Einführung - Periphere Blutmonozyten spielen eine Rolle in der Pathogenese der Arteriosklerose. Liu et al beschrieben signifikant erhöhte Zahlen aktivierter Monozyten bei spontan hypertensiven Ratten im Vergleich zu normotonen Wistar-Kyoto-Ratten [Liu et al 1996]. Auch das Renin-Angiotensin-System ist an der Entwicklung der Arteriosklerose beteiligt, wie von Okamura et al 1999 beschrieben. Strawn publizierte, dass Angiotensin II Subtyp1 (AT1) -Rezeptorblockade bei hypertensiven Ratten zu einer signifikant verminderten Zahl zirkulierender und endotheladhärenter Monozyten führt [Strawn et al 1999]. In unserer Arbeitsgruppe wurde festgestellt, dass Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie im Vergleich zu Normalkontrollen voraktiviert sind [Dörffel et al 1999].
Wir untersuchten Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie und von gesunden Probanden hinsichtlich möglicher Unterschiede in der Aktivierung anhand ihrer Adhäsion an von uns kultivierte humane Aortenendothelzellen (HAEC), von uns isolierte und kultivierte Saphenavenenendothelzellen (HSVEC), Umbilikalvenen- (HUVEC) und Umbilikalarterienendothelzellen (HUAEC). Außerdem bestimmten wir die Adhäsionsmoleküle humanes lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1), vaskuläres Zell-adhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) sowie E-Selektin und analysierten die Superoxidfreisetzung von humanem Endothel und humanen Monozyten.
Methoden - Humane periphere Blutmonozyten wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation und Plastikadhärenz isoliert und in vitro mit Lipopolysacchariden (LPS, 10 ng/ml), Angiotensin II (10-10 mol/l), Angiotensin II nach Vorinkubation mit dem AT1-Antagonisten Eprosartan (10-3 mol/l) stimuliert oder ohne Stimulans belassen. Nach Inkubation wurden die Monozyten auf einschichtigem Endothel ausgesät und die Adhäsion als Prozentsatz der initial gesäten Zellen erfasst. Die Superoxidfreisetzung des Endothels oder der Monozyten in Lösung wurde mittels Chemilumineszenz bestimmt. Die Sauerstoffradikalfreisetzung wurde durch Phorbol-Myristat-Azetat (PMA) induziert. Teile der Probe wurden mit Angiotensin II (10-10 mol/l), Angiotensin II nach Vorinkubation mit Eprosartan (10-3 mol/l) oder Lipopolysacchariden (LPS, 10 ng/ml) und PMA (8 x 10-5 mol/l) stimuliert oder ohne Stimulans belassen. Als chemiluminogenes Substrat wurden 10 µl Lucigenin (2,5 x 10-4 mol/l) eingesetzt. Die Lichtausgabe wurde in RLU/s mit einem Luminometer gemessen. Der Spitzenwert der Chemilumeneszenzaktivität wurde als Differenz zwischen stimulierten und unstimulierten Chemilumineszenzsignalen bestimmt. Alle Messungen wurden mindestens doppelt ausgeführt und für die statistische Auswertung wurde auf die Mittelwerte zurückgegriffen.
Ergebnisse - Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie hefteten sich im Vergleich zu gesunden Probanden spontan und nach Stimulation mit Angiotensin II signifikant verstärkt an humane Aortenendothelzellen (HAEC) und humane Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC)-Monolayer an, tendenziell auch an humane Saphenavenenendothelzellen (HSVEC). Die Adhäsion von Monozyten hypertensiver Patienten an humane Aortenendothelzellen, die mit LPS (Lipopolysacchariden) stimuliert wurden, war in der Patienten- und Kontrollgruppe im Vergleich zur Spontanadhäsion signifikant erhöht. Es fand sich keine statistisch relevante Beziehung zwischen Alter, Geschlecht, systolischem/ diastolischem Blutdruck und der Adhäsion von unstimulierten Monozyten.
Die Spiegel der humanen löslichen Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1 waren bei Patienten mit arterieller Hypertonie im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen signifikant erhöht. Es fand sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Patienten- und Kontrollgruppe hinsichtlich zirkulierender Mengen an humanem E-Selektin.
Die Chemilumineszenzaktivität postkonfluenter Endothelzellen erhöhte sich nach Stimulation mit Angiotensin II im Vergleich zur Messung ohne vorherige Stimulierung. Die Inkubation mit dem AT1-Antagonisten Eprosartan vor Stimulation mit Angiotensin II führte zu einer verminderten Chemilumineszenzaktivität.
Die Spitzenwerte, der vor Stimulation mit PMA spontan gemessenen Chemilumineszenzaktivität von Monozyten, unterschieden sich nicht signifikant zwischen Patienten- und Kontrollgruppe. Nach Stimulation mit PMA oder mit Angiotensin II wurden bei Hypertonikern signifikant höhere Werte für die Chemilumineszenzaktivität gemessen als bei gesunden Kontrollpersonen. Nach Inkubation von Monozyten mit PMA und LPS unterschied sich die Chemilumineszenzaktivität der Patientenmonozyten nicht signifikant von der Chemilumineszenzaktivität der Monozyten von gesunden Probanden.
Schluss - Bisherige Datenerhebungen anderer Arbeitsgruppen zum Adhäsionsverhalten von Monozyten basierten auf Tiermodellen. Die von mir unternommenen Versuche wurden zum ersten Mal an humanen Monozyten und humanen Endothelzellen unternommen. Mit diesen Versuchen wurde ein weiterer Beweis für die Aktivierung der Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie erbracht. Meine Ergebnisse unterstützen die Sicht einer Monozytenbeteiligung an der Pathogenese atherosklerotischer Läsionen, die mit arterieller Hypertonie in Zusammenhang stehen.
Introduction – Peripheral blood monocytes are involved in the pathogenesis of atherosclerosis. Liu et al described significantly elevated numbers of activated monocytes in spontaneously hypertensive rats compared to those in normotensive Wistar-Kyoto rats [Liu et al 1996]. Furthermore, the renin-angiotensin-system participates in the development of atherosclerosis, as described by Okamura et al 1999. Strawn et al reported significantly decreased numbers of activated circulating and endothelium adherent monocytes in hypertensive rats following blockage of Angiotensin II subtype 1 (AT1)-receptors [Strawn et al 1999]. Prior research by our group has shown that, in contrast to a control group, monocytes of patients with arterial hypertension are preactivated [Dörffel et al 1999]. This was proven by increased production of proinflammatory cytokines in the hypertensive patients as compared to controls.
This led us to investigate the adhesion behavior of human peripheral blood monocytes to human vascular endothelial cells and to see whether increased superoxide production in monocytes is present as a further activation marker. We isolated and cultivated human endothelial cells and examined monocytes from patients with arterial hypertension and healthy volunteers to identify possible differences in their adhesion behavior to human aortic endothelial cells (HAEC), saphenous vein endothelial cells (HSVEC), human umbilical veins (HUVEC) and human umbilical arteries (HUAEC). In addition, we determined the human soluble (hs) adhesion molecules intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular adhesion molecule-1 (VCAM-1) and E-selectin, and we analyzed superoxide release by human endothelium and human monocytes.
Methods – Peripheral blood monocytes were isolated by density gradient centrifugation and plastic adherence and subsets of the samples were stimulated with lipopolysaccharide (LPS, 10 ng/ml), Angiotensin II (10-10 mol/l), Angiotensin II following preincubation with the AT1-antagonist eprosartan (10-3 mol/l) or left without a stimulant. After incubation, monocytes were seeded onto confluent monolayers of human aortic endothelial cells and the adhesion was determined as the percentage of the initially seeded cells. Oxygen species release was analyzed for endothelium and monocytes in suspension by chemiluminescence. Reactive oxygen release was induced by phorbol-myristate-acetate (PMA). Subsets of the sample were incubated either with Angiotensin II (10-10 mol/l), or with Angiotensin II following preincubation with Eprosartan, or LPS (10 ng/ml) and PMA (8 x 10-5 mol/l), or left without a stimulant. 10 µl Lucigenin (2,5 x 10-4) were used as the chemiluminogenic substrate. The resulting light output was recorded in RLU/s in a luminometer. The final peak value was taken as the difference between stimulated and unstimulated chemiluminescence signals. Each measurement was performed at least twice and the mean was used for statistical analysis.
Results – Peripheral blood monocytes of patients with essential hypertension performed a significantly increased spontaneous adhesion and adhesion following stimulation with Angiotensin II to human aortic endothelial cells (HAEC-monolayers) and umbilical vein endothelial cells (HUVEC-monolayers). There was a trend toward increased monocyte adhesion to human saphenous vein endothelial cells (HSVEC) in comparison to healthy volunteers. The adhesion of monocytes from hypertensive patients to human aortic endothelial cells that were stimulated with lipopolysaccharides (LPS) was significantly increased compared to spontaneous adhesion in the patient and control groups. There was no statistically relevant relationship found for measured adhesion of unstimulated monocytes to HUVEC monolayers as well as age, gender, systolic or diastolic blood pressure.
Levels of human soluble adhesion molecules ICAM-1 and VCAM-1 were significantly raised in hypertensive patients. There was no significant difference for circulating levels of human soluble E-selectin between patients and controls.
Chemiluminescence activity of post confluent endothelial cells was increased after stimulation with Angiotensin II compared to the measurement before stimulation. Incubation with the AT1-receptor blocker eprosartan before stimulation with Angiotensin II resulted in a diminished chemiluminescence activity.
Peak values of chemiluminescence activity from monocytes obtained before stimulation with PMA did not differ significantly between the two populations. Following stimulation with PMA or Angiotensin II, significantly higher chem-iluminescence levels were measured in hypertensive patients compared to healthy volunteers. Chemiluminescence activity levels did not differ significantly between the patient and control groups if the monocytes were incubated with PMA and LPS.
Conclusion – Previous data collections of other groups focusing on monocyte adhesion were based upon animal models. Our experiments were performed on human monocytes and human endothelial cells for the first time. These data indicate that monocytes of patients with essential hypertension may be preactivated. My results support the view of a monocyte involvement in the pathogenesis of atherosclerotic lesions that are related to arterial hypertension.
Als Sonderform wird die isolierte systolische Hypertonie mit einer Erhöhung des systolischen Wertes auf ≥ 140 mmHg bei einem normalen diastolischen Druckanteil (< 90 mmHg) definiert.
Die Prävalenz der arteriellen Hypertonie der Erwachsenenpopulation in Industrieländern der westlichen Welt beträgt circa 15 - 25 %. Die Prävalenz von Bluthochdruck schwankt stark in Abhängigkeit von Alter (jenseits des 65. Lebensjahres beträgt die Prävalenz > 50 %), Geschlecht, Rasse, hormonellen und sozio-ökonomischen Einflüssen [Chalmers et al, WHO-ISH 1999; DLBB eV - DHG 1999; Mensah 2002].
Bei 95 % aller Hypertonien ist kein konkreter funktioneller oder morphologisch pathologischer Organbefund diagnostizierbar. Die Entstehung wird polygenetisch determiniert und durch Umweltfaktoren modifiziert. Nicht beeinflussbare Risikofaktoren sind genetische Prädisposition, Alter und Geschlecht. Als beeinflussbare Risikofaktoren gelten Übergewicht, Bewegungsmangel, erhöhter Kochsalz- und Alkoholkonsum.
Als sekundäre Hypertoniewird eine Blutdruckerhöhung infolge einer renalen, endokrinen oder kardiovaskulären Grunderkrankung mit sekundärer Blutdruckerhöhung bezeichnet.
Diagnostische Maßnahmen bei arterieller Hypertonie zielen darauf ab, erstens die Diagnose "Hochdruck" zu sichern, zweitens hochdruckbedingte Organschäden, Begleiterkrankungen und Risikofaktoren, die sich auf den Blutdruck, Krankheitsverlauf sowie Prognose auswirken können, zu erfassen und drittens Anhaltspunkte für eine sekundäre Hypertonie, d.h. organisch begründbare Hochdruckursachen, zu erhalten [Scholze 1999, DLBB eV - DHG 1999, Chalmers et al, WHO-ISH 1999].
Die Diagnose einer arteriellen Hypertonie ist durch eine standardisierte Blutdruckmessung im Sitzen an beiden Oberarmen, nach einer Ruhepause von 3 bis 5 Minuten, an drei verschiedenen Tagen und zu möglichst unterschiedlichen Tageszeiten zu stellen.
Eine Basisdiagnostik, inklusive Herz-Kreislauf-Risikoprofil (Anamnese, körperlicher Befund, Serum-Elektrolyte (K+, Na+), Kreatinin, Glukose, Cholesterin, Urinstatus gegebenenfalls mit Mikroalbuminbestimmung, Elektrokardiogramm, Nierensonographie) ist bei jedem Patienten mit mehrfach gemessenen Werten von 140/90 mm Hg und darüber angezeigt [Chalmers et al, WHO-ISH 1999; DLBB eV - DHG 1999; Scholze 1999; Peters 2002; Blumenfeld 2001; Klose 1996; Levine et al 1995; Shepherd et al 1995; SSSS Group 1994; Heinonen et al 1994; Frick et al 1987; Bartha 1978].
Weiterführende diagnostische Maßnahmen können beinhalten:
Funktionsdiagnostik: Ergometrie, Echokardiographie, Doppler-(Farbduplex)-Sonographie arterieller Gefäße (Carotiden, Aa. renales, Extremitätenarterien etc.), spezielle Szintigraphie, Angiographie (intraarterielle digitale Substraktions-angiographie, Spiral-CT, MR-Angiographie). Die einzelnen Maßnahmen sind gezielt aufgrund konkreter Hinweise aus der Basisdiagnostik in Abhängigkeit von Blutdruckhöhe, Alter bzw. bei Verdacht auf Begleitkrankheiten oder Endorganschäden auszuwählen.
Die WHO-Empfehlungen des Jahres 1999 zur Risikowertung einer arteriellen Hypertonie orientieren sich nicht mehr nur an der Blutdruckhöhe, sondern beachten auch das Gesamtrisikoprofil des Patienten [Chalmers et al, WHO-ISH 1999]. Hierzu zählen weitere Herz-Kreislauf-Risikofaktoren wie z.B. gleichzeitig vorhandene Dyslipoproteinämie, Adipositas und Nikotinabusus.
1. Kardiovaskuläre Risikofaktoren
1.1. Anzuwenden zur Risikostratifizierung
Schweregrad der Hypertonie
Rauchen
Dyslipoproteinämie
Diabetes mellitus
nicht beeinflussbar:
Alter
a) Männer > 55 Jahre
1.2. Weitere Risikofaktoren
Übergewicht
Körperliche Inaktivität
Erhöhtes Fibrinogen
Linksherzhypertrophie
Hyperalbuminurie
sonografischer oder radiologischer Nachweis arteriosklerotischer Plaques an den großen Gefäßen
Proteinurie oder leichte Kreatininerhöhung
Hypertensive Retinopathie
3. Folge- und Begleiterkrankungen
KHK mit Angina pectoris oder Myokardinfarkt, CABG oder PTCA in Vorgeschichte
Herzinsuffizienz
Schlaganfall oder Transitorische ischämische Attacke (TIA)
Chronische Nierenerkrankung, Proteinurie
periphere arterielle Verschlußkrankheit
Als besonders risikoinduzierend gelten Endorganschäden wie Linksherzhypertrophie, Albuminurie und Intima-Media-Verdickung der großen Gefäße. Ein Diabetes mellitus wird in seiner Risikowertung den Endorganschäden gleichgesetzt. Das höchste Risiko einer Blutdruckerhöhung ist gegeben, wenn der Patient schon eine Hypertonie-assoziierte Erkrankung wie Herzinfarkt, Apoplex oder Herzinsuffizienz erlitten hat. Die nächtliche Blutdruckerhöhung gilt als ein weiterer wichtiger Risikoindikator. So findet sich bei fehlender nächtlicher Blutdruckabsenkung (< 5 % des Tagesmittelwertes), besonders aber bei nächtlichem Blutdruckanstieg, eine deutlich erhöhte kardiovaskuläre Ereignisrate. Dies gilt sowohl für Herzinfarkte als auch Apoplexe. Auch die Reinfarkt- oder Reinsult-Rate steigt bei den betroffenen Patienten, wenn die physiologische Nachtsenke des Blutdruckes (normal > 10-15% des Tagesmittelwertes), fehlt. Zur Risikowertung der Hypertonie sollte demnach auch das nächtliche Verhalten des Blutdruckes erfasst werden [DLBB eV - DHG 1999; Mancia et al1993; Middecke 1998; Schrader 1995]. Berücksichtigt man die Höhe des Blutdrucks bzw. den Hypertonieschweregrad sowie die oben erwähnten Faktoren und Erkrankungen, lässt sich das kardiovaskuläre Gesamtrisiko abschätzen. Grundlage für eine von der WHO vorgeschlagene Differenzierung in vier Klassen ist die Prognose. Die Prognose wurde basierend auf großen epidemiologischen Studien, als 10-Jahres-Risiko einen kardiovaskulär bedingten Tod, nichttödlichen Schlaganfall oder Myokardinfarkt zu erleiden, kalkuliert.
Ziel jeglicher therapeutischer Bemühungen beim Hochdruckpatienten ist die Verbesserung der Prognose, d.h. die Vermeidung und gegebenenfalls die Rückbildung von Endorganschäden und damit die Senkung der kardio-/ zerebrovaskulären Morbidität und Mortalität. Das betrifft beim Herzen die linksventrikuläre Hypertrophie, die Herzinsuffizienz, koronare Zirkulations-störungen und den Herzinfarkt. Im Bereich des ZNS sind die transitorische ischämische Attacke (TIA), das prolongierte reversible ischämische neurologische Defizit (PRIND) sowie der Schlaganfall und an den Nieren die Albumin-/Proteinurie und die Niereninsuffizienz zu berücksichtigen. An den Gefäßen sind die Entwicklung einer Intima-Media-Dickenzunahme sowie Plaques und atherothrombotische Komplikationen zu beobachten. Der anzustrebende Zielblutdruck sollte unabhängig vom Lebensalter 140/90 mmHg oder niedriger, bei begleitendem Diabetes mellitus, Nieren- und Herzinsuffizienz 130/80 mmHg oder niedriger betragen. Die Blutdrucksenkung sollte langsam über Wochen und bei älteren Patienten gegebenenfalls sogar über Monate unter Beibehaltung bzw. Verbesserung der individuellen Lebensqualität erfolgen [Chalmers et al, WHO-ISH 1999; DLBB eV - DHG 1999; Scholze 1999; Slama et al 2002; Hansson et al 1998; Hansson et al 1999; Wiklund et al 1997; Bulpitt et al 1994].
Nichtmedikamentöse blutdrucksenkende Allgemeinmaßnahmen
Gewichtsnormalisierung/ -reduktion (Blutdrucksenkung pro kg Gewichtsverlust ca. 2 mmHg)
Ernährung:
kochsalzarm (< 6 g NaCl/d),
fettreduziert (besonders tierische Fette),
bevorzugt Gemüse, Salate, Fisch und pflanzliche Öle,
Reduktion des Alkoholkonsums auf unter 30 g/d
Regelmäßige sportliche Ausdauerbetätigung:
Walking, Radfahren, Jogging.
Abbau von Dysstreß (rasche, unregelmäßige Wechselschichten meiden; Entspannungsübungen).
Überprüfung der Indikation für eine laufende Therapie mit nichtsteroidalen Antirheumatika, Steroiden, Cyclosporin A und oralen Kontrazeptiva.
Verzicht auf Nikotinkonsum (assoziiertes Risiko wird gesenkt).
Prinzipiell gilt der Grundsatz: Je höher das individuelle Risiko, desto früher und konsequenter sollte der Blutdruck zu normalisiert werden. Daraus leiten sich in zeitlicher Abfolge die Indikationen zum Beginn einer Pharmakotherapie im Blutdruckbereich bis 160/100 mmHg ab, darüber gelegene Werte sollten umgehend sowohl der nichtmedikamentösen als auch der Pharmakotherapie zugeführt werden.
Wir wählten für unsere Versuche den AT1-Rezeptorantagonist Eprosartan als Antagonisten der Angiotensin II – Wirkung aus. Angiotensin II Typ 1 Rezeptor-Antagonisten wird eine wachsende Aufmerksamkeit bei der Behandlung der arteriellen Hypertonie zuteil.
Als erster Angiotensin II – Rezeptorantagonist wurde in den 70er Jahren die Substanz Saralasin synthetisiert. Diese Substanz hemmt den AT1–Rezeptor nicht spezifisch und zeigt intrinsische Wirkung. Unglücklicherweise war Saralasin oral verabreicht nicht aktiv und hatte nur eine sehr kurze Wirkdauer, sodass eine antihypertensive Langzeitbehandlung mit diesem Medikament nicht möglich war.
1988 erfolgte die Erstbeschreibung von Losartan als dem ersten nicht-peptidischen AT1–Rezeptorantagonisten [Carini und Duncia 1988].
Arteriosklerose ist in der westlichen Gesellschaft eine der häufigsten fatalen Erkrankungen. Heutzutage geht man davon aus, dass es sich um einen in der Kindheit beginnenden multifaktoriellen Prozess handelt, der im späteren Leben manifest wird. Obwohl atherosklerotische Veränderungen im gesamten Körper beobachtet werden können, sind bestimmte Gefäßzonen, die erhöhtem hämodynamischen Stress unterliegen besonders krankheitsgefährdet. Hierzu gehören der Aortenbogen, die Verzweigungsstellen größerer Gefäße und die Carotis- und Coronararterien. Histologisch lassen sich atherosklerotische Läsionen durch die Proliferation von Intimazellen der Arterienwand, der Akkumulation von Lipiden und Ablagerungen von Bestandteilen der extrazellulären Matrix charakterisieren. Voll entwickelte atherosklerotische Plaques enthalten lipidbeladene Makrophagen und glatte Muskelzellen, sowie Schaumzellen und extrazelluläre Cholesterolkristalle und können ulzerieren sowie kalzifizieren.
Zahlreiche pathophysiologische Beobachtungen an Menschen und Tieren führten zu der Formulierung der „response-to-injury“ Hypothese der Atherosklerose [Ross et al 1973]. Diese Hypothese legte nahe, dass Ablagerungen in den Arterien der erste Schritt der Atherogenese sind. Gegenwärtig wird die Betonung eher auf eine endotheliale Dysfunktion als Teil dieser Hypothese gelegt. Mögliche Ursachen der endothelialen Dysfunktion, die zur Atherosklerose führen können, schließen –
erhöhtes und modifiziertes LDL [Steinberg 1997; Griendling et al 1997; Diaz et al 1997; Rajavashisth et al 1990; Hajjar und Haberland 1997],
durch Zigarettenrauchen freigesetzte Radikale,
arterielle Hypertonie,
Diabetes mellitus,
genetische Veränderungen,
erhöhte Plasma-Homozystein Konzentrationen,
infektiöse Mikroorganismen, wie Herpesviren oder Chlamydia pneumoniae [Libby et al 1997; Jackson et al 1997],
- sowie Kombinationen dieser oder anderer Faktoren ein [Ross 1993].
Die durch die Verletzung bedingte endotheliale Dysfunktion führt zu Kompensationsmechanismen, die normale Homöostase des Gefäßes beeinträchtigen. Die verschiedenen Verletzungsformen vermitteln einen Anstieg der Adhäsionsbereitschaft des Endothels gegenüber Leukozyten und Thrombozyten sowie auch eine erhöhte Permeabilität des Endothels. Der Endothelschaden ist auch für die prokoagulatorischen Eigenschaften des sonst antikoagulatorisch wirkenden Endothels verantwortlich und induziert die Bildung vasoaktiver Moleküle, Zytokine und Wachstumsfaktoren. Wenn die angreifenden Substanzen durch die Entzündungsantwort nicht effektiv neutralisiert werden, kann der Prozess unbegrenzt fortschreiten. Durch die Entzündung werden Migration und Proliferation von glatten Muskelzellen stimuliert, die, im Entzündungsgebiet eingebunden, eine Intermediärlesion formen. Bei weiterem ungehindertem Fortschreiten der Entzündungsreaktion kann sie eine Verdickung der Arterienwand hervorrufen, die durch eine allmähliche Dilatation reagiert. Bis zu diesem Punkt bleibt das Gefäßlumen unverändert, oder ein Phänomen, das „remodeling“ genannt wird. Granulozyten sind nicht bei allen Stadien der Atherogenese anwesend. Stattdessen wird die Antwort durch von Monozyten abstammende Makrophagen und spezielle Subtypen von T-Lymphozyten während jedes Krankheitsstadiums vermittelt [Ross 1999].
Arterieller Bluthochdruck wird als einer der führenden Risikofaktoren in der Ätiologie der atherosklerotischen Gefäßkrankheit aufgefasst [Simon et al 1995; Violi et al 1996]. Die Mechanismen, die arterielle Hypertonie mit der erhöhten Inzidenz von Atherosklerose verbinden sind bisher jedoch nur unvollständig aufgeklärt worden [Tummala et al 1999, Frostegard et al 1998]. Einerseits wurde endotheliale Dysfunktion bei arterieller Hypertonie anhand eines erhöhten Niveaus des Schadensmarkers von-Willebrandt-Faktor, Endothel- abhängige gestörte Relaxation aufgezeigt [Blann 1998]. Hohe Plasmakonzentrationen des von-Willebrandt-Faktor lassen sich durch eine erfolgreiche antihypertensive Therapie senken [Blann and Waite 1996]. Andererseits sind die Adhärenz und transendotheliale Migration von zirkulierenden Monozyten in die Intima wichtige Etappen der Initiation der Atherosklerose [Ross 1993].
Bei Patienten mit arterieller Hypertonie finden sich oft erhöhte Konzentrationen des potenten Vasokonstriktors Angiotensin II. Zusätzlich zu seiner Hypertonie verursachenden Wirkung kann das Angiotensin auch durch eine Wachstumsstimulation glatter Muskelzellen zur Atherogenese beitragen [Ross 1999]. Angiotensin II bindet an spezifische Rezeptoren der glatten Muskelzellen und führt zu einer Aktivierung der Phospholipase C. Dies kann zu einer erhöhten intrazellulären Kalziumkonzentration und zu einer Kontraktion der glatten Muskulatur, zur erhöhter Proteinsynthese und Hypertrophie der glatten Muskulatur führen. Außerdem erhöht Angiotensin II die Lipoxygenaseaktivität der glatten Muskulatur, was die Entzündung und die Oxidation von LDL verstärken kann. Arterielle Hypertonie weist auch proinflammatorische Effekte auf und erhöht die Bildung von Wasserstoffperoxid sowie freien Radikalen wie dem Superoxidanion oder dem Hydroxylradikal im Plasma [Griendling et al 1997; Lacy et al 1998; Swei et al 1997]. Diese Substanzen reduzieren die Formung von Nitritoxid durch das Endothel [Vanhoutte und Boulanger 1995], erhöhen die Leukozytenadhäsion [Swei et al 1997] und können den peripheren Widerstand erhöhen.
Die Art der Strömung, das heißt, ob die Scherkräfte oder die Turbulenzen hoch oder niedrig sind, scheint entscheidend dafür zu sein, ob Läsionen an einer bestimmten Stelle im Gefäß entstehen. Strömungsänderungen beeinflussen die Expression von Genen, die Elemente an ihren Promoterregionen aufweisen, die auf Scherkräfte reagieren. Die Gene für das Interzelluläre Adhäsionsmolekül-1, die Platelet-derived-growth-factor-B Kette und den Tissue Factor besitzen diese Elemente beispielsweise. Ihre Expression wird durch reduzierte Scherkräfte verstärkt. Alterationen des Blutstromes scheinen entscheidend dafür zu sein, welche Stellen der Arterien anfällig für Läsionen sind. Als Folge der Hochregulation der Adhäsionsmoleküle an Endothel und Leukozyten erfolgt die Anheftung von Monozyten und T-Zellen an diesen Stellen.
Chemokine könnten für die Chemotaxis und Akkumulation von Makrophagen in sogenannten “fatty streaks“ verantwortlich sein. Dieses sind makroskopisch zu differenzierende, kissenförmige, weiße subendotheliale Intimabezirke, die hauptsächlich aus Schaumzellen bestehen und sich entweder zurückbilden oder zu einer fortgeschritteneren Läsion weiterentwickeln. Die Aktivierung von Monozyten und T-Zellen führt zur Hochregulation von Rezeptoren an ihrer Oberfläche, wie etwa der Muzin-ähnlichen Moleküle, die an Selektine binden, oder der Integrine, die sich mit Adhäsionsmolekülen der Immunglobulin-superfamilie und Rezeptoren kombinieren, die chemotaktische Moleküle anziehen. Diese Liganden-Rezeptor Interaktionen aktivieren mononukleäre Zellen. Sie induzieren Zellproliferation und helfen dabei die Entzündungs-reaktion an der Stelle der Läsion zu bestimmen und zu lokalisieren.
Ein Vergleich der relativen Rolle jedes dieser Moleküle beim Entzündungs-prozess in den Arterien und in der mikrovaskulären Struktur könnte Möglichkeiten zur Modifikation des Entzündungsprozesses an der jeweiligen Stelle aufzeigen und so eine Modifikation der Arteriosklerose ermöglichen.
Eine Klasse von Molekülen, die an interzellulären Aktionen beteiligt ist, bilden die Disintegrine. Sie werden manchmal auch als Metalloproteinase-ähnlich, Disintegrin-ähnlich und Cystein-reiche Proteine (MDC´s) bezeichnet und wurden im Endothel, in glatter Muskulatur und in Makrophagen identifiziert. Diese Transmembranproteine enthalten in ihrem extrazellulären Segment eine Metalloproteinase-Sequenz, die es ihnen gestattet, Moleküle wie den Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) zu aktivieren [Black et al 1997]. Sie werden nicht in normalen Arterien vorgefunden, aber MDC15, ein Vertreter dieser Proteinfamilie, ist in atherosklerotischen Läsionen anzutreffen [Herren et al 1997]. Adhäsions-moleküle, wie L-Selektin, können durch die Metalloproteinase (L-Selektin Sheddase) von der Oberfläche der Leukozyten abgespalten werden. Dies legt nahe, dass es in chronischen Entzündungssituationen möglich sein könnte, die ausgeschütteten („shed“) Moleküle, etwa die verschiedenen Adhäsionsmoleküle im Plasma als Marker einer anhaltenden Entzündungsantwort, zu messen [De Caterina et al 1997, Hwang et al 1997]. Disintegrine könnten an diesem Ausschüttungsprozeß (shedding) beteiligt sein. Wenn die Ausschüttung auftritt, könnte sie in verschiedenen Typen von Entzündungsreaktionen detektierbar sein. Patienten, für die ein Arterioskleroserisiko besteht, könnten anhand erhöhter Plasmakonzentrationen der ausgeschütteten Moleküle identifiziert werden.
Die ersten Zellen von denen man annahm, dass sie während der Expansion atherosklerotischer Läsionen proliferieren, waren glatte Muskelzellen. Die Replikation, der von Monozyten abstammenden Makrophagen und T-Zellen, ist wahrscheinlich von gleichrangiger Bedeutung [Rosenfeld and Ross 1990]. Die Fähigkeit der Makrophagen Zytokine (wie den Tumornekrosefaktor-α, Interleukin-1 und den Transformierenden-Wachstumsfaktor-β), und Wachstumsfaktoren (wie den Platelet-derived Growth Factor und Insulin-like Growth Factor-1) zu produzieren könnte entscheidend für die Rolle dieser Zellen bei Schadens- und Reparaturmechanismen sein, die für das Fortschreiten der Läsion verantwortlich sind.
Aktivierte Monozyten exprimieren Klasse-II-Histokompatibilitätsantigene, wie HLA-DR, die ihnen erlauben T-Lymphozyten zu präsentieren [Ross 1999]. So überrascht es nicht, dass zellvermittelte Immunantworten an der Atherogenese beteiligt sind, da CD4- und CD8-Zellen an den Läsionen zu jeder Zeit des Prozesses anwesend sind. Die T-Zellen werden aktiviert, wenn sie von Makrophagen prozessiertes und dargebotenes Antigen binden. T-Zellaktivierung führt zur Sekretion von Zytokinen, einschließlich Interferon-γ und Tumornekrosefaktor-α und -β, die die Entzündungsantwort amplifizieren. Glatte Muskelzellen aus den Läsionen weisen auch, wahrscheinlich durch Interferon-γ induziert, Klasse II HLA Moleküle an ihrer Oberfläche auf. Sie können auch T-Zellen Antigene präsentieren [Hansson et al 1989]. Ein mögliches Antigen könnte oxidiertes LDL sein [Stemme et al 1995], das von Makrophagen prozessiert wird [Folcik et al 1997]. Hitzeschockprotein 60 könnte ebenfalls zur Autoimmunität beitragen. Dieses Hitzeschockprotein dient, wie andere Hitzeschockproteine auch, dem Zusammensetzen, intrazellulären Transport und Abbau von Proteinen und der Verhinderung der Proteindenaturierung. Diese Proteine könnten an Endothelzellen vermehrt sein und an der Immunantwort teilhaben [Wick et al 1997].
Die mögliche Rolle der Leukozyten in der Pathologie der Atherosklerose bei arterieller Hypertonie ist ein Gegenstand von großem wissenschaftlichen Interesse [Shen et al 1995]. Die verfügbaren Informationen zu humanen Monozyten sind infolge der schwierigen Isolation von Monozyten aus dem peripheren Blut gering im Vergleich zu den vorhandenen Informationen über die neutrophilen Granulozyten.
Immunpathogenetische Mechanismen könnten an der Pathogenese der Atherosklerose und des hohen Blutdruckes beteiligt sein. McCarron wies 1994 [McCarron et al 1994] einen signifikanten Anstieg der Monozytenadhäsion an Endothelzellen von spontan hypertonen Ratten (SHR) gegenüber normotonen Wistar-Kyoto Ratten nach. Sie stimulierten die Monozyten mit Lipo-polysaccharid (LPS) oder proinflammatorischen Zytokinen (Interferon-γ [IF-γ], Interleukin-1β [IL-1β] oder Tumor Nekrose Faktor-α [TNF-α]).
Aus unserer Arbeitsgruppe wurde berichtet, dass Monozyten von Patienten mit arterieller Hypertonie nach Stimulation mit Angiotensin II (Ang II) oder Lipo-polysacchariden (LPS) signifikant höhere Mengen an proinflammatorischen Zytokinen (Interleukin-1β (IL-1β) und Tumornekrosefaktor-α (TNF-α)) ver-glichen mit normotonen Personen sezernieren. Eine Hochregulation der IL-1β und TNF-α Expression wurde auch auf RNA-Ebene festgestellt [Dörffel et al 1999]. Unter dem Einfluss von proinflammatorischen Zytokinen verändern Endothelzellen ihre Expression jener Adhäsionsmoleküle, die die Adhäsion der Monozyten an die Intimaoberfläche vermitteln [Swerlick et al 1992].
Die erhöhte Sekretion dieser Zytokine wird als ein Marker für aktivierte zirkulierende Monozyten angesehen [Fiotti et al 1999; Jelinek et al 1987]. Fukai et al (1999) zeigten, dass Angiotensin II und Bluthochdruck mit dem vaskulären Oxidationsstress ansteigen. Dieser kann zur Monozyten-Makrophagen- Infiltration beitragen.
Es wird allgemein angenommen, dass mit größter Wahrscheinlichkeit die Sekretion von Endothelzellfaktoren die Monozytenaktivierung verursacht. Unserer Meinung nach könnten die voraktivierten Monozyten in Patienten mit arterieller Hypertonie zu subendothelialer Infiltration führen und in der Folge das Risiko von atherosklerotischen Komplikationen auch im intakten Endothel erhöhen.
Monozyten aus peripherem Blut von Patienten mit essentieller Hypertonie und von gesunden Probanden, bei denen in vitro eine erhöhte Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen nachgewiesen werden konnte, sollten hinsichtlich weiterer möglicher Unterschiede des Aktivierungszustands analysiert werden. Dazu sollte das Adhäsionsverhalten der Monozyten, an von uns kultivierte humane Aortenendothelzellen (HAEC), an von uns isolierte und kultivierte Saphenavenenendothelzellen (HSVEC), sowie an Umbilikalvenen- (HUVEC) und Umbilikalarterienendothelzellen (HUAEC) untersucht werden.
Desweiteren sollte die spontane Superoxidfreisetzung von humanem Endothel und humanen Monozyten von Patienten mit arterieller Hypertonie und gesunden Kontrollpersonen analysiert werden. Durch das Messen der Chemilumineszenzaktivität nach Stimulation mit Angiotensin II sollte geklärt werden, ob der arterielle Hypertonus und Angiotensin II eine erhöhte Adhärenz von Monozyten an Endothelzellen verursachen.
Isolation und Stimulation von humanen Monozyten aus dem peripheren Venenblut,
Isolation humaner Endothelzellen aus Vena saphena, Umbilikalarterien und Umbilikalvenen,
Kultur humaner Endothelzellen aus Aorta, Vena saphena und Umbilikalarterien und Umbilikalvenen,
Messung der Adhäsion von Monozyten an humane Endothelzellen aus Aorta, Vena saphena und Umbilikalarterien und -venen,
Bestimmung der Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM und E-Selectin
Bestimmung der Superoxidfreisetzung von humanen Umbilikalvenenendothelzellen und Monozyten
gesucht und weiterentwickelt. Wir haben Stichproben von Hypertoniepatienten und gesunden Kontrollpersonen zusammengestellt und geeignete Verfahren zur Auswertung der Daten herangezogen.
Zur Evaluation des Adhäsionsverhaltens humaner Monozyten aus peripherem Blut wurden Versuche an humanen Aortenzellen, selbst isolierten Endothelzellen aus humaner Vena saphena, aus Umbilikalarterie und aus Umbilikalvene durchgeführt. Die Superoxidfreisetzung humaner Monozyten aus dem peripheren Blut wurde durch Messung der Chemilumineszenzaktivität untersucht.
Periphere Blut - Monozyten erhielten wir von 11 weiblichen und 11 männlichen Patienten im Alter zwischen 18 und 64 Jahren mit essentieller Hypertonie ohne antihypertensive Therapie, oder nach kompletter mindestens zehntägiger Therapiepause. Der Anteil der noch nie behandelten Hypertoniker lag bei 41 %. Alle Patienten unterlagen im Rahmen der klinischen Evaluation einer ambulanten 24-Stundenblutdruckmessung (ABDM). Es nahmen nur Patienten mit diastolischen Blutdruckwerten zwischen 90 und 110 mmHg an der Studie teil. Das mittlere Alter betrug 37 Jahre, der mittlere Blutdruck lag bei 158/95 mmHg. Das mittlere Körpergewicht betrug 73 ± 1,4 kg (SEM) und der mittlere Body Mass Index der Patienten lag bei 24,5 ± 0,51 kg/m2 (SEM).
Ausschlusskriterien von der Studie stellten alle anderen Krankheiten einschließlich sekundärer arterieller Hypertonie dar. Patienten und Kontrollen wurden auch aus der Studie ausgeschlossen, wenn sich bei den Laboruntersuchungen (Tabelle) pathologische Befunde zeigten. Es wurden die Serumkonzentrationen von Kalium (K+), Kreatinin (Krea), Leberenzymen (AST und ALT), die Erythrozytensedimentationsrate (BSG), C-reaktives Protein
(CRP), Leuko-, Thrombo- und Erythrozytenzahlen und LDL-Werte erfasst. Tabakraucher wurden von der Studie ausgeschlossen. Weitere Ausschlusskriterien stellten pathologisch veränderte Werte der ultrasonographisch gemessenen Intima-Media-Dicke der Arteria carotis, A. femoralis oder Aorta und vorhandene atherosklerotische Läsionen der Gefäße dar.
Sämtliche Versuche fanden unter sterilen Bedingungen im Labor statt.
Alle Lösungen und Chemikalien, die wir für die Isolations- und Aktivierungsprozeduren benutzt haben, waren endotoxinfrei. Das heißt, der Endotoxingehalt lag <0.01 ng/ml.
Humane Aortenendothelzellen bezogen wir von der Firma CellSystems Biotechnologie Vertrieb GmbH, St. Katharinen, Deutschland.
Die Monozyten wurden mittels Dichtegradienten-Zentrifugation (Megafuge, Heraeus) und Plastikadhärenz isoliert, wie von Rückert – Dörffel et al beschrieben [Rückert-Dörffel et al 1996; Dörffel et al 1999; Dörffel et al 2001]. Peripheres Venenblut wurde mit physiologischer Kochsalzlösung, die 100 U Heparin/ml enthielt, verdünnt. Dann wurde die Lösung über Ficoll-Paque (mit einer spezifischen Dichte von 1.077, hergestellt von Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) in spezielle Reagenzgefäße (Falcon, 50 ml) zur Leukozytenabtrennung geschichtet. Die Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 400x g zentrifugiert. Die aus der Interphase geernteten Zellen wurden in Phosphate Buffered Saline (PBS) gewaschen und in RPMI 1640-Medium (ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum (FCS), 100 Internationalen Einheiten (IE bzw. U)/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, und 50 µg/ml Gentamycin) resuspendiert. Die Zellen wurden in Petrischalen (Greiner GmbH, Nürtingen) angesiedelt und für eine Stunde bei 37°C mit 5% CO2 Begasung im Brutschrank inkubiert. Nichtadhärente Zellen wurden durch mehrmaliges Spülen mit auf 37°C vorgewärmtem RPMI 1640 von den Petrischalen verworfen. Mehr als 99% der adhärenten Zellen konnten durch das Spülen mit 4°C kaltem RPMI 1640 und durch vorsichtiges mechanisches Schaben abgelöst werden. Die adhärenten Zellen wurden in PBS gewaschen und für experimentelle Vorhaben in RPMI 1640 überführt, das mit 1% humanem Serumalbumin N 20% (Bayer, Leverkusen) ergänzt wurde; die Zellzahl wurde auf 1 x 106 Zellen/ ml eingestellt.
Die Identifikation der peripheren Blutmonozyten erfolgte mittels Fluoreszenz - aktiviertem Zellsortierer (FACS). Mittels Immunfluoreszenzfärbung der Oberflächenantigene wurden die Monozyten isoliert, wie bereits von Dörffel et al beschrieben [Dörffel et al 1999]. Monoklonale, für humane T-Zellen (CD 3; Clone UCHT1, code: F0818), humane B-Zellen (CD19; Clone HD37, code: F0768) und humane Monozyten (CD 14, CloneTÜK4, code: R0864) spezifische Mäuseantikörper wurden von DAKO A/S (Dänemark) bezogen. Eine angemessene Kontrolle durch Antikörper mit irrelevanter Spezifität wurde durchgeführt, um unspezifische Färbungen zu erkennen. Die mit den Antikörpern gefärbten Zellen wurden hinsichtlich ihrer Fluoreszenz mit einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACScalibur, Becton Dickinson Immunometry Systems, San Jose, CA, USA) untersucht. Die relative Häufigkeit der Zellen, die verschiedenen Zelloberflächenantigene zu exprimieren, wurde nach der Substraktion der Kontrollzellen von den experimentellen Fluoreszenzprofilen am Computer berechnet. Die Zellsuspension enthielt 94% Monozyten.
Die optimalen Bedingungen und Konzentrationen für die Stimulation der peripheren Blutmonzyten mit Angiotensin II und LPS wurden durch Zeit- und Konzentrationskinetiken bestimmt wie von Dörffel et al beschrieben [Dörffel et al 2001].
Die Zellen trafen tiefgefroren in Endothelzellwachstumsmedium (EGM 2, CellSystems, St. Katharinen) mit 10 % fetalem Kälberserum bei uns ein. Die Zellen wurden aufgetaut und in T25 - Kulturflaschen ausgesät, - 2500 Zellen/cm2 - bei 37°C und bei 5% CO2 inkubiert. Die Zellen wurden jeden zweiten Tag mit EGM 2 gefüttert. 48 Stunden vor dem Adhäsionsversuch wurden die Zellen bei 90 % Konfluenz durch Trypsinieren subkultiviert. 10 000 bis 50 000 Zellen wurden in einem halben ml EGM 2 resuspendiert und in 24-Loch-Platten überführt.
Zur Entwicklung einer Methode zur Isolierung humaner Endothelzellen aus der Vena saphena haben wir das Protokoll von Jaffe et al zur Isolierung von Endothelzellen aus Umbilikalvenen abgewandelt [Jaffe et al 1973].
Die Saphenavenen wurden intraoperativ unmittelbar nach erfolgter Saphenektomie in sterile Behälter mit einer Pufferlösung, die sich aus 0,14 mol/l NaCl, 0,004 mol/l KCl, 0,001 mol/l HEPES Puffer (pH von 7,4) und 0,011 mol/l Glucose zusammensetzte, überführt und bei 4°C bis zur Verarbeitung innerhalb von 24 Stunden gelagert. Unter sterilen Arbeitsbedingungen wurden die sichtbaren Gefäßabzweigungen der Vene mit chirurgischem Nahtmaterial ligiert. Die Vena saphena wurde dann mit female Luer Lock Konnektoren (Firma Sherwood Medical, Tullamore, Irland) bei einem Gefäßdurchmesser > 5mm, mit Knopfkanülen (Firma Falk Medizintechnik Berlin) bei einem Gefäßdurchmesser > 3 mm oder mit von uns stumpf geschliffenen Sterican Kanülen (B/Braun, Melsungen) bei einem noch kleineren Gefäßdurchmesser kanüliert. Die Kanülen wurden mittels steriler Nylonfäden fixiert. Nacheinander wurde mit einer 10 ml Spritze (B/Braun, Melsungen) je eine Kanüle geblockt. Durch die nicht geblockte Kanüle am anderen Gefäßende wurde das Gefäß mit der Pufferlösung gespült. Die nun durch austretenden Puffer sich bemerkbar machenden weiteren Gefäßabgänge der Vena Saphena wurden mit chirurgischem Nahtmaterial (4-0 Prolene, Ethicon, Norderstedt) ligiert. Nachdem das Gefäß mit insgesamt 100 ml Pufferlösung gespült worden war, wurde auf eine der beiden Kanülen ein 4 cm langer Silikonschlauch (Durchmesser von 0,8 cm) aufgesetzt und befestigt. 10 ml 0,2% Kollagenase (Collagenase 2, Worthington, CellSystems Biotechnologie Vertriebs GmbH) in Pufferlösung wurde mit einer Spritze in die Vene injiziert. Der Silikonschlauch wurde an einem Ende mit einer Klemme verschlossen, während die Spritze am anderen Ende im Konnektor fixiert war. Die Kollagenase - Verdauung fand während einer Inkubationszeit von 30 Minuten im Brutschrank bei 37°C, 5% CO2, statt. Dann wurde die Einwirkung des Enzyms durch Spülen der Vene mit 50 ml Pufferlösung beendet und die gesamte Lösung mit den Endothelzellen in ein steriles 50 ml Röhrchen (Falcon®) überführt, das 10 ml des Mediums 199 (M-199, Bio Whittaker, Boehringer Ingelheim Bioproducts Partnership, Heidelberg) mit 20% FCS (fötales Kälberserum) enthielt. Die Zellen wurden 5 Minuten bei 400 g zentrifugiert, in ECGM (Promocell, Heidelberg) resuspendiert und schließlich in 24-Lochplatten der Firma Nunc (Roskilde, Dänemark) mit einer Konzentration von 10000 - 50000 Zellen pro 0,5 ml ECGM pro Vertiefung der Lochplatte ausgesät und bei 37°C und 5% CO2 dampfgesättigter Atmosphäre im Brutschrank inkubiert. Die Zellen wurden durch Austauschen des verbrauchten Wachstumsmediums alle zwei bis drei Tage gefüttert. Die humanen Saphenavenenendothelzellen wurden etwa 48 Stunden vor dem geplanten Monozytenadhäsionsversuch durch Trypsinieren subkultiviert. Damit wurde sicher gestellt, dass nur frische Zellen benutzt wurden.
Zur Isolation der Endothelzellen aus humanen Umbilikalarterien kam das Protokoll von Jaffe et al mit leichten Abwandlungen, wie von Dörffel et al 2001 in der Zeitschrift „Atherosclerosis“ beschrieben, zur Anwendung [Jaffe et al 1973]. Zur Kanülierung der Arterie wurden von uns stumpf geschliffene Kanülen der Firma B/Braun (Melsungen) verwendet. Die Zellen wurden in serumarmem Medium (ECGM, Promocell, Heidelberg) endotoxinfrei gezüchtet.
Die Endothelzellen wurden durch Kollagenaseverdauung aus dem Inneren der Vene herausgelöst. 10 ml 0,2% Kollagenase (Collagenase P, Boehriner Mannheim GmbH) kamen zur Anwendung. Die Kollagenase - Verdauung fand während einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur statt. Mit 30 ml Pufferlösung wurde die Enzymwirkung nach abgelaufener Zeit gestoppt.
Die Zellen wurden in serumarmem Medium (ECGM, Promocell, Heidelberg) endotoxinfrei gezüchtet.
Die Monozytenadhäsion an Endothelzellen wurde wie von Hahn et al be-schrieben mit kleineren Änderungen durchgeführt [Hahn et al 1994]. Konfluente HAEC Monolayer wurden mindestens 2 Stunden vor Versuchsbeginn in serumfreies Medium überführt. Dazu wurde das Wachstumsmedium ECGM mit niedrigem Serumgehalt durch RPMI 1640 mit 1% Humanserumalbumin ergänzt. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Monozyten einmal mit RPMI 1640 (inklusive 1% HSA) gewaschen, unter dem Mikroskop gezählt, resuspendiert und anschließend jeweils 1 x 106 Zellen in ein Loch einer 24-Lochplatte auf die konfluenten Endothelzellen gesät. Die nicht adhärenten Monozyten wurden 2 Stunden später eingesammelt und unter einem Mikroskop mit Phasenkontrast (inverses Labormikroskop Leica DM IL HC, Leica Microsystems GmbH, Wetzlar) gezählt. Die Monozytenadhäsion wird als Prozent der initial gesäten Zellen angegeben.
Die obige Methode wurde in unserer Arbeitsgruppe durch einen zweiten Adhäsionsversuch überprüft, der wie von McCarron et al beschrieben mit kleineren Abweichungen durchgeführt wurde [McCarron et al 1994]. Die Monozyten habe ich bereit gestellt, die Messungen mit dem radioaktiven Material wurden durch unsere Arbeitsgruppe in einem Speziallabor vorgenommen.
Es wurden Blutproben zur Bestimmung der zirkulierenden Menge an löslichem humanem ICAM 1 (löslichem Interzellulärem Adhäsionsmolekül-1), löslichem humanem VCAM-1 (Gefäßzell-Adhäsionsmolekül-1) und löslichem humanem E-Selectin (Endothel - Leukozyten-Adhäsionsmolekül-1) gesammelt. Die Seren wurden jeweils doppelt mit dem kommerziellen, auf monoklonalen Antikörpern basierenden ELISA von R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) analysiert. Wir benutzten Parameterkits für sICAM-1, sVCAM-1 und sE-Selektin.
Die Serumproben wurden mit einer Verdünnungslösung durchmischt: Es wurden 15 µl Serumprobe mit 285 µl Verdünnungslösung im Ansatz zur Bestimmung von ICAM-1 ergänzt, sowie 10 µl Probe mit 490 µl (20fach) Verdünnungslösung zur Bestimmung von VCAM-1 (50fach) und 25µl Probe mit 475 µl (20fach) Verdünnungslösung zur Bestimmung von E-Selektin verwendet. Alle Reagenzien wurden auf Raumtemperatur (20° C) erwärmt. 100 µl verdünntes Konjugat wurden in jede Vertiefung einer Microlochplatte gegeben. Damit wurden 100 µl Standard, Kontrolle oder Probe durchmischt. Die Platte wurde abgedeckt und mit einem Plattensiegel 90 Minuten zur Inkubation stehen gelassen. Anschließend wurde der Inhalt jeder Vertiefung aspiriert und die Platte insgesamt sechsmal gewaschen und dekantiert. Dazu wurde jede Vertiefung der Platte mittels einer Multikanalpipette mit 300 µl Waschpuffer gefüllt und anschließend die Flüssigkeit vollständig entfernt. Nach dem letzten Waschdurchgang wurde die Platte mit den Öffnungen der Vertiefungen nach unten gerichtet auf einem Papierhandtuch ausgeklopft. Sofort wurden 100 µl Substrat (vor Licht geschützt) in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde mit der Plattenversiegelungsfolie verschlossen und für 30 Minuten (ICAM-1 und E-Selektin) beziehungsweise 20 Minuten (VCAM-1) ruhen gelassen. In der gleichen Reihenfolge wie das Substrat wurden nun 100 µl Stoplösung in jede Vertiefung gegeben. Die optische Dichte jeder Vertiefung wurde nun innerhalb von 30 Minuten mittels eines ELISA Readers bestimmt und die Konzentration in ng/ml ermittelt. Der Intra-Assay-Variationskoeffizient für sICAM-1 und sE-Selectin betrug 4,8%, und für sVCAM-1 5,9%.
Für HAEC und Monozyten wurde die Sauerstoffradikalfreisetzung mittels Chemilumineszenz ermittelt.
Konfluente Humane Aortenendothelzellen in 20 cm2 Petri - Schalen wurden dreimal mit einem modifizierten Krebspuffer gewaschen [Pueyo et al 1998]. Die Freisetzung von Sauerstoffradikalen von humanen Aortenendothelzellen (HAEC) wurde als Antwort auf Stimulation mit Angiotensin II (10-10 mol/l) gemessen. Bei dem Versuch mit Eprosartan wurde diese Substanz (10-3 mol/l) 30 Minuten vor dem Experiment hinzugefügt. HAEC (105 Zellen) wurden dann abgeschabt und in einem Luminometerröhrchen plaziert. Als chemiluminogenes Substrat wurden 10 ml Lucigenin (2.5 × 10-4 mol/l) hinzugefügt und das Endvolumen auf 1 ml eingestellt. Nach Inkubation über 5 Minuten bei 37°C wurde das Teströhrchen im Chemilumineszenz-Analysator plaziert (Biolumat, LB 9501, Berthold, Deutschland). Messungen wurden alle 30 Sekunden über 2 Stunden bis zu 72 Stunden durchgeführt. Als Differenz zwischen stimulierten und unstimulierten CL - Signalen wurde der Spitzenwert ermittelt, gemessen zum Zeitpunk, an dem das Spitzensignal erreicht wurde. Jede Messung wurde zweimal vorgenommen und der Durchschnitt zweier CL-Signale wurde für die statistische Auswertung verwendet.
Die Monozyten wurden in RPMI 1640 (bei 106 Zellen/ml) resuspendiert und in ein Eisbad gestellt.
Die Freisetzung von Sauerstoffradikalen wurde mit PMA induziert. PMA (in einer Konzentration von 8 × 10-5 mol/l) wurde in DMSO aufgelöst und bei -70°C aufbewahrt. Teile der Probe (jeweils 105 Monozyten) wurden mit Angiotensin II (10-6 mol/l), oder Angiotensin II nach Vorinkubation mit einem AT - 1 Rezeptor - Antagonisten (10-3 mol/l), oder LPS (10 ng/ml) und PMA vorinkubiert bzw. ohne Stimulans belassen.
Die Ergebnisse werden, falls nicht anders notiert, als Mediane ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die statistische Signifikanz der Differenzen wurde mit dem Mann-Whitney-U-Test für nichtnormalverteilte Stichproben getestet. Die Differenzen innerhalb der Gruppen wurden mit den Tests nach Friedman und Wilcoxon evaluiert und eine Alpha-Bonferoni-Abgleichung vorgenommen. Ein P Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Aufgrund der Größe der Stichproben kann von Nichtnormalverteilung der Stichprobe ausgegangen werden. Die Verteilung der Stichprobe wurde auch mit dem Nichtnormalverteilungstest nach Kolmogorov-Smirnov evaluiert.
Die gesamte Statistik wurde mit dem Statistical Package for Social Sciences (SPSS) 9.0 1999 (Chicago, USA) berechnet. Die deskriptive Darstellung der Ergebnisse erfolgte durch Boxplots und Säulendiagramme. Der im Inneren des Blocks gelegene schwarze Balken zeigt den Median an. 50% aller Werte einer Gruppe liegen innerhalb des Blocks (25. bis 75. Perzentile), die restlichen sind durch Antennen gekennzeichnet.
Die Aktivierung der peripheren Blutmonozyten wurde durch die Messung ihrer Adhäsion an humanes einschichtiges Endothel bewertet und als Prozentzahl der initial ausgesäten Zellen angegeben.
Die Spontanadhäsion unstimulierter Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie an humane Aortenendothelzellen war signifikant erhöht im Vergleich mit normotensiven Kontrollen (Patienten – 65 ± 6,52, Kontrollen - 54 ± 7,45, % ± SD, P = 0,001), (Abbildung 1 auf der vorangehenden Seite).
(Abbildung 2)
Vorinkubation mit dem Angiotensin II Typ I Rezeptor - Antagonisten Eprosartan mit anschließender Angiotensin II Exposition verminderte die Adhäsion der Monozyten in beiden Gruppen auf ein vergleichbares Niveau ohne statistischen Unterschied (Patienten – 62,5 ± 6,77, Kontrollen – 51 ± 12,36, % ± SD, P > 0,05), (Abbildung 3).
Sowohl bei Hochdruckpatienten als auch bei Normalkontrollen war die Adhäsion von Monozyten nach Stimulation mit LPS signifikant erhöht im Vergleich zur Spontanadhäsion (Patienten: Spontanadhäsion 65 ± 6,52, Adhäsion nach Stimulation mit LPS 69,5 ± 7,67, % ± SD, P = 0,015; Kontrollen: Spontanadhäsion 54 ± 7,45, Adhäsion nach Stimulation mit LPS 64 ± 8,5, % ± SD, P = 0,01). Die Adhäsion der Monozyten nach LPS Stimulation hat sich zwischen Patienten und Kontrollen nicht signifikant unterschieden (Patienten - 69,5 ± 7,67, Kontrollen 64 ± 8,5, % ± SD, P = 0,132), (Abbildung 4).
Es fand sich keine statistisch signifikante Beziehung zwischen der gemessenen Adhäsion unstimulierter Monozyten an einschichtiges humanes Aortenendothel und dem Alter (nach Pearson r = 0,25, P = 0,26 (nicht signifikant); nach Spearman rs = 0,21, P = 0,35 (nicht signifikant), Abbildung 5) und dem Geschlecht (P = 0,54). Hingegen zeigte sich ein tendenzieller Zusammenhang zwischen der gemessenen Adhäsion und dem systolischen (nach Pearson p = 0,42, P = 0,055; nach Spearman rs = 0,389, P = 0,082) und diastolischen Blutdruck (nach Pearson r = 0,41, P = 0,059; nach Spearman rs = 0,072, P = 0,072), (Abbildung 5).
Wir haben die Adhäsion von Monozyten aus dem peripheren Blut an eine Schicht humaner Endothelzellen aus der Vena saphena in vitro bestimmt.
Sowohl bei Hochdruckpatienten als auch bei Normalkontrollen war die Adhäsion von Monozyten nach Stimulation mit LPS tendenziell erhöht im Vergleich zur Spontanadhäsion (Patienten: Spontanadhäsion 73,5 ± 2,12, Adhäsion nach Stimulation mit LPS 78,5 ± 3,53, % ± SD, P = 0,18; Kontrollen: Spontanadhäsion 53 ± 8,48, Adhäsion nach Stimulation mit LPS 76,5 ± 9,19, % ± SD, P = 0,18). Die Adhäsion der Monozyten nach LPS Stimulation hat sich zwischen Patienten und Kontrollen nicht signifikant unterschieden (Patienten 69,5 ± 7,67, Kontrollen 64 ± 8,5, % ± SD, P = 0,18), (Abbildung 6).
Vorinkubation mit dem Angiotensin II Typ I Rezeptor - Antagonisten Eprosartan, mit anschließender Angiotensin II Exposition, verminderte die Adhäsion der Monozyten in beiden Gruppen statistisch nicht signifikant. Die Adhäsion unterschied sich ebenfalls nicht statistisch signifikant zwischen Patienten- und Kontrollgruppe (Patienten – 61,5 ± 6,36, Kontrollen – 30,5 ± 3,53, % ± SD, P > 0,18), (Abbildung 7).
Die Spontanadhäsion unstimulierter Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie an HUVEC war statistisch signifikant erhöht im Vergleich mit normotensiven Kontrollen (Patienten – 81,0 ± 5,19, Kontrollen - 36 ± 11,3 % ± SD, P = 0,021), (Abbildung 8).
Die Adhäsion der Monozyten nach LPS Stimulation hat sich zwischen Patienten und Kontrollen nicht signifikant unterschieden (Patienten 77,0 ± 10,01, Kontrollen 59,0 ± 13,16, % ± SD, P = 0,2), (Abbildung 8).
Bei den Kontrollpersonen war die Adhäsion von Monozyten nach Stimulation mit LPS statistisch signifikant erhöht im Vergleich zur Spontanadhäsion (Kontrollen: Spontanadhäsion - 36 ± 11,3, Adhäsion nach Stimulation mit LPS 59,0 ± 13,16, % ± SD, P = 0,043). Bei der Gruppe der Hypertoniker konnte eine tendenziell niedrigere Adhäsion ohne statistische Signifikanz nachgewiesen werden (Patienten: Spontanadhäsion - 81,0 ± 5,19, Adhäsion nach Stimulation mit LPS 77,0 ± 10,01, % ± SD, P = 0,513), (Abbildung 8).
Die Adhäsion von Monozyten, die mit Angiotensin II stimuliert wurden, war statistisch signifikant höher bei Hypertonikern im Vergleich zur Gruppe der gesunden Kontrollpersonen (Patienten – 78,0 ± 3,51, Kontrollen – 49,0 ± 12,8, % ± SD, P = 0,02). In der Kontrollgruppe unterschied sich die Adhäsion nach
Vorinkubation mit dem Angiotensin II Typ I Rezeptor Antagonisten Eprosartan, mit anschließender Angiotensin II Exposition, verminderte die Adhäsion der Monozyten in Patienten- und Kontrollgruppe statistisch nicht signifikant (Patienten: Adhäsion nach Stimulation mit Angiotensin II – 78,0 ± 3,51, Adhäsion nach Vorinkubation mit Eprosartan – 69,0 ± 8,14, % ± SD, P = 0,109; Kontrollen: Adhäsion nach Stimulation mit Angiotensin II – 49,0 ± 12,8, Adhäsion nach Vorinkubation mit Eprosartan – 26,0 ± 14,19, % ± SD, P = 0,273), (Abbildung 9).
Die Messung der Spontanadhäsion humaner Monozyten aus dem peripheren Blut an humane Umbilikalarterienendothelzellen betrug 28%. Nach Stimulation mit Lipopolysacchariden (LPS) ermittelten wir eine im Vergleich dazu erhöhte Adhäsion von 53%.
Wir untersuchten die Spiegel der humanen löslichen Adhäsionsmoleküle hsICAM-1 (humanes lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül-1, Abbildung 10), hsVCAM-1 (humanes lösliches vaskuläres Zelladhäsionsmolekül-1, Abbildung 11) und hsE-Selektin (humanes lösliches E-Selektin, Abbildung 12) im Serum.
Lösliches ICAM-1 war bei Patienten mit arterieller Hypertonie im Vergleich zu Normalkontrollen signifikant erhöht (Patienten – 409,2 ± 205,01, Kontrollen – 211,00 ± 4,46, ng/ml ± SD, P = 0,017, Abbildung 10).
Eine signifikante Erhöhung lies sich auch für sVCAM-1 nachweisen (Patienten – 692,9 ± 116,79, Kontrollen – 553,00 ± 16,78, ng/ml ± SD, P = 0,017, Abbildung 11).
Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen Patienten- und Kontrollgruppe bei den zirkulierenden Mengen an E-Selektin (Patienten - 46,78 ± 48,23, Kontrollen – 46,25 ± 2,75 ng/ml ± SD, P = 0,4, Abbildung 12).
Wir analysierten die Chemilumineszenzaktivität (CL-Aktivität) von humanen Aortenendothelzellen (Tabelle 4).
Vorinkubation mit dem Angiotensin II Typ 1 Rezeptorantagonisten Eprosartan führte zu einer tendenziellen Verminderung der Chemilumineszenzaktivität auf 39 ± 14,1, RLU/s ± SD, P = 0,189. Der Spitzenwert wurde nach 39 ± 14,1, Minuten ± SD erreicht.
Die Spitzenwerte der Chemilumineszenzaktivität von Monozyten, die vor der Stimulation mit Phorbol-Myristat-Azetat (PMA) ermittelt wurden, unterscheiden sich nicht signifikant zwischen Patienten- und Kontrollgruppe. (Patienten: 57,5 ± 60,12; Kontrollen: 45,5 ± 34,16; RLU/s ± SEM, P = 0,4), (Abbildung 13).
Die Chemilumineszenzaktivität von Patientenmonozyten unterschied sich nicht signifikant von Normalkontrollen, wenn Monozyten mit Phorbol-Myristat-Azetat (PMA) und Lipopolysacchariden (LPS) inkubiert wurden. (Patienten - 2483 ± 1780, Kontrollen - 519 ± 533,12, RLU/s ± SEM, P = 0,094, Abbildung 14).
Der Spitzenwert der Chemilumineszenzaktivität [time peak] wurde in Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie, die mit PMA stimuliert wurden im Vergleich zu dem der gesunden Gruppe signifikant früher erreicht (Patienten - 23 ± 12,5; Kontrollen – 40,5 ± 15,03, min ± SEM; P = 0.04), (Abbildung 16).
Wir wollten wissen, ob Alter oder Geschlecht oder Blutdruck der Studienteilnehmer, die bei der Chemilumineszenzmessung von Monozyten aus dem peripheren Blut bestimmten Werte, beeinflussen. Dazu korrelierten wir Alter, Geschlecht, systolischen und diastolischen Blutdruck mit den Chemilumineszenzaktivitätswerten von unstimulierten Monozyten der Hochdruckpatienten und gesunden Kontrollpersonen.
Zwischen den Werten der Chemilumineszenzaktivität unstimulierter Monozyten und dem Alter (r = 0,094, P = 0,74; rs = 0,08, P = 0,76, Abbildung 17), dem Geschlecht (P = 1,0), dem systolischen Blutdruck (r = 0,091, P = 0,75; rs = 0,28, P = 0,31) und dem diastolischen Blutdruck (Methode nach Pearson: r = 0,5, P = 0,058; Methode nach Spearman: rs = 0,47, P = 0,08) konnte keine statistisch signifikante Beziehung nachgewiesen werden.
Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie hefteten sich im Vergleich zu gesunden Probanden spontan signifikant verstärkt an humane Aortenendothelzellen (HAEC) und humane Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC)–Monolayer an, tendenziell auch an humane Saphenavenen-endothelzellen (HSVEC).
Nach Stimulation mit Angiotensin II war die Adhäsion der Monozyten von Patienten an HAEC und HUVEC ebenfalls signifikant erhöht, bei HSVEC und Umbilikalarterienendothelzellen (HUAEC) im Vergleich zu den gesunden Probanden tendenziell erhöht. In der Patienten- und Kontrollgruppe unterschied sich die Adhäsion der mit Angiotensin II stimulierten Monozyten, an HAEC signifikant von der Adhäsion der unstimulierten Monozyten. Eine Blockade des Angiotensin II Typ 1 Rezeptors vor der Stimulation mit Angiotensin II führt zu einer tendenziell verminderten Adhäsion der Monozyten an die genannten Endothelzellen.
Es fand sich keine statistisch relevante Beziehung zwischen Alter, Geschlecht, systolischem und diastolischem Blutdruck sowie der Adhäsion von unstimulierten Monozyten von Hypertonikern und gesunden Kontrollpersonen.
Die Spiegel der humanen löslichen Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1 waren bei Patienten mit arterieller Hypertonie im Vergleich zu den gesunden Kontrollpersonen signifikant erhöht. Es fand sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Patienten- und Kontrollgruppe hinsichtlich zirkulierender Mengen von humanem E-Selektin.
Die Spitzenwerte der vor Stimulation mit PMA spontan gemessenen Chemilumineszenzaktivität von Monozyten unterschied sich nicht signifikant zwischen Patienten- und Kontrollgruppe.
Nach Stimulation mit PMA wurden bei Hypertonikern signifikant höhere Werte für die Chemilumineszenzaktivität gemessen als bei den gesunden Kontrollpersonen.
Monozyten von Patienten mit arterieller Hypertonie generierten nach Stimulation mit Angiotensin II eine signifikant höhere Chemilumineszenz-aktivität, als die Monozyten der gesunden Kontrollpersonen.
Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass die erhöhte Adhäsion bei arterieller Hypertonie durch voraktivierte Monozyten verursacht wird. Wick et al 1995) nehmen an, dass eine Autoimmunreaktion gegen Hitzeschockprotein 60 (Hsp60), das von Endothelzellen nach der Behandlung mit bestimmten Zytokinen (TNF α, IL-1β) ausgeschüttet wird, das Initiationsereignis der Atherosklerose darstellt. Hitzeschockprotein 60 ist ein mitochondriales Protein, das leicht im Zytoplasma gestresster Zellen nachgewiesen werden kann. Durch unsere Arbeitsgruppe konnte von Dörffel et al nachgewiesen werden, dass im Vergleich zu Gesunden bei Hypertonikern erhöhte Mengen an Tumornekrosefaktor α und Interleukin-1β, bei Stimulation mit Angiotensin II oder Lipopolysacchariden (LPS), aus peripheren Blutmonozyten sezerniert werden [Dörffel et al 1999]. Für unstimulierte Monozyten wurden keine Unterschiede bei der Zytokinausschüttung zwischen Patienten und Kontrollen gefunden.
Eine erhöhte Zytokinsekretion kann bei der Superoxidradikalfreisetzung, Endothelverletzung, der Ablagerung und Aktivierung von zellulären Elementen auf der Gefäßwand und der Progression zur Atherosklerose eine Rolle spielen [Vaddi et al 1994]. Mit einer neueren Untersuchung wurde interessanterweise eine erhöhte Adhäsion von Monozyten von Hochdruckpatienten an humane Umbilikalvenenendothelzellen aufgezeigt. Daraufhin konnten wir dieses Ergebnis an humanen Aortenendothelzellen bestätigen.
Als ein weiterer Aktivierungsmarker waren die Spitzenwerte der Chemilumineszenz nach Stimulation mit PMA bei Patienten signifikant höher als bei den gesunden Freiwilligen.
Nach Vorinkubation von humanen Monozyten mit dem Angiotensin II - Typ 1 - Rezeptorantagonisten Eprosartan und anschließender Stimulation mit Angiotensin II unterschied sich die Chemilumineszenzaktivität der Monozyten bei Patienten und Kontrollpersonen nicht von der Chemilumineszenzaktivität nach Angiotensin II - Stimulation. Unser Ergebnis könnte möglicherweise im Zusammenhang mit einer potentiell agonistischen Wirkung von Eprosartan am AT1-Rezeptor von Monozyten stehen. Dechend et al identifizierten im Plasma prä-eklamptischer Frauen agonistische Autoantikörper, die gegen den AT1-Rezeptor gerichtet sind und zur Aktivierung der NADPH-Oxidase mit folgender Sauerstoffradikalfreisetzung führen [Dechend et al 2003]. Außerdem wird Angiotensin II – induzierten Sauerstoffradikalen eine entscheidende Rolle bei der Hypertonie, Atherosklerose und zellulärem Remodeling zuerkannt, die eine antioxidative Wirkung von AT1-Rezeptorantagonisten nahe legt. Diese Annahme konnte aber bisher nur eingeschränkt mit klinischen Studien belegt werden.
Nach Stimulation von Patientenmonozyten mit LPS kam es zu einem tendenziellen, jedoch nicht statistisch signifikanten Anstieg der Chemilumineszenzaktivität im Vergleich zur gemessenen Chemilumineszenz-aktivität bei der gesunden Kontrollgruppe. Eine mögliche Erklärung für dieses Ergebnis besteht darin, dass LPS nicht zu einer direkten Stimulation der NADPH-Oxidase führt, wie für neutrophile Granulozyten beschrieben wurde, sondern zur indirekten Aktivierung der Zellen (“Priming“) führt, dessen Mechanismus noch nicht genau verstanden wird [DeLeo et al 1998]. LPS interagiert mit Monozytenrezeptoren, wodurch der Transkriptionsfaktor NF-κβ aktiviert wird. Die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κβ führt zur Expression pro-inflammatorischer Zytokine und der Generierung von reaktiven Sauerstoffradikalen [Legrand-Poels et al 1997].
Wenn Low Density Lipoprotein-Partikel in einer arteriellen Gefäßwand abgelagert sind, können sie oxidiert und von Makrophagen über ihre Radikalfängerrezeptoren an der Oberfläche dieser Zellen aufgenommen werden [Steinberg 1997; Griendling et al 1997; Khoo et al 1992]. Der Grad, bis zu dem LDL verändert werden kann, variiert sehr stark [Griendling et al 1997; Diaz et al 1997]. In den Makrophagen gespeichertes LDL aktiviert die Schaumzellen. Außerdem wirkt LDL chemotaktisch auf andere Monozyten und kann die Expression von Genen für den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor [Rajavashisth et al 1990] und das von Endothelzellen abstammende “monocyte chemotactic protein“ hochregulieren [Leonard und Yoshimura 1990]. Nach der Bindung an Radikalfängerrezeptoren in vitro initiiert das modifizierte LDL eine Reihe intrazellulärer Ereignisse [Hajjar und Haberland 1997], einschließlich der Induktion von Urokinase [Falcone et al 1991] und inflammatorischen Zytokinen wie Interleukin-1 [Geng und Libby 1995]. Die Entzündungsreaktion selbst kann einen profunden Effekt auf die Lipoprotein-wanderung innerhalb der Arterien haben. Insbesondere Entzündungsvermittler, wie Tumornekrosefaktor-α, Interleukin-1 und Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor verstärken die Bindung von LDL an das Endothel und die glatte Muskulatur und erhöhen die Transkription des LDL-Rezeptor Gens [Hajjar und Haberland 1997]. Studien an transgenen Mäusen haben offengelegt, dass Lp-(a)-Lipoprotein, Cholesterolestertransferprotein, Apolipoprotein-A (das Hauptapolipoprotein des High Density Lipoproteins (HDL)) und andere Moleküle einen geringen Effekt auf die Atherogenese haben, wohingegen der Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor für die Regulation der Monozyten- und Makrophagenzahl sowie für die Läsionbildung bedeutsam zu sein scheint [Qiao et al 1997; de Villiers et al 1998].
Oxidiertes LDL in atherosklerotischen Läsionen beim Menschen [Ylä-Herttuala et al 1989] induziert eine proatherosklerotische NAD(P)H-Oxidase Expression [Rueckschloss et al 2001]. Mild oxidiertes LDL könnte während der Atherogenese auch zu einer Aktivierung des “platelet-derived-growth-factor“ führen [Escargueil-Blanc et al 2001]. Oxidiertes LDL kann direkt als endothelialer Stressor wirken. Es kann auch später zur Transformation von Makrophagen und von der Media abstammenden glatten Muskelzellen zu Schaumzellen führen [Frostegard et al 1992].
Obwohl der Hypercholesterolämie bei etwa 50 Prozent der Patienten mit kardiovaskulärer Erkrankung eine bedeutsame Rolle zufällt [Braunwald 1997], müssen auch andere Faktoren in Betracht gezogen werden. Die Arteriosklerose könnte eine Entzündungserkrankung sein und nicht einfach nur aus der Ansammlung von Lipiden resultieren [Ross 1999].
Oxidativer Stress trägt durch Förderung der Proliferation der glatten Gefäßmuskulatur, der Monozyten-/ Makrophageninfiltration, Veränderung des Gefäßtons und Aktivierung von Matrix-Metalloproteinasen, neben anderen Effekten auf die Zellfunktion, einschließlich der Regulation der Kinaseaktivität, Lipidperoxidation und Inaktivierung von Nitritoxid, zum Unterhalt von Gefäßerkrankungen bei [Griendling et al 1994].
Drei Isoenzyme der Superoxiddismutase wurden bislang identifiziert, 1. eine Kupfer und Zink-enthaltende Form (Cu/ZnSOD), die sich vor allem im Zytosol befindet, 2. eine mitochondriale, sogenannte manganesische Form (Mn-SOD), und 3. ein extrazelluläres Isoenzym (ecSOD). Im Interstitium der Gefäße liegen speziesabhängig bis zu 50% der Gesamt-Superoxiddismutase in der extrazellulären Form vor [Stralin et al 1995]. Insbesondere unter Zytokin-einwirkung [Marklund 1992] und an atherosklerotischen Gefäßen [Fukai et al 1998] sind erhöhte ecSOD-Spiegel zu finden.
Fukai et al stellten 1999 fest, dass Angiotensin II die Expression der extrazellulären Superoxiddismutase (ecSOD) über einen p42/44 MAP-Kinase-Weg unabhängig von der Superoxidproduktion hochreguliert. Die Gesamt-Gefäß-Superoxiddismutase war nach Angiotensin II - Infusion in vivo bei Fukai nicht erhöht. Trotzdem hat der durch Angiotensin II verursachte Anstieg an ecSOD einen bedeutenden Effekt auf den Radikalfang im Interstitium, wo sich das Enzym befindet.
In experimentellen Ansätzen scheint es, dass sowohl Arteriosklerose als auch Angiotensin II-induzierte arterielle Hypertonie den Spiegel der vaskulären extrazellulären Superoxiddismutase heben, wenn auch durch verschiedene Zelltypen.
Möglicherweise stellt die erhöhte Expression der Superoxiddismutase einen wichtigen Anpassungsmechanismus dar, der ein erhöhtes Einfangen von Superoxidanionen in den beiden Situationen, die mit einer erhöhten Produktionsrate von Superoxidanionen einhergehen, erlaubt. Das Superoxid-Anion kann den Blutdruck erhöhen, wohingegen ein erhöhter Spiegel der Superoxiddismutase im Gefäß den Blutdruck senken kann. Daher könnte die Antwort auf Angiotensin II als ein entscheidender Anpassungsmechanismus verstanden werden, der den Effekt von Angiotensin auf den Blutdruck und die vaskuläre Redoxsituation entschärft.
Transgene Mäuse, die die Kupfer- und Zink-Superoxiddismutase über-exprimieren, entwickeln eine ausgedehntere fatty-streak - Ablagerung als Kontrollmäuse, wenn sie mit einer cholesterolreichen Diät gefüttert werden [Tribble et al 1997]. Für die Gruppe von Griendling, die die Proliferation und Hypertrophie der glatten Gefäßmuskelzellen als entscheidende Veränderung bei der Entstehung der Atherosklerose ansieht, ist es vorstellbar, dass ein erhöhter vaskulärer Spiegel an extrazellulärer Superoxiddismutase einen nachteiligen Effekt haben könnte und Angiotensin II-induzierte Hypertonie mit der Gefäßkrankheit Atherosklerose verknüpft [Fukai et al 1999].
Arteriosklerose ist eine multifaktorielle, durch verschiedene Gene und Umweltfaktoren beeinflusste Krankheit. Daher könnte das Verständnis der Regulation der Genexpression und der Unterschiede im Ansprechen auf die krankheitsverursachenden Substanzen weiterhelfen. Die Genexpression variiert möglicherweise an Läsionen bei verschiedenen Personen und an verschiedenen Läsionsstellen, und eine genaue Kenntnis, könnte Aufschluss über genetische Unterschiede in der Empfindlichkeit und Ansprechbarkeit einer Therapie geben. Es könnte möglich werden, selektiv die gefährlichen Entzündungskomponenten in den Arterien zu entschärfen und dabei die protektiven Elemente intakt zu belassen.
Ähnlich wie in verschiedenen Berichten von DeSouza et al fanden wir signifikant erhöhte Mengen an humanem löslichen interzellulären Adhäsionsmolekül-1 (sICAM-1) und humanem löslichen vaskulären Adhäsionsmolekül-1 (sVCAM-1) bei Patienten mit arterieller Hypertonie im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen [DeSouza et al 1997]. Da wir erhöhte Mengen an zirkulierendem sICAM-1 und sVCAM-1 nachwiesen, benutzen wir humane Aortenendothelzellen, um eine primäre Aktivierung der Endothelzellen in unseren Adhäsionsversuchen auszuschließen. Die Sauerstoffradikal-freisetzung der humanen Aortenendothelzellen war minimal, verglichen mit der Sauerstoffradikalfreisetzung der Monozyten von Patienten. Mit unserem Versuchsansatz konnten wir somit eine Voraktivierung der Endothelzellen durch den arteriellen Hypertonus ausschließen. Der Mechanismus des Zusammen-hangs von arterieller Hypertonie und der erhöhten Zirkulation von Adhäsions-molekülen ist unklar. Flußunterschiede verändern die Expression von Genen für das interzelluläre Adhäsionsmolekül-1 [Nagel et al 1994]. Lokale Strömungs-änderungen können zu Veränderungen der Scherkräfte führen. Die Erhöhung der ICAM-1-Expression durch Scherkräfte ist von der Zeit und einwirkenden Kraft abhängig und reversibel [Watanabe et al 1998]. Es besteht auch die Möglichkeit, dass die erhöhten Mengen durch voraktivierte Monozyten verursacht werden, da TNF-α und IL-1β die Expression von ICAM-1 und VCAM-1 an Endothelzellen heraufzuregulieren scheinen, wie von Davies et al gezeigt wurde [Davies et al 1993].
Die Adhäsion von Leukozyten, einschließlich der Monozyten wird über Adhäsionsmoleküle vermittelt, die an der luminalen Oberfläche der Endothel-zellen exprimiert werden. Die Induktion und Hochregulierung von Adhäsionsmolekülen ist ein häufig, bei Entzündungsprozessen in verschiedenen Geweben, auftretender Prozess und wurde unter verschiedenen Bedingungen, wie der Allograftabstoßung, Schocklunge, systemischen Vaskulitis, Psoriasis und rheumatoiden Arthritis beobachtet [Davies et al 1993].
Die Expression von ICAM-1 auf Endothelzellen wird durch inflammatorische Zytokine, einschließlich TNF-α und IL-1, IL-4 und IFN-γ sowie durch atherogene Plasmalipoproteine, wie natives und oxidiertes LDL, auf dem Trankriptions-niveau hochreguliert [Fan et al 1993; Smalley et al 1996]. Auch Interleukin-8 kann die Monozytenadhäsion an das Endothel triggern [Gerszten et al 1999]. Lösliche Formen von ICAM-1 sind im Blut detektierbar und wurden als nützlicher Aktivierungsindikator im Zusammenhang mit der klinischen Manifestation der Arteriosklerose beschrieben [Blann et al 1994].
Eine kombinierte Therapie mit anti-ICAM-1 - und LFA-1 - Antikörpern führte zu einer synergistischen, aber inkompletten Inhibition der Makrophagenadhärenz und Intimawanderung [Watanabe et al 1998]. Dies signalisiert, dass noch andere ICAM-1-unabhängige Mechanismen von funktioneller Relevanz sind.
Wir fanden die Spiegel von ICAM-1 und VCAM-1 erhöht, jedoch keine Erhöhung von E-Selektin. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass diese Erhöhung durch eine Aktivierung von Monozyten in einem frühen Stadium der arteriellen Hypertonie, bevor Endothelschäden oder Gefäßläsionen in Erscheinung getreten sind, verursacht sein könnte.
Im Gegensatz zu unseren Ergebnissen fanden Blann et al signifikant erhöhte E-Selektin Spiegel bei Hochdruckpatienten [Blann et al 1994]. Seine Gruppe geht davon aus, dass große Mengen an E-Selektin vom Endothel ausgeschüttet werden, um eine Leukozytenadhäsion zu verhindern. Wir glauben, dass unsere Daten diese Theorie weiter unterstützen. Blann et al schlossen alle Patienten mit einer symptomatischen Gefäßerkrankung von ihren Exerimenten aus [Blann et al 1994]. Da die Patienten bereits im noch symptomlosen Zustand Gefäßveränderungen aufweisen könnten, bezogen wir nur Patienten ohne Intima-Media-Verdickung in unsere Untersuchungen ein. Unsere Arbeitsgruppe nimmt an, dass E-Selektin nur durch ein beschädigtes Endothel ausgeschüttet werden könnte. Dahingegen könnte der E-Selektin Spiegel im Frühstadium arterieller Hypertonie durchaus noch normal sein wie bei unseren Patienten, bei denen es noch zu keinen Gefäßveränderungen gekommen ist.
Wir studierten die Monozytenadhäsion nach Stimulation mit physiologisch relevanten Konzentrationen von Angiotensin II [Kahan et al 1997]. Monozyten von Patienten mit essentieller Hypertonie zeigten eine signifikant höhere Adhäsion an einschichtiges humanes Aorten- (HAEC), Saphenavenen- (HSVEC), Umbilikalvenenendothel (HUVEC), sowohl spontan (signifikant bei HAEC, HSVEC, HUVEC) als auch unter Stimulation mit Angiotensin II (signifikant bei HAEC und HUVEC, tendenziell bei HSVEC) und eine signifikant erhöhte Chemilumineszenzaktivität während der Inkubation mit Angiotensin II.
Die erhöhte Adhäsion konnte durch eine Inkubation mit dem AT1-Antagonisten Eprosartan vor Stimulation mit Angiotensin vermindert werden (bei HAEC, HSVEC, HUVEC). Die Prävention der Angiotensin II - vermittelten Aktivierung von Monozyten durch Eprosartan bei Patienten mit arterieller Hypertonie könnte ein neuer therapeutischer Ansatz zur Vermeidung von Gefäßveränderungen bei arterieller Hypertonie sein. Die mit Angiotensin II stimulierten Zellen zeigten eine signifikant höhere Adhäsion verglichen mit unstimulierten Zellen bei Patienten als auch Kontrollen. Unsere Ergebnisse wurden durch Folgearbeiten in unserer Arbeitsgruppe bestätigt. Darin wurde nachgewiesen, dass Monozyten nach Stimulation mit Angiotensin II und mit agonistischen Angiotensin-(1)-rezeptor-Autoantikkörpern Tissue-Factor exprimieren [Dörffel et al 2003]. Unsere Ergebnisse passen zu vorangehenden Studien, die einen Zusammenhang zwischen Angiotensin II induzierter Hypertonie und einer erhöhten Superoxid-Produktion bei Mäusen zeigten [Fukai et al 1999]. Die Resultate könnten ebenfalls in Beziehung zum Risiko atherosklerotischer Komplikationen bei Hochdruckpatienten und einem hohen Renin-Spiegel stehen [Aldermann et al 1991].
Es gab keine signifikante Beziehung zwischen der Monozytenadhärenz und dem Blutdruck. Daher scheint es unwahrscheinlich, dass der hohe Blutdruck selbst die peripheren Blutmonozyten voraktiviert. Es ließ sich jedoch ein gemeinsamer Trend zwischen Monozytenadhärenz und der Höhe des Blutdrucks ablesen.
Wir fanden keinen Zusammenhang zwischen dem Alter und der Monozyten-adhäsion (Abbildung 5), obwohl sogar die Monozytenadhäsion an das Gefäßendothel eines der initialen Ereignisse der Atherogenese darstellt und das Risiko für atherosklerotische Gefäßläsionen mit dem Alter ansteigt. Ein Grund für diese Befunde könnte der Ausschluss von Patienten mit erhöhten LDL-Niveaus oder erhöhter Intima-Media-Dicke der Arteria carotis und von Rauchern aus unserer Untersuchung sein. Bei der Betrachtung der Ergebnisse mit humanen Aorten- und Umbilikalgefäßendothelzellen muss jedoch berücksichtigt werden, dass Monozyten von Personen verschiedenen Alters verwendet wurden, wohingegen die Aortenendothelzellen von einer Person mittleren Alters gespendet wurden. Es wurden Umbilikalgefäße von Neugeborenen verwendet. Die Saphenagefässe wurden Patienten im Rahmen eines gefässchirurgischen Eingriffs entnommen.
Über die erhöhte Adhäsion von zirkulierenden Monozyten von Patienten mit arterieller Hypertonie und die verstärkte Superoxidproduktion bei Patienten und Kontrollen wurde bereits vorab von Dörffel et al berichtet [Dörffel et al 2001].
Die von mir unternommenen Versuche wurden zum ersten Mal an humanen Monozyten und humanen Endothelzellen unternommen. Datenerhebungen anderer Arbeitsgruppen basierten bisher auf Tiermodellen.
Herrn Professor Dr. med. Jürgen Scholze und Frau PD Oberärztin Dr. med. Yvonne Dörffel gilt mein besonderer und herzlicher Dank, dass ich unter ihrer Betreuung diese Promotionsarbeit anfertigen konnte. Besonders danke ich für die gelungene Kombination aus gewährter Freiheit und engagierter, fachlicher und vor allem auch persönlicher Unterstützung.
Auch der Arbeitsgruppe um Professor Scholze danke ich sehr für den interessanten Austausch, Anregungen und gegenseitige Hilfe. Insbesondere gilt mein Dank Stephanie Franz für die gute Einführung in das Labor.
Dem Team der Abteilung Transfusionsmedizin gilt mein herzlicher Dank für die gute und fröhliche Zusammenarbeit und Unterstützung im Ida-Simon-Haus. Ich danke auch sehr für die großzügige Überlassung des Laborraums und verschiedener Geräte.
Herrn Oberarzt Dr. med. Ralph Rückert danke ich sehr für die kompetente Hilfe und persönliche Betreuung bei der Aufbereitung und Präparation der Saphenavenen.
Herrn Dr. med. Müller danke ich ebenfalls sehr für die Bereitstellung von Venenpräparaten.
Frau Evelin Schwarzer und Herrn Dietmar Zaiss danke ich für ihre Hinweise zur Durchführung der Chemilumineszenzmessungen.
Meinen Eltern und Freunden danke ich für ihre unermüdliche seelische Unterstützung und Motivation zur Fertigstellung dieser Promotionsarbeit.
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Hiermit erkläre ich, dass die vorliegende Dissertation von mir selbst und ohne die Hilfe Dritter verfaßt wurde. Sie stellt keine Kopie anderer Arbeiten dar. Die benutzten Hilfsmittel sowie die Literatur sind vollständig angegeben.