Aus der Medizinischen Klinik für Rheumatologie und Klinische Immunologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Untersuchungen zum differenzierten Wirkungsprofil von Glucocorticoiden in humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Lydia Naumann
aus Radebeul

Dekan: Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. R. Straub
2. PD Dr. med. G. Kayser
3. Prof. Dr. med. F. Buttgereit

Datum der Promotion:14.02.2005

Abstract

Qualitativ unterschiedliche genomische und nichtgenomische Mechanismen vermitteln die starken anti-inflammatorischen und immunmdulatorischen Eigenschaften der Glucocorticoide (GC). Der genomisch vermittelte Mechanismus ist bereits gut untersucht und dokumentiert, während der nichtgenomisch vermittelte Mechanismen noch einen Gegenstand vielseitiger Untersuchungen darstellt. Wir haben uns daher die Frage gestellt, ob Beclometason und Clobetasol besonders geeignet für die topische Applikation sind, weil sie sich in ihrem Wirkungsspektrum von systemisch zu applizierenden GC wie Dexamethason unterscheiden. Wir verglichen dazu die Effekte auf den Sauerstoffverbrauch mittels der Clark-Elektrode (nichtspezifisch nichtgenomischer Mechanismus), auf die IL-6-Synthese mittels ELISA (genomischer Mechanismus) und auf die Apoptose mittels Durchflusszytometrie (nichtgenomischer und genomischer Mechanismus) in ruhenden und stimulierten humanen PBMC. Dabei zeigten Beclometason und Clobetasol in sehr niedrigen Konzentrationen (10-10, 10-8 M) einen stärkeren Effekt auf den Sauerstoffverbrauch, waren aber in hohen Konzentrationen (10-5, 10-4 M) weniger potent im Vergleich zu Dexamethason. Auch hinsichtlich ihrer genomischen Potenz waren die topischen GC in einer Konzentration von
10-10 M und 10-8 M effektiver als Dexamethason, in höheren Konzentrationen unterschieden sie sich aber nicht. Alle drei GC induzierten Apoptose konzentrationsabhängig und unterschieden sich nicht in Konzentrationen zwischen 10-8 M und 10-5 M. In einer Konzentration von 10-4 M war die Induktion von Apoptose durch die topischen GC in PBMC und Jurkat-T-Zellen aber signifikant stärker im Vergleich zu Dexamethason. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich topische und systemische GC in ihrer genomischen und nichtgenomischen Potenz signifikant unterscheiden. Es ist daher davon auszugehen, dass nichtgenomische Effekte eine deutlichere klinische Relevanz besitzen als bisher angenommen.

Eigene Schlagworte: Genomische und nichtgenomische Glucocorticoid-Effekte, systemische und topische Glucocorticoide, humane mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, Apoptose, Interleukin-6, Sauerstoffverbrauch

Abstract

Several different genomic and non-genomic mechanisms mediate the important anti-inflammatory and immunomodulatory effects of glucocorticoids (GCs). The genomic effects are the most important while the clinical relevance of non-genomic actions is still a matter of debate. We therefore investigated whether beclomethasone and clobetasol are particularly suitable for topical application because they differ in their spectrum of activity from systemically administered GCs such as dexamethasone. We compared effects on oxygen consumption as measured with a Clark electrode (nonspecific non-genomic glucocorticoid effects), on interleukin-6 synthesis by means of ELISA (genomic effects) and on apoptosis using flow cytometry (non-genomic and genomic effects) in quiescent and mitogen-stimulated PBMCs. Beclomethasone and clobetasol had stronger effects on the oxygen consumption of quiescent and stimulated cells at lower concentrations (10-10, 10-8 M) but were less potent at higher concentrations (10-5, 10-4 M) in comparison with dexamethasone. Also in terms of genomic potency, topical GCs were more effective than dexamethasone at 10-10 M and 10-8 M but gave similar results at higher concentrations. The ability of all three GCs to induce apoptosis was found to be concentration-dependent and similar at concentrations between 10-8 and 10-5 M but, compared with 10-4 M dexamethasone, 10-4 M beclomethasone or clobetasol was significantly more effective at inducing apoptosis in both PBMCs and Jurkat T cells. These results show that systemic and topical GCs differ significantly in their ability to induce genomic and non-genomic effects. This suggests that non-genomic effects are more therapeutically relevant in certain clinical conditions than currently assumed.

Keywords: genomic and non-genomic glucocorticoid effects, systemic and topical glucocorticoids, human peripheral blood mononuclear cells, apoptosis, interleukin-6, oxygen consumption

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Modulare Wirkungsmechanismen von Glucocorticoiden
  • 1.2 Struktur-Wirkungsbeziehung von Glucocorticoiden
  • 1.3 Bisherige Untersuchungen zu Wirkungsprofilen von Glucocorticoiden
  • 1.4 Fragestellung der vorliegenden Arbeit
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Präparation humaner mononukleärer Zellen des peripheren Blutes mittels Dichtegradientenzentrifugation
    • 2.1.1 Isolierung und in vitro-Inkubation von PBMC zur Messung des Sauerstoffverbrauchs
    • 2.1.2  Präparation, Zellkultur und in vitro-Inkubation von PBMC zur Messung der IL-6-Synthese und Apoptose
    • 2.1.3 Zellkultur von Jurkat-Zellen
  • 2.2 Amperometrische Quantifizierung des zellulären Sauerstoffverbrauchs
    • 2.2.1 Prinzip
    • 2.2.2 Versuchsdurchführung
  • 2.3 Nichtkompetitiver ELISA zur Quantifizierung der IL-6-Synthese
    • 2.3.1 Prinzip
    • 2.3.2 Durchführung
  • 2.4  Durchflusszytometrie (FACS) zur Quantifizierung von Apoptose
    • 2.4.1 Prinzip der Durchflusszytometrie
    • 2.4.2 Nachweis apoptotischer Zellen mittels Annexin V-FITC
    • 2.4.3 Nachweis apoptotischer Zellen mittels DNA-Färbung
    • 2.4.4 CD95-exprimierende humane Jurkat-Zelllinie
  • 2.5 Statistische Auswertungen
    • 2.5.1 Deskriptive Statistik
    • 2.5.2 Parametrische und nichtparametrische Tests
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Untersuchungen zum zellulären Energiestoffwechsel mittels Clark-Elektrode
    • 3.1.1 Sauerstoffverbrauch von ruhenden und stimulierten PBMC
    • 3.1.2  Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch von ruhenden PBMC
    • 3.1.3 Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch von stimulierten PBMC
    • 3.1.4 Effekte der Con A-Stimulation auf den Sauerstoffverbrauch von humanen PBMC nach Vorinkubation mit Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol
    • 3.1.5  Zusammenfassung
  • 3.2  Quantitative Bestimmung von IL-6 mittels nichtkompetitivem ELISA
    • 3.2.1 IL-6-Synthese von ruhenden und stimulierten PBMC
    • 3.2.2  Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf die IL-6- Synthese von ruhenden PBMC
    • 3.2.3 Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf die IL-6-Synthese von PHA-stimulierten PBMC
    • 3.2.4 Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf die IL-6-Synthesevon Con A-stimulierten PBMC
    • 3.2.5 Zusammenfassung
  • 3.3  Quantitative Bestimmung von Apoptose mittels Durchflusszytometrie (FACS)
    • 3.3.1 Standardisierungsbedingungen
    • 3.3.2  Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf die Apoptose von Jurkat-Zellen
    • 3.3.3  Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf die Apoptose von PBMC
• 4  Diskussion
  • 4.1 Grundlagen der Glucocorticoidtherapie
  • 4.2  Modulares Modell der Wirkmechanismen von Glucocorticoiden
    • 4.2.1 Unspezifisch nichtgenomischer Mechanismus
    • 4.2.2 Genomischer Mechanismus
    • 4.2.3  Apoptose als komplexer, trimodular vermittelter Prozess
    • 4.2.4 Nichtgenomische und genomische Potenzen für Clobetasol und Beclomethason im Vergleich zu Dexamethason und klinische Relevanz
• 5  Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Curriculum vitae
• Selbstständigkeitserklärung

Tabellen

• Tab. 1: Zellpopulationen in der Durchflusszytometrie nach Doppelfärbung mit FITC-konjugiertem Annexin V und PI.
• Tab. 2: Unspezifisch nichtgenomische und genomische relative glucocorticoide Potenzen der topischen Glucocorticoide, normiert auf Dexamethason = 1,0.

Bilder

• Abb. 1: Modulares Konzept der zellulären Glucocorticoidwirkungen nach Buttgereit et al. 1998. Genomischer (I), spezifisch nichtgenomischer (II) und unspezifisch nichtgenomischer (III) Wirkmechanismus; HSP: heat-shock-protein; IP3: Inositoltriphosphat; PKC: Proteinkinase C; NF-κB: nuclear factor κB; IL: Interleukin; TNF: Tumornekrosefaktor; COX: Cyclooxygenase
• Abb. 2: Intrazellulärer Glucocorticoidrezeptor α. (Berki et al. 1998, deRijk et al. 2002)
• Abb. 3: Chemische Struktur von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason.
• Abb. 4: Schematische Darstellung der Dichtegradientenzentrifugation über einen Fiquoll-Paque-Gradienten zur Isolierung von PBMC.
• Abb. 5: Schematische Darstellung von Clark-Elektrode und Respirationskammer.  1 Hamilton-Spritze zur Zugabe der Testsubstanzen, 2 Clark-Elektrode, 3 Messgefäß, 4 Semipermeable Membran, 5 Respirationskammer mit Zellsuspension, 6 Magnetrührer.
• Abb. 6: Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs (ΔO2) pro Zeiteinheit (Δt). Dargestellt ist beispielhaft die Zugabe von Con A und Dexamethason (10-4 M).
• Abb. 7: Standardeichkurve und Verdünnungsschritte der Standards.
• Abb. 8: (A) Zweidimensionale Dot-plot-Darstellung des FSC/SSC von humanen PBMC nach 20 h Kultur. (B) Dot-plot-Darstellung der Fluoreszenz von FITC- und PI-markierten PBMC nach 20 h Kultur und (C) nach 20 h Inkubation mit Dexamethason 10-4 M.
• Abb. 9: Schematische Darstellung eines Histogramms mit Sub-G1-Peak.
• Abb. 10: Histogramm mit Sub-G1-Peak. Beispielhaft ist ein Experiment dargestellt, bei dem Apoptose von humanen PBMC durch Beclomethason 10-6 M induziert wurde.
• Abb. 11: Sauerstoffverbrauch von ruhenden und Con A-stimulierten PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 52 für ruhende PBMC und n = 45 für stimulierte PBMC. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert  (p < 0,05).
• Abb. 12: Einfluss von Dexamethason auf den Sauerstoffverbrauch von ruhenden humanen PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-9. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 13: Einfluss von Clobetasol (A) und Beclomethason (B) auf den Sauerstoffverbrauch von ruhenden humanen PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 7. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 14: Einfluss von Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch von ruhenden humanen PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-7. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 15: Einfluss von Dexamethason auf den Sauerstoffverbrauch Con A-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-8. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 16: Einfluss von Clobetasol (A) und Beclomethason (B) auf den Sauerstoffverbrauch Con A-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-7. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert  (p < 0,05).
• Abb. 17: Einfluss von Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch Con A-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-7. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 18: Stimulierbarkeit des Sauerstoffverbrauchs humaner PBMC mit Con A ohne Glucocorticoide bzw. in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von Dexamethason. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-9. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert  (p < 0,05).
• Abb. 19: Stimulierbarkeit des Sauerstoffverbrauchs humaner PBMC mit Con A ohne Glucocorticoide bzw. in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von Clobetasol(A) oder Beclomethason (B). Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 5-7. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 20: Stimulierbarkeit des Sauerstoffverbrauchs humaner PBMC mit Con A ohne bzw. in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von Myxothiazol. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-7. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 21: IL-6-Synthese ruhender PBMC verglichen mit der IL-6-Synthese nach Stimulation mit 10 µg/ml/106 Zellen PHA bzw. 5 µg/ml/106 Zellen Con A. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6 für ruhende PBMC und n = 4 für stimulierte PBMC. *signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p ≤ 0,02).
• Abb. 22: Einfluss von Dexamethason auf die IL-6-Synthese ruhender humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 4.
• Abb. 23: Einfluss von Clobetasol (A) und Beclomethason (B)auf die IL-6-Synthese ruhender humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3-4.
• Abb. 24: Einfluss von Myxothiazol auf die IL-6-Synthese ruhender humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3-4.
• Abb. 25: Einfluss von Dexamethason auf die IL-6-SynthesePHA-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3-4. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 26: Einfluss von Clobetasol (A) und Beclomethason (B) auf die IL-6-SynthesePHA-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 27: Einfluss von Myxothiazol auf die IL-6-SynthesePHA-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3.  * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 28: Einfluss von Dexamethason auf die IL-6-SyntheseCon A-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3-4. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 29: Einfluss von Clobetasol (A) und Beclomethason (B) auf die IL-6-SyntheseCon A-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 30: Einfluss von Myxothiazol auf die IL-6-SyntheseCon A-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3-4. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 31: Einfluss von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf Apoptose von Jurkat-Zellen in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Repräsentatives Experiment von n = 3.
• Abb. 32: Einfluss von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf anti-Fas/CD95-induzierte Apoptose von Jurkat-Zellen in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Repräsentatives Experiment von n = 3.
• Abb. 33: Einfluss von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf Apoptose von PBMC in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Repräsentatives Experiment von n = 3.
• Abb. 34: Vergleichbarkeit von Annexin V-Färbung und DNA-Färbung bei (A) Jurkat-Zellen und (B) PBMC. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3-4. Angegeben sind der Mittelwert und der SD. n.s. = nicht signifikant.
• Abb. 35: Konzentrationsabhängiger Einfluss von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf Apoptose von Jurkat-T-Zellen nach 16 h Inkubation. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3. Angegeben sind der Mittelwert und der SD.
• Abb. 36: Apoptose von humanen PBMC nach 20 h Inkubation. (A) und (B) in Abwesenheit von Glucocorticoiden, (C) nach 20 h Inkubation mit Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason. (A) Zweidimensionale Dot-plot-Darstellung des FSC/SSC. Das Gate wurde auf die Population vitaler Lymphozyten gesetzt. (B) und (C) Dot-plot-Darstellung der Fluoreszenz von FITC- und PI-markierten PBMC. Repräsentatives Experiment von n = 3.
• Abb. 37: Konzentrationsabhängiger Einfluss von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf die Apoptose von humanen PBMC nach 20 h Inkubation. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3. Angegeben sind der Mittelwert und der SD.
• Abb. 38: Apoptose von humanen PBMC nach 20 h Inkubation mit Myxothiazol. Dargestellt sind die Ergebnisse im Annexin V-FITC/PI–Fenster. Repräsentatives Experiment von n = 3.
• Abb. 39: Apoptose von humanen PBMC nach 20 h Inkubation mit Myxothiazol. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3. Dargestellt sind der Mittelwert und der SD.
• Abb. 40: Einfluss verschiedenerKonzentrationen von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch in Con A-stimulierten humanen PBMC. Angegeben sind der Mittelwert und der S.E.M.  * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 41: Einfluss verschiedener Konzentrationen von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf die IL-6-Synthese PHA-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind der Mittelwert und der S.E.M. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).
• Abb. 42: Einfluss verschiedenerKonzentrationen von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf die Apoptose humaner PBMC. Angegeben sind der Mittelwert und der S.E.M. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).