2  Material und Methoden

2.1  Forschungsaufenthalt

Grundlage des Forschungsvorhabens war ein 6-wöchiger Forschungsaufenthalt in Januar und Februar 2004 im Oman von Prof. Dr. Neitzel und Herrn Abdelkrim Marnich, einem arabisch sprechenden Mitarbeiter (Fotograf und Dokumentationsassistent) des Instituts für Humangenetik.

Während des Forschungsaufenthalts suchten Prof. Dr. Neitzel und Herr Marnich 270 Familien, die sich in 15 Krankenhäusern aus 4 Regionen des Omans befanden, auf, von denen die Mundschleimhautproben entnommen und Fragebögen ausgefüllt wurden. Bei 117 Familien konnte die DNA betroffener Trisomie 21 Kinder und beider Eltern erfasst werden. Die Proben und Fragebögen dieser Familien bildeten die Basis für die vorliegende Dissertation. Den Personen wurde mehrere Male mit einem Watteträger über die Wangenschleimhaut gestrichen und die so gewonnenen Epithelzellen in 2 ml große Eppendorf-Gefäße (gefüllt mit 50 mM Tris: pH 8.0, 50 mM EDTA, 50 mM Sucrose, 100 mM NaCl, 10% SDS) gegeben. Außerdem wurde 10 Mitgliedern einer Familie mit mehreren Trisomie 21 Kindern Blut abgenommen und ihre Proben mittels Courier Dienst (DHL) nach Berlin gesendet.

2.3.1  Geräte

Tab. 3 : Geräte zur Isolierung der DNA

In Berlin angekommen, wurde aus den Proben die DNA nach folgendem Protokoll extrahiert:
Die Gefäße wurden 15 min in Thermomixer bei 90°C erwärmt und bei 700 rpm gerüttelt, um die Zellen aus der Watte zu lösen. Anschließend wurde das Lysat in 1,5 ml Eppendorf Gefäße pipettiert und in den BioRobot® dM48 der Firma QIAGEN gestellt. Ferner wurde der BioRobot® dM48 mit dem in Tabelle 4 beschriebenen Reaktions-Kit, sowie mit weiteren speziellen Arbeitsplatten und Pipettierspitzen laut Herstellerangaben bestückt.

Tab. 4 : Fertiges Reaktionssystem (Kit) zur Isolierung genomischer DNA aus Mundschleimhautzellen

Das angeschlossene Computerprogramm zeigte die Extraktionsschritte und Geschwindigkeit an. Gleichzeitig können 48 verschiedene Proben isoliert werden. Der Hersteller QIAGEN gibt keine Angaben, welche Reagenzien im Reaktions-Kit enthalten sind, erläutert aber das Prinzip der DNA Extraktion:
Magnetische Partikel binden an die DNA, die dann von einem äußeren Magneten gehalten werden. Das Lysat, bestehend aus Puffer, Salzen und eventuellen Watterückständen wird in mehreren Waschschritten entfernt. Nach Entfernung der magnetischen Partikel bleibt die gereinigte DNA in einer Konzentration von circa 5-10 ng in Ethanol präzipitiert übrig.

	Abb. 4 : DNA-Extraktion

2.4.1  Geräte

Tab. 5 : Verwendete Geräte (sofern nicht gesondert unter dem Kapitel 3.5 angegeben)

Die Methode der Polymerase-Kettenreaktion [Saiki et al.1988] wurde 1987 von Kary B. Mullis entwickelt. Dieses Verfahren hat die genetischen Analysen revolutioniert, denn es ermöglicht, enzymatisch von bestimmten Nukleotidsequenzen in vitro millionenfache Kopien herzustellen. Dieser als Amplifikation bezeichnete Vorgang macht auch sehr geringe Ausgangsmengen einer Analyse schnell zugänglich. Die Vorgänge bei der Vervielfältigung einer Nukleinsäure mittels PCR ähneln dem Reaktionsablauf der natürlichen Replikation. Dabei synthetisiert eine DNA-Polymerase, ausgehend von Startermolekülen, einen neuen DNA-Strang an einer einzelsträngigen Nukleinsäure-Matrize, der Template-DNA. Bei der PCR werden als Startermoleküle synthetische DNA-Oligonucleotide (Primer) verwendet, die spezifisch an die Template-DNA hybridisieren. Von deren 3’-Ende aus synthetisiert eine hitzestabile DNA-Polymerase den neuen DNA-Doppelstrang. Durch die Wahl des gegenläufig orientierten Oligonukleotid-Primerpaares kann gezielt die DNA-Sequenz zwischen den beiden Primern vervielfältigt werden. Das entscheidende Prinzip ist die zyklische Wiederholung der einzelnen Reaktionsschritte, wodurch die Matrize exponentiell amplifiziert wird.

Tab. 6 : Ansatz für die PCR pro Tube

Die PCR Amplifikation wurde in mehreren Ansätzen unter ansonsten gleichen Bedingungen durchgeführt. Der in Tabelle 6 beschriebene Ansatz unterschied sich lediglich in den Primerpaaren für die verschiedenen zu untersuchenden Marker. Ein PCR-Zyklus durchläuft zunächst die thermische Denaturierung. An die entstandene einzelsträngige DNA hybridisieren danach die Oligonukleotid-Primer (Annealing). Davon ausgehend synthetisiert die DNA-Polymerase schließlich die komplementären Stränge (Extension). Die PCR wurde auf ABI 9600 Cycler ausgeführt, der für bis zu 96 PCR-Probengefäße ausgerüstet ist. Eine automatische Steuerung regelt das zyklische Temperaturprogramm, in dem die jeweilige Temperatur und Zeit pro Reaktionsschritt sowie die Zyklenzahl wie in Tabelle 7 programmiert wurden.

Tab. 7 : Reaktionsschritte des ABI 9600 Cyclers

Mikrosatelliten oder polymorphe Marker können unterschiedliche Anzahlen von kurzen, aneinander gelagerten Repeat-Einheiten enthalten. Führt man eine PCR mit Primern durch, die solche Repeats begrenzen, entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge. Marker, für die verschieden lange DNA-Fragmente (Allele) bekannt sind, werden als hoch polymorph bezeichnet. Auf jedem Chromosom ist ein solches Allel vorhanden, so dass auf Grund eines diploiden Chromosomensatzes zwei Allele pro Person und im Fall der Trisomie 21 drei Allele pro Person amplifiziert werden können. Diese Allele werden stabil vererbt, das heißt die Länge der Repeats ändert sich fast nie bei der Vererbung von einer Generation auf die nächste; wohl unterscheidet sie sich aber bei nicht verwandten Individuen. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Individuum heterozygot (Het %) für ein Merkmal ist, und weitere Charakteristika der verwendeten Primer werden in den folgenden beiden Tabellen 8 und 9 angegeben.

Tab. 8 : Übersicht und Reihenfolge der verwendeten Primer des Chromosoms 14

Quellen: Human Genome Database (HDG), National Center for Biotechnology Infortmation (NCBI) und das Marschfield Center

Tab. 9 : Übersicht und Reihenfolge der verwendeten Primer des Chromosoms 21

Quellen: Human Genome Database (HDG), National Center for Biotechnology Infortmation (NCBI) und das Marschfield Center

Tab. 10 : Geräte für die Herstellung des Agarose-Gels und die Gelelektrophorese

Nach erfolgter PCR wurde die amplifizierte DNA auf einem 2 %igen Agarose-Gel überprüft. Die in Tabelle 11 genannten Reagenzien wurden in der Mikrowelle bei 360 W circa 10 Minuten erhitzt, bis die Agarose vollständig gelöst war. Dann wurde das Gel in etwa 5 mm Dicke auf ein sauberes Glas gegossen und zwei 24-zähnige Kämme eingelegt, die nach dem Aushärten gezogen werden konnten. Diese Arbeitsschritte erfolgten unter einem Abzug und mit Verwendung von Latexhandschuhen, da Ethidiumbromid mutagen und toxisch ist.

Tab. 11 : Reagenzien des 2%igen Agarosegels

Nach dem Erstarren des Gels wurde es in die Elektrophoresekammer gelegt, die an einem Spannungsgerät angeschlosssen ist. Das Puffer-Reservoir wurde mit 1x TBE gefüllt, so dass das Gel gerade vollständig mit Puffer bedeckt war. Dort wurden je 5 µl PCR-Produkt und 3 µl Ladepuffer [10 mmol EDTA, 40% Sucrose, Bromphenolblau (Merck)] in die Taschen pipettiert; sowie in die letzte Tasche 5 µl Kb-Leiter aufgetragen. Zur Orientierung, wie weit die DNA-Stränge bereits gelaufen sind, dient der Ladepuffer. Die DNA wandert auf Grund ihrer negativen Ladung in Richtung Anode, so dass sich die Geltaschen auf der Kathodenseite befinden müssen. Das Ethidiumbromid wandert in die entgegengesetzte Richtung zur Anode. Beim Aufeinandertreffen dieser Moleküle bindet sich Ethidiumbromid interkalierend zwischen die Basen der DNA – was durch seine fluoreszierenden Eigenschaften die DNA unter UV-Licht sichtbar macht. Das Gel lief 10 min bei 180 V und wurde nach dem Lauf unter Durchleuchtung von 302 nm ultraviolettem Licht auf einem Polaroid 667 Film aufgenommen.

2.6.1  Reagenzien

Je nach Stärke der Bande in der vorausgegangenen Gelelektrophorese wurde von jedem der amplifizierten Nukleotidrepeats 1-2 µl für die weitere Vorbereitung verwendet. Zu jeder Probe wurden 9 µl Formamid und 0,3 µl ROX Size Standard 400HD hinzugefügt und die gesamte Mixtur bei 3-4 min bei 96°C denaturiert. Um eine mögliche Wiederanlagerung zu verhindern, wurden die Proben bis zum Beladen des Sequenzers auf Eis gelagert. Die restliche DNA wurde für eventuelle Wiederholungsläufe eingefroren und wieder verwendet.

Die Analyse der PCR-Produkte erfolgte mit Hilfe des ABI 3100 Genescan-Sequenzierers, der zur Sequenz- und Fragmentanalyse verwendet wird. Dabei werden die zu analysierenden
DNA-Fragmente über ihre Größe und ihre Fluoreszenzmarkierung identifiziert. Vor dem Lauf des Sequenzers wurden die denaturierten Proben zusammen mit den Reagenzien im Abschnitt 3.6.1. versehen und eine Kalibrierung der Schrittmotoren vorgenommen. Dieser ist mit Genescan-Kapillaren mit 75µm Innendurchmesser und einer Halterung für 384 Proben versehen. Mit Hilfe einer angelegten Spannung wandern die DNA-Fragmente durch die mit Polymer-Gel gefüllten Kapillaren. Ein Argonlaser, der über ein Spiegelsystem auf das Gel gelenkt wird, regt den Fluoreszenzfarbstoff an. Dabei erfolgt die elektrophoretische Auftrennung nach der Größe der Fragmente.

Die Fluoreszenzemission wird an einem Spektrograph in die Spektralfarben aufgebrochen. Diese Spektralfarben werden auf eine CCD-Sensor Oberfläche geleitet, wo sie spezifisch detektiert werden. Das System erlaubt die simultane Detektion verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe. Während der Elektrophorese werden die Daten durch einen Computer digital erfasst. Ein angeschlossener Power Macintosh 7200, auf dem die zugehörige Software ABI PRISM 3100 Collection installiert ist, steuert den Sequenzierer auf Grund der folgenden Voreinstellungen:

Zusätzlich zu der untersuchten Probe wird in jeder Spur ein Längenstandard geladen (ROX Size Standard 400HD), der eine eigene Fluoreszenzmarkierung trägt. Mit Hilfe des internen Längenstandards können die Größen der untersuchten DNA-Fragmente bis auf 1bp genau berechnet werden.

Mit Hilfe des Programms „ABI Prism® GeneScan Analysis Software 3.7“, das auf einem angeschlossenen Rechner installiert ist, können die Rohdaten weiterverarbeitet werden. Der Sequenzierer bearbeitet maximal vier Fluoreszenzfarbstoffe, so dass neben den drei Primer- Farbstoffen ein weiterer für die Längenstandards (ROX Size Standard 400HD) verwendet wurde. Dieser weist folgende farbstoffmarkierte Oligonukleotide auf: 50, 60, 90, 100, 120, 150, 160, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380 und 400 bp. Wenn man diese Werte den dazugehörigen Peaks der Rohdaten zuordnet, kann die folgende Eichkurve erstellt werden, die für die gesamten Rohdaten eine Längenzuordnung ermöglicht.

	Abb. 5 : Eichkurve des GeneScan-400HD Size Standard

Abhängig von der Größe der zu erwartenden Nukleotidsequenzen und von den eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen, wurden im Rahmen der Voreinstellungen des Programms verschiedene Parameter für die Softwareanalyse eingestellt. Zur Markierung der DNA-Stränge wurden 6-Carboxyfluoreszein (6-FAM) sowie seine beiden Derivate Hexachloro-6-Carboxyfluoreszein (HEX) und Tetrachloro-6-Carboxyfluoreszein (TET) verwendet.

Tab. 12 : Absorbtions- und Emissionsmaxima der verwendeten Farbstoffe:

Nachfolgend wird am Beispiel des Markers D21S215 (hier TET markiert) eine Auswertung erläutert. In einer neuen Datei wird die Eichkurve des Längenstandards voreingestellt (ROX ist rot). Dann werden die analysierten Rohdaten geöffnet und der Bereich vergrößert, in dem die Signale erwartet werden (hier zwischen 160 und 180 bp). Sollten die Signale schwach sein, kann die Y-Achse in größeren Intervallen gezeigt werden. Umgekehrt gilt dies auch bei sehr starken Signalen. Die Veränderung der Skala hat keinen Einfluss auf die Auswertung und dient nur den Gründen der Anschaulichkeit. Als weiterer Schritt muss ein Allel definiert werden.

	Abb. 6 : : Beispielauswertung Index mit Trisomie 21

Im Beispiel oben besteht ein Allel aus zwei kleinen Vor-Peaks, dem tatsächlichen Allel-Peak, der durch Anklicken grün ausgefüllt wird und einem Nach-Peak. Die einzige Abweichung bildet das zweite Allel des Index. Es hat keine Vor-Peaks, weil es dicht nach dem ersten Allel folgt. Dieses Auswertungsmuster kehrt in anderen analysierten Daten des gleichen Markers wieder und muss nur bei einem anderen Marker neu definiert werden. Höhe und Fläche der Peaks gibt das Programm in einer Tabelle gesondert an.

An der Allelverteilung im Beispiel ist deutlich zu erkennen, dass das Index-Kind trisom für das Chromosom 21 ist. Der Vater hat das Allel 167 und die Mutter das Allel 169 an das Kind weitervererbt. Da die Eltern beide das Allel 173 besitzen ist hieraus noch nicht zu ersehen, wer von beiden das überzählige Chromosom 21 vererbt hat. Diese Frage lässt sich jedoch auf Grund der Konstellation weiterer Marker klären.

2.7.1  Personenauswahl

Wie auch bei der Mikrosatellitenanalyse wurden die 117 Mütter mit einem Down Syndrom Kind auf den Polymorphismus hin untersucht. Zusätzlich zu den innerfamiliären Untersuchungen, dienten die Ergebnisse der Väter als Kontrollen.

Die verwendeten Geräte werden wie in Kapitel 3.5. beschrieben eingesetzt. Die Reagenzien sind, sofern nicht anders in Tabelle 13 erwähnt, vom Hersteller Applied Biosystems.

Für die Untersuchung auf die Mutation im MTHFR-Gen wird extrahierte DNA (unter 3.3. beschrieben) benötigt. Mit Hilfe der PCR wird ein Bereich um den möglichen Nucleotidaustausch an Position 677 des MTHFR-Gens von C (Cytosin) nach T (Thymin) amplifiziert und mit einem Restriktionsenzym auf die Mutation hin untersucht. Die detaillierte Vorgehensweise ist in der Tabelle 13 (nach dem Protokoll des Herstellers, Applied Biosystems) beschrieben.

Die Auswertung erfolgt ebenfalls mit dem Programm „ABI Prism® GeneScan Analysis Software 3.7“, wobei jeweils nur ein schwarzer Peak für C (Cytosin), ein roter Peak für T (Thymin) oder beide Peaks gleichzeitig im Fall der Heterozygotie pro Probe auszuwerten ist.

Tab. 13 : SNaP Shot Protokoll

Bei allen Trisomie 21 Fällen sowie deren Kontrollen wurden nur die Mütter mit einem strukturierten Interview befragt. Diese Interviews wurden persönlich durchgeführt und zu Beginn gemäß dem folgenden Text auf einige allgemeine Dinge hingewiesen:

2.8.1  Vorbemerkungen

„Bevor ich einige Fragen stelle, möchte ich auf einige Punkte hinweisen:

Ich bin Doktor und werde Ihre Antworten streng vertraulich behandeln. Dies gilt auch für die anderen Anwesenden. Keiner weiteren Person als die hier Anwesenden werden irgendwelche Informationen über Sie erhalten. Das, was Sie mir mitteilen, dient ausschließlich wissenschaftlichen Zwecken. Das Ziel unserer Untersuchung ist es, etwas über die Entstehung des Down Syndroms im Oman herauszufinden. Alle Daten werden anonymisiert ausgewertet, d.h. Ihr Name wird niemandem mitgeteilt und wird daher auch in keinem Bericht erscheinen.

Sie können zu jedem Zeitpunkt die Befragung abbrechen.

Selbstverständlich steht es Ihnen völlig frei, bestimmte Antworten zu verweigern. Mir ist es sogar lieber, wenn sie keine Antwort geben, als eine falsche Antwort, was immer auch die Gründe dafür sein mögen.

Ich bin gern bereit, Ihnen auf alle Fragen zu antworten, die sich Ihnen stellen. Ich wäre Ihnen aber sehr dankbar, wenn Sie damit möglichst bis zum Ende des Interviews warten würden.“

Die Auswertung der Fragebögen erfolgte durch die Erstellung einer Datenbank. Wie unter 3.7.4. Beschrieben erfolgte hier ebenfalls die statistische Auswertung mit SPSS. Da es sich bei dieser Untersuchung um eine Pilotstudie handelt, liegt die Bedeutung der Datenbank nur im Hinblick auf die Generation von Hypothesen für spätere, weiterführende Untersuchungen.

Tab. 14 : Der Fragebogen umfasst die folgenden Variablen: