Material und Methoden

↓24

Zur Untersuchung der Adhäsion von Monozyten an humane Endothelzellen und zum Studium der Superoxidfreisetzung von Endothelzellen und Monozyten bei Patienten mit arterieller Hypertonie und im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen haben wir Methoden zur -

↓25

3.1  Studienteilnehmer/ Stichprobe

Zur Evaluation des Adhäsionsverhaltens humaner Monozyten aus peripherem Blut wurden Versuche an humanen Aortenzellen, selbst isolierten Endothelzellen aus humaner Vena saphena, aus Umbilikalarterie und aus Umbilikalvene durchgeführt. Die Superoxidfreisetzung humaner Monozyten aus dem peripheren Blut wurde durch Messung der Chemilumineszenzaktivität untersucht.

Periphere Blut - Monozyten erhielten wir von 11 weiblichen und 11 männlichen Patienten im Alter zwischen 18 und 64 Jahren mit essentieller Hypertonie ohne antihypertensive Therapie, oder nach kompletter mindestens zehntägiger Therapiepause. Der Anteil der noch nie behandelten Hypertoniker lag bei 41 %. Alle Patienten unterlagen im Rahmen der klinischen Evaluation einer ambulanten 24-Stundenblutdruckmessung (ABDM). Es nahmen nur Patienten mit diastolischen Blutdruckwerten zwischen 90 und 110 mmHg an der Studie teil. Das mittlere Alter betrug 37 Jahre, der mittlere Blutdruck lag bei 158/95 mmHg. Das mittlere Körpergewicht betrug 73 ± 1,4 kg (SEM) und der mittlere Body Mass Index der Patienten lag bei 24,5 ± 0,51 kg/m2 (SEM).

↓26

Dazu in Alter und Geschlecht passend, suchten wir 12 weibliche und 15 männliche normotone, gesunde Studienteilnehmer im Alter zwischen 19 und 64 Jahren für die Teilnahme an der Studie aus. Das mittlere Alter der Kontrollgruppe lag bei 36 Jahren. Das mittlere Körpergewicht der Kontrollgruppe betrug 71 ± 1,93 kg /SEM) und der mittlere Body Mass Index der Kontrollpersonen lag bei 24,2 ± 0,7 kg/m2 (SEM).

Tabelle 1: Referenzwerte des Labors der Universitätspoliklinik der Charité

Laborparameter

Einheit

Bereich

Laborparameter

Einheit

Bereich

ALT

U/l

... - 19

Hsr

mg/dl

3,00 - 5,71

BSG

 

... - 20

Hst

mg/dl

14 - 42

Chol

mg/dl

… - 200

K

mmol/l

3,6 - 4,8

CRP

mg/dl

...- 0,8

Kreatinin

mg/dl

…- 1,10

Erythrozyten

/pl

4,20 - 5,40

LDL

mg/dl

…- 180

Glucose

mg/dl

60 - 117

Prot

g/dl

6,60 - 8,70

Hb

g/dl

12 - 16

TG

mg/dl

... - 200

Hk

l/l

0,37 - 0,47

Thrombozyten

/nl

130 - 340

Ausschlusskriterien von der Studie stellten alle anderen Krankheiten einschließlich sekundärer arterieller Hypertonie dar. Patienten und Kontrollen wurden auch aus der Studie ausgeschlossen, wenn sich bei den Laboruntersuchungen (Tabelle) pathologische Befunde zeigten. Es wurden die Serumkonzentrationen von Kalium (K+), Kreatinin (Krea), Leberenzymen (AST und ALT), die Erythrozytensedimentationsrate (BSG), C-reaktives Protein

↓27

Tabelle 2: Labordaten der Patienten (P) und Kontrollpersonen (C): Hämoglobin [g/dl], Leukozyten [/nl], Thrombozyten [/nl], Kreatinin [mg/dl], Harnsäure [mg/dl], Protein/ Sediment/ Glucose im Urin. Die Abkürzung n. z. bezeichnet “nicht zutreffend“; o.B. – ohne pathologischen Befund.

P/C Code

Hb [g/dl]

Leuko [/nl]

Throm [/nl]

Krea [mg/dl]

Hrs [mg/dl]

Prot, Sed, Glc Urin

Na [mmol/l]

K [mmol/l]

Glc [mg/dl]

Chol [mg/dl]

LDL [mg/dl]

ESR

CRP [mg/l]

Prot [g/dl]

ALT [U/l]

INR

Hypertonie-dauer

P1

14,6

7,74

267

0,60

5,70

oB

141,7

3,87

90,0

162

91

12/19

0,29

7,54

8

0,93

0,3

P2

14,7

8,49

208

0,99

5,06

oB

144,1

4,01

91,7

187

114

8/19

0,4

7,74

7

1,03

4,0

P3

13,3

8,34

196

0,70

4,10

oB

141,0

3,74

91,0

188

93

7/14

<0,1

7,12

8

1,02

8,0

P4

12,6

4,87

295

0,75

4,37

oB

142,3

4,28

72,0

174

149

9/19

0,21

7,30

11

1,04

15,0

P5

13,8

6,6

165

0,65

4,67

oB

138,9

3,78

78,0

173

143

8/15

0,23

7,48

10

0,98

5,0

P6

13,7

8,2

206

0,67

4,42

oB

139,5

4,43

84,0

182

124

7/14

0,26

7,32

12

1,02

0,8

P7

14,6

8,2

306

0,57

4,80

oB

142,7

3,87

76,0

164

136

8/15

0,20

7,68

8

1,01

0,9

P8

13,0

7,64

168

0,61

5,02

oB

141,8

3,94

78,0

178

129

6/12

0,32

7,23

10

0,99

1,5

P9

14,6

9,70

165

0,72

4,07

oB

143,4

4,37

86,0

172

154

7/15

0,27

7,80

7

1,02

0,0

P10

13

5,90

280

0,73

4,78

oB

141,8

4,29

73,0

164

136

6/12

0,18

7,77

13

1,04

0,2

P11

14,8

8,55

274

0,65

4,83

oB

143,0

4,16

93,0

167

164

9/18

0,25

7,65

7

1,02

12,0

P12

15,7

5,58

193

1,08

5,03

oB

144,0

4,46

102,0

194

115

7/13

0,32

7,96

18

0,98

10,0

P13

13,6

4,82

172

0,81

3,66

oB

141,0

4,03

66,0

187

132

9/22

0,40

7,54

13

1,07

3,5

P14

13,8

6,04

186

0,9

5,53

oB

142,7

4,10

100,3

187

149

12/16

0,19

7,61

11

1,02

5,0

P15

14,4

5,07

247

0,74

5,66

oB

144,0

4,42

111,8

166

162

6/19

<0,1

7,45

17

1,03

0,0

P16

13,8

6,24

230

0,80

4,67

oB

142,2

4,38

87,0

174

154

8/13

0,21

7,76

10

1,02

7,0

P17

13,5

9,41

188

0,76

4,87

oB

143,1

4,35

75,0

168

148

6/14

0,10

7,32

8

0,98

9,0

P18

13,3

7,22

197

0,67

4,36

 

142,5

4,28

77,0

174

156

7/13

0,28

7,86

8

1,04

1,8

P19

13,9

6,32

263

0,68

4,38

oB

141,8

4,34

87,0

180

139

6/14

0,21

7,21

7

1,02

11,0

P20

13,5

8,58

206

0,76

3,89

oB

141,5

4,28

85,0

182

153

7/15

0,33

7,43

10

1,02

8,0

P21

12,8

6,46

321

0,67

4,45

oB

142,3

4,37

78,0

166

132

8/12

0,20

7,34

9

1,01

0,6

P22

13,4

7,93

222

0,64

4,53

oB

144,2

4,33

76,0

175

147

9/15

0,18

7,45

12

1,05

3,0

C1

13,4

8,00

264

0,63

4,83

oB

144,2

4,40

88,0

172

130

5/12

0,10

7,47

11

0,98

n. z.

C2

13,7

6,30

165

0,67

4,28

oB

140,5

4,29

97,0

182

122

6/14

0,24

7,38

11

1,03

n. z.

C3

13,8

6,03

180

0,77

4,23

oB

143,6

4,25

77,0

174

134

8/13

0,34

7,42

13

1,01

n. z.

C4

14

8,8

287

0,62

4,77

oB

142,9

4,20

86,0

165

129

7/14

0,29

7,55

8

1,04

n. z.

C5

13,5

5,3

190

0,70

4,32

oB

141,4

4,34

84,0

176

142

6/11

0,17

7,64

15

1,02

n. z.

C6

13,3

6

206

0,64

4,16

oB

140,7

4,47

75,0

180

153

7/15

0,25

7,59

9

1,01

n. z.

C7

14,5

6,5

254

0,71

4,78

oB

141,3

4,40

79,0

173

146

6/13

0,26

7,41

10

1,05

n. z.

C8

15,6

6,6

209

0,80

4,63

oB

143,8

4,22

80,0

167

137

7/13

0,38

7,36

7

1,03

n. z.

C9

14,2

6,37

181

0,88

4,01

oB

142,4

4,13

89,0

148

130

5/14

0,16

7,74

17

1,07

n. z.

C10

13,7

5,2

199

0,77

4,96

oB

143,6

4,42

78,0

170

124

8/14

0,10

7,34

10

1,04

n. z.

C11

14,9

7,1

201

0,64

4,29

oB

142,2

4,38

88,0

171

132

7/12

0,15

7,23

9

1,01

n. z.

C12

14,9

7,8

233

0,65

4,67

oB

140,4

4,12

92,0

173

143

7/13

0,22

8,40

12

1,02

n. z.

C13

14,1

7,84

253

0,65

5,07

oB

141,5

3,87

88,0

187

114

9/18

0,39

7,45

11

1,03

n. z.

C14

13,8

5,2

284

0,62

4,39

oB

141,7

4,32

76,0

172

118

6/12

0,17

7,27

10

1,02

n. z.

C15

13,5

5,8

276

0,67

4,35

oB

140,8

3,87

95,0

179

123

8/15

0,24

7,36

9

1,04

n. z.

C16

14,6

4,9

244

0,68

4,52

oB

142,5

4,45

84,0

167

148

7/14

0,22

7,41

13

1,01

n. z.

C17

14,5

4,9

225

0,78

4,43

oB

143,4

4,24

87,0

194

134

5/12

0,31

7,53

7

1,03

n. z.

C18

13,3

8,7

298

0,65

4,08

oB

138,0

4,40

99,0

193

155

8/18

0,41

7,98

10

0,96

n. z.

C19

14,6

7,19

285

0,92

4,33

oB

140,0

4,22

117,0

182

140

9/16

0,19

7,61

11

1,08

n. z.

C20

13,2

6,74

275

0,64

4,03

oB

143,6

4,15

86,0

166

135

7/13

0,19

7,57

8

1,02

n. z.

C21

14,1

5,69

253

0,70

4,45

oB

142,5

4,43

79,0

168

132

7/12

0,17

7,21

14

1,03

n. z.

C22

13,7

6,54

262

0,72

4,73

oB

142,6

4,22

78,0

152

141

8/14

0,37

7,52

10

1,04

n. z.

C23

13,5

6,36

204

0,65

4,37

oB

141,1

4,43

83,0

163

121

6/13

0,25

7,56

11

1,02

n. z.

C24

14,7

7,56

334

0,84

4,23

oB

141,7

4,16

87,0

175

139

7/14

0,10

7,28

8

1.01

n. z.

C25

14,4

6,45

248

0,63

4,29

oB

142,5

4,08

78,0

168

144

7/12

0,14

7,36

8

0,98

n. z.

C26

13,6

5,78

250

0,62

4,34

oB

143,4

4,36

81,0

156

136

8/13

0,29

7,46

9

1,02

n. z.

C27

14,2

7,14

178

0,64

4,83

oB

142,0

4,18

86,0

174

129

7/14

0,12

7,63

12

1,02

n. z.

(CRP), Leuko-, Thrombo- und Erythrozytenzahlen und LDL-Werte erfasst. Tabakraucher wurden von der Studie ausgeschlossen. Weitere Ausschlusskriterien stellten pathologisch veränderte Werte der ultrasonographisch gemessenen Intima-Media-Dicke der Arteria carotis, A. femoralis oder Aorta und vorhandene atherosklerotische Läsionen der Gefäße dar.

Tabelle 3: Labordaten der Patienten und gesunden Kontrollpersonen: Mittelwerte ± Standardabweichung (SD)

Parameter

Patienten

Kontrollen

 

Mittelwert

SD

Mittelwert

SD

Hb [g/dl]

13.84

±

0.77

14.05

±

0.60

Leuko [/nl]

7.18

±

1.46

6.55

±

1.08

Throm [/nl]

225.23

±

48.62

238.44

±

43.21

Krea [mg/dl]

0.73

±

0.12

0.70

±

0.08

Hrs [mg/dl]

4.68

±

0.53

4.46

±

0.29

Prot, Sed, Glc, Urin

nicht zutreffend

nicht zutreffend

Na [mmol/l]

142.25

±

1.38

142.01

±

1.41

K [mmol/l]

4.19

±

0.23

4.26

±

0.16

Glc [mg/dl]

84.45

±

11.04

85.81

±

8.90

Chol [mg/dl]

175.64

±

9.22

172.11

±

10.71

LDL [mg/dl]

137.27

±

20.06

134.48

±

10.35

ESR

8/ 15

±

2/ 2

7/ 14

±

1/ 2

CRP [mg/l]

0.25

±

0.08

0.23

±

0.09

Prot [g/dl]

7.53

±

0.23

7.51

±

0.24

ALT [U/l]

10.18

±

3.06

10.48

±

2.42

INR

1.02

±

0.03

1.02

±

0.02

Hypertoniedauer (Jahre)

4.80

±

4.50

nicht zutreffend

↓28

Die Patienten wurden über unsere Studien ausführlich im Gespräch informiert und hatten sich mit der Untersuchung einverstanden erklärt. Die Studie wurde durch die Ethikkommission der Universitätsklinik Charité genehmigt und unter Beachtung der Helsinki-Deklaration durchgeführt.

3.2 Hilfsmittel und Chemikalien

Sämtliche Versuche fanden unter sterilen Bedingungen im Labor statt.

Alle Lösungen und Chemikalien, die wir für die Isolations- und Aktivierungsprozeduren benutzt haben, waren endotoxinfrei. Das heißt, der Endotoxingehalt lag <0.01 ng/ml.

3.2.1  Substanzen und Zubehör zur Monozytenisolation und -stimulation sowie Adhäsion an humane Endothelzellen

↓29

Substanz/ Hilfsmittel

Hersteller/ Anbieter

Angiotensin II Acetate, low endotoxin, 250 mg

Sigma Chemical Co., München, Deutschland/ St. Louis, MI, USA

AT1 Rezeptor-Antagonist Eprosartan

Hoechst Marion Roussel, Bad Soden/ Taunus

Cell Scraper

Falcon, BD Biosciences, Bedford, MA,USA

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Boehringer Ingelheim GmbH, Ingelheim, Deutschland

Endotoxinfreies fetales Kälberserum (FCS) mit einem Endotoxingehalt <0.002 ng/ml, Charge 181S

Biochrom KG/ Seromed, Berlin

Liquemin N 25000 (100 U Heparin/ ml)

Roche AG, Grenzach - Wyhlen

Ficoll – Paque mit einer spezifischen Dichte von 1.077

Pharmacia AB, Uppsala, Schweden

Human - Albumin N 20% Bayer, 1%ig

Bayer AG, Pharma Deutschland, Leverkusen

Leukosep-tubes

Greiner GmbH, Frickenhausen

LPS, E. coli Serotype 026:B6

Sigma Chemical Co., München, Deutschland/ St. Louis, MI, USA

PBS (without Ca2+ or Mg2+) PBS - Dulbecco

Biochrom KG/ Seromed, Berlin

RPMI 1640 ohne Phenolrot

Sigma Chemical Co., München, Deutschland/ St. Louis, MI, USA

Very Low Endotoxin (VLE) RPMI 1640 Medium mit Phenolrot

Biochrom KG/ Seromed, Berlin

3.2.2 Substanzen und Zubehör, die bei der Isolation und Kultur von Endothelzellen benötigt werden

Humane Aortenendothelzellen bezogen wir von der Firma CellSystems Biotechnologie Vertrieb GmbH, St. Katharinen, Deutschland.

Substanz/ Zubehör

Hersteller/ Anbieter

Collagenase 2

Worthington Biochemical Corporation; Lakewood, New Jersey; USA

Collagenase P

Boehringer Mannheim

Endothelial Cell Growth Medium (ECGM)

Promocell, Heidelberg

Endothelial Growth Medium (EGM) 2

CellSystems Biotechnologie Vertrieb GmbH, St. Katharinen, Deutschland/ Clonetics/ Bio Whittaker, USA

Factor VIII -related Antigen Staining Kit

Worthington Biochemical Corporation; Lakewood, New Jersey; USA

Fötales Kälberserum, Lot 75H 3391

Sigma Chemical Co., München, Deutschland/ St. Louis, MI, USA

Kanülen - Luer Lock, gerade, Knopfform A, 60 mm lang, Durchmesser 2 mm

Falk Medizintechnik, Berlin

M 199, Medium 199 in Earle´s Balanced Salt Solution (BSS)

Bio - Whittaker, Verviers, Belgium

Nahtmaterial für Gefäßligaturen:
4 - 0 Prolene

Ethicon, Norderstedt

Natriumchlorid

Merck, Berlin

Schlauchverbinder - Female Luer Lock Connector

Sherwood Medical, Schwalbach/ Tullamore, Irland

Trypsin - EDTA, Solution 10x

Sigma Chemical Co., München, Deutschland/ St. Louis, MI, USA

Universalbinder/ Kabelbinder 98 mm x 2,5 mm

neoLab Laborbedarf, Heidelberg

Zellkulturflaschen T25

Nunc A/S, Roskilde, Dänemark

3.2.3 Substanzen zur Adhäsionsmolekülbestimmung

↓30

Substanz/ Zubehör

Hersteller/ Anbieter

human soluble ICAM - 1 Parameterkit

R & D Systems GmbH, Wiesbaden, Minneapolis, MN, USA

soluble E-Selektin Parameterkit

human sVCAM - 1 Parameterkit

3.2.4 Substanzen, die zur Bestimmung der Chemilumineszenz – Aktivität von Monozyten und Endothelzellen benötigt werden

Substanz

Hersteller/ Anbieter

AT1 Rezeptor Antagonist Eprosartan

Hoechst Marion Roussel (Bad Soden/ Taunus, Germany)

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Boehringer Ingelheim GmbH (Ingelheim, Germany)

Lucigenin: N - Methylacredinium - Nitrate

Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA)

Phorbol-Myristate-Acetate (PMA)

Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, USA)

Röhrchen zur Chemilumineszenz,
5 ml, Durchmesser 75 x 12, # 55.476

Sarstedt AG & Co., Nümbrecht

3.3 Methoden der Isolation, Prüfung und Stimulation von humanen Monozyten aus dem peripheren Blut

3.3.1  Isolation von Monozyten aus dem peripheren Venenblut

Die Monozyten wurden mittels Dichtegradienten-Zentrifugation (Megafuge, Heraeus) und Plastikadhärenz isoliert, wie von Rückert – Dörffel et al beschrieben [Rückert-Dörffel et al 1996; Dörffel et al 1999; Dörffel et al 2001]. Peripheres Venenblut wurde mit physiologischer Kochsalzlösung, die 100 U Heparin/ml enthielt, verdünnt. Dann wurde die Lösung über Ficoll-Paque (mit einer spezifischen Dichte von 1.077, hergestellt von Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) in spezielle Reagenzgefäße (Falcon, 50 ml) zur Leukozytenabtrennung geschichtet. Die Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 400x g zentrifugiert. Die aus der Interphase geernteten Zellen wurden in Phosphate Buffered Saline (PBS) gewaschen und in RPMI 1640-Medium (ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), 100 Internationalen Einheiten (IE bzw. U)/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, und 50 µg/ml Gentamycin) resuspendiert. Die Zellen wurden in Petrischalen (Greiner GmbH, Nürtingen) angesiedelt und für eine Stunde bei 37°C mit 5% CO2 Begasung im Brutschrank inkubiert. Nichtadhärente Zellen wurden durch mehrmaliges Spülen mit auf 37°C vorgewärmtem RPMI 1640 von den Petrischalen verworfen. Mehr als 99% der adhärenten Zellen konnten durch das Spülen mit 4°C kaltem RPMI 1640 und durch vorsichtiges mechanisches Schaben abgelöst werden. Die adhärenten Zellen wurden in PBS gewaschen und für experimentelle Vorhaben in RPMI 1640 überführt, das mit 1% humanem Serumalbumin N 20% (Bayer, Leverkusen) ergänzt wurde; die Zellzahl wurde auf 1 x 106 Zellen/ ml eingestellt.

↓31

Die Vitalität der Monozyten lag bei über 98%, wie durch Trypanblau-Ausschluß-Färbung nach der Isolation bestimmt wurde.

3.3.2 Die Identifikation der humanen Monozyten

Die Identifikation der peripheren Blutmonozyten erfolgte mittels Fluoreszenz - aktiviertem Zellsortierer (FACS). Mittels Immunfluoreszenzfärbung der Oberflächenantigene wurden die Monozyten isoliert, wie bereits von Dörffel et al beschrieben [Dörffel et al 1999]. Monoklonale, für humane T-Zellen (CD 3; Clone UCHT1, code: F0818), humane B-Zellen (CD19; Clone HD37, code: F0768) und humane Monozyten (CD 14, CloneTÜK4, code: R0864) spezifische Mäuseantikörper wurden von DAKO A/S (Dänemark) bezogen. Eine angemessene Kontrolle durch Antikörper mit irrelevanter Spezifität wurde durchgeführt, um unspezifische Färbungen zu erkennen. Die mit den Antikörpern gefärbten Zellen wurden hinsichtlich ihrer Fluoreszenz mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACScalibur, Becton Dickinson Immunometry Systems, San Jose, CA, USA) untersucht. Die relative Häufigkeit der Zellen, die verschiedenen Zelloberflächenantigene zu exprimieren, wurde nach der Substraktion der Kontrollzellen von den experimentellen Fluoreszenzprofilen am Computer berechnet. Die Zellsuspension enthielt 94% Monozyten.

3.3.3 Stimulation, der aus dem peripheren Venenblut, isolierten humanen Monozyten

Die optimalen Bedingungen und Konzentrationen für die Stimulation der peripheren Blutmonzyten mit Angiotensin II und LPS wurden durch Zeit- und Konzentrationskinetiken bestimmt wie von Dörffel et al beschrieben [Dörffel et al 2001].

↓32

Die Monozyten aus dem peripheren Blut wurden bei 37°C und 5% CO2 über 14 Stunden bei einer Zellkonzentration von 106 Zellen/ ml in RPMI 1640 (ergänzt mit 1% Humanserumalbumin) mit oder ohne LPS (10 ng/ml) inkubiert. Außerdem wurden Monozyten, in einer physiologisch relevanten Konzentration von Angiotensin II (10-10 mol/l) [Kahan et al 1997] mit oder ohne Vorinkubation über 30 Minuten mit dem AT1-Rezeptorantagonist Eprosartan (10-3 mol/l), in Kultur gegeben.

3.4 Humane Endothelzellen

3.4.1  Kultur von humanen Endothelzellen aus der Aorta (HAEC)

Die Zellen trafen tiefgefroren in Endothelzellwachstumsmedium (EGM 2, CellSystems, St. Katharinen) mit 10 % fetalem Kälberserum bei uns ein. Die Zellen wurden aufgetaut und in T25 - Kulturflaschen ausgesät, - 2500 Zellen/cm2 - bei 37°C und bei 5% CO2 inkubiert. Die Zellen wurden jeden zweiten Tag mit EGM 2 gefüttert. 48 Stunden vor dem Adhäsionsversuch wurden die Zellen bei 90 % Konfluenz durch Trypsinieren subkultiviert. 10 000 bis 50 000 Zellen wurden in einem halben ml EGM 2 resuspendiert und in 24-Loch-Platten überführt.

3.4.2 Humane Vena saphena Endothelzellen (HSVEC)

Zur Entwicklung einer Methode zur Isolierung humaner Endothelzellen aus der Vena saphena haben wir das Protokoll von Jaffe et al zur Isolierung von Endothelzellen aus Umbilikalvenen abgewandelt [Jaffe et al 1973].

↓33

Die Endothelzellen aus der Vena saphena wurden durch Kollagenaseverdauung der inneren Gefäßwand gewonnen und in einem Medium (ECGM, Promocell, Heidelberg, Deutschland) mit niedrigem Serumanteil (2% FCS) unter endotoxinfreien Bedingungen gezüchtet.

Die Saphenavenen wurden intraoperativ unmittelbar nach erfolgter Saphenektomie in sterile Behälter mit einer Pufferlösung, die sich aus 0,14 mol/l NaCl, 0,004 mol/l KCl, 0,001 mol/l HEPES Puffer (pH von 7,4) und 0,011 mol/l Glucose zusammensetzte, überführt und bei 4°C bis zur Verarbeitung innerhalb von 24 Stunden gelagert. Unter sterilen Arbeitsbedingungen wurden die sichtbaren Gefäßabzweigungen der Vene mit chirurgischem Nahtmaterial ligiert. Die Vena saphena wurde dann mit female Luer Lock Konnektoren (Firma Sherwood Medical, Tullamore, Irland) bei einem Gefäßdurchmesser > 5mm, mit Knopfkanülen (Firma Falk Medizintechnik Berlin) bei einem Gefäßdurchmesser > 3 mm oder mit von uns stumpf geschliffenen Sterican Kanülen (B/Braun, Melsungen) bei einem noch kleineren Gefäßdurchmesser kanüliert. Die Kanülen wurden mittels steriler Nylonfäden fixiert. Nacheinander wurde mit einer 10 ml Spritze (B/Braun, Melsungen) je eine Kanüle geblockt. Durch die nicht geblockte Kanüle am anderen Gefäßende wurde das Gefäß mit der Pufferlösung gespült. Die nun durch austretenden Puffer sich bemerkbar machenden weiteren Gefäßabgänge der Vena Saphena wurden mit chirurgischem Nahtmaterial (4-0 Prolene, Ethicon, Norderstedt) ligiert. Nachdem das Gefäß mit insgesamt 100 ml Pufferlösung gespült worden war, wurde auf eine der beiden Kanülen ein 4 cm langer Silikonschlauch (Durchmesser von 0,8 cm) aufgesetzt und befestigt. 10 ml 0,2% Kollagenase (Collagenase 2, Worthington, CellSystems Biotechnologie Vertriebs GmbH) in Pufferlösung wurde mit einer Spritze in die Vene injiziert. Der Silikonschlauch wurde an einem Ende mit einer Klemme verschlossen, während die Spritze am anderen Ende im Konnektor fixiert war. Die Kollagenase - Verdauung fand während einer Inkubationszeit von 30 Minuten im Brutschrank bei 37°C, 5% CO2, statt. Dann wurde die Einwirkung des Enzyms durch Spülen der Vene mit 50 ml Pufferlösung beendet und die gesamte Lösung mit den Endothelzellen in ein steriles 50 ml Röhrchen (Falcon®) überführt, das 10 ml des Mediums 199 (M-199, Bio Whittaker, Boehringer Ingelheim Bioproducts Partnership, Heidelberg) mit 20% FCS (fötales Kälberserum) enthielt. Die Zellen wurden 5 Minuten bei 400 g zentrifugiert, in ECGM (Promocell, Heidelberg) resuspendiert und schließlich in 24-Lochplatten der Firma Nunc (Roskilde, Dänemark) mit einer Konzentration von 10000 - 50000 Zellen pro 0,5 ml ECGM pro Vertiefung der Lochplatte ausgesät und bei 37°C und 5% CO2 dampfgesättigter Atmosphäre im Brutschrank inkubiert. Die Zellen wurden durch Austauschen des verbrauchten Wachstumsmediums alle zwei bis drei Tage gefüttert. Die humanen Saphenavenenendothelzellen wurden etwa 48 Stunden vor dem geplanten Monozytenadhäsionsversuch durch Trypsinieren subkultiviert. Damit wurde sicher gestellt, dass nur frische Zellen benutzt wurden.

3.4.3 Isolation und Kultur von humanen Endothelzellen aus Umbilikalarterien (HUAEC)

Zur Isolation der Endothelzellen aus humanen Umbilikalarterien kam das Protokoll von Jaffe et al mit leichten Abwandlungen, wie von Dörffel et al 2001 in der Zeitschrift „Atherosclerosis“ beschrieben, zur Anwendung [Jaffe et al 1973]. Zur Kanülierung der Arterie wurden von uns stumpf geschliffene Kanülen der Firma B/Braun (Melsungen) verwendet. Die Zellen wurden in serumarmem Medium (ECGM, Promocell, Heidelberg) endotoxinfrei gezüchtet.

3.4.4 Isolation und Kultur von humanen Endothelzellen aus Umbilikalvenen (HUVEC)

↓34

Die Isolation und Kultur der humanen Endothelzellen aus Umbilikalvenen richtete sich nach dem Protokoll von Dörffel et al basierend auf der Anleitung von Jaffe et al [Dörffel et al 2001; Jaffe et al 1973].

Die Endothelzellen wurden durch Kollagenaseverdauung aus dem Inneren der Vene herausgelöst. 10 ml 0,2% Kollagenase (Collagenase P, Boehriner Mannheim GmbH) kamen zur Anwendung. Die Kollagenase - Verdauung fand während einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur statt. Mit 30 ml Pufferlösung wurde die Enzymwirkung nach abgelaufener Zeit gestoppt.

Die Zellen wurden in serumarmem Medium (ECGM, Promocell, Heidelberg) endotoxinfrei gezüchtet.

3.4.5 Identifikation der Endothelzellen

↓35

Die HAEC wurden immunhistochemisch mittels direkter Immunfluoreszenz-färbung auf von-Willebrandt-Faktor identifiziert. Dazu wurde Anti-Human - vWF-FITC Conjugate (Factor VIII-related Antigenfärbekit von Worthington Biochemical Corporation; Lakewood, New Jersey; USA) verwandt. Methanolfixierte mikrovaskuläre Endothelzellen und Fibroblasten dienten als positive bzw. negative Kontrollen. Die Prüfung mit dem Fluoreszenzmikroskop (Diaphot, Nikon, Japan) zeigte eine Färbung der Zellmatrix aller Zellen sowohl bei mikrovaskulären Endothelzellen als auch bei den getesteten humanen Aortenendothelzellen, Endothelzellen der Vena saphena, sowie der Umbilikalarterien und -venen. Die Fibroblasten blieben hingegen ungefärbt.

3.5 Durchführung der Monozyten-Adhäsions-Versuche

3.5.1  Modifizierte Methode nach Hahn et al 1994 - mikroskopische Auszählung der Monozyten

Die Monozytenadhäsion an Endothelzellen wurde wie von Hahn et al be-schrieben mit kleineren Änderungen durchgeführt [Hahn et al 1994]. Konfluente HAEC Monolayer wurden mindestens 2 Stunden vor Versuchsbeginn in serumfreies Medium überführt. Dazu wurde das Wachstumsmedium ECGM mit niedrigem Serumgehalt durch RPMI 1640 mit 1% Humanserumalbumin ergänzt. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Monozyten einmal mit RPMI 1640 (inklusive 1% HSA) gewaschen, unter dem Mikroskop gezählt, resuspendiert und anschließend jeweils 1 x 106 Zellen in ein Loch einer 24-Lochplatte auf die konfluenten Endothelzellen gesät. Die nicht adhärenten Monozyten wurden 2 Stunden später eingesammelt und unter einem Mikroskop mit Phasenkontrast (inverses Labormikroskop Leica DM IL HC, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar) gezählt. Die Monozytenadhäsion wird als Prozent der initial gesäten Zellen angegeben.

3.5.2 Modifizierte Methode nach McCarron et al 1994 - Zählung radioaktiv markierter Monozyten

Die obige Methode wurde in unserer Arbeitsgruppe durch einen zweiten Adhäsionsversuch überprüft, der wie von McCarron et al beschrieben mit kleineren Abweichungen durchgeführt wurde [McCarron et al 1994]. Die Monozyten habe ich bereit gestellt, die Messungen mit dem radioaktiven Material wurden durch unsere Arbeitsgruppe in einem Speziallabor vorgenommen.

↓36

Um die Zellen radioaktiv zu markieren, wurden 100 µCi Sodiumchromat (51Cr)/ml (Nycomed, Amersham, Großbritannien) zugegeben. Die Monozyten wurden über eine Stunde bei 37°C in einem Schüttelwasserbad inkubiert. Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert und zweimal mit warmem HBSS (Hanks Balanced Salt Solution, der Firma Sigma Aldrich gewaschen, das 4% fötales Kälberserum (FCS) enthielt. Die Monozyten (105/ml) wurden in die Vertiefungen der Platte gegeben und die Platten bei 37°C und 5% CO2 für eine Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurden die nichtadhärenten Zellen aspiriert. Das einschichtige Endothel (Monolayer) wurde vorsichtig zwei Mal mit warmem M-199 gewaschen. Die adhärenten Zellen wurden durch die Inkubation mit 2% (vol/vol) Triton-X (0,2 ml/ Vertiefung) über eine Nacht lysiert. Die Radioaktivität in allen Fraktionen wurde mit einem Packard Gamma-5650 Counter gemessen. Die prozentuale Adhäsion wurde ermittelt aus dem Quotienten des Betrags der Radioaktivität, der mit den adhärenten Zellen pro Minute assoziiert ist und der Gesamtzahl der Zerfälle („Counts“), die im Zusammenhang mit den Monozyten pro Minute stehen.

3.6 Bestimmung der Adhäsionsmoleküle ICAM-1, sVCAM-1 und sE-Selectin

Es wurden Blutproben zur Bestimmung der zirkulierenden Menge an löslichem humanem ICAM 1 (löslichem Interzellulärem Adhäsionsmolekül-1), löslichem humanem VCAM-1 (Gefäßzell-Adhäsionsmolekül-1) und löslichem humanem E-Selectin (Endothel - Leukozyten-Adhäsionsmolekül-1) gesammelt. Die Seren wurden jeweils doppelt mit dem kommerziellen, auf monoklonalen Antikörpern basierenden ELISA von R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) analysiert. Wir benutzten Parameterkits für sICAM-1, sVCAM-1 und sE-Selektin.

Die Serumproben wurden mit einer Verdünnungslösung durchmischt: Es wurden 15 µl Serumprobe mit 285 µl Verdünnungslösung im Ansatz zur Bestimmung von ICAM-1 ergänzt, sowie 10 µl Probe mit 490 µl (20fach) Verdünnungslösung zur Bestimmung von VCAM-1 (50fach) und 25µl Probe mit 475 µl (20fach) Verdünnungslösung zur Bestimmung von E-Selektin verwendet. Alle Reagenzien wurden auf Raumtemperatur (20° C) erwärmt. 100 µl verdünntes Konjugat wurden in jede Vertiefung einer Microlochplatte gegeben. Damit wurden 100 µl Standard, Kontrolle oder Probe durchmischt. Die Platte wurde abgedeckt und mit einem Plattensiegel 90 Minuten zur Inkubation stehen gelassen. Anschließend wurde der Inhalt jeder Vertiefung aspiriert und die Platte insgesamt sechsmal gewaschen und dekantiert. Dazu wurde jede Vertiefung der Platte mittels einer Multikanalpipette mit 300 µl Waschpuffer gefüllt und anschließend die Flüssigkeit vollständig entfernt. Nach dem letzten Waschdurchgang wurde die Platte mit den Öffnungen der Vertiefungen nach unten gerichtet auf einem Papierhandtuch ausgeklopft. Sofort wurden 100 µl Substrat (vor Licht geschützt) in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde mit der Plattenversiegelungsfolie verschlossen und für 30 Minuten (ICAM-1 und E-Selektin) beziehungsweise 20 Minuten (VCAM-1) ruhen gelassen. In der gleichen Reihenfolge wie das Substrat wurden nun 100 µl Stoplösung in jede Vertiefung gegeben. Die optische Dichte jeder Vertiefung wurde nun innerhalb von 30 Minuten mittels eines ELISA Readers bestimmt und die Konzentration in ng/ml ermittelt. Der Intra-Assay-Variationskoeffizient für sICAM-1 und sE-Selectin betrug 4,8%, und für sVCAM-1 5,9%.

3.7 Chemilumineszenz-Versuch und Zellstimulantien

↓37

Chemilumineszenz Aktivität ist ein Maß der Superoxidproduktion. Als Chemilumineszenz bezeichnet man von Zellen produziertes Licht chemischen Ursprungs. Es ist eine Funktion der Sauerstoff-Aktivität von Monozyten. [phagocytic oxygenating activity]. Die von Phagozyten freigesetzten Sauerstoffradikale sind hochaktiv und reagieren mit empfänglichen biologischen oder organischen Substraten zur Formierung erregter Komponenten. Diese Komponenten fallen in ihren Grundzustand zurück. Dabei werden Photonen emittiert. Diese Energiefreisetzung erfolgt in der Form von Licht, das durch Lucigenin (N, N’-Dimethyl-9,9’-biacridinium Nitrate) verstärkt wird und in einem Luminometer gemessen werden kann. Chemilumineszenz - Bestimmung ist eine gut etablierte Methode zur Überwachung der Sauerstoffradikalfreisetzung [Kricka 1993; Kitahora et al 1988; Pueyo et al 1998; Laursen et al 1997; Pagano et al 1998].

Für HAEC und Monozyten wurde die Sauerstoffradikalfreisetzung mittels Chemilumineszenz ermittelt.

3.7.1  Chemilumineszenz der Endothelzellen

Konfluente Humane Aortenendothelzellen in 20 cm2 Petri - Schalen wurden dreimal mit einem modifizierten Krebspuffer gewaschen [Pueyo et al 1998]. Die Freisetzung von Sauerstoffradikalen von humanen Aortenendothelzellen (HAEC) wurde als Antwort auf Stimulation mit Angiotensin II (10-10 mol/l) gemessen. Bei dem Versuch mit Eprosartan wurde diese Substanz (10-3 mol/l) 30 Minuten vor dem Experiment hinzugefügt. HAEC (105 Zellen) wurden dann abgeschabt und in einem Luminometerröhrchen plaziert. Als chemiluminogenes Substrat wurden 10 ml Lucigenin (2.5 × 10-4 mol/l) hinzugefügt und das Endvolumen auf 1 ml eingestellt. Nach Inkubation über 5 Minuten bei 37°C wurde das Teströhrchen im Chemilumineszenz-Analysator plaziert (Biolumat, LB 9501, Berthold, Deutschland). Messungen wurden alle 30 Sekunden über 2 Stunden bis zu 72 Stunden durchgeführt. Als Differenz zwischen stimulierten und unstimulierten CL - Signalen wurde der Spitzenwert ermittelt, gemessen zum Zeitpunk, an dem das Spitzensignal erreicht wurde. Jede Messung wurde zweimal vorgenommen und der Durchschnitt zweier CL-Signale wurde für die statistische Auswertung verwendet.

3.7.2 Chemilumineszenz von Monozyten

↓38

Die Monozyten wurden mittels Dichtegradienten-Zentrifugation und Plastikanheftung isoliert, wie von Rückert – Dörffel et al und in Abschnitt 3.1 bereits beschrieben [Rückert-Dörffel et al 1996; Dörffel et al 1999; Dörffel et al 2001]. Die Vitalität der Monozyten lag bei über 98%, wie durch Trypan-Blau-Ausschluß-Färbung nach der Isolation bestimmt wurde. Identifiziert wurden die Monozyten mittels Immunfluoreszenz - Färbung auf Antigene der Zelloberfläche, wie bereits beschrieben wurde [Dörffel et al 2001]. Die Zellsuspension im RPMI 1640 Medium enthielt zu 94% Monozyten.

Die Monozyten wurden in RPMI 1640 (bei 106 Zellen/ml) resuspendiert und in ein Eisbad gestellt.

Die Freisetzung von Sauerstoffradikalen wurde mit PMA induziert. PMA (in einer Konzentration von 8 × 10-5 mol/l) wurde in DMSO aufgelöst und bei -70°C aufbewahrt. Teile der Probe (jeweils 105 Monozyten) wurden mit Angiotensin II (10-6 mol/l), oder Angiotensin II nach Vorinkubation mit einem AT - 1 Rezeptor - Antagonisten (10-3 mol/l), oder LPS (10 ng/ml) und PMA vorinkubiert bzw. ohne Stimulans belassen.

↓39

Als chemiluminogenes Substrat wurden 10 ml Lucigenin (2.5 × 10-4 mol/l) hinzugefügt und das Endvolumen von 1 ml eingestellt. Nach Inkubation über 5 Minuten bei 37°C wurde das Teströhrchen im Chemilumineszenz Analysator Biolumat (hergestellt von Berthold, Deutschland) plaziert. Messungen wurden alle 30 Sekunden über 2 Stunden bis zu 24 Stunden durchgeführt. Als Differenz zwischen stimulierten und unstimulierten CL-Signalen wurde der Spitzenwert ermittelt, gemessen zum Zeitpunkt, an dem das Spitzensignal erreicht wurde. Eine kinetische Studie der PMA-induzierten Monozytenantworten wurde durchgeführt. Jede Messung wurde zweimal vorgenommen und der Durchschnitt zweier Chemilumineszenzsignale wurde für die statistische Auswertung verwendet.

3.8 Methoden der Datenanalyse

Die Ergebnisse werden, falls nicht anders notiert, als Mediane ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die statistische Signifikanz der Differenzen wurde mit dem Mann-Whitney-U-Test für nichtnormalverteilte Stichproben getestet. Die Differenzen innerhalb der Gruppen wurden mit den Tests nach Friedman und Wilcoxon evaluiert und eine Alpha-Bonferoni-Abgleichung vorgenommen. Ein P Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Aufgrund der Größe der Stichproben kann von Nichtnormalverteilung der Stichprobe ausgegangen werden. Die Verteilung der Stichprobe wurde auch mit dem Nichtnormalverteilungstest nach Kolmogorov-Smirnov evaluiert.

↓40

Die Korrelation wurde nach Spearman (RS) und Pearson (R) bestimmt.

Die gesamte Statistik wurde mit dem Statistical Package for Social Sciences (SPSS) 9.0 1999 (Chicago, USA) berechnet. Die deskriptive Darstellung der Ergebnisse erfolgte durch Boxplots und Säulendiagramme. Der im Inneren des Blocks gelegene schwarze Balken zeigt den Median an. 50% aller Werte einer Gruppe liegen innerhalb des Blocks (25. bis 75. Perzentile), die restlichen sind durch Antennen gekennzeichnet.


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14.02.2007