5 DISKUSSION

↓83

Im Rahmen dieser Arbeit wurden 69 Patienten untersucht, die als Teil einer internationalen Studie analog zu Patienten in bereits publizierten Studien behandelt wurden [60,61,62].

↓84

Von diesen 69 Patienten waren zum Zeitpunkt des Studieneinschlusses 37 in der chronischen Phase, 21 in der akzelerierten Phase und 11 Patienten in der Blastenkrise. Klinische Daten, wie hämatologisches und zytogenetisches Ansprechen, Nebenwirkungen sowie molekularbiologische Daten wurden während des Krankheitsverlaufes erfasst. In dieser Arbeit wurden ausserdem die bcr-abl, WT1, AGP und MDR1 mRNS Verläufe gemessen, um diese als potentielle Verlaufs- oder Prognoseparameter und im Rahmen der Resistenzentstehung gegenüber Imatinib beurteilen zu können.

Den Schwerpunkt dieser Arbeit stellt die Etablierung eines PNA-Clamping Assay dar, der ein Screening rezidivierter Patienten auf drei bekannte Mutationen (Thr315Ile, Glu255Lys, Tyr253His) ermöglichte. Aufgrund einer Sensivität des Assays von 1:500 konnte eine Mutation frühzeitig und vor dem hämatologischen Rezidiv detektiert werden.

5.1 METHODENDISKUSSION

Im Rahmen der Methodendiskussion werden zwei Punkte betrachtet. Dabei handelt es sich a) um den Vergleich Taqman versus Lightcycler, und b) um den Vergleich des PNA-Clamping gegenüber standardisierten Methoden.

↓85

Die molekularbiologischen Daten wurden durch Echtzeitfluoreszenz-PCR mit Hilfe des Taqman erfasst, was gegenüber anderen quantitativen PCR-Verfahren den Vorteil einer automatisierten und damit schnellen Durchführung hat. Bei einer gleichzeitigen Messung von 96 Proben im Taqman ermöglichen lineare Standardkurven von 107 bis 101 Kopien die Bestimmung absoluter Templatmengen. Ausserdem kommt es durch die Detektion von PCR-Produkten im geschlossenen Gefäss und Fehlen von post-PCR-Schritten zur Senkung der Kontaminationsgefahr.

Eine hohe Präzision der Ergebnisse wird durch das Erfassen der Kopienzahl der Gensequenz in der exponentiellen Phase der Reaktion erzielt. Eine gute Korrelation ist ein Indikator für die Messgenauigkeit. Diese Korrelation lag in allen Messungen bei 0.997 bzw. 0.998 lag (Abb.8).

Ergebnisse für eine quantitative Echtzeitfluoreszenz-PCR im Lightcycler liegen bereits nach ca. einer Stunde vor. Im Lightcycler können maximal 45 Proben gleichzeitig gemessen werden. Im Taqman können dagegen 96 Proben in einem PCR-Lauf gemessen werden und es wird – anstatt der fragilen Glaskapillaren im Lightcycler – eine stabilere Polyethylengefässplatte verwendet. In Abhängigkeit zu den PCR-Konditionen kann ein PCR-Lauf im Taqman allerdings bis zu zwei Stunden und länger dauern. Da die Erfassung der mRNS-Daten in dieser Arbeit jedoch retrospektiv erfolgte und keine klinischen Entscheidungen zur Folge hatte, spielte der Zeitfaktor in diesem Falle nur eine untergeordnete Rolle. Bei einer Detektionsgrenze von 10 Kopien konnten durch das Verfahren der Echtzeitfluoreszenz-PCR insgesamt valide und reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden.

↓86

Limitiert ist dieses Verfahren – unabhängig vom eingesetzten Gerät – zum einen durch den apparativen Aufwand und zum anderen durch die mangelnde Sensivität im Vergleich zur nested-PCR.

Des Weiteren musste im Rahmen dieser Arbeit eine externe Referenz verwendet werden, da für das Referenzgen β-Actin die PCR separat und nicht gleichzeitig mit der PCR des Zielgens als interne Referenz durchgeführt werden musste. Eine interne Referenz wäre nur über eine Duplex-PCR möglich gewesen, die zum Zeitpunkt der Messung aber nicht verfügbar war.

Aktuelle Detektionstechniken für Sequenzvariationen, wie Einzelstrang-Konformationspolymorphismus, DNS-Sequenzierung oder Echtzeitfluoreszenz-PCR haben eine limitierte Sensivität von ungefähr 1:5 (20%) [87]. Bezüglich eines Restriktionslängenpolymorphismus kann in Abhängigkeit vom Sequenzcharakter keine Sensivität unter 1:10 (10%) erzielt werden [116]. Assays mit einer grösseren Sensivität , wie sie bei Pourzand et al. (1993) und van Houten et al. (2000) aufgeführt werden, sind methodisch wesentlich komplizierter und zum Teil auch nur bedingt reproduzierbar [117,118]. Eine hohe Sensivität ist vor allem relevant bei relativ hohem Hintergrund an Wildtyp-Molekülen, wie z.B. nicht-mutiertes bcr-abl im Falle von Punktmutationen, die zur Imatinib-Resistenz führen.

↓87

Bei Nutzung von fluoreszenzmarkierten Hybridisierungsproben in der Echtzeitfluoreszenz-PCR können Variationen auf Einzelbasenpaarebene speziell durch Schmelzkurven analysiert werden. Um zuverlässige und sensitive Informationen über kleinste Mengen an mutierten Zellen nachzuweisen, können zusätzlich einzelne Klone gepickt und anschliessend deren DNS sequenziert werden.

Im Gegensatz zu den oben genannten arbeits- und zeitintensiven Prozeduren, wurde in der hier vorgestellten Arbeit die wesentlich weniger arbeits- und zeitintensive Methode des PNA-Clamping Assays etabliert und zur Detektion relevanter Mutationen der Imatinibresistenz angewandt. Bei diesem Assay handelt es sich um eine Kombination aus PNA-Clamping-PCR und einer Mutationsanalyse mit zwei fluoreszenzmarkierten Sonden.

Ein Assay dieser Art wurde bisher lediglich für Mutationen des Hämatochromatosegens und im Rahmen von c-kit Mutationen publiziert, wobei jedoch genauere Angaben bezüglich der Sensivität der angewandten Assays fehlten [44]. Sotlar et al. (2003) geben für einen solchen Assay zur Detektion von c-kit Mutationen eine Sensivität von 1:1000 (0,1%) an [119]. Es handelt sich hierbei um eine schnelle Technik mit einer Sensivität von 1:500 (0,2%), die 20 Minuten nach DNS-Präparation durchgeführt werden kann und sich deshalb zur Routinediagnostik eignen könnte. In einer von Roche-Lestienne et al. (2002) erschienenen Publikation wurden zur Detektion von bcr-abl Mutationen Allel-spezifische Primer verwandt. Die Autoren beschreiben hier eine Sensivität von 1:10000 [93]. Es ist jedoch zu bedenken, dass es bei dieser Methode leicht zu falsch-positiven Ergebnissen kommen kann, weil schon allein eine nicht-adäquate Primerhybridisation die Ursache für artifizielle Template sein kann.

↓88

Im PNA-Clamping Assay dieser Arbeit wurden keine Allel-spezifischen Primer verwendet. Aufgrund der PNA-Clamping-PCR konnte das mutierte Allel selektiv amplifiziert und durch seine spezifische Schmelzkurve einfach charakterisiert werden. Zusätzlich erfüllt der Assay das sogenannte Format des geschlossenen Gefässes.

Ein Schwachpunkt dieser Technik ist jedoch, dass der Allel-Status der amplifizierten PCR-Produkte nicht unterschieden werden kann.

5.2 AUSWERTUNG UND VERGLEICH DER STUDIEN CSTI571-0113/ -0114/ -0115

In dieser Arbeit wurden nicht alle Patienten analysiert, die am Campus Virchow, Charité rekrutiert worden waren. Ausgeschlossen wurden Patienten, bei denen Daten aufgrund von Non-Compliance fehlten oder die weniger als vier Wochen behandelt worden sind. Im Vergleich zu analog behandelten Patienten in bereits publizierten Studien war die Beobachtungszeit der in dieser Arbeit vorgestellten Patienten kürzer und eine Einjahresüberlebungsrate konnte nicht bestimmt werden, da die mittlere Beobachtungsrate bei weniger als einem Jahr lag [60,61,62]. Rezidive, die eventuell erst nach Ende des Beobachtungszeitraum auftraten, gingen nicht in die Beurteilung mit ein. Diese Gründe könnten dazu beigetragen haben, dass es im Vergleich zu den bereits publizierten Studien zu geringen Abweichungen der klinischen Ergebnisse kam. Bezüglich der zytogenetischen Ergebnisse sind direkte Vergleiche nicht möglich, da sich der Zeitpunkt der Knochenmarkspunktionen im Rahmen der Studien unterschied. Trotz fehlender direkter Vergleichbarkeit sind die Unterschiede der klinischen Ergebnisse der Studien nicht von solchem Umfang, dass generell andere Schlussfolgerungen aus den vorliegenden Ergebnissen gezogen werden müssen.

5.2.1 Hämatologische und zytogenetische Daten der Studie CSTI571-0113

↓89

In der Studie CSTI571-0113 führte Imatinib bei 83,8 % der Patienten zu einer kompletten hämatologischen Remission. Dieses Ergebnis unterscheidet sich geringfügig von der Studie von Kantarjian et al (2002), in der Imatinib bei 91% der Patienten zu einer kompletten hämatologischen Remission führte.

In dieser Studie hatten 46,2% der chronische Phase Patienten ein major zytogenetisches Ansprechen nach 3 Monaten, 87,5% nach 6 Monaten und 33,3% nach 9 Monaten. Die unterschiedlichen zytogenetischen Ansprechraten nach 3, 6 bzw. 9 Monaten sind unter anderem durch die unterschiedlichen Patientenzahlen zu diesen Zeitpunkten zu erklären.

Insgesamt lagen bei 23 Patienten der hier untersuchten Patienten suffiziente zytogenetische Analysen ( 20 Metaphasen) vor. Neun Patienten (39,1%) entwickelten ein major zytogenetisches Ansprechen innerhalb von 9 Monaten. Nach einer mittleren Beobachtungsdauer von 26 Wochen lag die Überlebensrate der Patienten bei 91,9% (vergl.Tab. 17). Bei Kantarjian et al. (2002) hatten 60% der Patienten ein zytognetisches Ansprechen, und die Überlebensrate nach 18 Monaten betrug 95%.

↓90

Somit zeigt sich zusammenfassend für die, bei Kantarjian et al. und die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Patienten, ein besseres zytogenetisches Ansprechen als im Falle einer Behandlung mit IFNα.

5.2.2 Hämatologische und zytogenetische Daten der Studie CSTI571-0114

Im Gegensatz zu 34% in der publizierten Studie von Talpaz et al. (2002) kam es in der hier vorgestellten Patientengruppe bei 71,4% der Patienten zu einer kompletten hämatologischen Remission.

Talpaz et al. (2002) berichten ausserdem von einem major zytogenetischem Ansprechen bei 24% der Patienten. Die mittlere Ansprechzeit lag dabei zwischen zwei und drei Monaten, aber selbst noch nach 12 Monaten entwickelten Patienten ein major zytogenetisches Ansprechen.

↓91

Demgegenüber hatten in der hier vorliegenden Arbeit nach 3 Monaten 33,3% der Patienten und nach 6 Monaten 25% der Patienten ein major zytogenetisches Ansprechen. Nach 9 Monaten gab es kein major zytogenetisches Ansprechen bei Patienten mit 20 auswertbaren Metaphasen. Allerdings lagen bei etlichen Patienten zu diesem Zeitpunkt keine auswertbaren Knochenaspirate vor. Nur ein Patient (33,3%) mit 10 analysierbaren Metaphasen zeigte ein major zytogenetisches Ansprechen. Von 15 auswertbaren Patienten entwickelten 2 Patienten (13,3%) ein major zytogenetisches Ansprechen ( 20 Metaphasen) (siehe Tab. 18).

Nach dem Studienprotokoll wurden in die Studie CSTI571-0114 auch Patienten eingeschlossen, die allein aufgrund chromosomaler Aberrationen in die akzelerierte Phase eingeordnet wurden, ohne dass signifikante Blutbildveränderungen mit erhöhten Blasten- und Promyelozytenanteilen vorlagen. In den grossen Studien [60,61,62] wurden diese Patienten häufig als chronische Phase Patienten eingestuft. Dieser Unterschied ist als Erklärung für bessere hämatologische und zytogenetische Ergebnisse in der hier vorgestellten Studie CSTI571-0114 möglich. Nach einer mittleren Beobachtungszeit von 24 Wochen überlebten insgesamt 87,5% der Patienten. Bei Talpaz et al. (2002) lag die mittlere Einjahresüberlebensrate bei 74%.

5.2.3 Hämatologische und zytogenetische Daten der Studie CSTI571-0115

Bei 7 (63,6%) der hier insgesamt 11 untersuchten Patienten der Studie CSTI571-0115 kam es zu einem kompletten hämatologischen Ansprechen. In der Arbeit von Sawyers et al (2002) wurde vergleichsweise von einem kompletten hämatologischen Ansprechen bei 7% der Patienten berichtet. Erneut muss jedoch auf die grosse Diskrepanz der jeweiligen Patientenzahlen hingewiesen werden.

↓92

Ein Patient der in dieser Arbeit untersuchten Patienten in Blastenkrise hatte bei 10 auswertbaren Metaphasen ein major zytogenetisches Ansprechen.

Im gesamten Untersuchungszeitraum konnte in der Mehrheit der Fälle keine suffiziente zytogenetische Analyse ( 20 Metaphasen) durchgeführt werden. Sechs Patienten (54,5%) verstarben nach einer mittleren Beobachtungszeit von 19 Wochen (siehe Tab. 19). Sawyers et al. (2002) berichteten von einer mittleren Einjahres-Überlebensrate von 32% [62]. Aufgrund der geringen Fallzahl unserer Studie ist ein aussagekräftiger Vergleich mit den Daten von Sawyers et al (2002) nicht möglich.

5.2.4 Nebenwirkungen

Im Vergleich zu IFNα traten während der Behandlung mit Imatinib insgesamt weniger Nebenwirkungen auf (siehe Tab. 20). Nach den allgemeinen Kriterien des National Cancer Institute [114] handelte es sich hauptsächlich um Nebenwirkungen vom Grad I oder Grad II. Die wesentlichen nicht hämatologischen Nebenwirkungen in allen drei Studien stellten oberflächliche Ödeme (vor allem Periorbitalödeme), Muskelkrämpfe, Exantheme und Gewichtszunahme dar. Diese Nebenwirkungen sind relativ übereinstimmend auch in anderen Studien beschrieben worden [58,59,60,61,62]. Die Inzidenz der einzelnen Nebenwirkungen ist im Vergleich zu bereits veröffentlichten Daten allerdings geringer und könnte mit der kürzeren Behandlungsdauer der Patienten in der vorliegenden Arbeit erklärt werden.

↓93

Im Vergleich zu den entsprechenden publizierten Studien kam es bei den hier vorgestellten Patientengruppen zu mehr hämatologischen Toxizitäten (siehe Tab. 20). Interessanterweise kam es bei den Knochenmarkspunktionen nach Therapiebeginn zum gehäuften Auftreten von hypozellulären – und daher für die zytogenetische Untersuchung inadäquaten – Proben. Diese Beobachtung könnte durch einen bis dato noch nicht eindeutig geklärten Effekt von Imatinib auf die Ph-Chromosom negative Granulopoese erklärt werden. Einige Autoren schreiben dem c-abl eine Beteiligung an zellregulatorischen Funktionen wie DNS-Reparaturmechanismus und Zell-differenzierung zu [120]. Imatinib könnte demnach über Inhibition des c-abl die Proliferation der bcr-abl negativen „Resthämatopoese“ beeinflussen.

Bei den nicht hämatologischen Toxizitäten sind die Entstehungsmechanismen noch nicht vollständig geklärt. Dies gilt insbesondere für Muskelkrämpfe, Nausea und Gewichtszunahme.

Lediglich die dermatologischen Toxizitäten wie z.B. Wundheilungsstörungen oder Dermatiden könnten erklärt werden mit einer Inhibition des PDGF-R durch Imatinib in Zusammenhang stehen. Diese Überlegung ergibt sich aus der Beobachtung, dass der PDGF-R an regenerativen Funktionen wie Wundheilung beteiligt ist [121].

5.3 α1-SAURES-GLYKOPROTEIN (AGP): PROTEINCHEMISCHE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE VERLÄUFE

↓94

Trotz viel versprechender Studienergebnisse in der Behandlung mit Imatinib stellt das Auftreten von Resistenzen gegenüber Imatinib ein zentrales Problem der klinischen Anwendung dar. In Zellkulturexperimenten konnte bereits im Jahr 2000 die Amplifikation des bcr-abl Fusionstranskriptes als ein möglicher Resistenzmechanismus beschrieben werden [64,65,66]. Spätere Arbeiten zeigten, das dieser Mechanismus durchaus eine klinische Relevanz hat [67].

Während jedoch eine Dosissteigerung im Zellkulturansatz zu einer erneuten Sensitivität der Zellen gegenüber Imatinib führte, kann eine Dosissteigerung im klinischen Einsatz die Resistenz nicht in allen Fällen überwinden. In diesem Falle könnte von Bedeutung sein, dass Imatinib im klinischen Ansatz zu 95% an Plasmaeiweiss gebunden ist, und eine Erhöhung der oralen Dosis keinen linearen Anstieg der freien und aktiven Plasmakonzentration zur Folge hat. Bei den hier untersuchten Patienten wurde im Rezidiv in Einzelfällen Amplifikationen des Ph-Chromosoms beschrieben.

Experimentelle Daten zu AGP in Zusammenhang zur Resistenzentwicklung gegenüber Imatinib wurden aus in vitro-Versuchen und Tiermodellen hergeleitet, eine klinische Relevanz ist noch nicht demonstriert worden. Kokultivierung von BCR-ABL positiven Zelllinien im Patientenserum mit niedrigen und hohen Konzentrationen an AGP zeigte jedoch eine dosisabhängige Inhibition von Imatinib [122].

↓95

In diesem Zusammenhang wurde in der vorliegenden Arbeit sowohl der Plasmaproteinspiegel des AGP (siehe Abb. 7A-C) wie auch die AGP mRNS-Transkriptzahlen im Verlauf bestimmt (siehe Abb. 10A-C).

Der Normbereich bei Gesunden für AGP liegt zwischen 50 und 120 g/dl. In Abhängigkeit des Krankheitsstadiums steigt die AGP Plasmakonzentration. Patienten mit Rezidiv wiesen initial – im Vergleich zu Patienten im gleichen Krankheitsstadium ohne Rezidiv – höhere AGP Plasmaspiegel auf [112,123]. Auch in dem geringfügig modifizierten Patientenkollektiv dieser Arbeit wurden diese Ergebnisse bestätigt. Für die Studie CSTI571-0113 (7A) war der mediane AGP Plasmaproteinwert in der Woche 0 für die Patienten ohne Rezidiv 96,0 g/dl, für die Patienten mit Rezidiv dagegen 148,5 g/d. Der mediane AGP Plasmaproteinwert der rezidivierten Patienten der Studie CSTI571-0114 (7B) lag mit 179,5 g/dl ebenfalls höher als in der Gruppe der nicht rezidivierten Patienten mit 141,0 g/dl. Für die Gruppe CSTI571-0115 (7C) ergab sich mit 183,5 g/dl der höchste mediane AGP Plasmaproteinwert in der Woche 0.

Zusammenfassend lagen die medianen AGP Plasmaproteinwerte für die rezidivierten Patienten in der Woche 0 ausserhalb des Normbereiches und höher als für die nicht rezidivierten Patienten. In Abhängigkeit des Krankheitsstadiums stieg der initiale AGP Plasmaproteinwert vor Therapiebeginn mit Imatinib von der chronischen Phase zur Blastenkrise an.

↓96

Während des gesamten Beobachtungzeitraums kam es für die nicht rezidivierten Patienten der Studie CSTI571-0114 (p=0,007) und für die Patienten der Studie CSTI571-0115 (p=0,051) zu einem statistisch signifikanten Abfall des Plasma-AGP-Spiegels.

AGP ist ein in der Leber synthetisiertes akute-Phase-Protein. Auf die Frage, inwieweit AGP überhaupt in peripheren Blutzellen exprimiert wird, zeigten le Coutre et al. (2002) zunächst, dass AGP mRNS in den peripheren Blutzellen von Patienten nachweisbar ist. Leukämische Blasten werden jedoch als Ursprung für die AGP mRNS-Synthese ausgeschlossen [112].

Gahmberg et al. gehen davon aus, dass AGP in den Lymphozyten synthetisiert wird [124]. Trotz der Theorie eines „shedding“ von AGP mRNS, einem Ausschwemmen von AGP mRNS aus der Leber in die Blutbahn, kann der Ursprung der AGP mRNS im Blut letztendlich nicht bestätigt werden.

↓97

Teilweise handelte es sich bei den in vergleichbaren Arbeiten untersuchten Patienten um Studienpatienten, die auch in dieser Arbeit beschrieben wurden. Die AGP mRNS-Spiegel der Patienten aus der Arbeit von le Coutre et al. (2002) wurden im Rahmen dieser Arbeit im Krankheitsverlauf weiterverfolgt.

Die [AGP/β-actin] mRNS Ratio in der Studie CSTI571-0113 verändert sich im Beobachtungszeitraum nur für die Gruppe der rezidivierten Patienten signifikant

(p<0,0005), wobei die Ratio um mehr als eine logarhythmische Stufe sinkt (siehe Abb. 10A). In der Studie CSTI571-0114 dagegen ist es die Ratio der nicht rezidivierten Patienten, die signifikant von 5,65x10-4 auf 2,04x10-4 abfällt (p=0,045) (siehe Abb. 10B). Die Ratio für die gesamten Patienten der Studie CST571-0115 (siehe Abb. 10C) blieb relativ stabil. Aufgrund dieser diskordanten Ergebnisse kann der detektierten AGP mRNS in dieser Arbeit bezüglich einer Rezidiventwicklung keine biologische Relevanz beigemessen werden. Le Coutre et al. (2002) kamen nach 13-wöchiger Verlaufs-beobachtung zu demselben Ergebnis.

↓98

Der Unterschied zwischen mRNS-Expression im peripheren Blut und den gemessenen AGP Proteinwerten könnte somit einerseits dadurch erklärt werden, dass Veränderungen des AGP Plasmaspiegels allein auf Veränderungen der hepatischen AGP mRNS zurückgehen, ohne in Verbindung mit der AGP mRNS im Plasma zu stehen. Andererseits könnten auch, dass posttranlationale Mechanismen unter Imatinib-Therapie so beeinflusst werden, dass erhöhte AGP Protein-Spiegel reduziert werden.

5.4 DISKUSSION DER BCR-ABL, WT1 und MDR1 mRNS DATEN

Bereits seit 1999 ist in unserer Arbeitsgruppe die quantitative PCR für bcr-abl sowohl im Lightcycler als auch im Taqman etabliert. In Vorarbeiten konnte an Leukämiepatienten festgestellt werden, dass in einer Echtzeitfluoreszenz-PCR bcr-abl und WT1 mRNS-Spiegel mit dem klinischen Verlauf und den molekularbiologischen Ergebnissen, die in einem konventionellen PCR-Verfahren erschlossen wurden, korrelieren [99,111,125]. Gleichzeitig kann davon ausgegangen werden, dass die quantitative mRNS-Bestimmung dieser beiden Parameter prädiktiven Wert hat und als neuer Marker bei der Detektion von Minimal Residual Disease (MRD) Verwendung finden könnte [126].

In der vorliegenden Arbeit lagen molekularbiologische Daten von 24 Patienten in chronischer Phase vor.

↓99

Bei den nicht rezidivierten Patienten in chronischer Phase kam es zu einer signifikanten Reduktion der medianen [bcr-abl/β-actin] mRNS Ratio im Verlauf von 8 Monaten um ca. 2 logarhythmische Stufen von 4,3x10-4 auf 9,3x10-6 (p<0,0005). Im Vergleich dazu zeigte sich bei den rezidivierten Patienten (n=4) ein Anstieg von 8,1x10-4 bis 2,3x10-3. Dieser Anstieg war im Einzelfall jeweils vor dem Eintreten des hämatologischen Rezidivs erkennbar. Die Ratio in der Woche 0 lag im Median mit 2,1x10-5 für die rezidivierten Patienten höher als für die nicht rezidivierten Patienten mit einer Ratio von 2,9x10-6. Diese Ergebnisse unterstützen die prädiktive Relevanz der quantitativen bcr-abl Analyse (siehe Abb. 9A).

In der Studie CSTI571-0114 sinkt die mediane [bcr-abl/β-actin] mRNS Ratio ebenfalls signifikant in der Gruppe der nicht rezidivierten Patienten (p=0,0368). Lediglich eine Patientin zeigte ein komplettes molekulares Ansprechen im Sinne einer [bcr-abl/β-actin] mRNS Ratios von 10-8 nach 5 monatiger Therapie mit Imatinib (siehe Abb. 9B). Diese Patientin hatte bei Therapiebeginn keine zusätzlichen chronischen Aberrationen. Sie wurde allein aufgrund von 25% Promyelozyten als akzelerierte Phase Patient rekrutiert. Es ist insofern von einer frühen akzelerierten Phase auszugehen.

Da 10 von insgesamt 11 Patienten in der Studie CSTI571-0115 rezidivierten, wurde bei der Analyse der Patienten in Blastenkrise auf eine Teilung zwischen rezidiviert und nicht rezidiviert verzichtet. Die Ratio aus [bcr-abl/β-actin] mRNS in der Studie CSTI571-0115 ist durch ein Ab- und Ansteigen charakterisiert (siehe Abb. 9C). Das effektivste molekulare Ergebnis bei einem Patienten in dieser Gruppe besteht in einer Reduktion der medianen [bcr-abl/β-actin] mRNS Ratio um zwei Logstufen in einem Zeitraum von vier Monaten mit einem anschliessenden rapiden Wiederanstieg (siehe Abb.9C).

↓100

Die Funktion des WT1 besteht in der transkriptionellen Regulation, abhängig vom zellulären Kontext, dem Zielpromotor und der WT1 Isoform. Als Zielgene wurden bislang u.a. epidermal growth factor-1 (EGF-1) [103], platelet derived growth factor (PDGFR-A) [127], retinoic acid receptor-alpha (RAR-alpha) [105], bcl-2 und c-myc [106] sowie p53 [107] identifiziert. Die physiologische und pathologische Bedeutung ist bislang jedoch noch ungeklärt. Aufgrund der höheren WT1 Expression in den unterschiedlichen Leukämietypen (40-70% bei AML, 20-40% bei ALL, 80% bei CML in Blastenkrise) bietet sich WT1 ebenfalls als zusätzlichen Minimal-Residual-Disease (MRD)-Parameter an bei der CML an.

Es zeigte sich, dass in bestimmten Leukämien WT1 überexprimiert wird und WT1 Transkripte vor allem in Zellen leukämischen Ursprungs stark erhöht sind [109]. Eine solche Expression von WT1 in den peripheren Blutzellen der Studienpatienten dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden. In der Gruppe der Studie CSTI571-0113 kam es in Übereinstimmung mit der medianen [bcr-abl/β-actin] mRNS Ratio in der Gruppe der nicht rezidivierten Patienten zu einem signifikanten Abfall der medianen [WT1/β-actin] mRNS Ratio von 2,9x10-6 in der Woche 0 bis zu 4,6x10-8 im 6. Monat (p<0,0005). Demgegenüber zeigte sich in der Gruppe der rezidivierten Patienten, ausgehend von 2,9x10-6 in der Woche 0, nach kurzweiligen Absinken auf 3,3x10-7 im dritten Monat ein sukzessiver Anstieg auf 4,8x10-5 im 5. Monat (Abb. 11A).

In der Gruppe der Patienten in akzelerierter Phase sank die mediane [WT1/β-actin] mRNS Ratio signifikant für die rezidivierten (p=0,008) und nicht rezidivierten (p<0,0005) Patienten. Der Abfall in der Gruppe der nicht rezidvierten Patienten war im Vergleich zu den rezidivierten Patienten jedoch wesentlich deutlicher. Ein statistisch signifikanter Unterschied ergab sich auch im direkten Vergleich der beiden Gruppen (p=0,018)
(Abb. 11B).

↓101

In Übereinstimmung mit den Daten der chronischen Phase kam es in der Blastenkrise zu einem ähnlichen Verhalten der medianen [bcr-abl/β-actin] mRNS Ratio und medianen [WT1/β-actin] mRNS Ratio (Abb. 9,11C). Statistisch signifikant war jedoch nur der Abfall für WT1 (p=0,019) (11C).

In diesem Sinne ist in den hier untersuchten Blastenkrisepatienten WT1 ein sensitiverer Verlaufsparameter.

In dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass die WT1 Transkriptzahlen vom Krankheitsverlauf abhängen und sich somit zum Monitoring von CML Patienten eignen. Ein Ansprechen auf eine Therapie mit Imatinib kann somit auch für CML-Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung beurteilt werden.

↓102

In der Frage möglicher intrinsischer Resistenzmechanismen wird eine MDR1 Überexpression diskutiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde bei allen Patienten die MDR1 mRNS Expression im Verlauf der Krankheit bestimmt. Im Gegensatz zu den variablen bcr-abl bzw. WT1 Transkriptverläufen blieben die MDR1 Transkriptzahlen in allen drei Studien während des gesamten Beobachtungszeitraumes stabil. Selbst die Patienten in der Studie CSTI571-0115 zeigten im Vergleich zu den Patienten in den
Studien CSTI571-0113 und CSTI571-0114 keine gesteigerte MDR1 mRNS Expression (siehe Abb. 12A-C). Basierend auf den in dieser Arbeit erzielten, molekularbiologischen Daten besteht bezüglich der Frage der Resistenzentwicklung gegenüber Imatinib kein Anhaltspunkt für eine MDR1 Beteiligung. Es muss dabei jedoch berücksichtigt werden, dass die Konzentration des Korrelats auf Proteinebene, dem MDR1 Protein, in dieser Arbeit nicht bestimmt worden ist. Eine erhöhte MDR1 Proteinsynthese bei konstanter MDR1 Expression z.B. durch veränderte Proteindegradation kann demnach nicht ausgeschlossen werden.

Interessanterweise gibt es in verschiedenen Publikationen unterschiedliche Daten hinsichtlich einer MDR1 Proteinexpression bei CML-Patienten, welche in einzelnen Fällen eine stadienabhängige Überexpression zeigen. Gleichzeitig und im Gegenteil berichten andere Autoren jedoch von keiner Veränderung der Expression in Abhängigkeit zu den Krankheitsstadien [128].

Die unterschiedlichen Daten bezüglich einer MDR1 Proteinexpression könnten auf verschiedene Sensivitäten der benutzten Methoden zurückzuführen sein, die zur Detektion und Quantifizierung von MDR1 Protein verwendet wurden.

↓103

Bemerkenswert ist dennoch, dass eine bcr-abl positive Zelllinie beschrieben wurde, die aufgrund einer MDR1 Überexpression resistent gegenüber Imatinib ist [129,130]. Weiterhin konnten Dai et al. (2003) zeigen, dass die in vitro-Gabe des MDR1 Proteininhibitors LY335979 zu einer veränderten intrazellulären Imatinibkonzentration führt [131]. Diese neueren Daten müssen als indirekter Hinweis auf eine Beteiligung des MDR1/ MDR1 Protein an der Entstehung von Resistenzmechanismen verstanden werden.

Als letzter möglicher intrinsischer Resistenzmechanismus, der in dieser Arbeit unter-sucht wurde, steht das Auftreten von Punktmutationen.

5.5 DISKUSSION DER DATEN DES PNA-CLAMPING ASSAYS

Die Entwicklung resistenter Klone stellt bei Patienten, die mit Imatinib therapiert werden, ein zentrales Problem dar. Hierbei ist von Bedeutung, dass aufgrund einer zu geringen Sensitivität der konventionellen Techniken Imatinib-resistente Klone nicht früh genug erkannt werden können. Des Weiteren könnte der Selektionsdruck einer weiterführenden Imatinib-Therapie das Auftreten von resistenten Zellen beschleunigen. Eine frühe Detektion von Punktmutationen durch den hier vorgestellten PNA-Clamping Assay könnte daher zu verbesserten Therapieentscheidungen führen. Eine Relevanz dieses Ansatzes konnte im Rahmen dieser Arbeit an vier Patienten gezeigt werden.

↓104

Bei Patient 1 zeigte sich anfangs ein Rückgang der bcr-abl mRNS Last. Im weiteren Verlauf entwickelte sich jedoch ein mutierter Klon, der acht Wochen vor Eintreten des hämatologischen Rezidives durch den PNA-Clamping Assay PNA-Clamping Assay detektiert werden konnte (siehe Abb.14A-B).

Bei den Patienten 2 und 4 erfolgte ein Krankheitsprogress unmittelbar nach Detektion der Mutation. Eine Begründung für den kurzen Zeitraum zwischen diesen beiden Ereignissen könnte sein, dass sich beide Patienten zu Beginn der Therapie mit Imatinib schon in der Blastenkrise befanden. Ausserdem hätten andere Mutationen, die durch diesen Assay nicht detektierbar sind, präsent sein und damit die Ursache für das schnelle Fortschreiten der Krankheit sein können.

Das Auftreten der BCR-ABL Mutation (Glu255Lys) wurde durch den etablierten Assay in der vorliegenden Arbeit bereits vor Behandlungsbeginn mit Imatinib detektiert. Eine 13 monatige Therapie führte bei Patient 3 zu keiner Reduktion der bcr-abl mRNS, so dass man in diesem Falle von einer ineffektiven Therapie ausgehen muss (siehe Abb. 15A-B).

↓105

Bei Patient 4 verschwand die anfangs (Woche 0) detektierbare Tyr253His-Mutation nach Therapiebeginn mit Imatinib. Nach sechs Wochen konnte die Mutation im leukozytopenischen Zustand jedoch wieder detektiert werden (siehe Abb. 16A-B).

Die hieraus resultierende Fragestellung ist, wie Patienten mit präexistenten oder sich entwickelnden resistenten Klonen in Zukunft behandelt werden könnten. Verschiedene Ansätze wurden bereits in vitro und/ oder in vivo vorgestellt:

  1. Absetzen der Imatinibtherapie. Für das Unterbrechen einer Behandlung mit Imatinib spricht das Argument, dass man auf diese Weise den Selektionsdruck für mutierte Klone reduziert. Einzelberichte zeigen eine Reduktion des resistenten Klons nach Absetzen der Therapie mit Imatinib [132,133].
  2. Kombinationen mit anderen antileukämischen Agenzien. Hierzu zählen vor allem die in der Behandlung der CML traditionell genutzten Chemotherapeutika, wie Interferon α (IFNα), Cytosin-Arabinoside (AraC), Hydroxyurea und Busulfan, aber auch andere Chemotherapeutika, die nicht zur klassischen Therapiemedikation gehören, wie Homoharringtonine (HHT) oder Farnesyltransferase-Inhibitoren.
  3. Verschiedene in in vitro-Untersuchungen bezüglich einer Kombination mit Imatinib sind zusammengefasst bei Topaly et al. (2002) zu finden [134]. Dabei wurden neben den klassischen Therapieagentien auch andere untersuchte Chemotherapeutika wie HHT und Farnesyltransferase-Inhibitoren mit antileukämische Wirkung getestet Trotz teilweiser kontroverser Ergebnisse berichten die meisten Autoren von einigen Chemotherapeutika mit synergistischer Wirkung bei gleichzeitiger Gabe von Imatinib, wie im Falle von IFNα und AraC [133,135,136,137]. Auch wenn in vitro Daten nicht immer mit den klinischen Wirkungen korrelieren, können diese Informationen bei der Erstellung von neuen Therapieprotokollen zur Kombinationstherapie bei CML von Bedeutung sein.
  4. Imatinib Dosiserhöhung
  5. Eine Dosiserhöhung von Imatinib führte bei CML-Patienten in chronischer Phase, die entweder eine zytogenetische Resistenz aufwiesen oder rezidiviert waren, in einigen Fällen zum Erfolg [138]. Hierbei ist der limitierende Faktor die Toxizität.
  6. Entwicklung von Imatinib-ähnlichen Substanzen mit erhöhter Bindungs-affinität.
  7. Eine Entwicklung von Imatinib-ähnlichen Substanzen mit erhöhter Bindungsaffinität stützt sich auf die Idee, auftretende Punktmutationen an der Bindungsstelle – genau auf Grund ihrer stärkeren Bindungsfähigkeit – überwinden zu können.
  8. Autoimmunvakzinierung. Eine Vakzinierung mit Peptiden aus der bcr-abl Fusionsregion kann eine spezifische Immunantwort bei CML Patienten induzieren [139]. Da spezifische T- Zellen bei Patienten in zytogenetischer Remission wie auch gesunden Spendern detektiert werden konnten, vermutet man eine Korrelation zwischen der zytogenetischen Antwort und Detektion von bcr-abl spezifischen T-Zellen [140].

↓106

Ein Vergleich der Ergebnisse dieser Studie mit vorangegangenen Arbeiten zeigt, dass Imatinib den bisherigen medikamentösen Therapien bei der CML hinsichtlich der Rate des hämatologischen und zyogenetischen Ansprechens überlegen ist. Komplette hämatologische Ansprechraten bis zu fast 84% in dieser Arbeit und sogar 91% bei Kantarjian et al. (2002) liegen sichtlich höher als bei vergleichbaren Patienten unter Therapie mit IFNα (70-80%) [31,141,142]. Ein major-zytogenetisches Ansprechens bei 33% der Patienten in akzelerierter Phase und 24% bei Talpaz et al. (2002) ist ermutigend, weil unter Therapie mit alternativen Mitteln weniger als 5% der CML-Patienten in akzelerierter Phase ein zytogenetisches Ansprechen und demnach ein kürzeres Überleben zeigten [143,144].

Die Resultate zeigen auch, dass mit Imatinib im Vergleich zu bisherigen medikamentösen Therapien bessere Ergebnisse bei geringerem Nebenwirkungsprofil erzielt werden können.

Bislang gibt es noch keine ausreichenden Langzeitergebnisse bezüglich einer Therapie mit Imatinib, um die Frage des Gesamtüberlebens beantworten zu können. Aufgrund der bekannten Korrelation zwischen zytogenetischem Ansprechen und der Überlebensdauer bei IFNα, könnte jedoch eine Verbesserung des Gesamtüberlebens unter Imatinib erwartet werden.

5.6 AUSBLICK

↓107

Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten bestätigen Imatinib als neue Therapieform, mit der hämatologische und zytogenetische Vollremissionen erreicht werden können.

Bei der Diskussion auftretener Resistenzen unter Therapie mit Imatinib ist jedoch zu bemerken, dass die Resistenz momentan allein auf eine Reaktivierung des p210 BCR-ABL zur vollen Stärke zurückzuführen ist. Diese Tatsache unterstreicht die Bedeutung des Fusionsproteins in der Progression der CML und begrenzt damit in gewisser Hinsicht das Problem der Resistenzentwicklung und der Erlangung notwendiger Kontrolle darüber. In Analogie zur Behandlung einer HIV-Erkrankung mit „Medikamenten-Cocktails“, bei dem jedes einzelne Medikament einen anderen Wirkmechanismus aufweist, basiert der Ansatz einer Kombinationstherapie von Imatinib mit anderen medikamentösen Agenzien vor allem auf der Idee, auf diese Weise das Wirkungsspektrum zu erhöhen und dem leukämischen Klon die schlechtesten Voraussetzungen zu liefern, Resistenzen gegenüber den Medikamenten zu entwickeln. Die Schwierigkeit, mit einem einzelnen Inhibitor alle Mutanten zu kontrollieren, unterstreicht die Bedeutung einer Prävention von Resistenzen bzw. einer Etablierung von Kombinationstherapien, die die Mutationen überwinden können.

Der in dieser Arbeit etablierte PNA-Clamping Assay ermöglichte das Detektieren mutierter leukämischer Klone zu einem sehr frühen Zeitpunkt. Vorstellbar wäre eine Weiterentwicklung dieses Assays zu einem Ansatz einer Multiplex-PCR, die alle bisher bekannten, bei Resistenz gegenüber Imatinib auftretenden Mutationen zu detektieren vermag. Weitere Untersuchungen sollten sich mit einem Vergleich verschiedener Therapiestrategien nach Auftreten von bcr-abl Mutationen beschäftigen.

↓108

Neben der Bedeutung für die Behandlungsstrategien stehen aber das Monitoring des Krankheitsverlaufes und das therapeutische Ansprechen im Vordergrund der Behandlung mit Imatinib. Der Nachweis einer „minimalen Resterkrankung“, d.h. ein Vorhandensein leukämischer Zellen bei Patienten in zytogenetischer Remission, hat vor allem zum Ziel, den Zeitpunkt einer Rezidivbehandlung zu optimieren.

Zum Zeitpunkt der IFNα-Therapie war die quantitative Echtzeitfluoreszenz-PCR zur Messung der bcr-abl mRNS noch nicht relevant, da es bei der Mehrzahl der Patienten zu keinem nennenswerten molekularbiologischen Ansprechen kam. Im Falle von Imatinib jedoch ermöglicht nun die quantitative Echtzeitfluoreszenz-PCR durch Messung der bcr-abl mRNS eine rasche Beurteilung der Remissionsqualität und ihrer Dynamik.

Die Aufgabe wird in Zukunft sein, bei Diagnosestellung eine effektive „individuelle Therapieplanung“ aufstellen zu können, basierend auf klinischen Parametern, individuell genetischen Faktoren, wie z.B. dem Medikamentenmetabolismus oder dem genetischen Aufbau der Leukämiezelle, der Zytogenetik und der initialen bcr-abl Last.

↓109

Genetische Profile könnten in Zukunft durch Microarrayanalysen erstellt werden [145].

Neue Behandlungsstrategien und ein verbessertes Monitoring prognostischer Faktoren, des Krankheitsverlaufes und des therapeutischen Ansprechens bieten somit neue Chancen, die Therapieergebnisse zu verbessern und daraus resultierend die Überlebenszeit von CML-Patienten zu verlängern.


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07.06.2005