0 und Aqua dest. umfasst.

3.6 MUTATIONSANALYSE IM LIGHTCYCLER©

↓59

Im Anschluss an eine Echtzeitfluoreszenz-PCR im LightCycler© kann durch Schmelzen – langsames Aufheizen von 45°C bis zu 85°C – im selben Ansatz eine qualitative Information über das Zielsequenzerzielt werden.

Diese Methode eignet sich vor allem zur Genotypisierung und Mutationsdetektion.

mrs:

Tabelle 14. PCR-Ansatz für eine Mutationsanalyse im Lightcycler.

Reagenz

Konzentration

Menge

dNTP

2,5 mM

4,0 µl

10x PCR-Puffer (Gibco GBR)

2,5 µl

TE-Puffer (pH 8,0)

0,3 µl

MgCl2

50 mM

2,0 µl

Bovines Serumalbumin (BSA)

600 µg/ml

0,3 µl

5` Primer

10 µM

1,5 µl

3` Primer

10 µM

1,5 µl

Sonde

10µM

1,0 µl

Anchor

10µM

1,0 µl

Gibco-Taq-Platinum-Polymerase

0,25 µl

DNS-Probe

1,0 l

Aqua dest.

9,65 µl

Gesamt

25,0 µl

3.7 DNA-SEQUENZIERUNG

↓60

Ausgewählte PCR-Produkte wurden durch die Firma Agowa direkt von einem automatischen Sequenzer (ABI 710, Applied Biosystem) analysiert.

3.8 3.8STATISTISCHE AUSWERTUNG

Um den Einfluss der Behandlung mit Imatinib auf CML-Patienten in chronischer Phase, akzelerierter Phase und Blastenkrise zu analysieren, wurde eine zweifaktorielle nicht-parametrische Varianzanalyse mit den Faktoren: molekulare Parameter und Zeit erstellt. Die statistische Auswertung erfolgte mit Unterstützung von Tanja Schink aus dem Institut für Medizinische Biometrie, Campus Charité Mitte, Humboldt-Universität Berlin [113].


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07.06.2005