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4  Diskussion

4.1 Grundlagen der Glucocorticoidtherapie

Die klinische Bedeutung der Glucocorticoide steht in deutlichem Widerspruch zum aktuellen Stand der Aufklärung ihrer Wirkmechanismen. Genomisch vermittelte Effekte bilden auch heute noch die Grundlage für Vergleiche von Wirksamkeiten verschiedener Glucocorticoide und der Erstellung von Äquivalenzdosen. Die spezifisch und unspezifisch nichtgenomischen Mechanismen sind nicht hinreichend geklärt und bleiben im klinischen Alltag weitestgehend unberücksichtigt.

Die vorliegende Arbeit diente der weiterführenden Aufklärung nichtgenomischer Wirkungen verschiedener Glucocorticoide. Anhand topischer Glucocorticoide sollte ein Wirkungsprofil über die qualitativ unterschiedlichen Mechanismen auf Immunzellen erstellt und mit Dexamethason als systemische Referenzsubstanz verglichen werden. Es stellte sich die Frage, ob sich topisch eingesetzte Glucocorticoide in ihren modularen Wirkungen auf Immunzellen grundlegend vom systemisch eingesetzten Standardpräparat Dexamethason unterscheiden und ob sich Rückschlüsse auf einen optimierten Einsatz von systemischen Glucocorticoiden in der Rheumatologie und klinischen Immunologie, angepasst an Unterschiede im nichtgenomischen/genomischen Wirkungsverhältnis, ziehen lassen.

Grundlage bildete das von Buttgereit et al. entwickelte modulare Konzept der Glucocorticoidwirkungen (Buttgereit et al. 1998). Danach lassen sich drei qualitativ unterschiedliche Wirkmechanismen in Abhängigkeit von der Konzentration und der zeitlichen Latenz bis zum Wirkungseintritt unterscheiden. (1) Gut bekannt sind ihre therapeutischen Wirkungen über genomische und ligandspezifische Mechanismen, die bereits in niedrigen Konzentrationen erreicht werden. Der Wirkungseintritt erfolgt mit einer zeitlichen Latenz nach Stunden. Der Weg ist transkriptions- und translationsabhängig. (2) Der spezifisch nichtgenomische Mechanismus ist ebenfalls rezeptorabhängig, aber transkriptions- und translationsunabhängig. Schnelle Signalkaskaden werden durch niedrige bis mittlere Konzentrationen ausgelöst, die Wirkung ist nach Sekunden bis Minuten messbar. (3) Es gibt Hinweise auf unspezifisch nichtgenomisch vermittelte Effekte, die nicht durch Transkriptionsinduktion oder -repression spezifischer Gene erklärbar sind. Sehr hohe[Seite 76↓] Konzentrationen sollen dabei zu einer unspezifischen Membraninterkalierung führen. Die Effekte sind nichtgenomisch vermittelt und treten bereits nach wenigen Sekunden auf. Da bei einer Dosis von 7,5 mg bzw. 15 mg Prednisolonäquivalent rechnerisch 42 % bzw. 63 % der intrazellulären Rezeptoren besetzt sind, muss man bei intravenös verabreichten Dosen über 250 mg Prednisolonäquivalent von einer vollständigen Sättigung aller intrazellulär verfügbaren Rezeptoren ausgehen. (Tyrell 1995, Buttgereit et al. 1998). Außerdem kommt es nach dem ersten Tag einer intravenösen Stoßtherapie mit Dosen von 500-1000 mg Prednisolonäquivalent zur Downregulation der intrazellulären Rezeptoren (Oakley et al. 1999, Schlaghecke et al. 1992). Schließlich kann man klinisch bei hohen Dosen sofortige Wirkungen beobachten, die zu schnell eintreten, als dass sie über eine Modifikation der Genexpression vermittelt sein könnten. Dies legt den Schluss nahe, dass der therapeutische Nutzen hoher Glucocorticoiddosen über 250 mg Prednisolonäquivalent über zusätzliche, qualitativ andere nichtgenomische Mechanismen vermittelt ist.

Buttgereit et al. fanden erstmals von genomischen Potenzen deutlich abweichende nichtgenomische Wirkstärken für verschiedene Glucocorticoide an stimulierten Thymozyten (Buttgereit et al. 1999). Schmid et. al. konnten diese Unterschiede an humanen PBMC bestätigen (Schmid et al. 2000). Croxtall et al. führten die vergleichenden Studien fort. Sie konnten zeigen, dass nichtgenomische Effekte auf die zytoplasmatische PLA2-Aktivität und genomische Effekte auf die COX2-Expression von A549-Zellen durch unterschiedliche Mechanismen vermittelt werden und dass sich Beclomethason-dipropionat dabei deutlich von Dexamethason unterscheidet (Croxtall et al. 2002).

Synthetische Glucocorticoide unterscheiden sich hinsichtlich ihrer chemischen Strukturen und ihrer genomischen und nichtgenomischen Wirksamkeiten (Äquivalenzdosen). Allen gemeinsam ist das chemische Grundgerüst bestehend aus drei Cyclohexanringen und einem Cylcopentanring. Unterschiede in der sterischen Konformation und Art der Substituenten bedingen die Unterschiedlichkeit ihrer Wirksamkeiten und ihres klinischen Einsatzes.

In der vorliegenden Arbeit wurde Dexamethason als Referenzsubstanz für systemische Glucocorticoide eingesetzt. Entscheidend für seine gegenüber Cortisol fast 30fach stärkere genomische Potenz sind neben der Doppelbindung zwischen C1 und C2 die Methylierung an Position 16α und Fluorierung an Position 9α. Durch die Substitutionen wird Dexamethason zu einem der potentesten synthetischen Cortisolanaloga.


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Für seine nichtgenomischen Wirkungen sind weniger die spezifischen Seitengruppen als vielmehr deren sterische Konformation von Bedeutung. Vergleicht man Dexamethason mit dem ebenfalls systemisch applizierten Betamethason wird dieser Unterschied deutlich. Beide Substanzen weisen eine nahezu identische chemische Struktur auf (Methylierung an C16, Fluorierung an C9). Dies erklärt ihre gleichen relativen genomischen Potenzen. Der Unterschied besteht in der räumlichen Konformation der Methylgruppe an C16. Diese liegt bei Dexamethason in der alpha-, bei Betamethason in der beta-Stellung vor. Dies begünstigt Dexamethason in seiner Fähigkeit, sich in Zellmembranen zu interkalieren und darüber eine starke, nichtgenomische Potenz zu entwickeln, wohingegen Betamethason fast keine nichtgenomischen Effekte aufweist (Schmid et al. 2000).

Der klinische Einsatz von Dexamethason beruht hauptsächlich auf seinen starken genomischen Wirkungen. Sie führen bereits in niedrigen Dosen zu Entzündungshemmung und Immunsuppression. Ungeachtet der Tatsache, dass es in sehr hohen Dosen stark suppressiv auf den hypothalamisch-hypophysär-adrenalen Regelkreis wirkt, kommt es in sehr hohen Dosen bei der Behandlung von Erkrankungen und Traumen des zentralen Nervensystems, die mit einer Ödembildung einhergehen, zum Einsatz. Diese bisher empirisch und klinisch etablierte Anwendung könnte durch seine starken unspezifisch nichtgenomischen Eigenschaften, die der Ödembildung durch Interkalierung in die Membran und folgende Reduzierung ihrer Permeabilität entgegenwirkt, erklärbar werden(Mursch et al. 2000).

Die Hypothese der vorliegenden Arbeit war, dass bei topischen Glucocorticoiden neben den gut etablierten genomischen Effekten auch starke nichtgenomische Wirkungen vorliegen sollten, da sie lokal so hohe Konzentrationen erreichen, dass auch nichtgenomische Mechanismen ihre gute klinische Wirksamkeit begründen müssen.

Clobetasol und Beclomethason wurden als Beispielsubstanzen für topische Glucocorticoide ausgewählt, da sie zu den am stärksten wirksamen topischen Glucocorticoiden in der Dermatologie bzw. Pneumologie zählen und ihre therapeutischen Wirkungen gut bekannt und dokumentiert sind (Griffiths 2001, Pfister et al. 1995, Lipworth 1993).

Wie bei Dexamethason sind auch bei den topischen Glucocorticoiden neben der Doppelbindung zwischen C1 und C2 die Substitutionen an C9 und C16 für ihre genomisch vermittelten antiinflammatorischen und antiproliferativen Effekte verantwortlich. Darüber hinaus weisen Clobetasol und Beclomethason Veresterungen an C17α auf. Bei der Therapie entzündlicher Atemwegserkrankungen spielen genomisch vermittelte Effekte eine übergeordnete Rolle. [Seite 78↓]Ausgehend von der Annahme, dass lokal hohe Glucocorticoidkonzentrationen erreicht werden, sind auch nichtgenomische Effekte über eine unspezifische Interkalierung in die Zellmembran anzunehmen. Sie werden therapeutisch über eine Reduzierung der Membranpermeabilität, die einer entzündungsbedingt erhöhten Gefäßdurchlässigkeit entgegenwirkt, ausgenutzt (Pfister et al. 1995).

HumanePBMC nehmen eine zentrale Stellung in der zellulären und humoralen Immunantwort ein. Sie sind stimulierbar, teilungsfähig und besitzen alle wichtigen Zellbestandteile und Funktionen. Sie sind ohne großen labortechnischen Aufwand in ausreichender Menge erhältlich. Zellvitalität und repräsentative Verteilung von B- und T-Lymphozyten werden bei der Gewinnung und Isolation durch die Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation nicht beeinträchtigt (Bøyum 1968). T-Lymphozyten stellen unter physiologischen Bedingungen mit einem Anteil von etwa 75 % die größte PBMC-Fraktion. B-Lymphozyten machen etwa 15 % und NK-Zellen 10 % der PBMC aus. Die für unsere Untersuchungen präparierte Zellsuspensionen bestanden somit zu einem überwiegenden und funktionell dominierenden Anteil aus T-Lymphozyten. Auf die weitere Separation einzelner PBMC-Fraktionen und die Gewinnung von Subpopulationen wurde bewusst verzichtet. Ziel war ein funktionierendes Gesamtzellsystem. In zahlreichen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass eine optimale Aktivierung der Zellen nur bei ausreichendem Zell-Zell-Kontakt und gegenseitiger funktioneller Interaktion der Zellen möglich ist (Zempleni et al. 1999, Karlsson et al. 1997, Grove et al. 1994).

Um ein modulares Wirkprofil der topischen Glucocorticoide zu erstellen, wurde ihr Einfluss auf die stimulierte IL-6-Produktion humaner PBMC als Beispiel für genomisch vermittelte Effekte (Buttgereit et al. 1994) untersucht. Der Sauerstoffverbrauch stellt einen Parameter des zellulären Energiestoffwechsels dar und sollte als Beispiel des unspezifisch nichtgenomischen Wirkmechanismus dienen (Buttgereit et al. 1997). Bei der glucocorticoid-induzierten Apoptose geht man davon aus, dass sie über alle drei modularen Mechanismen - genomisch, spezifisch/unspezifisch nichtgenomisch - wirkt (Gold et al. 2001, Barnes 1998, Gametchu et al. 1987).


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4.2  Modulares Modell der Wirkmechanismen von Glucocorticoiden

4.2.1 Unspezifisch nichtgenomischer Mechanismus

Messung des Sauerstoffverbrauchs mittels Clark-Elektrode und Energiestoffwechsel von PBMC.

Der Gesamtsauerstoffverbrauch von PBMC reflektiert die ungekoppelte Atmung, den extramitochondrialen Sauerstoffverbrauch und den Sauerstoffverbrauch durch ATP-verbrauchenden Prozesse. Unter den gegebenen Versuchsbedingungen stellte die Messung des Sauerstoffverbrauchs einen geeigneten Parameter des zellulären Energiestoffwechsels dar. Die Verstoffwechslung von Kohlehydraten, Fettsäuren und Aminosäuren zu Kohlendioxid und Wasser unter Verbrauch von Sauerstoff spielt die zentrale Rolle bei der Energiesynthese in Form von ATP in ruhenden wie stimulierten Zellen. Es lassen sich unter geeigneten Versuchsbedingungen durch die Messung des Sauerstoffverbrauchs Aussagen über den Energiestoffwechsel in Abhängigkeit von Testsubstanzen treffen. Glukose und anorganisches Phosphat sind wesentliche Induktoren der Glykolyse (Seshagiri et al. 1991). In ruhenden Lymphozyten ist der Beitrag der aeroben Glykolyse an der ATP-Synthese in glukosefreiem und phosphatarmen Medium vernachlässigbar gering (Müller et al. 1986). Gespeichertes Glykogen ist mit maximal 10 % an der zellulären Atmung in Lymphozyten beteiligt (Suter et al. 1976). Borsook-Eagle-Medium ist glukosefrei und enthält nur zu einem geringen Anteil anorganisches Phosphat. Die zelluläre Energiesynthese erfolgt unter diesen Bedingungen fast ausschließlich über die mitochondriale oxidative Phosphorylierung. Andere (extramitochondriale) Wege neben der mitochondrialen sauerstoffverbrauchenden Oxidation zur ATP-Gewinnung konnten vernachlässigt werden (Rolfe et al. 1997).

In den vorliegenden Untersuchungen lag der Sauerstoffverbrauch ruhender PBMC bei 5,84 ± 0,22 nmol O2/min/107 Zellen und ist vergleichbar mit Ergebnissen, die in anderen Arbeiten unter gleichen Versuchsbedingungen gefunden wurden (Schmid et al. 2000, Kuhnke et al. 2003). Ruhende Lymphozyten gewinnen den Hauptteil des zellulären ATP aus der sauerstoffverbrauchenden Oxidation energieliefernder Substrate innerhalb der oxidativen Phosphorylierung im Mitochondrium. Glykolyse und anaerobe Energiegewinnung spielen eine untergeordnete Rolle. Ein Drittel des Gesamtsauerstoffverbrauchs ist spezifischen Prozessen zuzuordnen. Dabei sind die Na+/K+-ATPase, die Proteinbiosynthese und das Protonenleak die hauptenergieverbrauchenden Prozesse. Ein weiterer Teil wird infolge der Phosphorylierung von Enzymen, der Verstoffwechslung metabolischer Substrate und der Anordnung und [Seite 80↓]Aufrechterhaltung des Zytoskeletts verbraucht. Schließlich wird ein Anteil für sog. futile cycling reactions benötigt, energieverbrauchende Reaktionszyklen, die nicht direkt in die Aufrechterhaltung des zellulären Stoffwechsels einfließen, sondern den Zellen ermöglichen soll, auf externe Signale schnell und adäquat reagieren zu können (Buttgereit et al. 1992).

Das Lektin Con A führt zur mitogenen Stimulation speziell von T-Lymphozyten. Es bindet an eine Untereinheit des T-Zell-Rezeptors (TCR) und führt über eine unspezifische Vernetzung der TCR zur Auslösung intrazellulärer Signalkaskaden. Es kommt zu einem Anstieg intrazellulärer second messenger wie Ca2+, IP3 und Diacylglycerol. Die Signaltransduktion führt unter Einbeziehung weiterer Regulatorproteine zu einer Aktivierung und Proliferation der Lymphozyten. Die Stimulierung erfolgt im Gegensatz zur Stimulation mit spezifischen Antigenen oder zur autoreaktiven Stimulation polyklonal und erfasst somit eine große Anzahl an Lymphozyten(Janeway et al. 1997). Experimente an Rattenthymozyten zeigten, dass in Abhängigkeit von den Versuchsbedingungen bis zu 80 % der isolierten Thymozyten innerhalb von Sekunden durch Con A mitogen stimuliert werden konnten (Buttgereit et al. 1993, Krauss et al. 1999). Experimente an humanen PBMC bestätigten die Stimulierbarkeit des Sauerstoffverbrauchs innerhalb von Sekunden (Schmid et al. 2000).

In der vorliegenden Arbeit erhöhten humane PBMC ihren Sauerstoffverbrauch durch mitogene Stimulation mit 75 µg Con A/ml (3,75 µg Con A/106 Zellen) erwartungsgemäß innerhalb von Sekunden um 3,05 ± 0,3 nmol O2/min/107 Zellen. Diese Steigerung um 55,4 % entspricht damit anderen gefundenen Ergebnissen unter vergleichbaren Versuchsbedingungen (Schmid et al. 2000). In stimulierten PBMC entfallen zwei Drittel des Gesamtsauerstoffverbrauchs auf spezifische Prozesse. Der Verbrauch an zellulärem ATP für Na+/K+-ATPase und Proteinbiosynthese ist insgesamt um etwa 11 % des Gesamtverbrauchs gesteigert. Proteinbiosynthese, Na+/K+-ATPase und Ca2+-ATPase sind die Hauptenergieverbraucher in stimulierten PBMC (Schmid et al. 2000). Die mitogene Stimulation bewirkt eine Aktivitätssteigerung zellulärer Enzymsysteme und einen Anstieg der Glykolyserate. Greiner et al. konnten nachweisen, dass es nach Stimulation von Rattenthymozyten in Anwesenheit von Glukose und anorganischem Phosphat zu einer Steigerung der anaeroben Laktatsynthese und einem Abfall der aeroben Energiesynthese kam (Greiner et al. 1994). Zwei Drittel der zellulären ATP-Synthese wurden durch anaerobe Laktatproduktion gedeckt. Ist allerdings Glukose und anorganisches Phosphat nicht in ausreichender Menge vorhanden, kommt es - auch unter mitogener Stimulation - zunehmend über aerobe Wege der Energiegewinnung zur ATP-Synthese. Diese ist in ihrem Gesamtumsatz durch das fehlende Substratangebot an Glukose nicht[Seite 81↓] beeinträchtigt. Das gleiche gilt bei einem fehlenden Angebot an Glutamin (Guppy et al. 1993). Die beschriebene Abnahme der aeroben Oxidation unter Bereitstellung von Glukose wird als Crabtree-Effekt bezeichnet.

Die Ergebnisse werden von den Versuchsbedingungen (Temperatur, Sauerstoffäquilibrierung) und dem Inkubationsmedium (Substratanteile von Glukose, Aminosäuren und anorganischem Phosphat; Einsatz bakterizider/bakteriostatischer Substanzen) beeinflusst. Die unter 2.2 beschriebenen Versuchsbedingungen wurden in unserer Arbeitsgruppe an verschiedenen Zellsystemen etabliert und kamen so in der vorliegenden Arbeit zur Anwendung (Müller et al. 1986, Buttgereit et al. 1991, 1992, Schmid et al. 2000, Kuhnke et al. 2003).

In der vorliegenden Arbeit stellte sich als wesentlicher Unterschied zu Dexamethason heraus, dass topische Glucocorticoide sowohl in ruhenden als auch in stimulierten PBMC bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen zu einer deutlichen Hemmung des Sauerstoffverbrauchs führten. Dexamethason hemmte den Sauerstoffverbrauch in ruhenden und stimulierten Zellen konzentrationsabhängig mit einer maximalen Hemmung bei der höchsten eingesetzten Konzentration von 10-4 M. Die Wirkung der topischen Glucocorticoide auf den zellulären Energiestoffwechsel blieb hingegen konzentrationsunabhängig. Die topischen Glucocorticoide zeigten also im Hinblick auf den zellulären Energiestoffwechsel bei sehr niedrigen Konzentrationen eine stärkere nichtgenomische Potenz als Dexamethason, während sie bei sehr hohen Konzentrationen weniger potent waren. Wie sind diese Unterschiede zu erklären?

Lipophilie und Sättigung der Interkalierung in die Membran.

Topische Glucocorticoide sind durch ihre Veresterung an Position 17α deutlich lipophiler als systemische Glucocorticoide (Ponec et al. 1986). Beclomethason-dipropionat ist zusätzlich an C21 verestert und besitzt eine über 2,5fach höhere Lipophilie im Vergleich zu Dexamethason. Topische Glucocorticoide sind damit besser in der Lage, in biologische Membranen zu diffundieren und sich so auch in die Membranen zu interkalieren. Topische Glucocorticoide könnten demnach im Unterschied zu systemischen Glucocorticoiden bereits bei sehr niedrigen und physiologisch vorhandenen Konzentrationen deutliche direkte, unspezifische Membraneffekte auslösen.

Bei steigender Konzentration kam es zu keiner weiteren Wirkungssteigerung der topischen Glucocorticoide auf den Sauerstoffverbrauch. Diese Tatsache ist dadurch erklärbar, dass [Seite 82↓]aufgrund der hohen Lipophilie der Sättigungsbereich der Diffusions- und Interkalierungskapazität für die topischen Glucocorticoide bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen erreicht ist. Die unspezifischen Effekte wären bei 10-10 M maximal. Denkbar wäre auch, dass der Sättigungsbereich bei einer sehr hohen Konzentration von 10-4 M für topische Glucocorticoide noch nicht erreicht ist. Allerdingssollte man berücksichtigen, dass Konzentrationsbereiche höher als 10-4 weder physiologisch noch therapeutisch erreicht werden.

Beclomethason zeigte eine tendenziell geringere Inhibition des Sauerstoffverbrauchs im Vergleich zu Clobetasol. Dieser nicht signifikante Unterschied ist darauf zurückzuführen, dass die Steigerung der Lipophilie durch die Doppelveresterung an C17α und C21 durch den negativ sterischen Effekt der somit verlängerten Seitengruppen eingedämmt wird. Diese Tatsache ist von Bedeutung, da Beclomethason aufgrund der Estergruppen einen deutlich stärkeren und mit Clobetasol vergleichbaren Hemmeffekt auf den Sauerstoffverbrauch hat als Dexamethason, aber nicht die nichtgenomische Wirkstärke von Clobetasol erreicht.

Dexamethason zeigte bis zu einer Konzentration von 10-6 M zwar eine signifikante, aber geringere Inhibition des Sauerstoffverbrauchs. Erst ab einer Konzentration > 10-6 M wurde der Hemmeffekt von Dexamethason im Vergleich zu den topischen Glucocorticoiden größer. Das Verhältnis zwischen Hydroxyl- und Estergruppen ist entscheidend für die lipophilen Eigenschaften von Steroiden. Dabei übt die Veresterung der Seitenketten einen positiven Effekt auf die Lipophilität aus, während die Hydroxylierungen die Lipophilität herabsetzen. Während alle drei Glucocorticoide an Position 11ß eine OH-Gruppe besitzen, ist Dexamethason zusätzlich an den Positionen 17α und 21 hydroxyliert und an keinem C-Atom verestert. Ponec et al. konnten an humanen epidermalen Keratinozyten zeigen, dass die Hydroxylierung an allen drei Positionen zu einer Herabsetzung der lipophilen Eigenschaften der Glucocorticoide führt (Ponec et a. 1986). Aufgrund der damit geringeren Lipophilie von Dexamethason im Vergleich zu den topischen Glucocorticoiden wäre eine ausreichende Sättigung der Diffusionskapazität biologischer Membranen erst ab einer Konzentration von 10-5 M erreicht (siehe Abb. 40). Um unspezifisch nichtgenomische Effekte über die Membran zu bewirken, wäre die Anreicherung in Membranen bei sehr hohen Konzentrationen erforderlich.


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Sättigung der Bindungskapazität des Glucocorticoidrezeptors und spezifisch nichtgenomisch vermittelte Effekte.

Sind für den Effekt auf den Sauerstoffverbrauch auch schnelle, transkriptionsunabhängige Effekte via cGRα mitverantwortlich? Ausgehend davon, dass ab einem Prednisolonäquivalent von 250 mg alle Glucocorticoidrezeptoren besetzt sind, stellen zusätzliche direkte Interaktionen der Glucocorticoide mit zellulären Membranen bei hohen Konzentrationen die Hauptursache für die Hemmung des Sauerstoffverbrauchs dar. Für mittlere Konzentrationen < 10-6 M, die ebenfalls eine signifikante Hemmung des Sauerstoffverbrauchs zeigten, muss aber ein glucocorticoidrezeptorabhängiger Mechanismus über zytosolische oder mögliche membranständige GR mitdiskutiert werden. Erste Hinweise auf nichtgenomische, cGR-vermittelte Effekte kamen aus Zellkulturexperimenten. Kurze Inkubationen mit Glucocorticoiden für Minuten führten zu einer schnellen Polymerisation und Stabilisierung des Aktin-Zytoskeletts von humanen Endometriumzellen (Koukouritaki et al. 1997). Dieser Prozess war nicht proteinsynthese-abhängig aber eine schnelle Aktivierung von Proteinkinasen war an diesen Effekten beteiligt. Croxtall et al. konnten zeigen, dass die schnelle Modulation der zytokin-stimulierten Arachidonsäure-Produktion durch Dexamethason MAPK- und cPLA2-abhängig war (Croxtall et al. 2000). Dieser Effekt trat innerhalb von Minuten ein und war durch RU486, nicht aber durch Proteinsyntheseinhibitoren blockbar. In einer weiterführenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Beclomethason-vermittelte Effekte auf die Hemmung der COX2-Expression von A549 Zellen durch Geldanamycin (bindet selektiv an HSP90 des cGR und verhindert die Translokation des Steroid-Ligand-Komplexes in den Zellkern), nicht aber durch PP2, einen src-Inhibitor, blockbar waren (Croxtall et al. 2002). Die Effekte von Dexamethason auf die COX2-Expression waren in der gleichen Studie ebenfalls durch Geldanamycin und NF-κB, nicht aber durch PP2 blockbar, während die Effekte auf die cPLA2 Aktivität durch PP2 hemmbar war, durch Geldanamycin und NF-κB aber unbeeinflusst blieb. Diese Ergebnisse ließen vermuten, dass Beclomethason cGR- und proteinsynthese-abhängige Mechanismen beeinflusst, während Dexamethason über den cGR sowohl transkriptionsabhängig als auch transkriptionsunabhängig agieren kann.

In den Experimenten zum Energiestoffwechsel ist analog zur obigen Aussage der durch sehr hohe Konzentrationen von Dexamethason (10-5 M bis 10-4 M) nach Sekunden ausgelöste Effekt am ehesten als unspezifisch nichtgenomisch zu definieren. Es erfolgt eine Interkalierung in Zellmembranen und eine daraus folgende direkte Wechselwirkungen mit physikochemischen Eigenschaften der Membransysteme. Für die bereits signifikanten Effekte bei Konzentrationen [Seite 84↓]ab 10-6 M und kleiner ist aber noch nicht von einer kompletten Rezeptorauslastung auszugehen. In diesen Konzentrationsbereichen ist noch kein zusätzlicher, signifikanter, unspezifisch nichtgenomischer Effekt zu erwarten. Daraus kann geschlussfolgert werden, dass die Signaltransduktion über schnelle Signalkaskaden nach Bindung an den zytosolischen und/oder membranständigen Glucocorticoidrezeptor für die schnellen Effekte von Dexamethason in Konzentrationsbereichen von 10-10 M bis 10-6 M mitverantwortlich sind.

Für die topischen Glucocorticoide könnte diese Hypothese auf den gesamten Konzentrationsbereich von 10-10 M bis 10-4 M übertragen werden. Wenn man davon ausgeht, dass die deutlichen und signifikanten Effekte ab 10-10 M schnelle, über den cGR vermittelte Effekte darstellen, ist der deutlichere Hemmeffekt durch die stärkere Bindungsaffinität der topischen Glucocorticoide im Vergleich zu Dexamethason zum cGR erklärbar. Da keine weitere Wirkungssteigerung bei zunehmender Konzentration zu sehen war, könnte bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen eine vollständige Rezeptorauslastung erreicht worden sein. Zu berücksichtigen sind aber die ausgeprägteren lipophilen Eigenschaften der topischen Glucocorticoide und die dadurch bessere Fähigkeit zur Interkalierung in Membranen. Wäre bei einer Konzentration von 10-10 M bereits eine vollständige Rezeptorauslastung erreicht, müsste man bereits hier einen zusätzlichen, unspezifisch nichtgenomischen Effekt sehen, der stärker wäre als der gezeigte Effekt bei sehr hohen Dexamethason-Konzentrationen. Denkbar wäre aber auch, dass auch bei der höchsten eingesetzten Konzentration das Steroid-Rezeptor-Sättigungsgleichgewicht für die topischen Glucocorticoide noch nicht erreicht ist. Dagegen spricht aber die um ein Vielfaches stärkere Bindungsaffinität der topischen Glucocorticoide gegenüber Dexamethason (Ponec et al. 1986, Wolff et al. 1978). Ob schnelle Signalkaskaden via zytosolischen Glucocorticoidrezeptor an den Effekten der Glucocorticoide auf den Sauerstoffverbrauch beteiligt sind, wird derzeit durch den Einsatz des spezifischen Glucocorticoidrezeptorinhibitors RU486 in weiterführenden Experimenten untersucht. Wäre der cGR an den schnellen Glucocorticoideffekten beteiligt, müssten diese Effekte durch RU486 antagonisierbar sein.

Reflektieren die beobachteten Effekte direkte Wirkungen an Membranen oder sekundäre Effekte infolge verminderter ATP-Synthese? Buttgereit et al. konnten an Con A-stimulierten Thymozyten zeigen, dass die Hemmung des Protonentransports über biologische Membranen durch Glucocorticoide nicht als Folge einer Hemmung der ATP-Synthese, sondern durch direkte Interaktionen mit den Membranen und membranassoziierten Proteinen erfolgt ([Seite 85↓] Buttgereit et al. 1997). Der Sauerstoffverbrauch, der durch die Na+/K+-ATPase und Ca2+-ATPase entsteht, konnte in in vitro Experimenten durch verschiedene Glucocorticoide gehemmt werden. Der Sauerstoffverbrauch durch die Proteinbiosynthese blieb dabei unbeeinflusst. Die Hemmung des Energiestoffwechsels durch Glucocorticoide kommt primär durch die Beeinflussung der Kationenpumpen zustande. In in vitro Experimenten an Rattenthymozyten wurde gezeigt, dass Methylprednisolon die intrazelluläre Ca2+-Konzentration reduziert. In diesen Experimenten und in Experimenten an humanen Lymphozyten konnte gezeigt werden, dass die Reduktion des intrazellulären Ca2+ nicht durch einen Aktivitätsanstieg der ATPase verursacht wurde, sondern durch eine direkte Blockierung der Ionenpermeabilität durch Glucocorticoide bedingt war. Die ATP-Reduzierung würde demnach aus einem verminderten Energiebedarf resultieren. Dies bedeutet, dass Glucocorticoide zu einem gewissen Anteil die mitochondriale oxidative Phosphorylierung direkt hemmen und das Protonenleak über die Membran verstärken. Auch hierdurch resultiert eine Reduzierung der zellulären ATP-Synthese (Buttgereit et al. 1994).

Die Effekte der topischen Glucocorticoide und Dexamethason auf den Sauerstoffverbrauch treten sofort ein und sind bereits nach wenigen Sekunden bis Minuten maximal. Sie erfolgen somit transkriptionsunabhängig und werden über physikochemische Wechselwirkungen des Glucocorticoidmoleküls mit der Zell- und mitochondrialen Membran vermittelt. Durch die Interkalierung in die Membranen kommt es zu einer Änderung des transmembranären elektrischen Potentials und damit zu einer Modulation der Kationenpermeabilität. Diese membranstabilisierende Wirkung von Glucocorticoiden konnte in verschiedenen Arbeiten an verschiedenen Zellsystemen bewiesen werden (Lamche et al. 1990, Hall et al. 1994).

Hemmen Glucocorticoide Prozesse, die in frühen Aktivierungsschritten von Lymphozyten involviert sind? Dexamethason verhinderte die Stimulation durch Con A konzentrationsabhängig und Beclomethason konzentrationsunabhängig, während Clobetasol keinen Einfluss zeigte (siehe 3.1.4). Einige der zeitigsten Ereignisse nach einer mitogenen Stimulation stellen die Beeinflussung des transmembranären Ionentransports (K+- und H+-Efflux, Na+- und Ca2+-Influx) und die Hydrolyse von Inositol-4,5-bisphosphat (mobilisiert intrazelluläres Ca2+) und Diacylglycerol (aktiviert PKC) innerhalb von Minuten dar. Buttgereit et al. konnten an Rattenthymozyten zeigen, dass auch Methylprednisolon zu einer konzentrationsabhängigen Inhibition der Stimulierbarkeit führte (Buttgereit et al. 1993). Er wies nach, dass Methylprednisolon dabei den Ca2+-Influx nach Con A-Stimulation inhibiert. Es ist wahrscheinlich, dass dieser Vorgang auch für die Effekte von Dexamethason und Beclomethason auf die Stimulierbarkeit in den vorliegenden Experimenten mitverantwortlich ist.


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Cytochrom c-Oxidase-Bindung und direkte Beeinflussung der oxidativen Phosphorylierung.

Glucocorticoide können direkt zu einer Beeinflussung der oxidativen Phosphorylierung führen (Simon et al. 1998, Bennett et al. 1996). Bennett et al. fanden, dass niedrige Glucocorticoidkonzentrationen in Ratten die Aktivität der Cytochrom c-Oxidase reduzieren. Um die Effekte der Glucocorticoide im Vergleich zu Myxothiazol, einem reinem Atmungskettenhemmstoff, zu bewerten, wurden zwei Konzentrationen, bei denen der Sauerstoffverbrauch zu 25 % (IC 25) und zu 50 % (IC 50) gehemmt wurde, ausgewählt. In den Experimenten konnte gezeigt werden, dass der stärkste erreichte Hemmeffekt der Glucocorticoide durch Dexamethason bei der höchsten eingesetzten Konzentration von 10-4 M nicht den Hemmeffekt der IC 25 von Myxothiazol erreicht und weit unter dem Hemmeffekt der IC 50 von Myxothiazol bleibt. Damit ist unwahrscheinlich, dass die Effekte der Glucocorticoide auf den Sauerstoffverbrauch maßgeblich durch eine direkte Bindung in der mitochondrialen Atmungskette bedingt sind.

Abbildung 40 fasst die Ergebnisse aller drei Glucocorticoide zusammen. Es wurde die verbleibende Atmung nach Zugabe des Glucocorticoids als prozentuale Abweichung vom Sauerstoffverbrauch stimulierter Zellen in % angegeben. Myxothiazol wurde in den Konzentrationen angegeben, bei denen eine 25%ige (IC25) bzw. 50%ige (IC50) Inhibition des Sauerstoffverbrauchs mitogen stimulierter humaner PBMC gefunden wurde.


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Abb. 40: Einfluss verschiedenerKonzentrationen von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf den Sauerstoffverbrauch in Con A-stimulierten humanen PBMC. Angegeben sind der Mittelwert und der S.E.M.
* signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).

4.2.2 Genomischer Mechanismus

Messung der IL-6-Synthese mittels nichtkompetitivem ELISA und IL-6-Synthese von PBMC.

Erkrankungen, bei denen Glucocorticoide therapeutisch zum Einsatz kommen, zeichnen sich durch eine starke Expression von proinflammatorischen Regulatorproteinen aus. Da sich die therapeutische Wirkung der Glucocorticoide oft erst nach Stunden bis Tagen zeigt, geht man davon aus, dass sie über den cGR vermittelt ist und eine de novo-Synthese von Proteinen voraussetzt. Das konnte in zahlreichen Untersuchungen in vivo und in vitro bestätigt werden (Barnes 1998).


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In der vorliegenden Arbeit wurden die genomischen Glucocorticoidwirkungen auf die IL-6-Synthese ruhender und stimulierter PBMC untersucht, weil IL-6 als ein essentielles und multifunktionales Zytokin viele Aspekte der Immunantwort und der Akut-Phase-Reaktion von Entzündungen reguliert. In vitro und in vivo agiert IL-6 u.a. als Differenzierungsfaktor für B-Lymphozyten und als Aktivierungsfaktor für T-Lymphozyten. In vitro konnten Effekte auf die Differenzierung hämatopoetischer Vorläuferzellen gezeigt werden (Ogawa 1993, Peters et al. 1998). IL-6 ist ein potenter Wachstumsfaktor für humane Myelomzellen. Masera et al. konnte die Erhöhung der Dichte von Glucocorticoidrezeptoren in zwei humanen osteoblastenähnlichen Zelllinien, Saos-2 und MG-63, durch IL-6 zeigen (Masera et al. 2000). Erhöhte Serum- oder Plasmakonzentrationen von IL-6 können bei verschiedenen Erkrankungen wie Sepsis (Steinmetz et al. 1995), autoimmunologischen Erkrankungen (Giacomelli et al. 1996), Lymphomen, AIDS, alkoholbedingten Lebererkrankungen, bei Patienten mit Infektionen (Buck 1994) oder während Abstoßungsreaktionen von Transplantaten (Hummel et al. 1994) auftreten.

Bei der IL-6-Produktion ruhender PBMC handelt es sich um eine sehr niedrige „Hintergrund“-Synthese. In unseren Experimenten betrug die basale IL-6-Synthese ruhender PBMC 9,26 ± 2,53 pg/ml. Sie war durch keines der eingesetzten Glucocorticoide weiter zu hemmen. Die basale IL-6-Synthese war durch die Mitogene PHA und Con A auf 2494,5 ± 496,9 pg/ml/106 Zellen bzw. 3434,1 ± 818,3 pg/ml/106 Zellen stimulierbar. Diese Ergebnisse korrelierten gut mit anderen Untersuchungen (Buttgereit et al. 1995).

In der vorliegenden Arbeit wurde als wesentlicher Unterschied zu Dexamethason festgestellt, dass die topischen Glucocorticoide bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen von 10-10 M die IL-6-Produktion mitogen stimulierter PBMC deutlich und signifikant hemmen. Im Gegensatz zu Dexamethason ist die Hemmung der IL-6-Produktion durch topische Glucocorticoide konzentrationsunabhängig. Sie zeigten also im Hinblick auf die Zytokinproduktion mitogen stimulierter Zellen bei sehr niedrigen Konzentrationen eine deutlich stärkere genomische Potenz. Bei sehr hohen Konzentrationen waren die topischen Glucocorticoide und Dexamethason in ihrer genomischen Potenz annähernd gleich. Die beiden topischen Glucocorticoide unterschieden sich dabei in ihrer genomischen Potenz kaum.


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Bindungsaffinität zum humanen Glucocorticoidrezeptor α und Lipophilität.

Die beiden topischen Glucocorticoide Clobetasol and Beclomethason besitzen eine um ein Vielfaches höhere Rezeptorbindungsaffinität zum cGRα im Vergleich zu Dexamethason. Entscheidend hierfür ist die Veresterung an Position 17α von Clobetasol und Beclomethason. Während es durch die Einführung einer Ester-Gruppe an Position 21 bereits zu einem Anstieg der Bindungsaffinität kommt, führt erst die Veresterung an Position 17α zu der beobachteten signifikanten Erhöhung der Bindungsaffinität (Pörtner et al. 1988). Wie Hammer et al. mit Hilfe eines molekularen GR-Ligandbindungsdomänen-Modells an einer GR-transfizierten COS-7-Zelllinie zeigen konnten, besitzt die Ligandbindungsdomäne des GRα eine sterische Kavität im Bereich von Position 17 des Steroidmoleküls. 17α-Ester können unter der Bildung von van der Waals-Bindungskräften diese Kavität in einer für sie energetisch günstigen Konformation einnehmen und mit den Aminosäuren des Rezeptors interagieren. Das erklärt die hohe Bindungsaffinität (Hammer et al. 2003).

Beclomethason zeigte wie Clobetasol bereits bei sehr geringen Konzentrationen von 10-10 M und 10-8 M eine signifikante Hemmung der IL-6-Synthese humaner PBMC, erreicht aber nicht den Hemmeffekt von Clobetasol. Beclomethason ist neben der veresterung an Position 17α zusätzlich an Position 21 verestert. Wie Hammer et al. zeigten, interagiert die gesteigerte Lipophilie von 17,21-Doppelestern mit dem sich daraus ergebenden negativen sterischen Effekt. In der sterischen Nähe von Position 21 ist die Größe der Ligandbindungsdomäne wesentlich restriktiver gestaltet und besitzt nicht eine von Position 17 vergleichbare Kavität. Um sich an den GRα binden zu können, sind 21-Ester gezwungen, eine energetisch ungünstigere Konformation einzunehmen, die ihre geringere Bindungsaffinität erklärt. 17,21-Doppelester verbinden die Bindungseigenschaften von 17- und von 21-Estern. Die Bindungsaffinität wird dabei maßgeblich von der Länge der Substituenten bestimmt. Aus der zunehmenden Länge der Estergruppe resultiert eine Abnahme der Rezeptorbindungsaffinität. Lipophilie und Rezeptorbindungsaffinität können somit nicht uneingeschränkt in Beziehung gesetzt werden. Würthwein et al. zeigten, dass die relative Bindungsaffinität des 17,21-Esters durch die Veresterung an Position 21 niedriger als die von Dexamethason war (Würthwein et al. 1990). Diese Aussage widerspricht jedoch den in der vorliegenden Arbeit und von Hammer et al. gefundenen Wirkstärken für Beclomethason und Dexamethason.


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In mitogen-stimulierten PBMC hemmte Dexamethason die IL-6-Synthese deutlich in Abhängigkeit von der Konzentration, wobei eine signifikante Hemmung erst ab einer Konzentration von 10-8 M und höher erreicht wurde. Unter Beachtung der fehlenden Estergruppe an Position 17α konnten Ponec et al. zeigen, dass die Einführung von Hydroxylgruppen an den Positionen 11, 17α und/oder 21 zu einer veränderten Bindungsaffinität führt (Ponec et al. 1986). Während der OH-Substituent an den Positionen 11 (Clobetasol, Beclomethason und Dexamethason) und 21 (nur Dexamethason) eine erhöhte Bindungsaffinität zur Folge hat, führt die Substituierung an Position 17α (nur Dexamethason) zu einer Erniedrigung der Bindungsaffinität. Bei Steroiden, die bereits OH-Substituenten an Position 11 und 21 besaßen, konnte durch die Hydroxylierung an Position 17α eine leichte Zunahme der resultierenden Bindungsaffinität beobachtet werden (nur Dexamethason). Die Einführung eines OH-Subsituenten an den Positionen 11, 17 oder 21 führte aber immer zu einer Herabsetzung der Lipophilie des Glucocorticoids.

Die in der vorliegenden Arbeit gefundenen Wirkstärken stimmen weitestgehend mit den Ergebnissen ähnlicher Arbeiten überein. Seeto et al. untersuchten die relative Potenz von Beclomethason-Estern auf die IL-5-Produktion humaner PBMC (Seeto et al. 2000). Dabei fanden sie analog zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit, dass Beclomethason in einem niedrigen Konzentrationsbereich von 10-9 bis 10-14 M die IL-5-Synthese signifikant und konzentationsunabhängig um etwa 80 % hemmt. Dexamethason zeigte in diesen Experimenten in der sehr niedrigen Konzentration von 10-10 M keinen Effekt auf die IL-5-Synthese humaner PBMC. Erst ab einer Konzentration von 10-8 M und höher kam es zu einer konzentrationsabhängigen Hemmung der Interleukin-Synthese, analog zu den Ergebnissen dieser Arbeitzeigten Chen et al., dass in Maus-Wildtyp-GR Dexamethasonkonzentrationen von 10-7 M nötig waren, um alle Wildtyp-GR-Moleküle vollständig zu besetzen (Chen et al. 1994).

Rezeptorvermittelte und transkriptionsabhängige Signaltransduktion.

Die Zeit, bis alle drei Glucocorticoide ihre volle Wirkung entfalteten, betrug mehrere Stunden. Während dieser Zeit diffundiert das Glucocorticoid durch die Zellmembran und bindet an den zytosolischen Glucocorticoidrezeptor. Das führt zu einer Konformationsänderung des Steroid-Rezeptorkomplexes und Abspaltung verschiedener Proteine sowie zu einer Affinitätserhöhung für DNA in den DNA-Bindungsdomänen des Steroid-Rezeptorkomplexes. Schließlich kann der aktivierte Steroid-Rezeptorkomplex in den Zellkern translozieren und die Transkription von [Seite 91↓]Genen in mRNA beeinflussen. Das endet in der Translation von Proteinmolekülen, die ihre biologische Wirkung entfalten können (Beato et al. 1996). Die Beeinflussung der Zytokinproduktion durch Glucocorticoide ist demnach ein rezeptorvermittelter und transkriptionsabhängiger Weg. Der zeitbestimmende Schritt sind hier die Transkription und Translation, also die de novo-Synthese von Proteinen. Schnelle Signaltransduktionswege, wie sie bei der Glucocorticoidwirkung auf den Energiestoffwechsel zu diskutieren sind, spielen bei den Effekten auf die Interleukinsynthese wahrscheinlich keine oder eine nur untergeordnete Rolle.

Man geht davon aus, dass Glucocorticoidrezeptoren die Transkription von Genen auf zwei verschiedenen Ebenen kontrollieren. Sie wirken teilweise über direkte Bindung des aktivierten GR-Homodimers in der GRE spezifischer Gene, die eine GRα-Bindungsstelle in ihrer Promoterregion haben. Außerdem kommt es zu einer Induktion antiinflammatorischer Gene, z.B. von Lipocortin-1 (Sudlow et al. 1996), IL1-Rezeptorantagonist (Levine SJ et al. 1996) oder IκBα (Adcock et al 2001).

Es wird aber auch eine Beeinflussung von Genen beschrieben, bei denen keine GRα-Bindungsstelle in ihrer Promoterregion nachgewiesen werden konnte. Wahrscheinlich modulieren Glucocorticoide die Aktivität anderer Transkriptionsfaktoren hauptsächlich unabhängig von einer direkten DNA-Bindung und wirken dabei v.a. repressiv auf spezifische Gene, z.B. proinflammatorischer Zytokine (Barnes 1998). Direkte Protein-Protein-Interaktionen werden für das p65 von NF-κB (Ito et al. 2000), AP-1 und STAT´s wie STAT3, STAT5, STAT6 (Karin 1998) diskutiert. Glucocorticoide modulieren dabei die Bindung und/oder Aktivierung dieser Transkriptionsfaktoren und modifizieren so die Bildung inflammatorischer Zytokine. Diese Interaktionen mit anderen Transkriptionsfaktoren treten in vitro relativ spät nach der Bildung des Prä-Initiationskomplexes ein (Herrlich 2001, Nissen et al 2000). Dazu werden hohe Glucocorticoidkonzentrationen benötigt (Boumpas 1996). Daher kann vermutet werden, dass auch nichtgenomische Mechanismen an der direkten Glucocorticoid- Transkriptionsfaktor-Interaktion beteiligt sind. Nicht zuletzt bewirken Glucocorticoide eine posttranskriptionelle Beeinflussung über eine Modifizierung der mRNA-Stabilität, Translation und Sekretion (Almawi et al. 2001).

Abbildung 41 gibt einen zusammenfassenden Überblick über die unterschiedlichen Wirkstärken der Glucocorticoide. Die verbleibende IL-6-Synthese der PBMC wurde als prozentuale Abweichung von der IL-6-Synthese PHA-stimulierter Zellen ohne Glucocorticoidzugabe in % angegeben. Myxothiazol wurde analog zu den Untersuchungen des Sauerstoffverbrauchs in den Konzentrationen IC25 und IC50 mitgeführt (siehe 3.1.2 und 3.1.3). Im Unterschied zu den [Seite 92↓]Untersuchungen zum Sauerstoffverbrauch wurde in diesen Konzentrationsbereichen keine Konzentrationsabhängigkeit von Myxothiazol gefunden. Diese Tatsache könnte dafür sprechen, dass es bei eingeschränkter Energiebereitstellung (Hemmung der ATP-Bereitstsellung durch Hemmung der oxidativen Phosphorylierung mittels Myxothiazol und der Glykolyse durch glukosefreies Medium) zu einer hierarchisch organisierten Abschaltung bestimmter zellulärer Funktionen unabhängig von der Konzentration kommt.

Abb. 41: Einfluss verschiedener Konzentrationen von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf die IL-6-Synthese PHA-stimulierter humaner PBMC. Angegeben sind der Mittelwert und der S.E.M. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).


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4.2.3  Apoptose als komplexer, trimodular vermittelter Prozess

Transkriptionsabhängiger Mechanismus via cGRα (Modul I)

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, das sowohl Dexamethason als auch die eingesetzten topischen Glucocorticoidein Abhängigkeit von der Konzentration Apoptose induzieren. Im Bereich niedriger Konzentrationen kam es zu einem Anstieg apoptotischer Zellen, der im Bereich mittlerer Konzentrationen signifikant wurde. Bei diesen Konzentrationen unterschieden sich die Wirkungen der topischen Glucocorticoide Dexamethason kaum. Bei sehr hohen Konzentrationen kam es zu einem deutlichen Anstieg des Anteils apoptotischer Zellen. Die topischen Glucocorticoide zeigten bei einer Konzentration von 10-5 M einen tendenziell deutlicheren Effekt auf die Apoptoseinduktion im Vergleich zu Dexamethason. In einer Konzentration von 10-4 M stieg der Anteil apoptotischer Zellen durch die Zugabe der topischen Glucocorticoide signifikant stärker im Vergleich zu Dexamethason. Die beiden topischen Glucocorticoide Clobetasol und Beclomethason unterschieden sich in ihrer Wirkstärke kaum.

Die glucocorticoid-induzierte Apoptose wird zu einem wesentlichen Teil über rezeptor- und kernabhängige Mechanismen ausgelöst (Reichardt et al. 2000, Barnes 1998). Das gegenwärtige Modell der genomisch vermittelten Apoptose geht von einem mehrsträngigen Prozess aus (Distelhorst 2002). Diskutiert wird zum einen die Repression von Genen, die für die Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase benötigt werden. Sie soll über eine Hemmung von Transkriptionsfaktoren wie AP-1 (fos/jun) oder NFκB erfolgen. Andererseits könnte die Transkription von Genen initiiert werden, die direkt für die Induktion von Apoptose fungieren. Distelhorst et al. fanden, dass für die glucocorticoid-induzierte Apoptose über eine Calcium-abhängige Signalkaskade zwei Gene involviert sein könnten, die für einen ATP-abhängigen Kationenkanal (P2X1 Rezeptor) und einen IP3-Rezeptor kodieren (Distelhorst et al. 1998). Kroemer et al. konnten zeigen, dass Apoptose durch Blockade der mRNA- und Proteinsynthese hemmbar ist, was die Annahme eines genomisch vermittelten Mechanismus unterstützt (Kroemer et al. 1997).

Berücksichtigt man, dass die glucocorticoid-induzierte Apoptose ein hauptsächlich genomisch vermittelter Prozess ist, sind für den signifikant deutlicheren Apoptose-induzierenden Effekt der topischen Glucocorticoide im Vergleich zu Dexamethason grundsätzlich dieselben strukturellen Ähnlichkeiten verantwortlich zu machen, wie sie bereits bei den Effekten auf die IL-6-Synthese [Seite 94↓]diskutiert wurden. Wenn die Bildung des Steroid-Rezeptor-Komplexes den Initiationsschritt für die genomisch vermittelte Apoptose darstellt, bildet die Veresterung des C-Atoms der topischen Glucocorticoide an Position 17α die entscheidende Voraussetzung für eine effektive Bindungsfähigkeit an die Ligandbindungsdomäne des cGRα unter energetisch günstigen Bedingungen.

Die Eigenschaft verschiedener Glucocorticoide, die Transaktivierung, NF-κB-Transrepression und Apoptose unterschiedlich zu beeinflussen, wurde durch Hofmann et al. für sieben Glucocorticoide beschrieben (Hofmann et al. 1998). Es wurden auch Dexamethason und Clobetasol untersucht, allerdings nur in Konzentrationen von 10-6 M und 10-7 M. Die Effekte höherer Konzentrationen blieben unberücksichtigt. Dabei wurden sehr unterschiedliche Wirksamkeiten der einzelnen Glucocorticoide gefunden. Prednisolon und Hydrocortison waren deutlich weniger effektiv, Apoptose in CEM-C7 Zellen zu induzieren als Dexamethason und Clobetasol. Die Autoren begründeten diese Tatsache mit der strukturellen Ähnlichkeit der Glucocorticoide an Position 16 und 17, ohne auf die genauen strukturellen Unterschiede der Substituenten einzugehen. Zhang et al. fanden für Beclomethason und Dexamethason mit den Ergebnissen dieser Arbeit vergleichbare Potenzen in humanen Eosinophilen (Zhang et al. 2000).

Transkriptionsunabhängige Mechanismen

In der vorliegenden Arbeit konnte eine deutliche glucocorticoid-induzierte Apoptose nach einer Inkubationszeit von 16 Stunden nachgewiesen werden. Es ist somit davon auszugehen, dass Apoptose im Wesentlichen ein transkriptions- und translationsabhängiger Prozess ist. Verschiedene Arbeiten konnten die Hemmung von glucocorticoid-induzierter Apoptose nach Zugabe von Inhibitoren der Transkription und Proteinsynthese zeigen (Helmberg et al. 1995, Hulkko et al. 2000). Apoptose stellt zumindest sekundär einen streng genomisch abhängigen Prozess dar. Aufgrund der Kinetik der lymphozytären Apoptose und der Effektivität hoher Glucocorticoiddosen insbesondere bei akuten Exazerbationen autoimmunologischer Erkrankungen wird jedoch geschlussfolgert, dass auch nichtgenomische Mechanismen für die Induktion von Apoptose mitverantwortlich sein können (Schmidt et al. 2000, Reichardt et al. 1998). Zusätzlich gibt es Hinweise für schnelle, cGR vermittelte, aber transkriptionsunabhängige Mechanismen, die zu Apoptose führen können (Marchetti et al. 2003, Cifone et al. 1999).


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Apoptose in Abhängigkeit vom zellulären ATP-Angebot und unspezifisch membranvermittelte Effekte (Modul III)

Können direkte Membranwirkungen der Glucocorticoide für die Induktion von Apoptose mitverantwortlich sein?Bereits Buttgereit et al. vermuteten, dass ein direkter, unspezifischer Glucocorticoideffekt an der inneren Mitochondrienmembran zumindest bei hohen Konzentrationen für den Verlust des Membranpotentials mit Anstieg der Protonenpermeabilität und der daraus resultierenden Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung verantwortlich sein könnte (Buttgereit et al. 1997). Die dadurch bedingte Verringerung des zellulären ATP-Angebots wird im Frühstadium der Apoptose, noch vor der DNA-Fragmentation beobachtet. Buttgereit et al. konnten ebenfalls nachweisen, dass unspezifisch nichtgenomische Mechanismen eine bedeutende Rolle bei der Modulation des Ca2+-Transports über Zellmembranen und Veränderung des intrazellulären Ca2+ spielten (Buttgereit et al. 1999). Diem et al. wiesen darauf aufbauend an retinalen Ganglionzellen von Ratten nach, dass der Ca2+-Influx funktionell relevant für die glucocorticoid-induzierte Hemmung der MAPK-Phosphorylierung im Prozess der Apoptosesignaltransduktion ist (Diem et al. 2003). Auch andere Arbeitsgruppen vermuteten, dass diese Vorgänge durch die Interaktion der Glucocorticoide mit zellulären Membranen und Beeinflussung derer physikochemischen Eigenschaften hervorgerufen werden (Gold et al. 2001, Leussink et al. 2001).

Mitochondrien als ein zentraler Wirkort von Glucocorticoiden.

Unter physiologischen Bedingungen akkumulieren lipophile Kationen in der Mitochondrienmatrix entlang dem elektrochemischen Gradienten entsprechend der Nernst´schen Gleichung. Während der Apoptose kommt es zu einer verminderten Retention dieser Kationen in der Mitochondrienmatrix und in der Folge zu einer Störung des mitochondrialen Membranpotentials. Aufgrund der gestörten Integrität der äußeren Mitochondrienmembran können mitochondriale Intermembranproteine, wie z.B. Cytochrom c, AIF oder Procaspasen 2, 3 und 9 austreten (Dallaporta et al. 1999, Marchetti P et al. 1996). Es ist davon auszugehen, dass die direkte Interaktion von Glucocorticoiden mit biologischen Membranen und die Beeinflussung des Kationentransports über die Membranen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von Apoptose spielen.


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Aufrechterhaltung der Zellhomöostase und Apoptose – zwei energieverbrauchende Prozesse.

Die Wahl zwischen Apoptose und Nekrose erfolgt u.a. in Abhängigkeit vom zellulären ATP-Angebot. Ist ausreichend Energie in Form von ATP vorhanden, können Zellen die geordnete energieabhängige Signalkaskade der Apoptose nutzen. Steht der Zelle hingegen ATP nicht in ausreichendem Maß zur Verfügung, erfolgt Nekrose, ein passiver Vorgang der Zelldegradation (Leist 1997). Mindestens zwei Prozesse der frühen Apoptose sind aktive, energieverbrauchende Prozesse und damit ATP-abhängig. Dazu gehören die Expression von Phosphatidylserin an der Zelloberfläche. Zum anderen ist die Kernkondensation und die Aufspaltung der DNA in Fragmente definierter Längeenergieverbrauchend. Dieser Vorgang wird durch die ATP-abhängige Translokation von Caspasen in den Zellkern initiiert. Glucocorticoide senken das mitochondriale Membranpotential und vermindern folglich das zelluläre ATP-Angebot.

Die Arbeit zeigte, dass Myxothiazol als ein spezifischer Hemmstoff der mitochondrialen Atmungskette primär über die Reduktion zellulären ATPs zu einer Apoptoseinduktion führt. Myxothiazol induzierte in den Konzentrationen IC25 und IC50 (analog zu den Experimenten des zellulären Sauerstoffverbrauchs) Apoptose. Interessanterweise führte eine verstärkte Hemmung der Atmungskette (50%ige Hemmung des Sauerstoffverbrauchs) nicht zu einer erhöhten Apoptoserate. Dieser Umstand erklärt sich dadurch, dass sowohl die Initiation als auch verschiedene Effektorprozesse im Verlauf der Apoptose energieverbrauchende Prozesse darstellen. So scheint initial die Störung der Zell- und Mitochondrienhomöostase durch Hemmung der mitochondrialen Atmungskette ein wesentlicher Auslösemechanismus für Apoptose zu sein. Die eingeschränkte Bereitstellung von Energie in Form von ATP limitiert aber diesen energieverbrauchenden Prozess. Das heißt, der Notwendigkeit der Zelle, einen programmierten Zelltod auszulösen, steht die eingeschränkte Möglichkeit durch ein reduziertes Energieangebot gegenüber.

Die Apoptoseinduktion durch hohe Glucocorticoidkonzentrationen scheint ein wichtiger Mechanismus immunkompetenter Zellen zu sein und zur Effizienz der immunsuppressiven Effekte hochdosierter Glucocorticoidtherapien beizutragen (Schmidt et al. 2000). In in vivo Experimenten untersuchten Migita et al. die Effekte hochdosierter Methylprednisolon-Infusionen auf die Induktion von Apoptose in T-Lymphozyten bei Patienten mit schweren autoimmunologischen Erkrankungen (Migita et al. 1997). Dabei konnte gezeigt werden, dass die Apoptoseinduktion in CD4+-Zellen stärker war als in CD8+-Zellen.


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Apoptose via spezifischer mGR (Modul II)

Spezifische, membranständige Rezeptoren für Glucocorticoide auf humanen Zellen wurden erstmals von Gametchu et al. auf einer humanen leukämischen Zelllinie und von Bartholome et al. auf humanen PBMC unter physiologischen Bedingungen nachgewiesen (Gametchu et al. 1993, Bartholome et al 2004). Gametchu et al. äußerten frühzeitig den Verdacht, dass membranständige Glucocorticoidrezeptoren für die Induktion von Apoptose mitverantwortlich sein könnten. Die Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass die Expression von mGR auf humanen CCRF-CEM-Zellen vom Zellzyklus reguliert ist und eine stärkste Expression in der späten Phase der DNA-Replikation (S) und während der zweiten Wachstumsphase bis hin zum Übergang in die Mitose (G2/M) stattfindet. Des weiteren wies sie nach, dass die Expression von mGR mit der Induktion von Apoptose korreliert (Sackey et al. 1997). Die genauen Mechanismen, die zu einer mGR-induzierten Apoptose führen, sind zum aktuellen Zeitpunkt nicht vollständig aufgeklärt.

Zu welchem Anteil könnte mGR-vermittelte Apoptose an der glucocorticoid-induzierten Apoptose humaner PBMC beteiligt sein? Bartholome et al. konnte zeigen, dass unter physiologischen Bedingungen bis zu 9,2 % der Monozyten und bis zu 12,3 % der B-Lymphozyten, aber keine T-Lymphozyten mGR-positiv waren. Unter Stimulation mit LPS stieg die Anzahl mGR-positiver Monozyten auf durchschnittlich 33,8 % stark an, nicht aber die mGR-Expression der Lymphozytenpopulationen. In den vorliegenden Untersuchungen kann von einem Anteil mGR-vermittelter, nichtgenomischer Mechanismen der glucocorticoid-induzierten Apoptose ausgegangen werden. Unter den gegebenen Versuchsbedingungen lässt sich aber keine eindeutige Aussage über den Anteil dieser nichtgenomisch vermittelten Glucocorticoideffekte im Vergleich zur cGR-vermittelten Apoptose treffen.

Abbildung 42 gibt einen zusammenfassenden Überblick über die unterschiedlichen Wirkstärken der Glucocorticoide und von Myxothiazol. Myxothiazol wurde analog zu den Untersuchungen des Sauerstoffverbrauchs humaner PBMC in den Konzentrationen IC25 und IC50 mitgeführt.


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Abb. 42: Einfluss verschiedenerKonzentrationen von Dexamethason, Clobetasol und Beclomethason sowie Myxothiazol auf die Apoptose humaner PBMC. Angegeben sind der Mittelwert und der S.E.M. * signifikant unterschiedlich zum Kontrollwert (p < 0,05).

4.2.4 Nichtgenomische und genomische Potenzen für Clobetasol und Beclomethason im Vergleich zu Dexamethason und klinische Relevanz

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass neben den gut untersuchten genomischen Mechanismen auch nichtgenomische Mechanismen für die Wirksamkeit topisch angewandter Glucocorticoide verantwortlich sind. Dabei ist hervorzuheben, dass sich die topischen Glucocorticoide hinsichtlich ihrer Effektivität nichtgenomischer und genomischer Effekte deutlich von Dexamethason unterscheiden. Um eine 15%ige Hemmung des Sauerstoffverbrauchs (IC15) Con A-stimulierter PBMC hervorzurufen, bedarf es nur minimaler Konzentrationen der topischen Glucocorticoide (< 10-10 M für Clobetasol und 10-9 M für Beclomethason), während für Dexamethason eine Konzentration von 2x10-6 M benötigt wird, um [Seite 99↓]den gleichen Effekt auszulösen (siehe Tab. 2). Bezüglich der genomisch vermittelten Effekte erreichen Clobetasol und Beclomethason bereits in einer Konzentration < 10-10 M bzw. von
10-10 M einen Effekt (50%ige Hemmung der stimulierten IL-6-Synthese, IC50), für den Dexamethason in einer Konzentration von 3 x 10-8 M erforderlich ist. Diese Äquivalenzdosen lassen aber aufgrund der unterschiedlichen Kinetiken der topischen Glucocorticoide im Vergleich zu Dexamethason nur einen begrenzten Vergleich der Effektivitäten der einzelnen Glucocorticoide zu. Daher war es notwendig, für die topischen Glucocorticoiden eine den einzelnen Konzentrationen zugeordnete relative glucocorticoide Potenz im Vergleich zu Dexamethason zu erstellen. Dabei wurden die in Tabelle 2 aufgeführten Werte auf Dexamethason = 1,0 innerhalb des entsprechenden Konzentrationsbereiches normiert.

Tab. 2: Unspezifisch nichtgenomische und genomische relative glucocorticoide Potenzen der topischen Glucocorticoide, normiert auf Dexamethason = 1,0.

Aus dem Vergleich der nichtgenomischen und genomischen relativen Potenzen der topischen Glucocorticoide und Dexamethason lassen sich einige klinische Beobachtungen erklären. So wird beispielsweise Dexamethason trotz seiner ausgeprägten suppressiven Wirkungen auf den hypothalamisch-hypophysären-adrenalen Regelkreis in sehr hohen Dosen bei Traumen im Bereich des zentralen Nervensystems, die mit der Entwicklung von Ödemen einhergehen, therapeutisch eingesetzt. Die deutlichen nichtgenomisch unspezifischen Effekte in sehr hohen Konzentrationen wirken über einen membranstabilisierenden Effekt und über den Schutz vor [Seite 100↓]Lipidoxidation durch freie Radikale der Entwicklung eines posttraumatischen Hirn- oder Rückenmarködems entgegen. Die beiden topischen Glucocorticoide zeigen ebenfalls deutliche nichtgenomisch unspezifische Wirkungen, die schon bei sehr niedrigen Konzentrationen eine maximale Wirkung zeigen. Beclomethason wird vor allem zur Behandlung des Asthma bronchiale eingesetzt, wo seine unspezifischen Effekte vor allem der Membranstabilisierung dient. Auch Dexamethason kommt bei der Therapie von Atemwegserkrankungen zum Einsatz. Mygind et al. beschrieben aber, dass die Anwendung von Dexamethason in der Behandlung der allergischen Rhinitis mit starken Nebenwirkungen verbunden war, die durch Beclomethason in äquivalenten Dosierungen nicht hervorgerufen wurden. Es waren relativ hohe Dosen von Dexamethason erforderlich, um einen vergleichbaren therapeutischen Effekt hervorzurufen (Mygind et al. 1996). Diese Beobachtung lässt sich mit der in der vorliegenden Arbeit gefundenen nichtgenomischen und genomischen Effektivität der topischen Glucocorticoide gegenüber Dexamethason erklären.

Um Nebenwirkungen der Glucocorticoidtherapie zu minimieren, bedarf es der Optimierung des „drug design“ synthetischer Glucocorticoide. Die Veresterung des C-Atoms an Position 17α, wie es bei den untersuchten topischen Glucocorticoiden der Fall ist, scheint eine Lösung zur Erhöhung der Nutzen-Risiko-Ratio systemisch eingesetzter Glucocorticoide darzustellen. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die repräsentativ ausgewählten topischen Glucocorticoide Clobetasol und Beclomethason sowohl bei nichtgenomisch als auch bei genomisch vermittelten Effekten bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen maximale Effekte erzielten, die durch Dexamethason erst in hohen bis sehr hohen Dosen zu erreichen waren. Für die klinische Anwendung könnte das bedeuten, dass unter Verwendung systemischer Glucocorticoide, deren chemische Struktur in wesentlichen Details an die Struktur topischer Glucocorticoide angelehnt ist, eine bedeutend geringere Dosierungen zum Erreichen des gleichen therapeutischen Effekts mit einem entsprechend geringer ausgeprägten Nebenwirkungungsprofil nötig wäre. Die Apoptose verschiedener Gewebe und Zellen stellt eine häufig auftretende Nebenwirkung von Glucocorticoidtherapien dar. Wie die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, werden maximale nichtgenomische und genomische Effekte durch topische Glucocorticoide bereits bei sehr niedrigen Konzentrationen erreicht, bei denen die Effekte auf die Induktion von Apoptose gering sind und sich von Dexamethason nicht unterscheiden. Durch die Kinetik des lymphozytären Zelltodes nach Zugabe der topischen Glucocorticoide wird durch die Ergebnisse dieser Arbeit ein weiterer Vorteil topischer Glucocorticoide gegenüber Dexamethason deutlich. Bereits mittlere Konzentrationen der topischen Glucocorticoide [Seite 101↓]erreichen annähernd die Wirkstärke sehr hoher Konzentrationen von Dexamethason. In sehr hohen Konzentrationen übertreffen die topischen Glucocorticoide deutlich die apoptose-induzierende Wirkung von Dexamethason. In klinischen Situationen, in denen die Apoptose lymphozytärer Zellen erwünscht ist, beispielsweise bei der Behandlung akuter Exazerbationen autoimmunologischer Erkrankungen, zeigen die topischen Glucocorticoide eine deutlich stärkere Potenz als Dexamethason. Damit wäre ein differenzierterer Einsatz von Glucocorticoiden zur Behandlung akuter Schübe autoimmunologischer Erkrankungen möglich. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass Clobetasol und Beclomethason eine bessere Nutzen-Risko-Ratio zeigten und die chemisch-strukturellen Eigenschaften der topischen Glucocorticoide von Interesse für das drug design systemischer Glucocorticoide und somit von klinischem Nutzen sein können.


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26.04.2005