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2  Material und Methoden

2.1 Präparation humaner mononukleärer Zellen des peripheren Blutes mittels Dichtegradientenzentrifugation

Zur Präparation der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) wurden 2 bis 6 Stunden alte buffy coats gesunder Blutspender der Blutspende der Charité verwendet. Unter einem „buffy coat“ versteht man die Schicht aus Leukozyten und Thrombozyten, die sich nach Zentrifugation von Vollblut zwischen der Plasmaphase und den sedimentierten Erythrozyten bildet.

2.1.1 Isolierung und in vitro-Inkubation von PBMC zur Messung des Sauerstoffverbrauchs

Inkubationsmedium

Das Inkubationsmedium war ein Mischmedium aus Borsook-Medium und Eagle-Medium in einem Verhältnis von 1:1,54. Es enthielt keine Glucose. Das Eagle-Basalmedium wurde mit Hanks-Puffer im Verhältnis von 1:1 ohne Glutamin und NaHCO3 versetzt (Eagle et al. 1955). Dem Borsook-Medium (0,15 M Tris-/HCl-Pufferlösung, pH = 7,4) wurden 19 L-Aminosäuren mit einer Endkonzentration von je 0,2 mM zugesetzt (Borsook et al. 1971). Unmittelbar vor Verwendung wurde das Borsook-Eagle-Medium durch einen sterilen Einmalfilter mit einer Porengröße von 0,2 µm sterilfiltriert.

Präparation

Die PBMC wurden mittels Ficoll-Paque–Dichtegradientenzentrifugation isoliert (Bøyum 1964). Als Lymphozytentrennmedium wurde eine Ficoll-Paque-Lösung (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) verwendet. Sie weist eine höhere Dichte (1,077 g/l) als Lymphozyten und Monozyten und eine geringere Dichte als Erythrozyten, Granulozyten und tote Zellen auf.

Es wurden 15 ml Ficoll-Paque-Plus-Lösung (Raumtemperatur) in einem 50 ml Filterröhrchen unter den Filter abzentrifugiert. Danach wurden 15 ml 0,9%ige NaCl-Lösung zugegeben, mit buffy coat auf 50 ml aufgefüllt und bei 2000 U/min 20 min zentrifugiert (BECKMANN GS-5 Zentrifuge, München, Deutschland). Erythrozyten, Granulozyten und tote Zellen setzten sich [Seite 24↓]dabei als unterste Schicht ab. Wegen ihrer geringeren Dichte verbliebendie Lymphozyten in der Interphase zwischen Plasma- und Ficoll-Schicht, zusammen mit anderen langsam sedimentierenden Partikeln (Monozyten, Thrombozyten). Die gereinigte Lymphozytenschicht wurde abpipettiert und mit 0,9%iger NaCl-Lösung 8 min bei 1800 U/min gewaschen. Der Überstand mit restlichen Thrombozyten wurde verworfen. Das verbliebene Lymphozytenpellet wurde in 10 ml Borsook-Eagle-Medium resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung auf Eis kühl gestellt (Abb. 4).

Abb. 4: Schematische Darstellung der Dichtegradientenzentrifugation über einen Fiquoll-Paque-Gradienten zur Isolierung von PBMC.

Die Zellzahl wurde nach Färbung mit einer 0,04%igen Trypanblaulösung im Verhältnis 1:10 und Zugabe von 10 µl in einer Neubauer-Zählkammer nach Neubauer (Mittelwert der 4 Quadranten x 104 x Verdünnung x Ausgangsvolumen) berechnet und auf eine Zellkonzentration von 1,5–2,5 x 107 Zellen/ml Medium eingestellt. Eine Zellkonzentration von mindestens 1 x 107 Zellen/ml ist für Sauerstoffverbrauchsmessungen mittels Clark–Elektrode notwendig. Die Differentialzählungen ergaben einen Anteil von über 90 % Lymphozyten sowie weniger als 10 % Monozyten und Granulozyten. Die Bestimmung der Vitalität erfolgte nach dem Trypanblau-Ausschlusstest in der Neubauer-Zählkammer. Danach betrug die Zellvitalität am Anfang einer jeden Experimentreihe mehr als 95 %.


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2.1.2  Präparation, Zellkultur und in vitro-Inkubation von PBMC zur Messung der IL-6-Synthese und Apoptose

Zellkulturmedium

RPMI 1640 Medium (Biochrom KG, Deutschland) wird zur Zellkultur humaner Leukozyten eingesetzt. Es enthält 5,5 g/l NaCl, 5 mg/l Phenol (Indikator, rot), 2 g/l NaHCO3, 25 mM HEPES, 0,532 g/l N-Acetyl-L-Alanyl-L-Glutamin und 11,1 mM Glukose. Es wurde mit fetalem bovinen Serum (FCS, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland) in einem Verhältnis von 1:10 versetzt. FCS wurde vor Gebrauch 30 min bei 56 °C im Wasserbad hitzeinaktiviert. Die Hitzeinaktivierung diente der Komplement-, Fibrinogen- und Enzymzerstörung neben der Vermeidung allgemein störender Einflüsse des Serums (Viren, Mykoplasmen, Vitamine).

Präparation

35 ml der mit PBS (Phosphate Buffered Sodium Solution, Roth, Karlsruhe, Deutschland) in einem Verhältnis von 1:5 verdünnten buffy-coats wurden auf 15 ml Ficoll-Paque-Plus-Lösung vorsichtig aufgeschichtet. Nach 20 minütiger Zentrifugation bei 2000 U/min (Raumtemperatur) wurde die Leukozyteninterphase abgenommen und zweimal in PBS 10 min bei 1500 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in RPMI 1640 aufgenommen und 2 h im Brutschrank (37 °C; 5 % CO2) inkubiert. Diese Inkubationszeit diente der Monozyten-/Makrophagen-Adhärenz. Danach wurde die Zellsuspension vorsichtig abgenommen und auf eine Zellkonzentration von
1 x 106 Zellen/ml eingestellt.

Gewinnung des Zellüberstands zur Messung der IL-6-Synthese

Die Zellsuspension wurde auf 24-well Mikrotiterplatten zu je 1 ml aufgeteilt und 12 h im Brutschrank (37 °C; 5 % CO2) kultiviert. Der Umgehung des Monozyten-/Makrophagen-bedingten IL-6-peaks diente ein nochmaliger Mediumwechsel. Nach Zugabe der Stimulanzien und Hemmstoffe in den entsprechenden Endkonzentrationen folgte eine Inkubation über 24 h im Brutschrank (37 °C; 5 % CO2). Zur Gewinnung des Zellüberstands wurden 600-700 µl Zellsuspension pro well vorsichtig abgenommen und 8 min bei 2000 U/min zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde abpipettiert, aliquotiert und bis zur weiteren Verwendung auf Eis gelagert bzw. bei –20 °C eingefroren.


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2.1.3 Zellkultur von Jurkat-Zellen

Die Jurkat-Zellen (Klon E6-1) wurden von der ATCC (Katalog Nr. TIB-152) bezogen. Es handelt sich um eine humane akute Leukämie-T-Zelllinie, die in Suspension vorliegt. Die Kultur erfolgte in Zellkulturflaschen (Fa. Costar) mit einem Gesamtvolumen von 300 ml. Die Zellen wurden in RPMI 1640 unter Zusatz von 10 % FCS, 100 µg/ml Streptomycin und 100 U/ml Penicillin kultiviert. Der Medienwechsel und das Umsetzen der Zellen fand bei einer Dichte von etwa 5 x 105 Zellen/ml nach 2-3 Tagen statt. Die Zellen wurden bei 37 °C in einem CO2-begasten Inkubator kultiviert. Die Prüfung der Zellvitalität erfolgte nach dem Trypanblau-Ausschlusstest und durchflusszytometrisch am FACS nach Propidiumjodid-Färbung (siehe 2.4).

2.2 Amperometrische Quantifizierung des zellulären Sauerstoffverbrauchs

2.2.1 Prinzip

Der zelluläre Energiestoffwechsel wurde amperometrisch mittels einer Clark-Elektrode (Clark 1959) anhand des Sauerstoffverbrauchs quantifiziert.

Die Zellsuspension wurde dazu in ein luftdicht abgeschlossenes Messgefäß überführt. Mittels einer polarisierbaren Clark-Elektrode ließ sich die Sauerstoffkonzentration innerhalb der Messlösung kontinuierlich bestimmen. Dem Messverfahren liegt eine Redoxreaktion zugrunde. Ein Sauerstoffmolekül nimmt an der negativ polarisierten Elektrode (Kathode) vier Elektronen auf und wird mit zwei Wassermolekülen zu vier Hydroxylionen reduziert. Der durch den Elektronenfluss bedingte Strom ist das Messsignal. Da für jedes entladene Sauerstoffmolekül vier Elektronen fließen, kann aus dem Messstrom auf die Anzahl reduzierter Sauerstoffmoleküle geschlossen werden. Der resultierende Stromfluss ist also bei gegebener Spannung dem Sauerstoffverbrauch proportional. Der Elektrodenraum wird von der Messlösung durch eine Polypropylen-Membran getrennt, die eine hohe Sauerstoffdurchlässigkeit besitzt. Die Arbeitselektrode (Platin) berührt die Innenseite der Membran vollständig, sodass der durch die Membran diffundierende Sauerstoff vollständig an ihr reduziert werden kann. In der KCl-Elektrolytlösung befindet sich neben der Platin-Arbeitselektrode die Silber-Gegenelektrode und die Bezugselektrode. Auf der Membraninnenseite stellt sich eine Sauerstoffkonzentration ein, die [Seite 27↓]abhängig ist von der Sauerstoffkonzentration auf der Membranaußenseite und damit von der Sauerstoffkonzentration im Messgefäß. Damit die Platinelektrode jedem Sauerstoffmolekül bei seiner Reduktion vier Elektronen liefern kann, muss die Gegenelektrode diese Elektronen zur Verfügung stellen:

Somit kann der zelluläre Sauerstoffverbrauch pro Zeiteinheit bestimmt werden (Rapoport et al. 1977).

Die Membrandurchlässigkeit ist temperaturabhängig – mit steigender Temperatur nimmt die Sauerstoffdurchlässigkeit zu. Daher wurde die Temperatur über ein Thermostat bei 37 °C streng konstant gehalten.

Abb. 5: Schematische Darstellung von Clark-Elektrode und Respirationskammer.
1 Hamilton-Spritze zur Zugabe der Testsubstanzen, 2 Clark-Elektrode, 3 Messgefäß, 4 Semipermeable Membran, 5 Respirationskammer mit Zellsuspension, 6 Magnetrührer.


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Der Zelle stehen zwei getrennte Wege der Energiegewinnung zur Verfügung: Oxidative Phosphorylierung (mitochondriale Atmung) und Glykolyse. Sie unterscheiden sich in ihrer Effektivität. Durch Glykolyse werden 2 Mol ATP pro Mol Glukose gebildet, durch oxidative Phosphorylierung 38 Mol pro Mol Glukose. Bei ausreichender Sauerstoffversorgung ist die Glykolyse zugunsten der Atmung unterdrückt (Pasteur-Effekt). In in vitro-Experimenten lässt sich diese Voraussetzung durch geeignete Versuchsbedingungen erzielen (Schmid et al. 2000, Kuhnke et al. 2003).

Die indirekte Erfassung des Energiestoffwechsels durch den Sauerstoffverbrauch erfolgt unter der Annahme, dass im „steady state“ der Energiebedarf die Energiesynthese bestimmt (Brown 1992) und der intrazelluläre ATP-Pool konstant bleibt. Ist unter geeigneten Versuchsbedingungen die ATP-Bereitstellung durch Glykolyse zu vernachlässigen, entspricht die Änderung des Sauerstoffverbrauchs durch oxidative Phosphorylierung der resultierenden Änderung der Energiesynthese. Der Sauerstoffverbrauch ist wegen des extramitochondrialen Sauerstoffverbrauchs und des Protonenleaks nicht dem Energieverbrauch gleichzusetzen. Anhand des Sauerstoffverbrauchs lassen sich aber somit Einflüsse auf den Energieverbrauch quantifizieren.

2.2.2 Versuchsdurchführung

Für die Messung wurden 0,7 ml der PBMC-Suspension in die Respirationskammer überführt. Dies entsprach bei vorgegebener Zellkonzentration einer Zellzahl von 1,05-1,75 x 107 Zellen. Vor dem Aufsetzen der Elektrode wurde die Zellsuspension mittels Magnetrührer im Respirationsgefäß gleichmäßig und ausreichend mit Sauerstoff äquilibriert. Bei 37 °C und normalem Sauerstoffpartialdruck der Luft (Sauerstoffkonzentration 20,9 Vol%) lösten sich maximal 4,7 ml Sauerstoff pro Liter Medium, so dass nach ausreichender Äquilibrierung
147,7 nmol Sauerstoff in 0,7 ml der PBMC-Suspension gelöst waren. Mittels Magnetrührer wurde während der Messung ein gleichmäßiger Anstrom der Messlösung an die Membran gewährleistet, damit an der äußeren Membranseite eine konstante Sauerstoffkonzentration herrschen konnte. Die Registriergeschwindigkeit des Schreibers betrug 0,2 mm/Sekunde. Die Eichung des Gerätes (Messbereich D100%) erfolgte durch Mediumzugabe ohne Zellsuspension.

Der Anstieg des erfassten Graphen (Dx) gab den Sauerstoffverbrauch (ΔO2) pro Zeiteinheit (Δt) wieder (Abb. 6).


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Abb. 6: Bestimmung des Sauerstoffverbrauchs (ΔO2) pro Zeiteinheit (Δt). Dargestellt ist beispielhaft die Zugabe von Con A und Dexamethason (10-4 M).

Der Sauerstoffverbrauch der PBMC im Respirationsgefäß lässt sich nun normiert auf nmol/min/107Zellen wie folgt berechnen:

Zur Untersuchung des Einflusses der Glucocorticoide auf den zellulären Energiestoffwechsel wurden die Zellen mit 75 µg Con A/ml/107 Zellen für 3 min stimuliert und bei maximaler und konstanter Stimulation die Glucocorticoide in den entsprechenden Konzentrationen zugegeben. Die Verdrängung von Zellen aus der Respirationskammer während der Zugabe der Testsubstanzen wurde bei der Berechnung des tatsächlichen Sauerstoffverbrauchs berücksichtigt.

Hemmstoffe und Concanavalin A

Es wurden die Glucocorticoide Dexamethason (Fortecortin®, Merck, Darmstadt, Deutschland), Clobetasol (Dermoxinale®) und Beclomethason (Sanasthmyl®, beide GlaxoWellcome, Bad Oldesloe, Deutschland) sowie Myxothiazol (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) [Seite 30↓]untersucht. Dexamethason und Myxothiazol wurden in Aqua destillata, Clobetasol und Beclomethason in DMSO in einer Konzentration von 10-1 M gelöst. Alle Glucocorticoide wurden in Endkonzentrationen von 10-10 M bis 10-4 M verwendet.

Zur Stimulierung der PBMC wurde das Mitogen Concanavalin A (Con A; Serva, Heidelberg, Deutschland) eingesetzt. Es ist ein spezifisches, kohlenhydratbindendes Protein, dass aus der Schwertbohne Conavalia ensiformis isoliert wird und zur Gruppe der Lektine gehört (Janeway et al. 1997). Es kommt im Gegensatz zur antigenen Stimulation zu einer stark ausgeprägten unspezifischen, polyklonalen Stimulierung der Zellen. Betroffen sind vornehmlich T-Lymphozyten, so dass davon ausgegangen werden konnte, dass die überwiegende Anzahl der PBMC erfasst wurde. Con A wurde in einer Konzentration von 5 mg/ml Aqua destillata angesetzt und in einer Endkonzentration von 75 µg/ml eingesetzt, was bei einer standardisierten Zellkonzentration von 1,5-2,5 x 107 Zellen/ml Medium einer durchschnittlichen Konzentration von 3,75 µg Con A/106 Zellen entsprach.

2.3 Nichtkompetitiver ELISA zur Quantifizierung der IL-6-Synthese

2.3.1 Prinzip

Der enzymgekoppelte Immunadsorptionstest (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)stellt eine quantitativ analytische Methode zur Messung von Antigen oder Antikörpern dar. Es werden unmarkierte, polyklonale anti-Zytokin-Antikörper (anti-IL-6-AK, Primärantikörper) auf einem festen Träger (Kunststoff-Mikrotiterplatten) fixiert. Nach Zugabe des Antigens (Interleukin-6-haltige Zellsuspension) lässt sich das gebundene Interleukin (IL) durch einen zweiten Antikörper (Sekundärantikörper) nachweisen. Dieser ist ein enzymmarkierter monoklonaler anti-IL-6-AK, der gegen ein anderes Epitop gerichtet ist. Damit wird mit dem ELISA eine sehr hohe Spezifität erreicht. Die Menge des Antikörpers lässt sich direkt anhand der Antigenbindung bestimmen. Der Nachweis erfolgt über eine enzymatische Reaktion, die ein farbloses Substrat in ein farbiges Produkt umwandelt (Kemeny 1994, Liddell 1995).

In den vorliegenden Untersuchungen wurde ein nichtkompetitiver Test verwendet. Der Vorteil von nichtkompetitiven gegenüber kompetitivenAssays besteht darin, dass nur der unmarkierte Antikörper in einer limitierenden Konzentration vorhanden ist und so Fehler bei der Zugabe [Seite 31↓]anderer Reagenzien einen nur geringen Einfluss auf das Ergebnis haben. Die Wahrscheinlichkeit, durch unspezifische Bindungen oder Kreuzreaktionen beeinflusst zu werden, ist allerdings größer. Der von uns verwendete Test zeichnete sich daher durch eine hohe Spezifität für humanes IL-6 aus.

Festphasen-Tests sind gegenüber Flüssigphasentests sensitiver und einfacher auszuführen. Die Konzentration des Antikörpers an der Oberfläche einer Festphase ist sehr hoch. Dadurch können Antikörper weit unter den Affinitäten der beteiligten Reagenzien nachgewiesen werden. Die Hintergrundfärbung, d.h. der Anteil nichtspezifischer Bindungen kann dadurch aber erhöht sein (Kemeny et al. 1994).

IL-6–cDNA kodiert für ein aus 212 Aminosäuren bestehendes Polypeptid. Dieses Protein wird zu einem 184 Aminosäuren umfassenden Protein posttranslational prozessiert. Durch verschiedene Glykosylierungsstufen an Position 73 bzw. 172 und Phosphorylierungsstufen variiert das Molekulargewicht des IL-6-Moleküls zwischen 21,5 und 28 kDa. Die Fähigkeit, IL-6 zu synthetisieren, besitzen viele verschiedene Zellen des Immunsystems. Dazu zählen Monozyten/Makrophagen, Fibroblasten, Endothelzellen, Keratinozyten, Mastzellen,
T-Lymphozyten und verschiedene Tumorzelllinien (Diehl et al. 2002, Hirano et al. 1990).

2.3.2 Durchführung

Zur Quantifizierung der IL-6-Synthese humaner PBMC kam in den folgenden Experimenten ein kommerzieller ELISA-Kit (Milenia IL-6 Endpoint Enzyme Immunometric Assay, DPC, Deutschland) mit einer Sensitivität von ca. 4 pg/ml und einer hohen Spezifität für humanes IL-6 zum Einsatz. Alle Materialien wurden bei Raumtemperatur verwendet.

Jeweils 100 µl der Kontrollen und Proben wurden an Mikrotiterplatten, die mit monoklonalem (Maus-) anti-IL-6-AK beschichtet waren, in 150 µl Serum-/Puffer-Gemisch (pH = 7,4) über 2 h adsorbiert. PHA- und Con A-stimulierte Proben wurden vor Zugabe mit Standard-/Proben-Verdünnungspuffer (IL-6-freies Serum) in einem Verhältnis von 1:10 bzw. 1:70 verdünnt. Nach Waschen mit 1:4 verdünnter Pufferlösung (5fach gepufferte Lösung mit Detergenz und Stabilisator) erfolgte die Inkubation der Proben und Kontrollen mit 200 µl Meerrettichperoxidase-konjugiertem, affinitätsgereinigtem, polyklonalem (Kaninchen-) anti-IL-6-AK für 2 h. Nicht zur Reaktion gekommenes Material wurde durch einen wiederholten [Seite 32↓]Waschschritt entfernt. Danach folgte die Zugabe der Substratlösung (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, Wasserstoffperoxid). Die Substratumsetzung wurde mit einem säurehaltigen Stoppreagenz (2 N Salzsäure) nach 30 min beendet und die Extinktion bei 450 nm mit einem automatischen Plattenlesegerät gemessen. Die Farbintensität war direkt proportional zur IL-6-Konzentration des Zellüberstandes. Es wurde zu jedem Ansatz eine Standardeichkurve mitgeführt (Abb. 7). Die Verdünnung des Standards erfolgte in sechs linearen Verdünnungsschritten, so dass die Extinktionen bei linearem Verhältnis zwischen Farbdichte und Probenkonzentration und halblogarithmischer Darstellung eine sigmoide Standardkurve ergaben. Der Extinktion der höchsten Verdünnungsstufe (2,0 OD) entsprach eine Zytokin-Konzentration von 1000 pg/ml. Die Standardkurve erstreckte sich damit über 5 log-Einheiten der Verdünnung (Westgard 1981).

Abb. 7: Standardeichkurve und Verdünnungsschritte der Standards.

Phytohämagglutinin

Das polyklonale Mitogen Phytohämagglutinin (PHA) ist ein Glykoprotein, dass aus der Gartenbohne Phaseolus vulgaris gewonnen wird. Ähnlich wie Con A stimuliert PHA unspezifisch vor allem humane T-Lymphozyten. Zur Verwendung in unseren Experimenten wurde PHA (Biochrom, Berlin, FRG) in Aqua destillata gelöst und in einer Endkonzentration von 10 µg/ml/106 Zellen eingesetzt.


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2.4  Durchflusszytometrie (FACS) zur Quantifizierung von Apoptose

2.4.1 Prinzip der Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie stellt eine Methode zur Analyse von Zellsuspensionen auf Einzelzellniveau (single cell analysis) dar. Es werden chemische und physikalische Eigenschaften wie Zellgröße und -granularität sowie antigene Zellstrukturen, an die fluoreszenzmarkierte Antikörper gebunden werden, simultan analysiert. Die Zellsuspension wird über eine Kapillare mittels Überdruck in die Messküvette gepresst. Durch die starke Beschleunigung werden Zellaggregate aufgetrennt und in das Zentrum der Messkammer fokussiert. Dieser Vorgang wird als hydrodynamische Fokussierung bezeichnet. Den Analysepunkt stellt ein 488 nm-Argonlaser dar. Das monochromatische Licht des Lasers ändert bei Auftreffen auf die Zelle seine Richtung und ist in Vorwärtsstreulicht, forward scatter (FSC) und Seitwärtsstreulicht, side scatter (SSC), zu unterscheiden. Der FSC bildet die Zellgröße ab und wird entlang der Laserachse mittels Photodiode detektiert, während der SSC ein Maß für die Granularität (Membranstruktur und Beschaffenheit intrazellulärer Bestandteile) darstellt und im 90° Winkel zum Laserstrahl abgelenkt wird. Die Fluoreszenzfarbstoffe absorbieren Licht in einem weiten Wellenlängenbereich. Die Emissionsspektren liegen dabei in einem langwelligeren Bereich als die Absorptionsspektren (sog. Stokes-Shift).

In der vorliegenden Arbeit wurden die Fluoreszenzfarbstoffe Fluorescein Isothiocyanat (FITC) und Propidiumjodid (PI) eingesetzt. Es wurde ein Durchflusszytometer der Firma Coulter; Miami, USA mit einem 488 nm-Argonlaser, einem 635 nm-Diodenlaser und vier Fluoreszenzkanälen (FL1–FL4) verwendet. In den vorliegenden Untersuchungen wurde die Durchflusszytometrie zur Messung der glucocorticoid-induzierten Apoptose eingesetzt.

2.4.2 Nachweis apoptotischer Zellen mittels Annexin V-FITC

Prinzip

Für die Messung der Apoptose wurde ein kommerzieller Annexin V-FITC Kit (Immunotech; Marseille, Frankreich) verwendet. Die Methode kombiniert die Eigenschaft von Annexin V, an Phosphatidylserin (PS) der Zellmembran zu binden mit der Gegenfärbung durch Propidiumjodid [Seite 34↓](PI), dass zwischen Basenpaare doppelsträngiger Nukleinsäuren interkaliert. Nur bei Zellen, deren Zellmembran alteriert ist, werden intrazelluläre Proteine und DNA für PI zugängig.

In der frühen Phase der Apoptose ist die Integrität der Zellmembran noch erhalten. Die Zellen verlieren aber bereits die asymmetrische Anordnung ihrer membranständigen Phospholipide und PS wird von der Innen- auf die Außenseite der Zytoplasmamembran verschoben. Dort verbleibt es für den Rest der Apoptosekaskade. Annexin V ist ein Phospholipid-bindendes Protein der Annexin–Familie. In Gegenwart von Ca2+ bindet es mit hoher selektiver Affinität an PS bevor es zu morphologischen Veränderungen und zur Hydrolysierung von DNA kommt. Durch die frühe Detektion und das ubiquitäre Vorkommen von PS war diese Methode für die Fragestellung in dieser Arbeit geeignet. In vitro kommt es in einer späten Phase der Apoptose zu einem Verlust der Integrität der Plasmamembran und zu einer sekundären Nekrose der Zelle. Um die apoptotischen von den sekundär-nekrotischen Zellen zu differenzieren, wird mit PI im gleichen Messansatz gegengefärbt. Wird im FSC/SSC auf die vitale Lymphozytenpopulation gegatet, können damit im FITC/PI-Dot plot drei Zellpopulationen unterschieden werden: 1) vitale Population 2) apoptotische Population und 3) sekundär-nekrotische Population (Tab. 1, Abb. 8).

Tab. 1: Zellpopulationen in der Durchflusszytometrie nach Doppelfärbung mit FITC-konjugiertem Annexin V und PI.

 

Annexin V - Färbung

Propidium Iodid - Färbung

Intakte Zellen

-

-

Apoptotische Zellen

+

-

Sekundär-nekrotische Zellen

+

+


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Abb. 8: (A) Zweidimensionale Dot-plot-Darstellung des FSC/SSC von humanen PBMC nach 20 h Kultur. (B) Dot-plot-Darstellung der Fluoreszenz von FITC- und PI-markierten PBMC nach 20 h Kultur und (C) nach 20 h Inkubation mit Dexamethason 10-4 M.

Durchführung

Die wie unter 2.1.2. beschrieben präparierten Zellen wurden auf 24-well Mikrotiterplatten zu je 0,7 ml aufgeteilt. Die Reagenzien wurden in entsprechenden Konzentrationen zugegeben und in getrennten Messansätzen für 16 h, 20 h, 36 h, 48 h oder 56 h im Brutschrank (37 °C; 5 % CO2) inkubiert. Die Zellsuspension wurde dann in zwei Waschschritten mit PBS jeweils für 5 min bei 1000 U/min und 4 °C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 450 µl eisgekühlter Pufferlösung resuspendiert. Zur Färbung wurden 5 µl Annexin V – FITC – Lösung und 5 µl PI-Lösung zugegeben und die Zellen für 10 min auf Eis im Dunkeln inkubiert.

2.4.3 Nachweis apoptotischer Zellen mittels DNA-Färbung

Prinzip

Intakte Zellen enthalten high-molecular-weight DNA (HMW-DNA) im Zellkern und keine DNA im Zytoplasma. DNA in apoptotischen Zellen unterliegt einer Fragmentation durch Endonukleasen in low-molecular-weight Nukleosomen(LMW-DNA). Diese beginnen in das Zytoplasma zu migrieren, so dass der zelluläre Gehalt an nukleärer HMW-DNA abnimmt, während der Gehalt an LMW-DNA im Nukleus und im Zytoplasma zunimmt. Die Fragmentation der DNA erfolgt dabei in charakteristischen Abständen von n (146 ± 50) bp. Durchflusszytometrisch kann der DNA-Gehalt nach Färbung mit PI gemessen werden. Ein [Seite 36↓]typisches Histogramm ist in Abb. 9 und in Abb. 10 dargestellt. Apoptotische Zellen erscheinen dabei als Sub-G1-Peak auf der DNA-Achse (Darzynkiewicz et al. 1992).

Abb. 9: Schematische Darstellung eines Histogramms mit Sub-G1-Peak.

Abb. 10: Histogramm mit Sub-G1-Peak. Beispielhaft ist ein Experiment dargestellt, bei dem Apoptose von humanen PBMC durch Beclomethason 10-6 M induziert wurde.

Ein wichtiges Kriterium für die Genauigkeit einer durchflusszytometrischen Ein-Parameter-Analyse ist der Variationskoeffizient (VK), der anhand der Breite des G0/G1-Peaks bestimmt wird. Die Größe des VK-Wertes gibt eine standardisierte Auskunft über die Breite einer Werteverteilung, bezogen auf deren Mittelwert und wird nach folgender Formel berechnet:


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Je kleiner der gemessene VK-Wert ist, um so besser ist die Auflösung und Reproduzierbarkeit der Messung. Durchflusszytometrische Messungen mit einem VK-Wert über 5,0 % wurden von der Auswertung ausgeschlossen.

Durchführung

Es wurde ein DNA-Kit verwendet, der uns freundlicherweise vom Institut für Immunologie und Genetik Kaiserslautern zur Verfügung gestellt wurde. Er setzte sich aus einem Triton-Puffer und einem FITC/PI-Puffer zusammen.

Die wie unter 2.1.2. beschrieben präparierten Zellen wurden analog zur Annexin V-Färbung auf 24-well Mikrotiterplatten zu je 0,7 ml aufgeteilt. Die Reagenzien wurden in entsprechenden Konzentrationen zugegeben und in getrennten Messansätzen für 16 h, 20 h, 36 h, 48 h oder 56 h im Brutschrank (37 °C; 5 % CO2) inkubiert. Die Zellsuspension wurde dann zwei mal mit PBS jeweils für 5 min bei 1000 U/min und 4 °C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde mit 450 µl eisgekühlter Pufferlösung resuspendiert. Es folgte die Zugabe von 200 µl Triton-Puffer für
15 min, um die Zellen zu permeabilisieren. Danach erfolgte die Färbung mit 500 µl FITC-/PI-Puffer für 15 min.

2.4.4 CD95-exprimierende humane Jurkat-Zelllinie

Die Elimination von Zellen durch Zelloberflächenrezeptor-induzierte Aktivierung von Caspasen ist ein wichtiger immunologischer Vorgang. Ein Beispiel ist die Auslösung von Apoptose in stimulierten Lymphozyten durch die Aktivierung der Caspase 8 mittels CD95/CD95-Ligand (Yonehara et al. 1999).

Zur Induktion von Apoptose in vitro wurde ein monoklonaler (Maus-) anti-CD95-AK (CH-11-Klon) verwendet. Das CD95-Antigen (APO-1/Fas) ist ein transmembranes 40-50 kDa Glykoprotein. Es gehört zur Nerve Growth Factor Receptor/Tumor Necrosis Factor (NGFR/TNF) Superfamilie und enthält extrazelluläre cystein-reiche Domänen. Wichtig für die Induktion von Apoptose ist die intrazelluläre Domäne, die sogenannte Todesdomäne (Itoh et al. 1993). CD95 wird von aktivierten CD4+ und CD8+ T-Zellen, B-Zellen, Granulozyten,[Seite 38↓] Monozyten, NK-Zellen, Thymozyten und myeloiden Zelllinien exprimiert (Miyawaki et al. 1992, Yoshino et al. 1994, Yonehara et al. 1994). Unter physiologischen Bedingungen wird CD95 durch die Bindung eines spezifischen Liganden, CD95Ligand (APO-1L/FasL) aktiviert. Der agonistisch stimulierende CH-11-Antikörper induziert in vitro in diversen Fas-exprimierenden Zelllinien Apoptose (Miyawaki et al. 1992, Yoshino et al. 1994, Yonehara et al. 1994).

Wenn nicht anders angegeben, wurde die Zellsuspension 16 h mit CH-11-anti Fas-AK in einer Konzentration von 1 µg/ml bei 37 °C inkubiert.

2.5 Statistische Auswertungen

Die statistischen Tests wurden mit dem Statistik-Programm SPSS Version 11.0 für Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) durchgeführt.

2.5.1 Deskriptive Statistik

Arithmetischer Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD bzw. S.E.M.) stellen wichtige Kennwerte einer Stichprobe dar. Der Mittelwert bestimmt die durchschnittliche Größe der Stichprobenwerte und ist als deren arithmetisches Mittel definiert. Das arithmetische Mittel ist die Summe aller Beobachtungen, geteilt durch die Anzahl dieser Beobachtungen. Die Standardabweichung steht für die Streuung der Stichprobenwerte um das arithmetische Mittel. Sie ist die positive Wurzel aus der mittleren quadratischen Abweichung. Der Standardfehler des Mittelwertes beschreibt die Streuung der Mittelwerte der Stichproben mit jeweils n Beobachtungen und ist die Standardabweichung geteilt durch die Wurzel aller Beobachtungen.

2.5.2 Parametrische und nichtparametrische Tests

Zum Vergleich zweier abhängiger (verbundener) Stichproben wurde bei nicht normaler Verteilung der nichtparametrische Wilcoxon-Vorzeichen-Rang-Test, bei Normalverteilung der Stichproben der Student´s t-Test für verbundene Stichproben verwendet. Der Vergleich zweier [Seite 39↓]nicht verbundener (unabhängiger) Stichproben erfolgte bei nicht normalverteilter Stichprobe durch den nichtparametrischen Mann-Whitney-U-Test, bei nachgewiesener Normalverteilung durch den Student´s t-Test für unverbundene Stichproben. Das Vorliegen einer Normalverteilung errechnete sich für einen Stichprobenumfang kleiner 50 mit dem Shapiro-Wilk-Test (es lagen ausschließlich Stichprobenumfänge kleiner 50 vor). Eine statistische Wahrscheinlichkeit von
p ≤ 0,05 wurde als signifikant angesehen (Sachs 1992, Trampisch et al. 1997).


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26.04.2005