Aus der Medizinischen Universitätspoliklinik
der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin
Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Die Bedeutung voraktivierter Monozyten
bei ihrer Adhäsion an humane Aorten-, Saphenavenen-, Umbilikalarterien- und Umbilikalvenenendothelzellen
und die Untersuchung der
Superoxidausschüttung
von Endothel und Monozyten
bei Patienten mit arterieller Hypertonie und gesunden Kontrollpersonen im Vergleich

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charité – Universitätsmedizin Berlin

von Gesa Neumann
aus Berlin

Dekan:
Prof. Dr. med. Joachim W. Dudenhausen
Prof. Dr. med. Martin Paul

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. Hermann Haller
2. Prof. Dr. med. Ralph Kettritz
3. PD Dr. med. Yvonne Dörffel

Datum der Promotion: 12. August 2004

Zusammenfassung

Einführung - Periphere Blutmonozyten spielen eine Rolle in der Pathogenese der Arteriosklerose. Liu et al beschrieben signifikant erhöhte Zahlen aktivierter Monozyten bei spontan hypertensiven Ratten im Vergleich zu normotonen Wistar-Kyoto-Ratten [Liu et al 1996]. Auch das Renin-Angiotensin-System ist an der Entwicklung der Arteriosklerose beteiligt, wie von Okamura et al 1999 beschrieben. Strawn publizierte, dass Angiotensin II Subtyp1 (AT1) -Rezeptorblockade bei hypertensiven Ratten zu einer signifikant verminderten Zahl zirkulierender und endotheladhärenter Monozyten führt [Strawn et al 1999]. In unserer Arbeitsgruppe wurde festgestellt, dass Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie im Vergleich zu Normalkontrollen voraktiviert sind [Dörffel et al 1999].

Wir untersuchten Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie und von gesunden Probanden hinsichtlich möglicher Unterschiede in der Aktivierung anhand ihrer Adhäsion an von uns kultivierte humane Aortenendothelzellen (HAEC), von uns isolierte und kultivierte Saphenavenenendothelzellen (HSVEC), Umbilikalvenen- (HUVEC) und Umbilikalarterienendothelzellen (HUAEC). Außerdem bestimmten wir die Adhäsionsmoleküle humanes lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1), vaskuläres Zell-adhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) sowie E-Selektin und analysierten die Superoxidfreisetzung von humanem Endothel und humanen Monozyten.

Methoden - Humane periphere Blutmonozyten wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation und Plastikadhärenz isoliert und in vitro mit Lipopolysacchariden (LPS, 10 ng/ml), Angiotensin II (10-10 mol/l), Angiotensin II nach Vorinkubation mit dem AT1-Antagonisten Eprosartan (10-3 mol/l) stimuliert oder ohne Stimulans belassen. Nach Inkubation wurden die Monozyten auf einschichtigem Endothel ausgesät und die Adhäsion als Prozentsatz der initial gesäten Zellen erfasst. Die Superoxidfreisetzung des Endothels oder der Monozyten in Lösung wurde mittels Chemilumineszenz bestimmt. Die Sauerstoffradikalfreisetzung wurde durch Phorbol-Myristat-Azetat (PMA) induziert. Teile der Probe wurden mit Angiotensin II (10-10 mol/l), Angiotensin II nach Vorinkubation mit Eprosartan (10-3 mol/l) oder Lipopolysacchariden (LPS, 10 ng/ml) und PMA (8 x 10-5 mol/l) stimuliert oder ohne Stimulans belassen. Als chemiluminogenes Substrat wurden 10 µl Lucigenin (2,5 x 10-4 mol/l) eingesetzt. Die Lichtausgabe wurde in RLU/s mit einem Luminometer gemessen. Der Spitzenwert der Chemilumeneszenzaktivität wurde als Differenz zwischen stimulierten und unstimulierten Chemilumineszenzsignalen bestimmt. Alle Messungen wurden mindestens doppelt ausgeführt und für die statistische Auswertung wurde auf die Mittelwerte zurückgegriffen.

Ergebnisse - Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie hefteten sich im Vergleich zu gesunden Probanden spontan und nach Stimulation mit Angiotensin II signifikant verstärkt an humane Aortenendothelzellen (HAEC) und humane Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC)-Monolayer an, tendenziell auch an humane Saphenavenenendothelzellen (HSVEC). Die Adhäsion von Monozyten hypertensiver Patienten an humane Aortenendothelzellen, die mit LPS (Lipopolysacchariden) stimuliert wurden, war in der Patienten- und Kontrollgruppe im Vergleich zur Spontanadhäsion signifikant erhöht. Es fand sich keine statistisch relevante Beziehung zwischen Alter, Geschlecht, systolischem/ diastolischem Blutdruck und der Adhäsion von unstimulierten Monozyten.

Die Spiegel der humanen löslichen Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1 waren bei Patienten mit arterieller Hypertonie im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen signifikant erhöht. Es fand sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Patienten- und Kontrollgruppe hinsichtlich zirkulierender Mengen an humanem E-Selektin.

Die Chemilumineszenzaktivität postkonfluenter Endothelzellen erhöhte sich nach Stimulation mit Angiotensin II im Vergleich zur Messung ohne vorherige Stimulierung. Die Inkubation mit dem AT1-Antagonisten Eprosartan vor Stimulation mit Angiotensin II führte zu einer verminderten Chemilumineszenzaktivität.

Die Spitzenwerte, der vor Stimulation mit PMA spontan gemessenen Chemilumineszenzaktivität von Monozyten, unterschieden sich nicht signifikant zwischen Patienten- und Kontrollgruppe. Nach Stimulation mit PMA oder mit Angiotensin II wurden bei Hypertonikern signifikant höhere Werte für die Chemilumineszenzaktivität gemessen als bei gesunden Kontrollpersonen. Nach Inkubation von Monozyten mit PMA und LPS unterschied sich die Chemilumineszenzaktivität der Patientenmonozyten nicht signifikant von der Chemilumineszenzaktivität der Monozyten von gesunden Probanden.

Schluss - Bisherige Datenerhebungen anderer Arbeitsgruppen zum Adhäsionsverhalten von Monozyten basierten auf Tiermodellen. Die von mir unternommenen Versuche wurden zum ersten Mal an humanen Monozyten und humanen Endothelzellen unternommen. Mit diesen Versuchen wurde ein weiterer Beweis für die Aktivierung der Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie erbracht. Meine Ergebnisse unterstützen die Sicht einer Monozytenbeteiligung an der Pathogenese atherosklerotischer Läsionen, die mit arterieller Hypertonie in Zusammenhang stehen.

Eigene Schlagworte: Humane Monozyten, Essentielle Hypertonie, Humane Aortenendothelzellen (HAEC), Humane Saphenavenenendothelzellen (HSVEC), Humane Umbilikalarterienendothelzellen (HUAEC), Humane Umbilikalvenenendothel-zellen (HUVEC), Zelladhäsion, Humanes ICAM-1, Humanes VCAM, Humanes E-Selektin, Chemilumineszenz.

Abstract

Introduction – Peripheral blood monocytes are involved in the pathogenesis of atherosclerosis. Liu et al described significantly elevated numbers of activated monocytes in spontaneously hypertensive rats compared to those in normotensive Wistar-Kyoto rats [Liu et al 1996]. Furthermore, the renin-angiotensin-system participates in the development of atherosclerosis, as described by Okamura et al 1999. Strawn et al reported significantly decreased numbers of activated circulating and endothelium adherent monocytes in hypertensive rats following blockage of Angiotensin II subtype 1 (AT1)-receptors [Strawn et al 1999]. Prior research by our group has shown that, in contrast to a control group, monocytes of patients with arterial hypertension are preactivated [Dörffel et al 1999]. This was proven by increased production of proinflammatory cytokines in the hypertensive patients as compared to controls.

This led us to investigate the adhesion behavior of human peripheral blood monocytes to human vascular endothelial cells and to see whether increased superoxide production in monocytes is present as a further activation marker. We isolated and cultivated human endothelial cells and examined monocytes from patients with arterial hypertension and healthy volunteers to identify possible differences in their adhesion behavior to human aortic endothelial cells (HAEC), saphenous vein endothelial cells (HSVEC), human umbilical veins (HUVEC) and human umbilical arteries (HUAEC). In addition, we determined the human soluble (hs) adhesion molecules intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular adhesion molecule-1 (VCAM-1) and E-selectin, and we analyzed superoxide release by human endothelium and human monocytes.

Methods – Peripheral blood monocytes were isolated by density gradient centrifugation and plastic adherence and subsets of the samples were stimulated with lipopolysaccharide (LPS, 10 ng/ml), Angiotensin II (10-10 mol/l), Angiotensin II following preincubation with the AT1-antagonist eprosartan (10-3 mol/l) or left without a stimulant. After incubation, monocytes were seeded onto confluent monolayers of human aortic endothelial cells and the adhesion was determined as the percentage of the initially seeded cells. Oxygen species release was analyzed for endothelium and monocytes in suspension by chemiluminescence. Reactive oxygen release was induced by phorbol-myristate-acetate (PMA). Subsets of the sample were incubated either with Angiotensin II (10-10 mol/l), or with Angiotensin II following preincubation with Eprosartan, or LPS (10 ng/ml) and PMA (8 x 10-5 mol/l), or left without a stimulant. 10 µl Lucigenin (2,5 x 10-4) were used as the chemiluminogenic substrate. The resulting light output was recorded in RLU/s in a luminometer. The final peak value was taken as the difference between stimulated and unstimulated chemiluminescence signals. Each measurement was performed at least twice and the mean was used for statistical analysis.

Results – Peripheral blood monocytes of patients with essential hypertension performed a significantly increased spontaneous adhesion and adhesion following stimulation with Angiotensin II to human aortic endothelial cells (HAEC-monolayers) and umbilical vein endothelial cells (HUVEC-monolayers). There was a trend toward increased monocyte adhesion to human saphenous vein endothelial cells (HSVEC) in comparison to healthy volunteers. The adhesion of monocytes from hypertensive patients to human aortic endothelial cells that were stimulated with lipopolysaccharides (LPS) was significantly increased compared to spontaneous adhesion in the patient and control groups. There was no statistically relevant relationship found for measured adhesion of unstimulated monocytes to HUVEC monolayers as well as age, gender, systolic or diastolic blood pressure.

Levels of human soluble adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1 were significantly raised in hypertensive patients. There was no significant difference for circulating levels of human soluble E-selectin between patients and controls.

Chemiluminescence activity of post confluent endothelial cells was increased after stimulation with Angiotensin II compared to the measurement before stimulation. Incubation with the AT1-receptor blocker eprosartan before stimulation with Angiotensin II resulted in a diminished chemiluminescence activity.

Peak values of chemiluminescence activity from monocytes obtained before stimulation with PMA did not differ significantly between the two populations. Following stimulation with PMA or Angiotensin II, significantly higher chem-iluminescence levels were measured in hypertensive patients compared to healthy volunteers. Chemiluminescence activity levels did not differ significantly between the patient and control groups if the monocytes were incubated with PMA and LPS.

Conclusion – Previous data collections of other groups focusing on monocyte adhesion were based upon animal models. Our experiments were performed on human monocytes and human endothelial cells for the first time. These data indicate that monocytes of patients with essential hypertension may be preactivated. My results support the view of a monocyte involvement in the pathogenesis of atherosclerotic lesions that are related to arterial hypertension.

Keywords: Human monocytes, Essential hypertension, Human aortic endothelial cells (HAEC), Human saphenous vein endothelial cells (HSVEC), Human umbilical artery endothelial cells (HUAEC), Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), Cell adhesion, Human ICAM-1, Human VCAM-1, Human E-Selectin, Chemiluminescence.

Meinen Eltern in Dankbarkeit.

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14.02.2007