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3  Ergebnisse

3.1 Untersuchungen zum zellulären Energiestoffwechsel mittels Clark-Elektrode

3.1.1 Sauerstoffverbrauch von ruhenden und stimulierten PBMC

Abbildung 11 zeigt den basalen Sauerstoffverbrauch von ruhenden mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) im Vergleich zum Sauerstoffverbrauch nach mitogener Stimulation der PBMC. Der Sauerstoffverbrauch ruhender PBMC betrug 5,84 ± 0,22 nmol/min/107 Zellen
(n = 52). Dieser und alle folgenden Werte sind als Mittelwert ± S.E.M. (Zahl der Experimente) angegeben.

Als Modell zur Untersuchung der Reaktionsfähigkeit der PBMC auf einen definierten Stimulationsreiz diente uns die mitogene Stimulation mit dem Lektin Concanavalin A (Con A). Das Ausmaß der Stimulation ist durch die Clark-Elektrode exakt quantifizierbar. Es wurde stets die gleiche Menge Con A verwendet und nach einem konstanten Stimulationsintervall von 3 min der Sauerstoffverbrauch gemessen. Die Stimulation mit dem Mitogen Con A führte zu einem sofortigen (innerhalb von Sekunden), konstanten und statistisch signifikanten Anstieg des Sauerstoffverbrauchs um 55,4 % auf 8,89 ± 0,45 nmol/min/107 Zellen (n = 40, p < 0,05).

Abb. 11: Sauerstoffverbrauch von ruhenden und Con A-stimulierten PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 52 für ruhende PBMC und n = 45 für stimulierte PBMC. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert
(p < 0,05).


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3.1.2  Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch von ruhenden PBMC

Um den Einfluss der Glucocorticoide auf die untersuchten Parameter in ruhenden Zellen zu ermitteln, wurden aus buffy coats präparierte Zellsuspensionen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason behandelt. Die Zellen wurden dann wie unter 2.2.2 beschrieben zur Messung des Sauerstoffverbrauchs verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Abbildungen 12 und 13 dargestellt. Zum Vergleich gibt Abbildung 14 die Effekte unterschiedlicher Konzentrationen von Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch ruhender PBMC wieder. Da Clobetasol, Beclomethason und Myxothiazol in DMSO gelöst waren, wurden gleiche Mengen DMSO auf dessen Effekt auf den Sauerstoffverbrauch untersucht und als Kontrolle mitgeführt. Alle Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.E.M. (n = Zahl der Experimente) angegeben.

Abb. 12: Einfluss von Dexamethason auf den Sauerstoffverbrauch von ruhenden humanen PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-9. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).


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Abb. 13: Einfluss von Clobetasol (A) und Beclomethason (B) auf den Sauerstoffverbrauch von ruhenden humanen PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 7. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).

Die in den Abbildungen 12-13 dargestellten Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:

Die Zugabe von Dexamethason führte in allen Konzentration zu einer signifikanten Hemmung des Sauerstoffverbrauchs ruhender Lymphozyten. Dexamethason in einer Konzentration von
10-4 M hemmte den Sauerstoffverbrauch von 5,84 ± 0,22 nmol/min/107 Zellen auf 4,95 ± 0,11 nmol/min/107 Zellen (p < 0,05), was einer prozentualen Verminderung um 15,0 % ± 1,9 % entsprach. Auch in den Konzentrationen von 10-5 M, 10-6 M, 10-8 M und 10-10 M hemmte Dexamethason den Sauerstoffverbrauch ruhender PBMC signifikant (p < 0,05), und zwar um 14,4 % ± 1,7 %, 5,7 % ± 1,4 %, 5,7 % ± 1,6 % bzw. 5,4 % ± 0,7 %.

Die Hemmwirkungen der untersuchten topischen Glucocorticoide waren im Gegensatz dazu nahezu konzentrationsunabhängig. So führte Clobetasol in der sehr niedrigen Konzentration von 10-10 M zu einer Hemmung des Sauerstoffverbrauchs um 9,5 % ± 1,7 % auf 5,24 ± 0,1 nmol/min/107 Zellen (p < 0,05). Das Ausmaß der Atmungshemmung war dann bis 10-4 M annähernd unverändert (11,2 %). Einen ähnlichen Verlauf der Hemmeffekte wies Beclomethason auf, erreichte aber insgesamt ein etwas stärkeres Hemmniveau. Die [Seite 43↓]Konzentration von 10-10 M führte hier schon zu einer Hemmung des Sauerstoffverbrauchs um 13,6 % ± 3,6 % auf 4,93 ± 0,23 nmol/min/107 Zellen (p < 0,05). 10-4 M hemmte um 17,4 % ± 2,4 % auf 4,77 ± 0,11 nmol/min/107 Zellen (p < 0,05).

DMSO zeigte in der verwendeten Menge von 1 µl keine signifikante Wirkung auf den Sauerstoffverbrauch. Nach Zugabe betrug dieser 5,67 ± 0,25 nmol/min/107 Zellen im Vergleich zur Basalatmung von 5,84 ± 0,22 nmol/min/107 Zellen.

Myxothiazol

Zur besseren Interpretation der für die verschiedenen Glucocorticoide gewonnenen Ergebnisse wurde vergleichend der Atmungskettenhemmstoff Myxothiazol untersucht (siehe 1.4). Beispielhaft wurden zwei Konzentrationen gewählt, die zu einer Hemmung des Sauerstoffverbrauchs von ruhenden PBMC um 25 % bzw. 50 % führten. Nach Titrierung ergaben sich Konzentrationen von 14 µM und 40 µM.

Die Zugabe von 14 µM Myxothiazol führte zu einer Hemmung des Sauerstoffverbrauchs von 5,84 ± 0,22 nmol/min/107 Zellen auf 4,20 ± 0,19 nmol/min/107 Zellen und die Zugabe von
40 µM zu einer Hemmung auf 3,01 ± 0,43 nmol/min/107 Zellen. Dies entsprach einer prozentualen Hemmung um 27,3 % ± 3,4 % bzw. 47,9 % ± 7,4 % (Abb. 14).

Abb. 14: Einfluss von Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch von ruhenden humanen PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-7. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).


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3.1.3 Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch von stimulierten PBMC

Zur Erfassung der glucocorticoid-induzierten Veränderungen des Energiestoffwechsels nach Aktivierung der PBMC wurden diese mit dem mitogenen Lektin Concanavalin A vorinkubiert. Con A wurde in einer Endkonzentration von 75 µg/ml eingesetzt. Bezogen auf die standardisierte Zellkonzentration von im Mittel 2,0 x 107 Zellen/ml Medium entsprach dies einer durchschnittlichen Zugabe von 3,75 µg Con A/106 Zellen. Diese Konzentration erwies sich nach Vorversuchen als optimal für die Stimulierung der humanen PBMC. Die Zugabe des zu untersuchenden Glucocorticoids erfolgte immer nach einer konstanten Inkubationszeit mit Con A von 3 min. Auch für stimulierte Zellen wurde eine Kontrolle von 1 µl DMSO mitgeführt. Die Abbildungen 15 und 16 zeigen die Effekte der drei Glucocorticoide Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf den Sauerstoffverbrauch der Con A-stimulierten Lymphozyten. Der Ausgangswert entspricht dem Sauerstoffverbrauch stimulierter Zellen.

Abb. 15: Einfluss von Dexamethason auf den Sauerstoffverbrauch Con A-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-8. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).


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Abb. 16: Einfluss von Clobetasol (A) und Beclomethason (B) auf den Sauerstoffverbrauch Con A-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-7. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert
(p < 0,05).

Zusammenfassend lassen sich aus den Abbildungen 15–16 folgende Aussagen ableiten:

Die mitogene Stimulation der PBMC mit Con A führte zu einem Anstieg des Sauerstoffverbrauchs auf 8,89 ± 0,45 nmol/min/107 Zellen. Dies entsprach einer prozentualen Steigerung gegenüber ruhenden Zellen von 55,4 % ± 4,6 %.

Nach Zugabe von Dexamethason kam es in allen Konzentrationen zu einer statistisch signifikanten, konzentrationsabhängigen Hemmung des Sauerstoffverbrauchs. 10-4 M zeigte eine absolute Hemmung auf 5,95 ± 0,21 nmol/min/107 Zellen (p < 0,05), was einer prozentualen Differenz von 32,1 % ± 2,4 % entsprach. 10-5 M führte zu einer Hemmung um 19,2 % ± 2,6 %
(p < 0,05). Ähnlich wie für ruhende Zellen unterschieden sich die Konzentrationen 10-6 M, 10-8 M und 10-10 M nicht voneinander. Sie zeigten eine Hemmung um 12,9 % ± 3,5 % bzw.
12,5 % ± 2,8 % bzw. 11,5 % ± 1,8 % (p < 0,05).

Diese Konzentrationsabhängigkeit zeigte - wie schon für ruhende PBMC festgestellt – weder Clobetasol noch Beclomethason. Die Zugabe von Clobetasol führte bereits bei einer Konzentration von 10-10 M zu einem Abfall des Sauerstoffverbrauchs um 16,5 % ± 2,5 %
(p < 0,05). Dieses Hemmniveau blieb bis 10-4 M annähernd unverändert (20,8 % ± 3,2 %).


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Nahezu identisch dazu verhielt sich Beclomethason. Auch hier kam es nach Zugabe von 10-10 M zu einer maximalen Hemmung um 12,6 % ± 3,1 % (p < 0,05). Diese Hemmung blieb bis 10-4 M annähernd konstant (17,3 % ± 2,7 %).

Nach Zugabe von 1 µl DMSO betrug der Sauerstoffverbrauch stimulierter Zellen
8,84 ± 0,22 nmol/min/107 Zellen. Damit ist auch der Effekt von DMSO auf den Sauerstoffverbrauch stimulierter PBMC nicht signifikant.

Myxothiazol

Abbildung 17 veranschaulicht den konzentrationsabhängigen Einfluss von Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch Con A-stimulierter PBMC. Die Zugabe von 14 µM führte zu einer signifikanten Hemmung des Sauerstoffverbrauchs in Con A-stimulierten PBMC auf
5,85 ± 0,45 nmol/min/107 Zellen (p < 0,05), entsprechend 33,2 % ± 5,1 %. Myxothiazol in einer Konzentration von 40 µM hemmte statistisch signifikant um 54,2 % auf
4,01 ± 0,33 nmol/min/107 Zellen (p < 0,05).

Abb. 17: Einfluss von Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch Con A-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-7. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).


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3.1.4 Effekte der Con A-Stimulation auf den Sauerstoffverbrauch von humanen PBMC nach Vorinkubation mit Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol

In den unter 3.1.2. und 3.1.3. dargestellten Untersuchungen wurde der Einfluss der Glucocorticoide auf ruhende bzw. stimulierte PBMC analysiert. In weiteren Experimenten sollte der Glucocorticoideffekt auf die Stimulierbarkeit der Zellen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden aus buffy coats präparierte Zellsuspensionen zunächst mit unterschiedlichen Konzentrationen von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason für 4 min vorinkubiert. Die Zellen wurden dann mit 3,75 µg Con A/106 Zellen stimuliert, es erfolgte die Messung des Sauerstoffverbrauchs. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Abbildungen 18 und 19 dargestellt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± S.E.M. (n = Zahl der Experimente) angegeben. Zum Vergleich ist jeweils der Con A–stimulierte Sauerstoffverbrauch von unbehandelten PBMC (vgl. 3.1.3.) angegeben.

Abb. 18: Stimulierbarkeit des Sauerstoffverbrauchs humaner PBMC mit Con A ohne Glucocorticoide bzw. in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von Dexamethason. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-9. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert
(p < 0,05).


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Abb. 19: Stimulierbarkeit des Sauerstoffverbrauchs humaner PBMC mit Con A ohne Glucocorticoide bzw. in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von Clobetasol(A) oder Beclomethason (B). Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 5-7. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).

Wie aus Abbildung 18 zu entnehmen ist, war die Stimulierbarkeit der Zellen nur bei der höchsten Konzentration von Dexamethason (10-4 M) signifikant reduziert und lag bei
6,79 ± 0,34 nmol/min/107 Zellen (p < 0,05). Verglichen mit der Kontrolle entsprach dies einer Reduktion um 22,5 % ± 3,8 % (p < 0,05). Durch Konzentrationen von 10-5 M bis 10-8 M wurde die Stimulierbarkeit nicht signifikant beeinflusst. Die PBMC waren nach Zugabe von Dexamethason in einer Konzentration von 10-10 M signifikant stimulierbar. Die Zugabe von Con A führte hier zu einer Steigerung des Sauerstoffverbrauchs auf 10,57 ± 0,83 nmol/min/107 Zellen, was einer prozentualen Zunahme von 19,7 % ± 9,4 % entsprach (p < 0,05).

Im Gegensatz dazu rief Clobetasol in allen Konzentrationen keine Änderung der Stimulierbarkeit hervor (Abb. 19 A). Es kam bei allen Konzentrationen zu einem leichten, aber statistisch nicht signifikanten Anstieg der Stimulierbarkeit. Sie stieg nach Zugabe von 10-4 M um 4,5 % auf
9,16 ± 0,57 nmol/min/107 Zellen (p > 0,05).


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Beclomethason führte in allen Konzentrationen (10-10 M bis 10-4 M) zu einer signifikanten Verminderung der Stimulierbarkeit (Abb. 19 B). Dieser Effekt war konzentrationsunabhängig und entsprach im Mittel einer Reduktion um 18 %.

Myxothiazol

Abbildung 20 stellt den Einfluss von Myxothiazol auf die Stimulierbarkeit humaner PBMC dar. Die Zugabe von Myxothiazol führte zu einer statistisch signifikanten Verminderung der Stimulierbarkeit. In Anwesenheit von 14 µM Myxothiazol waren die Zellen nur noch auf
5,88 ± 1,09 nmol/min/107 Zellen (p < 0,05) stimulierbar, was bezogen auf die Ausgangsstimulation von 8,89 ± 0,45 nmol/min/107 Zellen einer prozentualen Hemmung um 32,9 % entsprach. Nach Zugabe von 40 µM Myxothiazol waren die Zellen nur noch auf
3,56 ± 1,25 nmol/min/107 Zellen (p < 0,05) stimulierbar. Dies entsprach einer prozentualen Hemmung um 59,4 %.

Abb. 20: Stimulierbarkeit des Sauerstoffverbrauchs humaner PBMC mit Con A ohne bzw. in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen von Myxothiazol. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6-7. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).


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3.1.5  Zusammenfassung

Dexamethason

Dexamethason hemmt sowohl in ruhenden als auch in Con A–stimulierten PBMC den Sauerstoffverbrauch konzentrationsabhängig.

  1. In ruhenden Zellen werden prozentuale Hemmeffekte von 6 % (10-8 M und 10-6 M) bis 15 % (10-5 M und 10-4 M) erreicht.
  2. In stimulierten Zellen sind die Hemmeffekte stärker ausgeprägt. Hier rufen Konzentrationen von 10-8 M bzw. 10-6 M Hemmungen um etwa 13 % hervor, während es durch 10-4 M zu einer etwa 32%igen Hemmung kommt.
  3. Die Stimulierbarkeit wird durch Dexamethason nur in einer Konzentration von 10-4 M signifikant reduziert.

Clobetasol

Die Effekte von Clobetasol auf den Sauerstoffverbrauch in PBMC weichen von den für Dexamethason beschriebenen Effekten deutlich ab. Clobetasol hemmt in ruhenden wie in Con A–stimulierten Zellen den Sauerstoffverbrauch deutlich, aber konzentrationsunabhängig.

  1. In ruhenden Zellen wird der Sauerstoffverbrauch von 10-10 M bis 10-4 M statistisch signifikant um 9,5 % (10-10 M) bis 11 % (10-4 M) gehemmt. Damit erreicht Clobetasol in ruhenden Zellen nicht die Hemmstärke von Dexamethason (15 % bei 10-4 M).
  2. In stimulierten Zellen ist die Hemmung auch konzentrationsunabhängig und stärker ausgeprägt. Hier werden Hemmeffekte von etwa 17 % (10-10 M bis 10-5 M) bis 20 % (10-4 M) erreicht.
  3. Die Stimulierbarkeit der Zellen wird durch keine der Konzentrationen von Clobetasol reduziert. Im Gegensatz dazu kommt es zu einem geringgradigen, aber nicht signifikanten Anstieg der Stimulierbarkeit.

Beclomethason

Beclomethason führt sowohl in ruhenden als auch in stimulierten PBMC zu einem konzentrationsunabhängigen Hemmeffekt auf die Zellatmung. Damit unterscheidet es sich in gleicher Weise wie Clobetasol von Dexamethason.


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  1. In ruhenden Zellen rufen alle Konzentrationen (10-4 M bis 10-10 M) einen signifikanten Hemmeffekt von etwa 14 % hervor.
  2. In stimulierten Zellen führt Beclomethason zu einer konzentrationsunabhängigen Atmungshemmung, die bei Konzentrationen zwischen 10-4 M bis 10-10 M etwa 15 % beträgt.
  3. Beclomethason reduziert in allen Konzentrationen die Stimulierbarkeit konstant um etwa
    18 %. Es wird aber nicht das Niveau des basalen Sauerstoffverbrauchs erreicht.

Myxothiazol

Die gemessenen Effekte von Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch in PBMC zeigen in ruhenden wie in Con A-stimulierten Zellen eine deutliche Konzentrationsabhängigkeit.

  1. In ruhenden Zellen wird die Atmung um etwa 27 % (14 µM) bis 33 % (40 µM) gehemmt.
  2. Bei beiden Konzentrationen sind die Hemmeffekte in stimulierten Zellen stärker ausgeprägt. Sie erreichen prozentuale Hemmungen von 48 % (14 µM) bis 54 % (40 µM).
  3. Die Stimulierbarkeit wird durch beide Konzentrationen deutlich und statistisch signifikant herabgesetzt. Die Reduktion liegt bei 33 % (14 µM) bzw. 59 % (40 µM).

Ein zusammenfassender Vergleich der drei Glucocorticoide führt demnach zu folgenden Aussagen:

  1. In ruhenden und stimulierten PBMC hemmt Dexamethason den Sauerstoffverbrauch konzentrationsabhängig. Im Gegensatz dazu hemmen die beiden topischen Glucocorticoide Clobetasol und Beclomethason in ruhenden und in stimulierten Zellen konzentrationsunabhängig.
  2. In stimulierten PBMC sind die Hemmeffekte von Dexamethason und Clobetasol deutlich stärker ausgeprägt als in ruhenden Zellen. Der Hemmeffekt von Beclomethason unterscheidet sich in stimulierten und in ruhenden Zellen nicht.
  3. Topische Glucocorticoide sind hinsichtlich ihres Hemmeffektes auf den zellulären Energiestoffwechsel in niedrigen Konzentrationen potenter und in hohen Konzentrationen weniger potent als Dexamethason.
  4. In ihrem Verhalten auf die Stimulierbarkeit der Zellen unterscheiden sich alle drei Glucocorticoide untereinander: Dexamethason hemmt die Stimulierbarkeit nur bei 10-4 M. [Seite 52↓]Clobetasol hat keinen statistisch signifikanten Effekt auf die Stimulierbarkeit. Beclomethason hemmt die Stimulierbarkeit konstant in allen Konzentrationen.


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3.2  Quantitative Bestimmung von IL-6 mittels nichtkompetitivem ELISA

3.2.1 IL-6-Synthese von ruhenden und stimulierten PBMC

Abbildung 21 zeigt die basale IL-6-Synthese ruhender PBMC im Vergleich zur IL-6-Synthese nach mitogener Stimulation mit 5 µg/ml/106 Zellen Con A bzw. 10 µg/ml/106 Zellen PHA. Die IL-6-Synthese ruhender PBMC lag bei 9,26 ± 2,53 pg/ml. Die mitogene Stimulation mit PHA und Con A führte unter beiden Bedingungen zu einer signifikanten Steigerung der IL-6-Synthese auf 2494,5 ± 496,9 pg/ml/106 Zellen (p = 0,015) bzw. 3434,1 ± 818,3 pg/ml/106 Zellen
(p = 0,02).

Abb. 21: IL-6-Synthese ruhender PBMC verglichen mit der IL-6-Synthese nach Stimulation mit 10 µg/ml/106 Zellen PHA bzw. 5 µg/ml/106 Zellen Con A. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 6 für ruhende PBMC und n = 4 für stimulierte PBMC. *signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p ≤ 0,02).


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3.2.2  Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf die IL-6- Synthese von ruhenden PBMC

Um den Einfluss der Glucocorticoide auf die IL-6- Synthese ruhender PBMC zu untersuchen, wurden die Zellen mit ansteigenden Konzentrationen von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason für 24 h inkubiert. Als Negativkontrolle diente die basale IL-6-Synthese der Zellen ohne Glucocorticoidzusatz. Wie unter 2.3.2. beschrieben wurde der Zellüberstand gewonnen und zur Messung der IL-6-Synthese verwendet. Die Auswertung erfolgte stets als Doppelwertbestimmung aus zwei Proben. Die gewonnenen Ergebnisse sind in den Abbildungen 22 und 23 dargestellt.

Abb. 22: Einfluss von Dexamethason auf die IL-6-Synthese ruhender humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 4.


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Abb. 23: Einfluss von Clobetasol (A) und Beclomethason (B)auf die IL-6-Synthese ruhender humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3-4.

Wie die Abbildungen 22-23 zeigen, führte keines der drei Glucocorticoide in ruhenden Zellen zu einer signifikanten Beeinflussung der IL-6-Synthese. Diese betrug nach Zugabe von Dexamethason 10-4 M 8,7 ± 3,0 pg/ml/106 Zellen (p = 0,4), nach Zugabe von Clobetasol 10-5 M 11,5 ± 4,1 pg/ml/106 Zellen (p = 0,6) und nach Zugabe von Beclomethason 10-5 M 10,9 ± 1,52 pg/ml/106 Zellen (p = 0,5).

Myxothiazol

Nachdem bei den Untersuchungen der Glucocorticoideffekte auf den Sauerstoffverbrauch der Vergleich zu Myxothiazol als einen bekannten Hemmstoff der Atmungskette hergestellt wurde (siehe 3.1), interessierte nun das Verhalten von Myxothiazol auf die Interleukin-Produktion peripherer Lymphozyten. Dazu wurden analog zu den Sauerstoffexperimenten die gleichen Konzentrationen von 14 µM und 40 µM benutzt.

Aus Abbildung 24wird deutlich, dass der Einfluss von Myxothiazol auf die IL-6-Synthese ruhender PBMC nicht den gleichen konzentrationsabhängigen Effekt hatte, wie auf den [Seite 56↓]Sauerstoffverbrauch ruhender PBMC (siehe 3.1.2). Ähnlich zu den beschriebenen Glucocorticoideffekten zeigte sich kein signifikanter Effekt von Myxothiazol auf die Interleukin-Synthese. Die IL-6-Synthese nach Zugabe von 40 µM Myxothiazol betrug 17,4 ± 7,2 pg/ml/106 Zellen (p = 0,4) und nach Zugabe von 14 µM 20,6 ± 9,0 pg/ml/106 Zellen (p = 0,3).

Abb. 24: Einfluss von Myxothiazol auf die IL-6-Synthese ruhender humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3-4.

3.2.3 Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf die IL-6-Synthese von PHA-stimulierten PBMC

Im Weiteren sollte die Wirkung von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf mitogen stimulierte Zellen untersucht werden. Dazu wurden die PBMC mit dem Mitogen Phytohämagglutinin (PHA) in einer Endkonzentration von 10 µl/ml/106 Zellen für 24 h präinkubiert. Die Stimulation führte zu einer signifikanten Steigerung der IL-6-Synthese(siehe 3.2.1.). Die Glucocorticoide wurden dann analog den Experimenten mit ruhenden Zellen in ansteigenden Konzentrationen von 10-10 M bis 10-4 M bzw. 10-5 M zugegeben.

Die Abbildungen 25und 26 stellen die Wirkungen der Glucocorticoide auf die Interleukin-Synthese der stimulierten Lymphozyten dar. Der Ausgangswert entspricht dabei der IL-6-Synthese PHA-stimulierter Zellen ohne Glucocorticoidzugabe.


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Abb. 25: Einfluss von Dexamethason auf die IL-6-SynthesePHA-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3-4. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).

Abb. 26: Einfluss von Clobetasol (A) und Beclomethason (B) auf die IL-6-SynthesePHA-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).


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Aus den Abbildungen 25-26 ergeben sich für die IL-6-SynthesePHA-stimulierter humaner peripherer Lymphozyten folgende Aussagen:

Die mitogene Stimulation humaner PBMC mit PHA in einer Endkonzentration von 10 µg/ml/106 Zellen führte zu einer signifikanten Stimulation der Interleukin-Produktion von basal 9,3 ± 1,5 pg/ml/106 Zellen auf 2494,5 ± 496, 9 pg/ml/106 Zellen (p = 0,02).

Die Zugabe von Dexamethason in Konzentrationen von 10-4 M bis 10-10 M führte zu einer konzentrationsabhängigen Reduzierung der IL-6-Synthese der PBMC. Dabei kam es nur bei Zugabe von 10-4 M und 10-6 M zu einer statistisch signifikanten Hemmung und zwar um 86,4 % ± 6,1 % auf einen Absolutwert von 338,3 ± 105,9 pg/ml/106 Zellen (p = 0,03) bzw. 84,2 % ± 0,2 % auf 393,2 ± 92,6 pg/ml/106 Zellen (p = 0,02). Bei 10-8 M und 10-10 M war die IL-6-Synthesetendenziell, aber nicht statistisch signifikant vermindert.

Im Gegensatz dazu stellte sich für Clobetasol eine von Dexamethason völlig abweichende Kinetik dar. Bereits die Zugabe von 10-10 M Clobetasol führte zu einer signifikanten Hemmung der IL-6-Syntheseum 83,9 % ± 0,8 % auf absolut 400,9 ± 217,9 pg/ml/106 Zellen (p = 0,02). Alle eingesetzten Konzentrationen hemmten statistisch signifikant im Mittel um 80 %.

Auch für Beclomethason wurde gefunden, dass es bereits bei einer Zugabe von 10-10 M Beclomethason zu einer deutlichen Hemmung der IL-6-Synthese um 52,8 % ± 0,9 % auf 1176,7 ± 435,5 pg/ml/106 Zellen (p = 0,8) kam. Die Zugabe von 10-8 M, 10-6 M bzw. 10-5 M führte zu einer statistisch signifikanten Hemmung der IL-6-Syntheseund zwar von im Mittel 75 % ± 0,5 % auf 578,6 ± 193,2 pg/ml/106 Zellen bei 10-8 M (p < 0,05), auf von 572,3 ± 152,4 pg/ml/106 Zellen bei 10-6 M (p < 0,05) bzw. auf 718,9 ± 251,4 pg/ml/106 Zellen bei 10-5 M.

Myxothiazol

Im Gegensatz zu den für ruhende PBMC gefundenen Ergebnissen führte die Zugabe des Atmungskettenhemmstoffs zu Con A- bzw. PHA-stimulierten Zellen zu einer ausgeprägten und statistisch signifikanten Hemmung der IL-6-Synthese. Die Kinetik dieser Hemmung stellte sich in diesen Konzentrationsbereichen als nahezu konzentrationsunabhängig dar.

So betrug die IL-6-Synthese nach Zugabe von 40 µM Myxothiazol auf PHA-stimulierte humane PBMC noch 699,72 ± 251,5 pg/ml/106 Zellen (p = 0,02), was verglichen mit dem Kontrollwert einer Verminderung um 71,9 % ± 1,1 % entsprach. Auch bereits 14 µM Myxothiazol reduzierte die IL-6-Synthese signifikant um 68,1 % ± 2,5 % (p = 0,02) und wich damit nicht signifikant von [Seite 59↓]der Hemmung ab, die für 40 µM Myxothiazol gefunden wurde. Abbildung 27 veranschaulicht die für Myxothiazol bei PHA-stimulierten PBMC gefundenen Ergebnisse.

Abb. 27: Einfluss von Myxothiazol auf die IL-6-SynthesePHA-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3.
* signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).

3.2.4 Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf die IL-6-Synthesevon Con A-stimulierten PBMC

Neben der PHA-Stimulierung stellt die Stimulierung mit Con A ein weiteres etabliertes System zur mitogenen Stimulation peripherer T-Lymphozyten dar. Es wurde bereits zur Stimulierung der PBMC für die Experimente zum Sauerstoffverbrauch verwendet. Aus diesen Gründen sollte die Stimulation mit Con A als Vergleich zu den gefundenen Werten für die PHA-stimulierten Zellen dienen. Die PBMC wurden mit Con A in einer Endkonzentration von 5 µg/ml/106 Zellen vorinkubiert. Die Stimulation führte zu einer signifikanten Steigerung der IL-6-Synthese (siehe 3.2.1.). Die Glucocorticoide Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason wurden dann in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Abbildungen 28-29 dargestellt.


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Abb. 28: Einfluss von Dexamethason auf die IL-6-SyntheseCon A-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3-4. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).

Abb. 29: Einfluss von Clobetasol (A) und Beclomethason (B) auf die IL-6-SyntheseCon A-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).


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Wie die Abbildungen 28-29 zeigen, finden sich die für die PHA-Stimulation gefundenen Werte durch die Con A-Experimente weitestgehend bestätigt. Es lassen sich folgende Aussagen treffen:

Die Konzentrationsabhängigkeit der Hemmeffekte von Dexamethason auf die IL-6-Synthese mitogen stimulierter PBMC wurde bestätigt. Auch die prozentualen Hemmwerte in Con A-stimulierten Zellen entsprachen annähernd denen der PHA-stimulierten Zellen. So wurde die IL-6-Synthesenach Zugabe von 10-4 M und 10-6 M Dexamethason statistisch signifikant vermindert und zwar auf 684,8 ± 238,2 pg/ml/106 Zellen (80,1 % ± 4,1 %, p = 0,03) bzw. auf 893,0 ± 256,9 pg/ml/106 Zellen (74,0 % ± 4,2 %, p = 0,02). Mit abnehmender Konzentration näherten sich die Werte dem Ausgangswert bis auf 3140,46 ± 832,0 pg/ml/106 Zellen (8,6 % ± 5,1 %, p = 0,16) an (vgl. 7,5 % ± 5,1 % für PHA-stimulierte Zellen).

Die beiden topischen Glucocorticoide Clobetasol und Beclomethason wiesen ein nahezu identisches Verhalten hinsichtlich ihrer Wirkung auf die IL-6-SyntheseCon A-stimulierter Zellen auf. So kam es sofort nach Zugabe von 10-10 M zu einer statistisch signifikanten Hemmung der Interleukin-Produktion. Diese betrug für Clobetasol in dieser Konzentration
74,0 % ± 18,9 % (p < 0,05) und für Beclomethason 65,6 % ± 22,3 % (p < 0,05). Für beide Glucocorticoide war im folgenden eine konzentrationsunabhängige Hemmwirkung festzustellen. Sie betrug für Clobetasol in einer Konzentration von 10-8 M 79,7 % ± 10,5 % (p = 0,04) und für Beclomethason in gleicher Konzentration 80,7 % ± 11,4 % (p = 0,04). Diese für eine Konzentration von 10-8 M gefundenen Werte blieben auch in Anwesenheit von 10-6 M bis 10-5 M unverändert bei im Mittel 80 %.

Myxothiazol

Auch für Myxothiazol wurden die für PHA-stimulierte PBMC gefundenen Ergebnisse durch die Con A-Stimulation bestätigt. Beide Konzentrationen (14 µM und 40 µM) hemmten die IL-6-SyntheseCon A-stimulierter humaner PBMC signifikant und in diesen Konzentrationsbereichen nahezu konzentrationsunabhängig. Somit betrug die Interleukin-Produktion in Anwesenheit von 40 µM noch 590,7 ± 188,5 pg/ml/106 Zellen (p = 0,02) und in Anwesenheit von 14 µM 736,2 ± 191,9 pg/ml/106 Zellen (p = 0,02). Dies entsprach einer prozentualen Hemmung um 82,8 % ± 8,9 % bzw. um 78,6 % ± 11,3 % (Abb. 30).


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Abb. 30: Einfluss von Myxothiazol auf die IL-6-SyntheseCon A-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind Mittelwerte und S.E.M. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3-4. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).

3.2.5 Zusammenfassung

Dexamethason

Das systemisch wirksame Dexamethason hat keinen Einfluss auf die IL-6-Synthese ruhender humaner PBMC, weist aber einen deutlichen und konzentrationsabhängigen Effekt auf die stimulierte IL-6-Synthese (Con A bzw. PHA) auf.

  1. In PHA-stimulierten PBMC hemmt Dexamethason 10-8 M die IL-6-Synthese tendenziell, Konzentrationen zwischen 10-6 M und 10-4 M dagegen statistisch signifikant - im Mittel um 85 %.
  2. In Con A-stimulierten PBMC vermindert Dexamethason die IL-6-Synthese konzentrationsabhängig. Konzentrationen von 10-6 M bzw. 10-4 M hemmen statistisch signifikant Hemmungen um 74 % bzw. 80 % .

[Seite 63↓]Clobetasol

Clobetasol hat keinen Einfluss auf die IL-6-Synthese ruhender PBMC. Es hemmt deutlich und konzentrationsunabhängig die IL-6-Synthese in PHA- und Con A-stimulierten Zellen und weicht somit deutlich von den für Dexamethason beschriebenen Ergebnissen ab.

  1. In PHA-stimulierten Zellen rufen alle Konzentrationen (10-10 M bis 10-5 M) eine signifikante Hemmung der IL-6-Synthese von 73,1 % (10-5 M) bis 88,5 % (10-8 M) hervor.
  2. Das Hemmverhalten von Clobetasol nach Vorinkubation mit Con A entspricht weitestgehend dem nach Vorinkubation mit PHA. Es werden konstante Hemmungen zwischen 74 % (10-10 M) und 79 % (10-5 M bis 10-8 M) erreicht. Somit ist durch Con A Stimulation das Hemmausmaß und die Konzentrationsunabhängigkeit der PHA-stimulierten Werte bestätigt.

Beclomethason

Die Effekte der beiden topischen Glucocorticoide waren sowohl in ruhenden als auch stimulierten PBMC nahezu identisch. In ruhenden PBMC hat Beclomethason keine Wirkung auf die IL-6-Synthese, in PHA- und Con A-stimulierten Zellen kommt es aber zu einem statistisch signifikanten und konzentrationsunabhängigen Effekt.

  1. In PHA-stimulierten Zellen wird ab einer Konzentration von 10-8 M eine konstante, statistisch signifikante Hemmung von im Mittel 75 % erreicht. Damit liegt Beclomethason etwas unter den Hemmeffekten von Clobetasol (88,5 %).
  2. In Con A-stimulierten PBMC stellen sich die gleichen Effekte dar wie nach PHA-Stimulation. Ab einer Konzentration von 10-8 M wird eine konstante, statistisch signifikante Hemmung von im Mittel 82 % erreicht. Hier liegt das gleiche Hemmausmaß wie unter Zugabe von Clobetasol (79 %) vor.

Myxothiazol

Im Gegensatz zu den deutlich konzentrationsabhängigen Effekten von Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch humaner PBMC, lässt sich für die Effekte auf die IL-6-Synthese nur ein geringer Unterschied zwischen 14 µM und 40 µM Myxothiazol finden.

  1. Myxothiazol hat keinen Einfluss auf die IL-6-Synthese in ruhenden PBMC.
  2. In PHA-stimulierten Zellen kommt es zu einer statistisch signifikanten Hemmung der Interleukin-Produktion von im Mittel 70 %.
  3. In Con A-stimulierten Zellen werden ebenfalls signifikante Hemmeffekte von etwa 80 % erzielt.

Es wurden demnach die folgenden Unterschiede zwischen den drei untersuchten Glucocorticoiden gefunden:

  1. In ruhenden Zellen zeigen die drei Glucocorticoide keinen Effekt auf die IL-6-Synthese humaner PBMC. Sie unterscheiden sich dabei untereinander nicht.
  2. In PHA- und Con A-stimulierten Zellen hemmt Dexamethason die IL-6-Synthese konzentrationsabhängig. Im Gegensatz dazu ist der Hemmeffekt der topischen Glucocorticoide Clobetasol und Beclomethason in stimulierten Zellen konzentrationsunabhängig.
  3. In niedrigen Konzentrationen zeigen die topischen Glucocorticoide eine stärkere genomische Potenz. In sehr hohen Konzentrationen ist der Hemmeffekt von Dexamethason und den topischen Glucocorticoiden annähernd gleich.
  4. Die beiden topischen Glucocorticoide Clobetasol und Beclomethason sind in ihrer Wirkung auf die IL-6-Synthese stimulierter humaner PBMC nahezu identisch.
  5. Das kinetische Verhalten der einzelnen Glucocorticoide unterscheidet sich nicht zwischen PHA- und Con A-stimulierten Zellen.


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3.3  Quantitative Bestimmung von Apoptose mittels Durchflusszytometrie (FACS)

3.3.1 Standardisierungsbedingungen

Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf die Apoptose in Abhängigkeit von der Inkubationszeit

Die Induktion von Apoptose über den Fas/CD95-Rezeptor von Jurkat–T–Zelllinien mittels anti-Fas/CD95-AK und die nachfolgende Detektion der Apoptose mit Annexin V-FITC/PI–Färbung stellt ein standardisiertes System zur durchflusszytometrischen Analyse von Apoptose dar. Die Induktion von Apoptose an einer Fas/CD95-exprimierenden humanen Jurkat-T–Zelllinie diente daher als Positivkontrolle zur Etablierung unseres Zellsystems. Dazu wurden aus Jurkat-Zellkulturen (siehe 2.1.3) präparierte Zellsuspensionen mit Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason in einer Konzentration von jeweils 10-4 M behandelt und für jeweils 2 h, 4 h, 6 h und 16 h inkubiert. Die Zellen wurden dann wie unter 2.4.4 beschrieben zur durchflusszytometrischen Messung von Apoptose verwendet. Als Positivkontrolle wurde mittels anti-Fas/CD95-Antikörper (Klon 7C11) Apoptose induziert. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 31 und 32 dargestellt.

Abb. 31: Einfluss von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf Apoptose von Jurkat-Zellen in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Repräsentatives Experiment von n = 3.


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Abb. 32: Einfluss von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf anti-Fas/CD95-induzierte Apoptose von Jurkat-Zellen in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Repräsentatives Experiment von n = 3.

Dabei konnte gefunden werden, dass es bei Jurkat-Zellen nach einer Inkubationsdauer von 16 h sowohl für Dexamethason als auch für Beclomethason und Clobetasol zu einem deutlichen Anstieg apoptotischer Zellen kam (Abb. 31). Der Anteil spontan-apoptotischer Zellen lag zwischen 3,9 % nach 6 h Inkubation und 5,9 % nach 16 h Inkubation. Nach 6 h Inkubation mit Dexamethason betrug der Anteil apoptotischer Zellen 8,1 %, nach 16 h Inkubation betrug dieser 14,7 %. Der Anteil apoptotischer Zellen nach Zugabe von Clobetasol bzw. Beclomethason betrug nach 6 h Inkubation 16,7 % bzw. 17,2 % und nach 16 Stunden Inkubation 49,0 % bzw. 49,7 %.

Wie Abbildung 32 zeigt, führte die monoklonale Stimulierung mit anti-Fas/CD95-AK nach einer Inkubationsdauer von 4 h zu einer Steigerung der Apoptose von 5,6 % auf 16,4 % und nach 16 h von 5,9 % auf 45,7 %. Die Zugabe von Dexamethason führte zu einem weiteren Anstieg des Anteils apoptotischer Zellen auf 26,5 % nach 4 h und auf 48,8 % nach 16 h Inkubation. Nur nach Zugabe der topischen Glucocorticoide Clobetasol bzw. Beclomethason kam es bereits nach 2 h zu einem Anstieg der Apoptose auf 19,8 % bzw. 18,2 %. Mit Zunahme der Inkubationsdauer kam es im Vergleich zur Positivkontrolle zu einer weiteren deutlichen Zunahme des Anteils [Seite 67↓]apoptotischer Zellen und zwar nach 4 h auf 44,8 % (Clobetasol bzw. Beclomethason) und nach 16 h auf 54,3 % (Clobetasol) bzw. 51,6 % (Beclomethason).

Es sollte nun entsprechend diesen Ergebnissen untersucht werden, wie sich Apoptose in Abhängigkeit von der Inkubationsdauer nach Zugabe der Glucocorticoide bei humanen PBMC verhält. Ausgehend von den für humane Jurkat-Zellen gefundenen Werten wurden dazu humane PBMC für 16 h, 20 h, 36 h und 48 h inkubiert (Abb. 33).

Abb. 33: Einfluss von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf Apoptose von PBMC in Abhängigkeit von der Inkubationszeit. Repräsentatives Experiment von n = 3.

Dabei erwies sich eine Inkubationszeit von 20 h als optimal und wurde für alle folgenden Messreihen weitergeführt. Der Anteil spontan-apoptotischer PBMC lag nach 20 h durchschnittlich bei 5,6 %. Nach einer weiteren Zunahme der Inkubationszeit stieg der Anteil spontan-apoptotischer Zellen an (9,6 % nach 36 h und 11,3 % nach 48 h). Im Unterschied zu Jurkat-Zellen kam es bei PBMC nach einer Inkubationsdauer von 16 h weder bei Dexamethason (9,1 % apoptotische Zellen) noch bei Clobetasol bzw. Beclomethason (13,5 % bzw. 13,6 % apoptotische Zellen) zu einer deutlichen Zunahme des Anteils apoptotischer Zellen. Nach einer Inkubationsdauer von 20 h stieg dann der Anteil apoptotischer Zellen bei allen drei Glucocorticoiden an und zwar bei Dexamethason auf 14,5 %, bei Clobetasol auf 21,5 % und bei Beclomethason auf 20,1 %.


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Humane periphere T-Zellen exprimieren in nicht aktiviertem Zustand kaum Fas/CD95-Rezeptor (Yang et al. 1995). Erwartungsgemäß zeigte sich in unseren Experimenten keine Induktion von Apoptose durch anti-Fas/CD95-AK an nicht aktivierten humanen PBMC (Daten nicht gezeigt).

Vergleich von Annexin V – Färbung und DNA – Färbung

Die DNA–Färbung sollte neben der Färbung mit Annexin V ein zweites System zur Detektion apoptotischer Zellen darstellen und gleichzeitig als Kontrolle dienen. Die Äquivalenz beider Systeme konnte durch eine enge Korrelation der Messwerte nachgewiesen werden. Abbildung 34 (A) zeigt beispielhaft die Ergebnisse an Jurkat-Zellen nach Inkubation von 16 h mit dem jeweiligen Glucocorticoid in einer Konzentration von 10-4 M. Abbildung 34 (B) stellt die Ergebnisse an PBMC nach Inkubation von 20 h mit dem jeweiligen Glucocorticoid in einer Konzentration von 10-4 M dar.

Abb. 34: Vergleichbarkeit von Annexin V-Färbung und DNA-Färbung bei (A) Jurkat-Zellen und (B) PBMC. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3-4. Angegeben sind der Mittelwert und der SD. n.s. = nicht signifikant.


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3.3.2  Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf die Apoptose von Jurkat-Zellen

Nachdem für nicht aktivierte Jurkat-Zellen ein deutlicher Anstieg des Anteils apoptotischer Zellen nach einer Inkubationsdauer von 16 h gefunden wurde (vgl. 3.3.1), sollte der Einfluss der Glucocorticoide auf dieses Testsystem quantifiziert werden. Dazu wurden die Zellen mit dem jeweiligen Glucocorticoid in Konzentrationen von 10-4 M, 10-5 M und 10-8 M für 16 h inkubiert. Anti-Fas/CD95-AK wurde als Positivkontrolle mitgeführt. Der Anteil spontan-apoptotischer Zellen nach 16 h Inkubation lag bei 5,8 % ± 0,2 % (n = 3). Die Zugabe von Dexamethason
10-4 M bzw. 10-5 M führte zu einem signifikanten Anstieg apoptotischer Zellen auf 14,7 % ± 0,1 % (p = 0,03) bzw. 10,7 % ± 0,4 % (p = 0,03). Für die topischen Glucocorticoide zeigte sich, dass es erst nach Zugabe von Clobetasol 10-4 M bzw. Beclomethason 10-4 M zu einer signifikanten Zunahme des Anteils apoptotischer Zellen kam und zwar auf 46,7 % ± 5,6 % (p = 0,02) bzw. auf 47,3 % ± 7,9 % (p = 0,03).

Die Inkubation mit anti-Fas/CD95-AK führte zu einer Induktion von Apoptose auf 47,5 % ± 5,4 % (p = 0,03). Die Ergebnisse sind in Abbildung 35 dargestellt.

Abb. 35: Konzentrationsabhängiger Einfluss von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf Apoptose von Jurkat-T-Zellen nach 16 h Inkubation. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3. Angegeben sind der Mittelwert und der SD.


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3.3.3  Effekte von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf die Apoptose von PBMC

Zur Quantifizierung der glucocorticoid-induzierten Apoptose humaner PBMC wurden die Zellen mit dem jeweiligen Glucocorticoid in Konzentrationen von 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M und 10-8 M für 20 h inkubiert. Bekannt war, dass Dexamethason in sehr hohen Konzentrationen als Induktor der Apoptose fungiert. Es interessierte dabei das Verhalten der topischen Glucocorticoide und ob sich eine direkte Abhängigkeit von der Konzentration finden lassen würde.

Es zeigte sich, dass alle drei Glucocorticoide nach 20 h Inkubation konzentrationsabhängig Apoptose induzieren. Der Anteil spontan-apoptotischer Zellen lag bei 5,6 % ± 2,0 % (n = 3). Die Zugabe von Dexamethason in einer Konzentration von 10-4 M führte zu einer signifikanten Zunahme des Anteils apoptotischer Zellen auf 14,5 % ± 2,0 % (p = 0,04). Dexamethason 10-5 M führte zu einem nicht signifikanten Anstieg apoptotischer Zellen auf 11,5 % ± 0,4 % (10-6 M auf 11,1 % ± 0,8 %, 10-8 M auf 9,8 % ± 0,8 %).

Die Inkubation mit den topischen Glucocorticoiden führte im Vergleich dazu zu einer deutlicheren Zunahme apoptotischer Zellen. Die Inkubation mit Clobetasol führte bereits bei einer Konzentration von 10-5 M zu einem signifikanten Anstieg des Anteils apoptotischer Zellen auf 13,2 % ± 0,9 % (p = 0,02). Nach Zugabe von 10-4 M kam es zu einer maximalen Zunahme apoptotischer Zellen auf 21,5 % ± 1,3 % (p = 0,02). Die Inkubation mit Beclomethason 10-4 M und 10-5 M für 20 h führte zu einem signifikanten Anstieg des Anteils apoptotischer Zellen auf 20,1 % ± 4,1 % (p = 0,03) bzw. 12,8 % ± 1,0 % (p = 0,04). Beclomethason in den Konzentrationen von 10-6 M und 10-8 M führte zu einem tendenziellen, aber nicht signifikanten Anstieg apoptotischer Zellen auf 11,1 % ± 0,8 % bzw. 9,2 % ± 1,4 %. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 36 und 37 dargestellt.


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Abb. 36: Apoptose von humanen PBMC nach 20 h Inkubation. (A) und (B) in Abwesenheit von Glucocorticoiden, (C) nach 20 h Inkubation mit Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason. (A) Zweidimensionale Dot-plot-Darstellung des FSC/SSC. Das Gate wurde auf die Population vitaler Lymphozyten gesetzt. (B) und (C) Dot-plot-Darstellung der Fluoreszenz von FITC- und PI-markierten PBMC. Repräsentatives Experiment von n = 3.


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Abb. 37: Konzentrationsabhängiger Einfluss von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason auf die Apoptose von humanen PBMC nach 20 h Inkubation. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3. Angegeben sind der Mittelwert und der SD.

Ein zusammenfassender Vergleich der drei Glucocorticoide Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason führt zu folgenden Aussagen:

  1. Sowohl Dexamethason als auch die topischen Glucocorticoide führen zu einer konzentrationsabhängigen Zunahme der Apoptose von humanen PBMC nach 20 h Inkubation.
  2. Bei niedrigen Konzentrationen unterscheiden sich Dexamethason und die topischen Glucocorticoide kaum.
  3. Bei sehr hohen Konzentrationen zeigen beide topischen Glucocorticoide einen deutlich stärkeren proapoptotischen Effekt als Dexamethason.
  4. Die beiden topischen Glucocorticoide Clobetasol und Beclomethason unterscheiden sich hinsichtlich ihrer apoptoseinduzierenden Wirkung nahezu nicht von einander.

[Seite 73↓]Myxothiazol

Die mitochondriale Funktionalität spielt eine bedeutende Rolle bei der Auslösung von Apoptose. Es wurde der Einfluss von Myxothiazol als irreversibler Hemmstoff der Atmungskette auf die Apoptose humaner PBMC untersucht. Analog zu den Experimenten unter 3.1 wurden zwei Konzentrationen (40 µM und 14 µM) eingesetzt und für 20 h inkubiert.

Dabei fand sich, dass auch Myxothiazol zu einer signifikanten Zunahme des Anteils apoptotischer Zellen führte. Nach Zugabe von 14 µM Myxothiazol lag der Anteil apoptotischer Zellen bei 23,1 % ± 3,7 % (p = 0,01), nach Zugabe von 40 µM bei 22.0 % ± 3,6 % (p = 0,02). Es war kein signifikanter Unterschied zwischen 14 µM und 40 µM Myxothiazol nachweisbar. Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 38 und 39 dargestellt.

Abb. 38: Apoptose von humanen PBMC nach 20 h Inkubation mit Myxothiazol. Dargestellt sind die Ergebnisse im Annexin V-FITC/PI–Fenster. Repräsentatives Experiment von n = 3.


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Abb. 39: Apoptose von humanen PBMC nach 20 h Inkubation mit Myxothiazol. Die Anzahl der Experimente betrug n = 3. Dargestellt sind der Mittelwert und der SD.


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26.04.2005