Aus der Klinik für Allgemeine Pädiatrie, Labor für pädiatrische Molekularbiologie
der Medizinischen Fakultät der Charité
Universitätsmedizin Berlin

Dissertation

Regulation des Zellzyklus durch das
Maus- und Ratten-Zytomegalievirus

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
Universitätsmedizin Berlin

von
Anke Neuwirth
aus Berlin

Gutachter:
1. Prof. Dr. Dr. C. Hagemeier
2. Priv.-Doz. Dr. med. Chr. Sinzger
3. Prof. Dr. R. Heilbronn

Datum der Promotion: 21.11.2005

Diese Arbeit widme ich meinen Eltern und meiner Schwester.

Inhaltsverzeichnis

• 1. Einleitung
  • 1.1  Familie der Herpesviridae
  • 1.2 Zytomegalieviren
  • 1.3 Humanes Zytomegalievirus
    • 1.3.1  Epidemiologie, Transmission
    • 1.3.2 Klinik der HCMV Infektion
    • 1.3.3 CMV als Ursache hyperproliferativer Erkrankungen
  • 1.4 Der Zellzyklus
    • 1.4.1  Regulation des Zellzyklus
    • 1.4.2 Einfluss des humanen CMV auf den Zellzyklus
  • 1.5 Tiermodelle für die HCMV Infektion
    • 1.5.1  Ratten-Zytomegalievirus
    • 1.5.2 Murines Zytomegalievirus
    • 1.5.3 Nager-CMV als Tiermodell
  • 1.6 Fragestellung der Arbeit
• 2. Material und Methoden
  • 2.1  Lösungen
  • 2.2 Zellkulturmedien
  • 2.3 Zellkultur
  • 2.4 Virusanzucht und Virustiterung
  • 2.5 Infektionen
  • 2.6 Synchronisation der Zellpopulationen
    • 2.6.1  Serumentzug
    • 2.6.2 Behandlung mit Nocodazol
  • 2.7 Zellernte
  • 2.8 Durchflußzytometrische Bestimmung des zellulären DNA-Gehalts
  • 2.9 Zellextraktion
  • 2.10  Chromatinextraktion
  • 2.11  SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
  • 2.12  Immunoblot-Analysen
  • 2.13  Comassiefärbung
  • 2.14  Bestimmung von Zyklin-assozierten Kinaseaktivitäten
  • 2.15  BrdU-Einbauexperimente / Bestimmung der Histon H3 Phosphorylierung
  • 2.16  Behandlung mit Lambda Phosphatase
  • 2.17  Chromosomenpräparation
• 3. Ergebnisse
  • 3.1  Inhibition der Zellproliferation durch MCMV und RCMV
  • 3.2 Blockierung der Zellzyklusprogression durch MCMV und RCMV
  • 3.3 Der späte Zellzyklusarrest liegt in der G2-Phase und nicht in der Mitose
  • 3.4 MCMV und RCMV replizieren sowohl in G1 als auch in G2
  • 3.5 Deregulation molekularer Zellzyklusregulatoren durch M/RCMV
    • 3.5.1  Repression der Zyklin D1-assoziierten Kinaseaktivität
    • 3.5.2 Einfluss von MCMV und RCMV auf die Zyklin E Expression
    • 3.5.3 Einfluss von MCMV und RCMV auf Zyklin A, Zyklin B1 und CDK1
  • 3.6 RCMV, aber nicht MCMV verhindert replication licensing
• 4. Diskussion
  • 4.1  Inhibition der Zellproliferation und Position des Arrestes im Zellzyklus
  • 4.2 Mechanismus des neuartigen durch M/RCMV verursachten G2-Arrestes
  • 4.3 Virale Repression von Zyklin D1
  • 4.4 Neuartige Zyklin E- Phosphorylierung in Nager-CMV infizierten Zellen
  • 4.5 Zyklin A, Zyklin B und CDK1
  • 4.6 G1-Arrest als gemeinsames Merkmal aller CMV
  • 4.7 Tiermodell für HCMV- Zellzyklusregulation, ein Ausblick
• 5. Literatur
• 6. Zusammenfassung
• Abkürzungsverzeichnis
• Publikationen
• Selbständigkeitserklärung
• Danksagung

Tabellen

• Tabelle 1: Verwendete Zelllinien.
• Tabelle 2: Für Immunoblot-Analysen verwendete Antikörper.
• Tabelle 3: Gegenüberstellung von MCMV, RCMV und HCMV

Bilder

• Abbildung 1: Schematische Darstellung des allgemeinen Aufbaus eines Herpesvirion.
• Abbildung 2: Der zytopathische Effekt von Zytomegalieviren. Mikroskopische Aufnahmen von uninfizierten NIH-3T3 und Rat1 Zellen im Vergleich zu Zellen die mit Maus- und Ratten-Zytomegalievirus (MCMV und RCMV) infiziert wurden und einen deutlichen CPE zeigen.
• Abbildung 3: Der Zellzyklus.Der Fortgang des Zellzyklus wird durch die Aktivität Zyklin-assoziierter Kinasen (CDK) und deren regulatorischen Untereinheiten, den Zyklinen gesteuert. Zellen verweilen, z. B. durch den Entzug von Wachstumsfaktoren (WF) in der G0 Phase des Zellzyklus.
• Abbildung 4: Beginn der DNA Replikation. Durch das Zusammensetzen des Pre-RC aus ORC, Cdt1, CDC6 und den MCMs wird der Beginn der DNA-Replikation vorbereitet (nach (Wiebusch et al., 2003).
• Abbildung 5: CDK-Inhibitoren. CKI der CIP/KIP-Familie binden an CDK2/ Zyklin E/A und inhibieren so die katalytische Aktivität (A). CKI der INK4-Familie blockieren durch Unterbrechung der Zyklinbindung an CDK 4/6 die Aktivität des Komplexes (B).
• Abbildung 6: Hemmung der zellulären DNA-Synthese durch HCMV.HCMV verhindert das Binden der MCMs an den ORC-Komplex (Wiebusch 2003).
• Abbildung 7: Einfluss des HCMV auf den Zellzyklus. Der Fortgang des Zellzyklus wird durch die Aktivität Zyklin-assoziierter Kinasen (CDK) und deren regulatorischen Untereinheiten, den Zyklinen gesteuert. Zellen verweilen durch den Entzug von Wachstumsfaktoren (WF) in der G0-Phase des Zellzyklus. Durch die HCMV Infektion wird der Zellzyklus in seinem Fortgang wie gezeigt beeinflusst.
• Abbildung 8: Zellproliferationskurven von infizierten und uninfizierten Zellpopulationen. Asynchron proliferierende NIH-3T3 Zellen, MEFs, Rat1 Zellen, REFs und immortalisierte REFs wurden mit M/RCMV (MOI=10) infiziert und zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet. Anschließend wurde die Zellzahl in der Neubauerzählkammer bestimmt. In den Diagrammen ist die errechnete Zellzahl gegen die Erntezeitpunkte aufgetragen.
• Abbildung 9: Zellzyklusverteilung M/RCMV infizierter Zellen. Die jeweilige Zellpopulation wurde zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet. Durch Propidiumjodidfärbung und anschließende durchflußzytometrische Bestimmung des DNA-Gehalts wurde dann ihre Zellzyklusverteilung ermittelt. Gezeigt sind DNA-Histogramme, in denen die prozentuale Verteilung auf die einzelnen Zellzyklusphasen (G0,G1/S/G2, M) vermerkt ist.
• Abbildung 10: Synchronisation der Zellen mit Nocodazol. Zellen wurden durch 50 ng/ml Nocodazol reversibel in der Prometaphase der Mitose arretiert. Die solchermaßen synchronisierten Zellen wurden in der Folge in  M/G1- oder in früher S-Phase infiziert (MOI=10). Die gezeigten DNA-Histogramme demonstrieren den Erfolg der Synchronisierung und die Zellzyklusverteilung zu den Zeitpunkten der Infektion.
• Abbildung 11: MCMV und RCMV arretieren Zellen in G1 und G2/M. Zellen wurden wie bereits in Abb. 10 beschrieben in M/G1 bzw. früher S-Phase infiziert. Zu den genannten Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet, mit Propidiumjodid gefärbt und ihr DNA-Gehalt durchflußzytometrisch bestimmt. Gezeigt ist die Zellzyklusverteilung M/RCMV infizierter und nicht infizierter Zellen in DNA- Histogrammen.
• Abbildung 12: Die Infektion in der späten S-Phase ist für den G2/M-Arrest nicht ausreichend. Es wurde wie in Abb. 11 beschrieben verfahren. Die Zellen wurden 46,5 h nach dem Ausplatieren infiziert, als sie sich in der späten S-Phase befanden. Gezeigt ist die Zellzyklusverteilung M/RCMV infizierter und nicht infizierter Zellen in DNA-Histogrammen.
• Abbildung 13: BrdU-Einbau infizierter Zellen. Zellen wurde 72 h das Serum entzogen, um sie in G0 zu akkumulieren. Nach der dann folgenden Infektion mit MCMV (A) bzw. RCMV (B) in Anwesenheit von Serum wurde dem Zellkulturmedium das Thymidin-Analog BrdU zugefügt. Eine Doppelfärbung der geernteten Zellen mit Propidiumjodid und FITC-markiertem BrdU-Antikörper machte somit die Darstellung der DNA-Neusynthese möglich. Dargestellt sind die Ergebnisse in Density Dot Blots, in denen der DNA-Gehalt gegen die Menge an eingebautem BrdU aufgetragen ist.
• Abbildung 14: Chromosomenpräparate infizierter Zellen. Nocodazol behandelte Zellen wurden in der frühen  S-Phase infiziert, zum Zeitpunkt des G2/M-Arrestes geerntet und wie bereits beschrieben durchflußzytometrisch analysiert. Dann erfolgte die hier gezeigte Chromosomenpräparation und die Färbung des Zellmaterials mit dem Giemsa-Farbstoff.
• Abbildung 15: Histon H3 Phosphorylierung. Die Zellen wurden wie in Abb. 14 beschrieben infiziert. Die durch CMV in G2 arretierten Zellen wurden nach der Ernte mit einem phosphospezifischen Histon H3 Antikörper behandelt und das Signal des phosphospezifischen Histon H3 Antikörpers wurde im Durchflußzytometer gemessen. Als Kontrolle dienten nocodazolbehandelte Zellen. In den gezeigten Dot Blots ist die Zellgröße gegen die Histon H3 Phosphorylierung aufgetragen.
• Abbildung 16: Virale, GCV sensitive DNA-Synthese in G1- und G2-Zellen. NIH-3T3 Zellen wurden wie beschrieben in An- bzw. Abwesenheit von Gancyclovir (GCV) infiziert. Zu den genannten Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet und ihre Zellzyklusverteilung analysiert. Die Ergebnisse wurden sowohl als DNA-Histogramme dreidimensional (A) als auch als Density Dot Blots (B) dargestellt.
• Abbildung 17: GCV hat keinen Einfluss auf RCMV infizierte Zellen.Rat1 Zellen wurden wie beschrieben in  An- bzw. Abwesenheit von Gancyclovir (GCV) infiziert. Zu den genannten Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet und ihre Zellzyklusverteilung analysiert. Die Ergebnisse wurden dreidimensional in DNA-Histogrammen dargestellt.
• Abbildung 18: PFA reduziert virale DNA-Replikation. Rat1 Zellen wurden wie beschrieben in An- bzw. Abwesenheit von Foscarnet (PFA) infiziert. Zu den genannten Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet und ihre Zellzyklusverteilung analysiert. Die Ergebnisse wurden als auch als Density Dot Blots dargestellt, in denen der relative DNA-Gehalt gegen die relative Zellzahl aufgetragen ist. Die vertikale Linie markiert die Stelle des  4 N DNA-Gehalts von Zellen die sich in der G2-Phase des Zellzyklus befinden.
• Abbildung 19: Produktion infektiöser Virionen von M/RCMV in G1- und G2-Zellen.Gezeigt sind die Titer der infektiösen Virusnachkommen von Überständen infizierter in G1 und G2 arretierter Kulturen, die mithilfe des Plaque-Assays ermittelt wurden. Zellen wurden wie in Abb. 11 dargestellt infiziert. Zu den genannten Zeitpunkten wurden die Überstände geerntet und in Plaque-Assays analysiert.
• Abbildung 20: Einfluss von M/RCMV auf die Expression von Zyklin D1 und die Zyklin D1-assoziierte Kinaseaktivität. Quieszente Zellen wurden in An- bzw. Abwesenheit von Serum infiziert. Die Zellen wurden nach 16 Stunden, wenn serumrestimulierte Zellen die S-Phase erreicht hatten, geerntet und Proteinextrakte wurden erstellt. In diesen wurde mit Hilfe von in vitro- Kinaseassays die Zyklin-assoziierten Kinaseaktivitäten (A) mit GST-Rb als Substrat bestimmt. Des weiteren wurden die Extrakte auf Zyklinexpression (B) in Immunoblotanalysen mit Zyklin-spezifischen Antikörpern untersucht.
• Abbildung 21: Einfluss von M/RCMV auf CDK4. Es wurden in Abb. 20 beschriebene Zellextrakte verwendet Diese wurden unmittelbar (A) oder nach erfolgter Zyklin D1-Immunpräzipitation (B) auf CDK4 Expression in Immunoblotanalysen untersucht.
• Abbildung 22: Zelluläre Zellzyklusregulatoren p16 und p15 sind nicht für verminderte Zyklin D1-assoziierte Kinaseaktivität verantwortlich. Es wurden in Abb. 20 beschriebene Zellextrakte verwendet Diese wurden mit einem p16-spezifischen (A) und p15-spezifischen (B) Antikörper in Immunoblotanalysen untersucht.
• Abbildung 23: P19 und p21 Expression in infizierten Zellen. Es wurden in Abb. 20 beschriebene Zellextrakte verwendet Diese wurden mit einem p19-spezifischen (A) und p21-spezifischen (B) Antikörper in Immunoblotanalysen untersucht.
• Abbildung 24: Einfluss von M/RCMV auf die Expression von Zyklin E und die Zyklin E-assoziierte Kinaseaktivität. Quieszente Zellen wurden in An- bzw. Abwesenheit von Serum infiziert. Die Zellen wurden nach 16 Stunden geerntet und Proteinextrakte wurden erstellt. In diesen wurde mit Hilfe von in vitro- Kinaseassays die Zyklin-assoziierten Kinaseaktivitäten mit H1 als Substrat bestimmt (A). Des weiteren wurden die Extrakte auf Zyklinexpression in Immunoblotanalysen mit Zyklin-spezifischen Antikörpern (B) untersucht.
• Abbildung 25: Phosphorylierte Zyklin E Form in MCMV/RCMV infizierten Zellen. Die Zellen wurden wie bereits beschrieben synchronisiert und nach 16 h geerntet. Zur Erstellung der Extrakte wurde ein Extraktionspuffer ohne Phosphataseinhibitoren verwendet. Vor der Immunoblotanalyse wurden die Extrakte mit Phosphatase behandelt oder unbehandelt belassen und dann mit einem Zyklin E-spezifischen Antikörper analysiert. (*kürzere Exposition)
• Abbildung 26: Zyklin E wird nicht durch CDK2 phosphoryliert. Infizierte Zellen wurden mit dem synthetischen CDK2-Hemmstoff Roscovitin (15 μM) behandelt, anschließend wurden Zellextrakte erstellt und in Immunoblotanalysen mit einem Zyklin E-spezifischen Antikörper behandelt, als Kontrolle wurden unbehandelte Zellen verwendet (A). Um das effiziente Wirken von Roscovitin nachzuweisen wurden die geernteten Zellen im Durchflußzytometer gemessen. Die dargestellten Histogramme zeigen, dass die Roscovitin behandelten Zellen in G1 arretieren (B).
• Abbildung 27: Einfluss von M/RCMV auf die Expression von Zyklin A und B1 und die Zyklin A- und  B1-assoziierte Kinaseaktivität. Quieszente Zellen wurden in An- bzw. Abwesenheit von Serum infiziert. Die Zellen wurden nach 16 Stunden geerntet und Proteinextrakte wurden erstellt. Es wurden mit Hilfe von  in vitro- Kinaseassays die Zyklin-assoziierten Kinaseaktivitäten mit Histon H1 als Substart bestimmt (A). Außerdem wurden die Extrakte auf Zyklinexpression (B) in Immunoblotanalysen mit Zyklin-spezifischen Antikörpern untersucht. (*nach längerer Expositionen wird auch die Bande in – Serum + Virus sichtbar)
• Abbildung 28: CDK1 liegt in M/RCMV infizierten Zellen in seiner aktiven, unphosphorylierten Form vor. Zellextrakte (erstellt wie in Abb. 27 beschrieben) wurden in Immunoblotanalysen mit einem phosphospezifischen CDK1-Antikörper analysiert. Als Kontrolle dienten Extrakte, die vor der Analyse mit Phosphatase behandelt worden waren. In der längeren Exposition (*) sind die Banden, der Extrakte quieszenter Zellen deutlicher zu erkennen.
• Abbildung 29: RCMV nicht aber MCMV verhindert replication licensing. Quieszente Fibroblasten wurden serumrestimuliert und/oder infiziert. Sowohl Ganzzellextrakte als auch Chromatinextrakte wurden erstellt und es wurde die MCM2 Expression (A) sowie die MCM2 und CDC6 Chromatinbindung (B) überprüft.
• Abbildung 30: Unterschiedliche Mechanismen der Zyklin D1-CDK 4/6 Repression durch CMV. HCMV verhindert die mRNA-Expression von Zyklin D1. M/RCMV unterbinden die Assoziation des Zyklin D1-CDK4-Komplexes.
• Abbildung 31: Modellvorstellung der Regulation von CDC2 durch CMV (modifiziert nach (Advani et al., 2001).
• Abbildung 32: Modellvorstellung der Inhibition der DNA-Synthese durch CMV. Dargestellt ist die Inhibierung der Pre-RC Assemblierung durch RCMV, die fehlende Aktivierung durch MCMV und die Tatsache, dass beide Schritte in HCMV negativ reguliert sind. (* Die Phosphorylierung der MCM-Proteine durch RCMV konnte aus ihren Laufverhalten nicht abgelesen werden.)