4 ERGEBNISSE

4.1 THERAPIEERGEBNISSE

↓60

Insgesamt wurden am Campus Virchow der Charité 79 Patienten in die oben genannten CSTI571-0113/-0114/-0115-Studien rekrutiert, von denen 69 Patienten im Rahmen dieser Arbeit untersucht worden sind.

↓61

Zur Ermittlung der mittleren Therapiedauer wurde der Zeitraum zwischen dem Tag der ersten Einnahme von Imatinib bis zu dem Datum des zuletzt gemessenen PCR-Ergebnisses für die einzelnen Patienten errechnet. Folglich sind in diese Berechnung auch nur diejenigen Patienten einbezogen worden, von denen dementsprechende PCR-Daten vorlagen, um molekularbiologische Daten in Korrelation zu klinischen Daten setzen zu können. Die mittlere Therapiedauer für Patienten in chronischer Phase (CSTI571-0113) lag bei 5,9 Monaten, für Patienten in akzelerierter Phase (CSTI571-0114) bei 5,5 Monaten und für Patienten in Blastenkrise (CSTI571-0115) bei 4,3 Monaten. Im Laufe des Beobachtungszeitraums verstarben insgesamt 12 Patienten, davon jeweils 3 Patienten in der Studie CSTI571-0113 und der Studie CSTI571-0114 und 6 Patienten in der Studie CSTI571-0115.

Insgesamt rezidivierten 21 Patienten, 4 in der Studie CSTI571-0113, 7 in der Studie CSTI571-0114 und 10 in der Studie CSTI571-0115. Tab. 15 vergleicht Patienten mit bzw. ohne Rezidiv. Sie zeigt das mittlere Alter, die mittlere Leukozyten- und Thrombozytenzahl zu Beginn der Therapie mit Imatinib, sowie die mittlere Krankheitsdauer zum Zeitpunkt des Studieneinschlusses.

Tabelle 15. Klinische Daten der Patienten mit Rezidiv und ohne Rezidiv im Vergleich.
N= Anzahl der Patienten.

↓62

Sowohl in der CSTI571-0113- als auch in der CSTI571-0114 Studie sind die Patienten

mit Rezidiv zu Beginn der Imatinib-Therapie im Durchschnitt älter und länger in vorangegangener Behandlung gewesen.

Die mittleren Leukozytenzahlen bei den Patienten ohne Rezidiv lagen in beiden Studien geringfügig höher.

↓63

Im Vergleich der mittleren Thrombozytenzahlen zu Beginn der Therapie mit Imatinib waren diese vor allem in der Studie CSTI571-0114 bei den Patienten ohne Rezidiv deutlich höher als bei den Patienten mit Rezidiv derselben Studie.

4.1.1 Hämatologisches Ansprechen

Ein komplettes hämatologisches Ansprechen ist nach den Kriterien des Studienprotokolls folgendermassen definiert: Leukozyten < 11 x 109/L und Thrombozyten < 400 x 109/L sowie ein normales Differentialblutbild ohne unreife Granulozyten über vier Wochen.

In der Studie CSTI571-0113 führte Imatinib bei 83,8 % (n=31) der Patienten zu einem kompletten hämatologischen Ansprechen. In den Studien CSTI571-0114 und CSTI571-0115 waren es 71,4% (n=15) bzw. 63,6 % (n=7) der Patienten.

↓64

Tab. 16 stellt die mittlere Dauer bis zum Eintritt des Rezidivs, die mittlere Dauer des hämatologischen Ansprechens und die Anzahl der refraktären Patienten während der Imatinibtherapie für die einzelnen Studien dar.

Tabelle 16. Klinische Daten zum hämatologischen Ansprechen und Rezidiveintritt, sowie die Anzahl refraktärer Patienten in den einzelnen CSTI571-Studien während der Imatinib-Therapie.
N = Anzahl der Patienten.

CSTI571-Studie (rezidivierte Patienten in n)

0113 (n=4)

0114 (n=5)

0115(n=10)

Mittlere Dauer bis zum Eintritt des Rezidivs [Wochen]

23,3

29,5

16,3

Mittlere Dauer des hämatologischen Ansprechens [Wochen]

20,8

22,5

5,6

Refraktäre Patienten [n]

-

2,0

2,0

4.1.2 Zytogenetisches Ansprechen

In Übereinstimmung mit dem Studienprotokoll wurden alle 12 Wochen zytogenetische Analysen des Knochenmarks durchgeführt worden. Eine solche zytogenetische Untersuchung erfordert die Analyse von mindestens 20 Metaphasen. Aufgrund von Hypozellularität in den Knochenmarksproben nach Therapiebeginn mit Imatinib waren diese Analysen nicht bei allen Patienten zu jedem Zeitpunkt möglich.

↓65

In Tab: 17-19 sind die zytogenetischen Ergebnisse nach jeweils 3, 6 und 9 Monaten der einzelnen Studien aufgelistet. Insgesamt wurden in der CSTI571-0113 Studie 23 Patienten 3 Monate lang, 15 Patienten 6 Monate lang und 5 Patienten 9 Monate lang behandelt. In der CSTI571-0114 Studie wurden insgesamt 15 Patienten 3 Monate lang, 8 Patienten 6 Monate lang und 4 Patienten 9 Monate lang und in der CSTI571-0115 Studie insgesamt 7 Patienten 3 Monate lang behandelt. Tab. 17-19 beschreiben ausserdem das zytogenetische Ansprechen der Patienten sowohl in Bezug auf die Gesamtzahl der behandelten Patienten (Gruppe „alle behandelten Patienten“) als auch in Bezug auf die Gesamtzahl der suffizienten Knochenmarksproben (Gruppe „suffiziente zytogenetische Analysen“).

Um auch Patienten mit hypozellulären Knochenmarksaspiraten und somit nicht ausreichender Metaphasenzahl evaluieren zu können, wurden in einer zusätzlichen Analyse die Daten derjenigen Zytogenetiken berücksichtigt, die mindestens 10 auswertbare Metaphasen aufwiesen. Diese Analyse führte erwartungsgemäss zu generell höheren zytogenetischen Ansprechraten.

Tabelle 17. Darstellung der zytogenetischen Ergebnisse der Chronische Phase-Studie (CSTI571-0113) nach 3, 6 und 9 Monaten. Definitionen für komplettes, partielles und major Ansprechen siehe Kapitel 1.2.3. Suffizient waren die Analysen, wenn sie entweder mehr als 20 oder mehr als 10 analysierbare Metaphasen aufwiesen. N [%] = Anzahl der Patienten mit jeweiligen Ansprechen [Prozent zur Gesamtzahl]. ng= Gesamtzahl der Patienten.

Tabelle 17. Zytogenetische Ergebnisse der Chronische Phase-Studie (CSTI571-0113)

    

Zytogenetik
Anzahl der Patienten
n [Anteil in % zur Gesamtzahl ng]

Komplett

n [%]

Partiell

n [%]

Major

n [%]

 

nach
3 Monaten

≥ 20 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng =23)

1 [4,3 %]

5 [21,7 %]

6 [26,1 %]

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =13)

1 [7,7 %]

5 [38,5 %]

6 [42,2 %]

≥ 10 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng =23)

4 [17,4 %]

6 [26,0 %]

10 [43,5 %]

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =18)

4 [22,2 %]

6 [33,3 %]

10 [55,5 %]

     

nach
6 Monaten

≥ 20 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng =15)

6 [40,0 %]

1 [6,7 %]

7 [46,7 %]

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =8)

6 [75,0 %]

1 [12,5 %]

7 [87,5 %]

≥ 10 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng =15)

7 [46,7 %]

2 13,3 %]

9 [60,0 %]

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =11)

7 [63,6 %]

2 [18,2 %]

9 [81,8 %]

     

nach
9 Monaten

≥ 20 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng=5)

-

-

-

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =3)

1 [33,3 %]

-

1 [33,3 %]

≥ 10 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (n=5)

-

-

-

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =3)

1 [33,3 %]

-

1 [33,3 %]

Tabelle 18. Darstellung der zytogenetischen Ergebnisse der Akzelerierte Phase-Studie (CSTI571-0114) nach 3, 6 und 9 Monaten. Definitionen für komplettes, partielles und major Ansprechen siehe Kapitel 2.1.4. Suffizient waren die Analysen, wenn sie entweder mehr als 20 oder mehr als 10 analysierbare Metaphasen aufwiesen. N [%] = Anzahl der Patienten mit jeweiligen Ansprechen [Prozent zur Gesamtzahl]. ng= Gesamtzahl der Patienten.

Tabelle 18. Zytogenetische Ergebnisse der Akzelerierte Phase-Studie (CSTI571-0114)

    

Zytogenetik Anzahl der Patienten n [Anteil in % zur Gesamtzahl ng]

Komplettn [%]

Partielln [%]

Majorn [%]

 

nach3 Monaten

≥ 20 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng =15)

1 [6,6 %]

1 [6,6 %]

2 [13,3 %]

suffiziente zytogenetische. Analysen (ng =6)

1 [16,6 %]

1 [16,6 %]

2 [33,3 %]

≥ 10 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng =15)

1 [6,6 %]

1 [6,6 %]

2 [13,3 %]

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =8)

1 [12,5 %]

1 [12,5 %]

2 [25,0 %]

     

nach
6 Monaten

≥ 20 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng =8)

-

-

-

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =2)

-

-

-

≥ 10 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng =8)

1 [25,0 %]

-

1 [25,0 %]

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =4)

1 [25,0 %]

-

1 [25,0%]

     

nach
9 Monaten

≥ 20 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng =4)

-

-

-

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =2)

-

-

-

≥ 10 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng =4)

-

1 [25,0 %]

1 [25,0 %]

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =3)

-

1 [33,3 %]

1 [33,3 %]

Tabelle 19. Darstellung der zytogenetischen Ergebnisse der Studie der Blastenkrise (CSTI571-0115) nach 3 Monaten. Definitionen für komplettes/ Major und partielles Ansprechen siehe 2.1.4. Suffizient waren die Analysen, wenn sie entweder mehr als 20 oder mehr als 10 analysierbare Metaphasen aufwiesen. n [%]= Anzahl der Patienten mit jeweiligen Ansprechen [Prozent zur Gesamtzahl].
ng= Gesamtzahl der Patienten.

Tabelle 19. Zytogenetische Ergebnisse der Studie der Blastenkrise (CSTI571-0115)

    

Zytogenetik Anzahl der Patienten n [Anteil in % zur Gesamtzahl ng]

Komplettn [%]

Partielln [%]

Majorn [%]

 

nach

3 Monaten

20 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng =7)

-

-

-

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =4)

-

-

-

10 Metaphasen

   

alle behandelten Pat. (ng =7)

1 [14,3 %]

-

1 [14,3 %]

suffiziente zytogenetische Analysen (ng =5)

1 [20,0 %]

-

1 [20,0 %]

4.1.3 Nebenwirkungen

↓68

Tab. 20 beinhaltet die im Rahmen dieser Arbeit bei den behandelten Patienten aufgetretenen Nebenwirkungen und ihre Häufigkeitsverteilungen auf. Zu den häufigsten nicht hämatologischen Nebenwirkungen gehörten Knöchel- und Periorbitalödeme, Muskelkrämpfe und Nausea. Weiterhin kam es vereinzelt zu Adipositas, Dermatitis, Exanthemen, Wundheilungsstörungen, Allergien, Fieberinfekten, Erythemen und asthmatischen Beschwerden. Bei den meisten Nebenwirkungen handelte es sich ausschliesslich um Nebenwirkungen vom Grad I und Grad II nach den allgemeinen Kriterien des National Cancer Institute [114]. Lediglich zwei Patienten (je einer aus der CSTI571-0113- und der CSTI571-0114 Studie) entwickelten während der Behandlung mit Imatinib nach 16 bzw. 21 Wochen eine Adipositas vom Grad III/ IV [114]. Eine andere Patientin aus der Studie CSTI571-0113 entwickelte Desweiteren ein Exanthem vom Grad III/ IV schon einen Monat nach Therapiebeginn [115].

Die hämatologischen Komplikationen traten gehäuft bei Patienten in fortgeschritteneren Stadien der CML auf. 8 von 14 Patienten der Studie CSTI571-0113, 9 von 13 Patienten der Studie CSTI571-0114 und 8 von 11 Patienten der Studie CSTI571-0115 reagierten thrombozytopenisch mit einem Thrombozytenanteil von weniger als 50/ nl.

Tabelle 20. Hämatologische und nicht hämatologische Nebenwirkungen.

Anzahl der Patienten mit Nebenwirkung
(Anteil in % zur Gesamtzahl in der Studie)

   

Nebenwirkungen

CSTI571-
0113-Studie

CSTI571-
0114-Studie

CSTI571-
0115-Studie

 

Nicht hämatologische:

 

Periorbitalödeme

7 (18,9)

9 (42,9)

4 (36,4)

 

Andere Ödeme

8 (21,6)

5 (23,8)

1 (9,1)

 

Nausea

1 (2,7)

4 (19,0)

3 (27,3)

 

Krämpfe

7 (18,9)

6 (28,9)

2 (18,2)

 

Adipositas

2 (5,4)

2 (9,5)

-

 

Dermatitis

-

2 (9,5)

-

 

Exanthem

2 (5,4)

1 (4,7)

1 (9,1)

 

Wundheilungssörungen

1 (2,7)

1 (4,7)

-

 

Allergie

1 (2,7)

-

-

 

Fieberinfekt

1 (2,7)

-

-

 

Erythem

1 (2,7)

-

-

 

Asthmatische

1 (2,7)

-

-

 

Beschwerden

Sonstige





10 (47,6)



5 (45,5)

 

 

Hämatologische:

 

Neutropenie

-

4 (19,0)

3 (27,3)

 

[Leukozyten < 1,0/nl]

 

Anämie [Hb < 8g/dl]

3 [8,1]

8 [38,1]

4 [36,4]

 

Thrombozytopenie [< 100/nl]

14 [37,8]

13 [61,9]

11 [100,0]

 

4.2 AGP SERUMSPIEGEL

↓69

Die Abb. 7A, B und C zeigen den Verlauf der medianen AGP Plasmaproteinwerte unter Therapie mit Imatinib. Der Normbereich bei einem Gesunden liegt zwischen 50 und 120 g/dl.

Vor Therapiebeginn mit Imatinib lag der medianen AGP Plasmaproteinwert in der Studie CSTI571-0113 für das nicht rezidiverte Patientenkollektiv im Normbereich (A).

Der entsprechende Wert für die rezidivierten Patienten der CSTI571-0113 war dagegen pathologisch erhöht (148,5 g/dl) (A). In der Studie CSTI571-0114 waren die medianen AGP Plasmaproteinwerte zum Zeitpunkt 0 für die nicht rezidiverten (141g/dl) und rezidivierten Patienten (179,5 g/dl) oberhalb des Normbereich (B). Da 10 von 11 Patienten der Studie CSTI571-0115 (C) rezidivierten, wurde hier auf eine entsprechende Trennung zwischen Patienten mit und ohne Rezidiv verzichtet. Der mediane AGP Plasmaproteinwert in der Studie CSTI571-0115 war mit 183,5 g/dl vor der Therapie mit Imatinib ebenfalls pathologisch erhöht.

↓70

In den Studien CSTI571-0113 und CSTI571-0114 zeigten sich im Verlauf in der Gruppe der rezidivierten Patienten höhere mediane AGP Plasmaproteinwerte als im Vergleich zur Gruppe der nicht rezidiverten Patienten. Bei den rezidivierten Patienten der Studie CSTI571-0113 kam es lediglich im 4. Monat zur kurzzeitigen Normalisierung der medianen AGP Plasmaproteinwerte. Die medianen AGP Plasmaproteinwerte bei nicht rezidiverten Patienten der gleichen Studie überstiegen im gesamten Beobachtungszeitraum nicht den Normbereich (A). In der Studie CSTI571-0114 kam es bis zum 3. Monat zu einer signifikanten Senkung der medianen AGP Plasmaproteinwerte bei nicht rezidiverten Patienten in den Normbereich, woran sich im Laufe des Untersuchungszeitraumes auch nichts mehr veränderte (p=0,007). Die rezidivierten Patienten in der Studie CSTI571-0114 (B) erreichten keine normalen medianen AGP Plasmaspiegel.

Für die Patienten der Studie CSTI571-0115 (C) kam es bis zum 4. Monat zu einem statistisch signifikanten Abfall (p=0,051) der Plasmaproteinwerte, wobei im 5. Monat wieder eineTendenz nach obenzu beobachten.

Abbildung 7. Die Abbildung zeigt die medianen AGP Werte der Patienten in der Studie CSTI571-0113 (A), Studie CSTI571-0114 (B) und CSTI571-0115 (C). Nur in A und B sind die Patienten mit und ohne Rezidiv getrennt dargestellt. Auf der x-Abbildung 2: Abbildung 3: Achse ist die Therapiedauer und auf der y-Achse die AGP Plasmaproteinkonzentration angegeben. Die horizontale Linie begrenzt den oberen Normwert für die AGP Plasmakonzentration [120 g/dl]. Die Anzahl der Patienten zum Zeitpunkt 0 wird durch n angegeben.

4.3 ERGEBNISSE DER QUANTITATIVEN ECHZEIT-FLUORESZENZ-PCR

↓71

Die PCR-Daten der Studien lassen sich wie folgt zusammenfassen:

CSTI571-0113: Insgesamt lagen Messdaten von 24 Patienten vor. 4 Patienten sind rezidiviert.

CSTI571-0114: Insgesamt lagen Messdaten von 17 Patienten vor.

↓72

CSTI571-0115: Insgesamt lagen Messdaten von 11 Patienten vor.

Abb. 9, 10, 11 und 12 zur molekularbiologischen Verlaufsdarstellung wurden aus den Messdaten der Echtzeitfluoreszenz-PCR und daraus ermittelten Medianwerten erstellt. Die Medianwerte setzen sich aus mindestens 3 Messdaten von 3 verschiedenen Patienten zusammen. Im Falle der rezidivierten Patienten setzen sich die Medianwerte nur aus mindestens 2 Messwerten zusammen, da die Gruppe der rezidivierten Patienten in der Studie CSTI571-0113 nur insgesamt 4 Patienten und in der Studie CSTI571-0114 nur insgesamt 6 Patienten umfasste.

Über eine nicht-parametrische Varianzanalyse wurde die Signifikanz eines Abfalles oder Ansteigens der Verlaufskurve geprüft. Dabei wurden der erste und der letzte Medianwert verglichen. Ausserdem wurde errechnet, ob sich die Medianverläufe nicht rezidivierter Patienten und rezidivierter Patienten statistisch signifikant unterscheiden.

↓73

Da β-Aktin für die Quantifizierung das Referenzgen darstellte, wurden die gemessenen Kopienzahlen der untersuchten molekularen Parameter in Relation zur gemessenen Kopienzahl des β-Aktin derselben cDNS gesetzt.

4.3.1 Darstellung von Standardkurven

Zur Quantifizierung spezifischer Gensequenzen bedarf es der Erstellung von Standardreihen. Dabei laufen bekannte Kopienzahlen klonierter, spezifischer Gen-sequenzen in jeder PCR mit, beginnend mit 1,0E+01 und aufsteigend bis 1,0E+07.

Durch die ct-Werte der einzelnen Standards wird eine Funktionsgerade mit der Steigung m gezogen. Eine gute Korrelation (korr.) der ct-Werte, die bestenfalls bei 1 liegt, ist für eine optimale Quantifizierung der Ausgangskopienzahlen notwendig. Abb. 8 stellt die seriellen Standardverdünnungsreihen (107 bis 101 Kopien) von β-Actin(A), bcr-abl(B), WT1(C), MDR1(D) und AGP(E) mRNS dar.

↓74

Abbildung 8. Diese Abbildung zeigt die seriellen Standardver-dünnungsreihen (101 bis 107 Kopien) von β-Actin(A), bcr-abl(B), WT1(C), MDR1(D) und AGP(E) mRNS. Auf der x-Achse ist jeweils die PCR-Zykluszahl und auf der y-Achse die relative Reporterfluoreszenz dargestellt. Die Steigung m wird bestimmtdurch eine Ausgleichsgerade, die durch die 1. Ableitungen der einzelnenStandardverdünnungen gezogen wird. Die Korrelation (korr.) der1.Ableitungen im Ctzur Ausgleichsgeraden stellt ein Mass für die Genauigkeit der jeweiligen Standardverdünnung dar.

4.3.2 bcr-abl mRNS Transkripte

Abb. 9 zeigt die Verläufe der [bcr-abl/ β-actin] mRNS Ratio im Verlauf der Imatinib-Therapie.

Für die Studien CSTI571-0113 (A) und CSTI571-0114 (B) sind die Verläufe der rezidivierten (rez.) und nicht rezidiverten (nicht rez.) Patienten getrennt dargestellt. Bei der Studie CSTI571-0115 (C) werden die rezidiverten und nicht rezidivierten Patienten in einem Verlauf betrachtet. Die Anzahl der Patienten in den jeweiligen Gruppen zum Zeitpunkt 0 wird durch n angegeben.

↓75

Zwei Patienten wurden im Verlauf der Studien vorrübergehend bcr-abl negativ. Hierbei handelte es sich um einen Patient in der Studie CSTI571-0113 in den Monaten 3 und 4 bzw. eine Patientin in der Studie CSTI571-0114 in den Monaten 5 und 6.

Als statistisch signifikant sind die Abfälle für die nicht rezidiverten Patienten der Studien CSTI571-0113 (p<0,0005) und CSTI571-0114 (p=0,0368) zu sehen.

Abbildung 9. Verläufe der medianen [bcr-abl/β-actin] mRNS Ratio (y-Achse, logarhythmisch) für die einzelnen Studienkollektive im Verlauf der Therapie (x-Achse, linear).
N stellt die Anzahl der Patienten dar.

4.3.3 AGP mRNS Transkripte

↓76

Abb. 10 zeigt den Verlauf der [AGP/ β-actin] mRNS Ratio im Verlauf der Behandlung mit Imatinib.

Für die Studien CSTI571-0113 (A) und CSTI571-0114 (B) sind die Verläufe der rezidivierten (rez.) und nicht rezidiverten (nicht rez.) Patienten getrennt dargestellt. Bei der Studie CSTI571-0115 (C) werden beide Gruppen zusammengefasst betrachtet. N gibt die Anzahl der Patienten in den jeweiligen Gruppen zum Zeitpunkt 0 an.

Statistisch signifikant ist der Abfall der rezidivierten Patienten der Studie CSTI571-0113 (p<0,0005) sowie der Abfall der nicht rezidiverten Patienten der Studie CSTI571-0114 (p=0,453).

↓77

Abbildung 10. Diese Abbildung zeigt die Verläufe der medianen [AGP/β-actin] mRNS Ratio (y-Achse, logarhythmisch) für die einzelnen Studienkollektive im Verlauf der Therapie (x-Achse, linear).
N ist die Anzahl der Patienten. In A und B werden die nicht rezidiverten und rezidivierten Patienten getrennt dargestellt.

4.3.4 WT1 mRNS Transkripte

Abb. 11A, 11B und 11C zeigen die Verläufe der [WT1/ β-actin] mRNS Ratio im Verlauf der Behandlung mit Imatinib.

Für die Studien CSTI571-0113 (A) und CSTI571-0114 (B) sind die Verläufe der rezidivierten (rez.) und nicht rezidiverten (nicht rez.) Patienten getrennt dargestellt. Bei der Studie CSTI571-0115 (C) werden beide Gruppen zusammengefasst betrachtet. N gibt die Anzahl der Patienten in den jeweiligen Gruppen zum Zeitpunkt 0 an.

↓78

Die mediane [WT1/β-actin] mRNS Ratio sank statistisch signifikant für die rezidivierten Patienten der Studie CSTI571-0113 (p<0,0005) (A) und für beide Gruppen - nicht rezidivierte (p<0,0005) und rezidivierte (p=0,008) Patienten - der Studie CSTI571-0114 (B). Im Vergleich zu den rezidivierten Patienten war der Abfall der nicht rezidivierten Patienten der Studie CSTI571-0114 jedoch wesentlich deutlicher: von 3,37x10-5 zum Zeitpunkt 0 auf 2,31x10-7 im 3. Monat. Die Medianverläufe der beiden Gruppen bezüglich der [WT1/β-actin] mRNS Ratio unterscheiden sich signifikant (p=0,018).

Die [WT1/β-actin] mRNS Ratio in der Studie CSTI571-0115 verlief ähnlich der medianen [bcr-abl/β-actin] mRNS Ratio. In diesem Falle ist der Abfall jedoch signifikant (p=0,019) (C).

Abbildung 11. Diese Abbildung zeigt die Verläufe der medianen [WT1/β-actin] mRNS Ratio (y-Achse, logarhythmisch) für die einzelnen Studienkollektive im Verlauf der Therapie (x-Achse, linear).
N ist die Anzahl der Patienten.

4.3.5 MDR1 mRNS Transkripte

↓79

Abb. 12 zeigt den Verlauf der [MDR1/ β-actin] mRNS Ratio im Verlauf der Behandlung mit Imatinib für die Studien CSTI571-0113 (A) und CSTI571-0114 (B). Hierbei werden die Verläufe der rezidivierten (rez.) und nicht rezidiverten (nicht rez.) Patienten getrennt dargestellt. N gibt die Anzahl der Patienten in den jeweiligen Gruppen zum Zeitpunkt 0 und SD die Standardabweichung an.

In der Studie CSTI571-0115 werden nicht rezidivierte und rezidivierte Patienten in einem Verlauf (C) betrachtet.

Im gesamten Beobachtungszeitraum blieb die mediane [MDR1/β-actin] mRNS Ratio in allen 3 CSTI571-Studien stabil, ohne statistisch signifikante Abfälle oder Anstiege.

↓80

Abbildung 12. Diese Abbildung zeigt die Verläufe der medianen [MDR1/β-actin] mRNS Ratio (y-Achse, logarhythmisch) für die einzelnen Studienkollektive im Verlauf der Therapie (x-Achse, linear).
N ist die Anzahl der Patienten.

4.4 4.4ERGEBNISSE DES CLAMPING-PROBE ASSAYS

4.4.1 Methodenevaluation

Um die Evolution oder Präexistenz von relevanten bcr-abl Mutationen zu studieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit Mutationsanalysen während des Krankheitsverlaufes durchgeführt. Zur Demonstration der Sensivität des Assays, der die PNA-Clamping PCR mit einer Mutationsanalyse kombiniert, wurden definierte Mengen an Positivkontrollenplasmid hergestellt und in Wildtyp-cDNA verdünnt. Abb. 13 stellt dar, dass Verdünnungen von 1:10 bis 1:500 mittels des PNA-Clamping Assays detektiert werden konnten.

Abb. 14A - 16A zeigen die Mutationsanalysen der für diese Arbeit untersuchten rezidivierten Patienten. Parallel dazu zeigen Abb. 14B - 16B die Messungen der bcr-abl/ -Actin mRNS Ratio während des Krankheitsverlaufes, sowie den Zeitpunkt der hämatologischen Resistenz (HR).

↓81

Abbildung 13. stellt die Verdünnung von Tyr253His cDNA in Wildtyp-cDNA dar. Die Tyr253His cDNA, die aus dem Blut eines Patienten synthetisiert wurde, der diese Mutation entwickelte, wurde in Wildtyp cDNA eines gesunden Spenders verdünnt und anschliessend im etablierten PNA-Clamping Assay gemessen.
NTK = non-Template-Kontrolle; WTK = Wildtyp-Kontrolle.

4.4.2 Mutationsnachweis bei therapierefraktären und rezidivierten Patienten

Bei Patientin 1 handelt sich um eine 61-jährige Frau, bei der 88 Monate vor Einschluss in die Studie CSTI571-0113 CML diagnostiziert wurde. Mittels des im Rahmen dieser Arbeit etablierten PNA-Clamping Assays konnte eine Thr315Ile-Mutation in der 16. Woche nach Therpiebeginn mit Imatinib detektiert werden (Abb. 14A). Zu einer hämatologischen Resistenz, bestätigt durch ein Ansteigen der Blasten im peripheren Blut, kam es bei dieser Patientin allerdings erst in der 24.Woche (Abb. 14B).

Bei der 67-jährigen Patientin 2 wurde die CML 11 Monate vor Einschluss in die Studie CSTI571-0115 diagnostiziert. Nach Studiengebinn detektierte man in der 6. Woche hier ebenfalls eine Thr315Ile-Mutation. Kurz darauf konnte – zwischen Woche 6 und 7 – eine hämatologische Resistenz festgestellt werden (ohne Abb.).

↓82

Abbildung 14. Longitudinale Messungen der detektierten Mutation Thr315Ile und der bcr-abl mRNS bei Patienten 1, die refraktär gegenüber der Imatinib-Therapie war. A zeigt die Schmelzkurven der cDNA, während B die quantitative bcr-abl Last als Ratio zwischen Ziel- und Kontroll-Template (-Aktin) darstellt. Die Zeit der Imatinib-Therapie ist in Wochen angegeben. HR = Hämatologische Resistenz.
NTK = non-Template-Kontrolle; WTK = Wildtyp-Kontrolle.

Bei Patient 3 konnte die Glu255Lys-Mutation schon vor Beginn der Imatinib-Therapie detektiert werden (Abb. 15A). Beim Einschluss in die Studie CSTI571571-0114 war der Patient 64 Jahre alt, und die CML schon seit 47 Monate bekannt. Der Patient entwickelte weder ein hämatologisches noch zytogenetisches Ansprechen, so dass nach 37 Wochen die Imatinib-Therapie beendet wurde. Die bcr-abl mRNS Kopienzahl blieb währed der gesamten Behandlungsperiode erhöht (Abb. 15B).

Abbildung 15. Longitudinale Messungen der detektierten Mutation Glu255Lys und der bcr-abl mRNS bei Patient 3, der refraktär gegenüber der Imatinib-Therapie war. A zeigt die Schmelzkurven der cDNA, während B die quantitative bcr-abl Last als Ratio zwischen Ziel- und Kontroll-Template (-Aktin) darstellt. Die Zeit der Imatinib-Therapie ist in Wochen angegeben.
NTK = non-Template-Kontrolle; WTK = Wildtyp-Kontrolle.

↓83

Patientin 4 wurde 82-jährig in die Studie CSTI571-0115 aufgenommen. Die CML war zu diesem Zeitpunkt bereits 32 Monate lang bekannt. Die anfangs (Woche 0) detektierbare Tyr253His-Mutation war nach Therapiebeginn mit Imatinib zunächst nicht mehr nachweisbar, trat dann aber in der sechsten Woche erneut auf (Abb. 16A). Da die Patientin zu diesem Zeitpunkt leukozytopenisch war, konnten weder hämatologische noch zytogenetische Daten über ihren Krankheitszustand erschlossen werden. Nach einem hämatologischen Rezidiv in der 10.Woche, verstarb die Patientin zwischen Woche 11 und 12 (Abb. 16B).

Abbildung 16. Longitudinale Messungen der detektierten Mutation Tyr253His und der bcr-abl mRNS bei Patient 4, die refraktär gegenüber der Imatinib-Therapie war. A zeigt die Schmelzkurven der cDNA, während B die quantitative bcr-abl Last als Ratio zwischen Ziel- und Kontroll-Template (-Aktin) darstellt . Die Zeit der Imatinib-Therapie ist in Wochen angegeben.
NTK = non-Template-Kontrolle; WTK = Wildtyp-Kontrolle


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07.06.2005