2. Material und Methoden

▼ 21 (fortgesetzt)

2.1  Lösungen

▼ 22 

PBS:

8,5 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4,

137 mM NaCl, 3 mM KCl

TTBS:

10 mM Tris-Cl (pH 7,6), 9 g/l NaCl,

0,1% Tween 20

IPB1:

50 mM Tris-Cl (pH 7,4), 150 mM NaCl,

10 mM MgCl2, 10 mM NaF, 0,5 mM Na3VO4,

0,5% Nonidet P-40, 10% Glycerol,

1 mM DTT, 2 μg/ ml Aprotinin,

1 mM Leupeptin, 1 mM PMSF

IPB2:

50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl,

1mM EDTA, 2,5 mM EGTA, 10% Glycerol,

1 mM DTT, 0,1% Tween-20, 10 mM,

ß- Glycerophosphat, 1mM NaF,

0,1 mM sodium orthovanadate,

2 μg/ ml Aprotinin, 5 μg/ ml Leupeptin,

0,1 mM PMSF

SDS-Probenpuffer (2-fach):

100 mM Tris-Cl (pH 6,8), 200 mM

Dithithreitol,

4% SDS, 0,2% Bromphenolblau,

20% Glycerol

2.2 Zellkulturmedien

DMEM I:

DMEM (Gibco-BRL, Katalog-Nr. 61965026)

wurde supplementiert mit

100 Units/ ml Penicillin/ Streptomycin und

jeweils 5% FBS und NKS

(beides von Biochrom, Berlin).

DMEM II:

DMEM (Gibco-BRL, Katalog-Nr. 61965-26)

wurde supplementiert mit 50 Units/ ml

Penicillin/ Streptomycin und 10% FBS

MEM:

MEM (Gibco-BRL, Katalog-Nr. 31095-029)

wurde supplementiert mit

Gentamicin (Gibco 15750-037),

5 mM Glutamine (Gibco 25030-024) und

10% FBS.

2.3 Zellkultur

Eine Übersicht über die verwendeten Zelllinien ist Tabelle 1 zu entnehmen. Die Zellen wurden als adhärent wachsende Zellrasen auf Plastikschalen gehalten. Es wurden mittelgroße Schalen (d = 10 cm) mit 10 ml Medium oder große Schalen (d = 14 cm) mit 25 ml Medium verwendet. REFs, immortalisierte REFs und Rat-1 Zellen wurden in MEM, NIH-3T3 Zellen in DMEM I und MEF Zellen in DMEM II bei 37 °C, 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit gehalten. Zum Passagieren der Zellen wurden diese wie unter 2.7 beschrieben geerntet, in frischem Medium aufgenommen und auf neuen Schalen ausplattiert. Das beim Passagieren der unterschiedlichen Zelllinien verwendete Verdünnungsverhältnis ist in Tabelle 1 angegeben. Die verwendeten Passagenzahlen lagen für die Embryonalen Fibroblasten zwischen 2 und 12, für die immortalisierten Rattenfibroblasten zwischen 70 und 80, bei den restlichen Zelllinien war die Passagenzahl nicht bekannt. Eingefroren wurden die Zellen in 1,5 ml Kulturmedium mit 10% DMSO. Nach langsamem Abkühlen auf -80 °C wurden sie in flüssigem Stickstoff gelagert. Durch Auftauen im 37 °C warmen Wasserbad, Waschen und nachfolgendem Ausplattieren in DMSO-freien Medium wurden sie wieder in Kultur genommen.

▼ 23 

Tabelle 1: Verwendete Zelllinien.

Name

bezogen von

Haltung

Herkunft

Status

NIH-3T3

AG R. Müller

1:6 alle 3 Tage

in DMEM I

Mausfibroblasten, nach

„3T3“-Schema immortalisiert

p16INK4A -negativ

MEF

M. Pohlers

1:4 alle 3 Tage

in DMEM II

Mäusestamm C57BI/ 6x 129 SV

Wildtyp

Rat-1

T. Kouzarides

1:12 alle 3 Tage

in MEM

immortalisierte Rattenfibroblasten

p21WAF1 -negativ

immortalisierte

REF

S. Voigt

1:12 alle 3 Tage

in MEM

immortalisierte Rattenfibroblasten

unbekannt

REF

O. Raudies

1:3 alle 3 Tage

in MEM

Rattenstamm Sprague Dawley

Wildtyp

2.4 Virusanzucht und Virustiterung

Primäre embryonale Mausfibroblasten und Rat-1 Zellen wurden 24 h vor Infektion im Verhältnis 1:12 passagiert und dann mit einer MOI (Multiplizität der Infektion) von 0,01 PFU (plaquebildende Einheit, Plaque forming Unit) pro Zelle CMV-infiziert (siehe 2.5). Der MCMV Stamm „Smith“ wurde in MEFs gezüchtet, die RCMV Stämme „Maastricht“ und „England“ wurden in Rat-1 Zellen propagiert. Die infizierten Zellen wurden in 2%igem Medium gehalten, sobald die gesamte Zellpopulation den CMV-typischen CPE zeigte, wurde der virenhaltige Überstand gesammelt, durch Zentrifugation von Zelldebris befreit, aliquotiert und bei -80 °C gelagert.

Zur Betimmung des Virustiters wurde die Methode des Plaque-Assay verwendet, (Wentworth und French, 1970) wodurch die absolute Menge infektiöser Partikel bestimmt wurde. Hierzu wurden 0,1 ml einer logarithmischen Verdünnungsreihe von MCMV oder RCMV auf subkonfluente
24-well Zellkulturplatten (Biochrom P92240) gegeben. MCMV wurde auf 3T3 Zellen getitert und die beiden Stämme von RCMV auf Rat-1 Zellen. Nach einer Inkubationszeit von 1,5 h wurden die Zellen mit jeweils 1 ml Modified Eagle Medium (Gibco 21935-028) unter Zusatz von 2,5% Methylcellulose, 5% FBS, 5 mM Glutamin und Gentamicin (30 μg/ml) überschichtet und für 6 Tage bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Methylcellulose entfernt und der Zellrasen mit Methylenblau
(0,04%) gefärbt. Dadurch, dass die Methylcellulose die Diffusion behindert, können die freigesetzten Viren nur auf Nachbarzellen übertragen werden. Aufgrund der fortschreitenden Lyse infizierter Nachbarzellen entstehen „Plaques“, die vom dichten Zellrasen umgeben sind. Mittels Lichtmikroskopie kann dann die Anzahl der „Plaques“ ermittelt werden.

2.5 Infektionen

▼ 24 

Proliferierende Zellen wurden 24 h vor der geplanten Infektion passagiert. Bei der Infektion von quieszenten Zellen wurde, wie in Abschnitt 2.6.1 ausgeführt, vorgegangen. Um die Virusmenge zu berechnen, deren Einsatz zum Erreichen des beabsichtigten MOI-Wertes nötig war, wurden vor der Infektion Zellen einer Referenzschale geerntet und in einer Neubauerzählkammer (der Firma Roth) gezählt. Anschließend wurden Aliquots einer geeigneten Viruspräparation aufgetaut und bei Bedarf mit Medium verdünnt. Den zu infizierenden Zellen wurde der Kulturüberstand abgesaugt und durch soviel Virussuspension ersetzt, dass zum einen die Zellrasen gerade mit Flüssigkeit bedeckt und zum anderen der gewünschte MOI-Wert gewährleistet war. In diesem Zustand wurden die Zellkulturschalen für 1,5 h bei 37 °C inkubiert. Um eine gleichmäßige Flüssigkeitsverteilung aufrechtzuerhalten, wurden sie dabei regelmäßig geschwenkt. Nach dieser sogenannten Adsorptionsphase wurde die Virussuspension wieder entfernt und die Zellen bis zur Ernte in serumhaltigem bzw. serumfreiem Kulturmedium gehalten. Für die Infektion mit MCMV wurden 3T3 und MEFs verwendet, für die beiden RCMV Stämme wurden Rat-1 und REF Zellen verwendet.

Zum Erstellen von Zellkinetiken wurden 24 h vor Infektion die Zellen in einer Dichte von 1x104 Zellen/cm2 auf 6-well Zellkulturplatten (Biochrom, P 92406) ausplattiert und wie beschrieben infiziert. Uninfizierte Kontrollzellen wurden in Medium mit gleichen Serumkonzentrationen wie die Viruspräparate gehalten. Um die virale Replikation zu hemmen, wurden folgende Wirkstoffe verwendet: Ganciclovir (GCV) (50μM ) und Foscarnet (PFA) (300μg/ml).

2.6 Synchronisation der Zellpopulationen

2.6.1  Serumentzug

Wenn dem Kulturmedium kein Wachstumsfaktoren enthaltendes Kälberserum zugesetzt wird, hören die meisten Zellen auf zu zyklieren und gehen in einen als Quieszenz oder G0-Phase des Zellzyklus bezeichneten Zustand über. Erfolgt dann eine Restimulierung mit Medium, das die Serummitogene enthält, tritt ein großer Teil der Zellen synchron wieder in den Zellzyklus ein.

▼ 25 

In der vorliegenden Arbeit wurden 24 h nach Ausplattieren die Wachstumsfaktoren durch Verwenden von 0,1 – 0,4% FCS-haltigem Medium minimiert. Dies erfolgte durch Absaugen des serumhaltigen Mediums, Waschen mit serumfreiem Medium und Hinzufügen des serumarmen Mediums. Nach 72-stündiger Inkubation erfolgte entweder die Restimulation mit 10% serumhaltigem Medium (Zeitpunkt
t = 0) oder die Zellen wurden weiterhin im Serumentzug belassen, um dann zu den jeweils angegebenen Zeitpunkten geerntet zu werden (siehe 2.7). Sollte der Einfluss von MCMV/RCMV auf quieszente oder restimulierte Zellen untersucht werden, wurde 1,5 h vor der Serumrestimulierung mit der Adsorptionsphase der Virusinfektion (siehe 2.5) begonnen.

2.6.2 Behandlung mit Nocodazol

Zur Synchronisierung der Zellen in der Mitose wurden die Zellen mit dem „Spindelgift“ Nocodazol
(50 ng/ml) behandelt, welches die Formation der Mikrotubuli verhindert und so einen reversiblen Arrest der Zellen in der Prometaphase bewirkt. Nach 12 h Nocodazolbehandlung wurden die Zellen zweimal mit nocodazolfreiem Medium gewaschen und durch Hinzufügen von neuem serumhaltigen Medium erreichten die Zellen nach 2 h synchron den Übergang M/G1-Phase, nach 10 h erreichten die Zellen synchron die frühe S-Phase. Zu den gewünschten Zeitpunkten wurden dann die Zellen, wie in 2.5 beschrieben, infiziert, 8h, 12 h und 24 h nach Infektion geerntet und auf ihre Zellzyklusverteilung untersucht.

2.7 Zellernte

Zunächst wurde der Kulturüberstand in ein passendes Zentrifugenröhrchen überführt. Medienreste wurden durch einmaliges Waschen mit PBS entfernt, um die Zellen dann in einer Trypsin/EDTA-Lösung (Gibco-BRL, Katalog-Nr. 25300-054) solange bei 37 °C zu inkubieren, bis sie sich vom Plastikuntergrund ablösten. Mit Hilfe einer Pasteurpipette wurden die Zellen suspendiert und dann in den vorgelegten Kulturüberstand aufgenommen. Um das Trypsin zu inaktivieren wurde bei Bedarf noch Serum hinzugefügt. Nach einer fünfminütigen Zentrifugation bei 200 g wurden die Zellen in PBS resuspendiert und erneut für 5 min bei 200 g pelletiert. Nach diesem Waschschritt wurde das Zellmaterial durch die jeweiligen Analysemethoden entsprechend weiterverarbeitet.

2.8 Durchflußzytometrische Bestimmung des zellulären DNA-Gehalts

▼ 26 

Die durchflußzytometrischen Analysen wurden mit einem FACScan-Gerät durchgeführt, welches von dem Computerprogramm CellQuest (beides von Becton Dickinson) gesteuert wurde. Um den
DNA-Gehalt der Zellen durchflußzytometrisch messen zu können und so eine Auskunft über ihre Position im Zellzyklus zu erlangen, mussten Zellen erst permeabilisiert und mit Propidiumjodid gefärbt werden. Aus diesem Grund wurden geerntete Zellen (siehe 2.7) in 1 ml PBS suspendiert und unter ständigem Aufwirbeln mit 3 ml –20 °C kaltem Ethanol versetzt. Dann wurden sie für mindestens 14 h bei 0 °C gelagert und anschließend 3 min bei 400 g zentrifugiert. Nach Resuspension in 1 ml PBS und nochmaliger Zentrifugation bei 200 g wurden sie abhängig von der Zellzahl in 0,25 – 1 ml einer Färbelösung (PBS, 50 μg/ml Propidiumjodid, 100 U/ml RNase A) aufgenommen und darin 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Das Propidiumiodid-Fluoreszenzsignal der in der Färbelösung suspendierten Zellen wurde anschließend durchflußzytometrisch analysiert. Mit Hilfe des Dublettendiskriminierungsmoduls des Zytometers wurden aneinanderhaftende Zellen ausgegrenzt und DNA-Histogramme erstellt, in denen der DNA-Gehalt gegen die Zellzahl aufgetragen wurde.

2.9 Zellextraktion

Die geernteten Zellen (siehe 2.7) wurden in IPB1, für Zyklin D1-Analysen in IPB2, suspendiert. Bei der Erstellung der Extrakte für die Lambda-Phosphatase Behandlung wurde dem Lysepuffer IPB1 kein NaF und kein Natriumorthovanadat zugesetzt. Die Zellen wurden durch Einfrieren in siedendem Stickstoff und Auftauen im Wasserbad bei 37 °C lysiert. Anschließend wurden die Zelllysate bei 0 °C 20 min inkubiert und 20 min bei 20.000 g zentrifugiert. Die resultierenden Überstände wurden aufgehoben und bei –80 °C gelagert. Mithilfe des DC Protein Assay der Firma Bio-Rad, welcher auf der Lowry-Methode (Waterborg und Matthews, 1994) beruht, wurde die Proteinkonzentration der Extrakte bestimmt. Dazu wurden 2 μl des Extraktes mit 198 μl H2O verdünnt, 0,1 ml der kurz zuvor im Verhältnis 1:50 gemischten Reagenzien „S“ und „A“ hinzugefügt und dann mit 0,8 ml Reagenz „B“ gemischt. 10 min später wurde die Lichtabsorption der entstandenen Lösung bei 750 nm im Photometer gemessen, bei der Nullkontrolle wurde anstelle des Extraktes IPB eingesetzt. Als Proteinstandard wurde eine BSA-Verdünnungsreihe erstellt. Ganzzellextrakte wurden durch Sonifizieren im SDS-Probenpuffer erstellt.

2.10  Chromatinextraktion

Zur Isolierung von Chromatin wurde nach dem Protokoll von Méndez und Stillman vorgegangen (Mendez und Stillman, 2000). Dazu wurden die Zellen zuerst in Puffer A [10 mM HEPES (pH 7,9),
10 mM KCL, 1,5 mM, MgCl2, 0,34 M Saccharose, 10% Glycerol, 1 mM DTT, 5 μg/ml Aprotinin,
5 μg/ml Leupeptin, 0,5 μg/ml Pepstatin A, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 0.1% Triton] resuspendiert und 5 Minuten bei 0 °C inkubiert. Die Zellkerne wurden dann durch Zentrifugation
(4 min, 1300g, 4 °C) pelletiert und einmal mit Puffer A gewaschen. Anschließend wurden die Zellkerne in Puffer B [ 3 mM EDTA, 0.2 mM EGTA, 1 mM DTT, 5 μg/ml Aprotinin, 5 μg/ml Leupeptin,
0,5 μg/ml Pepstatin A, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid] lysiert, das Chromatin durch Zentrifugation pelletiert (4 min, 1700 g, 4 °C), einmal mit Puffer B gewaschen und unter gleichen Bedingungen erneut zentrifugiert. Das so erhaltene Chromatinpellet wurde in SDS-Probenpuffer resuspendiert und soniziert.

2.11  SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese

▼ 27 

Die Auftrennung der Proteine nach ihrer Größe erfolgte durch das Verfahren der SDS-PAGE (Polyacrylamid-Gelelektrophorese) nach Laemmli (Laemmli, 1970). Es fand in dieser Arbeit bei Immunoblot-Analysen von Zellextrakten und bei der Bestimmung von Zyklin-assozierten Kinaseaktivitäten Anwendung. Die jeweiligen Proteinproben wurden mit einem zweifach konzentrierten, reduzierenden SDS-Probenpuffer gemischt. Danach wurden sie für 3 min bei 95 °C erhitzt und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Dazu wurde das Mini Protean II-System der Firma Bio-Rad benutzt. Das Gel bestand aus zwei Teilen: Das obere Viertel, das sogenannte Sammelgel, enthielt
5% Polyacrylamid, 125 mM Tris (pH 6,8) und 0,1% SDS. Das untere sogenannte Trenngel enthielt je nach Anwendung zwischen 7,5% und 12% Polyacrylamid, außerdem 375 mM Tris (pH 8,8) und
0,1% SDS. Das eingesetzte Acrylamid hatte einen Bisacrylamidanteil von 2,6%, die Polymerisierung wurde durch 0,1% APS und 0,1% TEMED eingeleitet. Der SDS-PAGE-Laufpuffer bestand aus
125 mM Tris, 1,25 M Glycin, 0,5% SDS. Nach dem Einlaufen der Proben bei 90 V lief die Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 200 V solange, bis die Lauffront das untere Ende des Gels erreicht hatte.

2.12  Immunoblot-Analysen

Die Immunoblot-Analyse der nach Größe aufgetrennten Proteine (siehe 2.11) bestand aus zwei Teilen: dem Transfer der Proteine auf Membranen und dem Nachweis einzelner Proteine mit spezifischen Antikörpern. Durch Verdünnung der jeweiligen Proben mit IPB wurde die Proteinkonzentration der Zellextrakte angeglichen und jeweils gleiche Volumina in SDS-PAGE eingesetzt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurden die Proteine auf eine PVDF-Membran (Hybond von Millipore) transferiert. Hierzu wurde ein sogenannter Semi-Dry-Blotter (Phase, Best.-Nr. 84115000) eingesetzt. Der Transfer lief 1 h bei anfänglich 4 V ab. Als Transferpuffer diente 20% Methanol/25 mM Tris/190 mM Glycin. Nach erfolgtem Proteintransfer wurde die Membran in TTBS mit 6% gelöstem Trockenmilchpulver mindestens 30 min inkubiert, um auf diese Weise unspezifische Proteinbindungsstellen zu blockieren. Die Membranen wurden dann mit einem gegen das zu untersuchende Protein gerichteten, sogenannten Primärantikörper, dann mit einem gegen den Primärantikörper gerichteten Peroxidase-gekoppelten Sekundärantikörper inkubiert. Die jeweiligen Antikörper wurden in TTBS/6% Trockenmilch gelöst und die Inkubationen liefen entweder 2–4 h bei Raumtemperatur oder 12-24 h bei 4 °C ab, gefolgt von viermal zehnminütigem Waschen der Membranen mit TTBS. Die einmal gebrauchten Antikörperlösungen wurden mit 0,1% NaN3 haltbar gemacht und wenn möglich mehrfach verwendet. Die benutzten Antikörper mit der jeweiligen Verdünnung sind in Tabelle 2 aufgeführt; die beiden dort zuletzt aufgeführten sind mit einem Peroxidaseemzym gekoppelt. Abschließend wurden die antikörperbindenden Proteinbanden durch Chemilumineszenznachweis der gleichfalls gebundenen Peroxidaseaktivität sichtbar gemacht. Dabei wurden je nach Signalstärke die ECL Plus-Reagenzien von Amersham oder die Super-Signal-West-Fermento-Reagenzien von Pierce nach den Anleitungen der Hersteller benutzt. Durch Exposition eines Röntgenfilms (Kodak X-Omat) wurde das Ergebnis autoradiographisch festgehalten.

Tabelle 2: Für Immunoblot-Analysen verwendete Antikörper.

Antigen, Epitop

Herkunft

bezogen von

Konzentration Stammlösung

Verdünnung

Zyklin D1

Klon DCS6

(Maus)

Neomarkers

200 μg/ml

1:200

Zyklin D1

Klon DCS11

(Maus)

Neomarkers

200 μg/ml

1:200

Zyklin E

polyklonal

(Kaninchen)

Santa Cruz Biotechnology

(M20)

100 μg/ml

1:200

Zyklin A

polyklonal

(Kaninchen)

Santa Cruz Biotechnology

(H432)

200 μg/ml

1:200

Zyklin B1

Klon GNS1

(Maus)

Santa Cruz Biotechnology

100 μg/ml

1:200

Phospho-CDC2

(Tyr15)

polyklonal

(Kaninchen)

Cell Signaling

unbekannt

1:1000

Phospho-Rb

(Ser795)

polyklonal

(Kaninchen)

Cell Signaling

unbekannt

1:1000

CDC6

Klon 180.2

(Maus)

Santa Cruz Biotechnology

200 μg/ml

1:200

CDK4

polyklonal

(Kaninchen)

Santa Cruz Biotechnology

(C-22)

200 μg/ml

1:200

MCM2

Klon 46

(Maus)

BD Transduction Laboratories

250 μg/ml

1:500

p15

polyklonal

(Kaninchen)

Santa Cruz Biotechnology

(K-18)

200 μg/ml

1:200

p16

polyklonal

(Kaninchen)

Santa Cruz Biotechnology

(M-156)

100 μg/ml

1:300

p18

Klon DCS-118

Neomarkers

200 μg/ml

1:200

p19

polyklonal

(Kaninchen)

Santa Cruz Biotechnology

(M-167)

200 μg/ml

1:200

p21

polyklonal

(Kaninchen)

Santa Cruz Biotechnology

200 μg/ml

1:100

Kaninchen IgG

polyklonal

(Ziege)

Dianova

(Katalog-Nr. 111-035-045)

0,8 mg/ml

1:5000

Maus-IgG,

Fc-Fragment

polyklonal

(Ziege)

Sigma

(Katalog-Nr. A 0168)

unbekannt

1:3000

2.13  Comassiefärbung

▼ 28 

Um gleichmäßige Gelbeladung zu kontrollieren, wurden die SDS- Polyacrylamidgele für 30 min bei Raumtemperatur in einer Färbelösung (50% Methanol, 10% Essigsäure, 0,025% Coomassie brillant blue R250) geschüttelt. Anschließend folgte mehrmaliges Waschen mit dem Entfärber (30% Methanol, 10% Essigsäure), bis der Hintergrund vollständig entfärbt war. Danach wurde das Gel in einem Vakuumtrockner für 45 min bei 80 °C auf Whatmann-Papier (3MM) getrocknet.

2.14  Bestimmung von Zyklin-assozierten Kinaseaktivitäten

Um die Kinaseaktivität eines in einem Zellextrakt enthaltenen Proteins oder Proteinkomplexes zu messen, führt man in der Regel zuerst eine Immunpräzipitation mit einem gegen dieses Protein gerichteten Antikörper durch, um das solchermaßen gereinigte Protein dann in einer Kinasereaktion einzusetzen. In dieser wird ein geeignetes Substrat radioaktiv phosphoryliert, so dass nach gelelektrophoretischer Separierung des Substrats die zugehörige radioaktive Signalstärke Auskunft über die Höhe der präzipitierten Kinaseaktivität gibt. Nach diesem Prinzip wurde auch in dieser Arbeit vorgegangen, um die mit einzelnen Zyklinen assoziierten Kinaseaktivitäten zu bestimmen. Als Substrat diente Histon H1 und zur Analyse der Zyklin D1 assoziierten Kinaseaktivität Glutathion S-Transferase (GST)-Rb (379-928).

Biszu 100μg eines wie in Abschnitt 2.9 beschrieben hergestellten Zellextraktes wurden mit 0,1 μg eines Zyklinspezifischen Antikörpers für 1 h bei 0 °C in IPB (Endvolumen = 50 μl) inkubiert.
Es wurden die in Tabelle 2 genannten Antikörper benutzt, gegen Zyklin D1 wurde der Klon DCS11 verwendet. Nach Verdünnung mit IPB auf 1 ml wurden die entstandenen Immunkomplexe mit 10 μl aufgeschlämmter Protein A- oder Protein G- Sepharose (Sigma) für 12 h bei 4 °C präzipitiert. Damit die Agarosekügelchen ständig in Suspension gehalten werden konnten, wurden die Proben an einem drehenden Rad befestigt. Anschließend wurden die Immunpräzipitate viermal in IPB und zweimal in
50 mM Tris-Cl (pH 7,4)/10 mM MgCl2/1 mM DTT gewaschen. Ein Waschschritt bestand aus Resuspendierung, fünfminütiger Inkubation der Präzipitate in einer der genannten Pufferlösungen bei
0 °C und anschließender Zentrifugation für 1 min bei 3500 g.

▼ 29 

Die Immunpräzipitate wurden dann in 25 μl des Kinasereaktionspuffers (50 mM Tris-Cl [pH 7,4],
10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μM ATP) aufgenommen und die Kinasereaktion durch Zugabe von 5 μCi [γ-32P]ATP und 5 μg Histon H1 (Roche, 223549) bzw. 1 μg (GST)-Rb gestartet. Die Reaktionsansätze wurden für 30 min bei 30 °C rotiert, durch Zugabe von
SDS-Probenpuffer wurde dann die Reaktion beendet. Im Folgenden wurden die Proben mittels 12% SDS-PAGE (siehe 2.11) aufgetrennt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde der Teil des Geles, welcher das nicht eingebaute radioaktive ATP enthielt, abgeschnitten und der verbliebene Teil des Geles in 45% Methanol/10% Essigsäure für 20 min fixiert. Danach wurde das Gel auf Whatman-Papier (3MM) aufgezogen, getrocknet und autoradiographisch analysiert.

2.15  BrdU-Einbauexperimente / Bestimmung der Histon H3 Phosphorylierung

Dem Kulturmedium infizierter und uninfizierter Kontrollzellen wurden mit Beginn der Serumrestimulation 10 μm BrdU zugesetzt und die Zellen darin bis zur Ernte (siehe 2.7) belassen. Danach wurden die Zellen in PBS/70% Ethanol fixiert. Anschließend wurden die fixierten Zellen einmal in 1 ml eiskaltem PBS gewaschen, 3 min bei 200 g pelletiert, in 0,5 ml 2 N HCl resuspendiert und darin 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreiminütiger Zentrifugation bei 200 g wurden die Zellen in 0,5 ml PBS und in 0,5 ml PBS/0,5% BSA, jeweils mit nachfolgender Zentrifugation
(3 min, 200 g), gewaschen. Dann wurden sie erst mit einem Anti-BrdU Antikörper (Klon 3D4, Pharmingen), danach mit einem FITC-konjugierten Anti-Maus-IgG1 Antikörper (Klon A85-1, Pharmingen) inkubiert. Beide Bindungsreaktionen wurden unter Verwendung von 0,25 μg Antikörper in 50 μl PBS/0,5% BSA für 15 min bei Raumtemperatur ausgeführt und waren jeweils gefolgt von einem Waschschritt mit 0,5 ml PBS/0,5% BSA. Zum Schluss wurden die Zellen, wie in Abschnitt 2.8 beschrieben, mit Propidiumjodid gefärbt, um sie im Durchflußzytometer zu analysieren.

So wurde auch die Histon H3 Phosphorylierung bestimmt, dabei wurde ein Phospho-Histon H3 (Ser10) monoklonaler Mausantikörper der Firma Cell Signaling verwendet.

2.16  Behandlung mit Lambda Phosphatase

▼ 30 

Lambda Protein Phosphatase ist eine Mn2+ abhängige Phosphatase, die Serin-, Threonin- und Tyrosin- Reste dephosphoryliert. Die zu behandelnden Proteinextrakte wurden mit 2 mM MnCl2, 1x Phosphatasepuffer und 1000 U Lambda Protein Phosphatase (New England BioLabs P0753S) für 30 min bei 30 °C inkubiert. Die zur Kontrolle eingesetzten Proteinextrakte wurden ohne Phosphatase inkubiert. Durch die Zugabe von Laemmli Puffer wurde die Reaktion beendet. Anschließend wurden die Proben mittels SDS-PAGE (siehe 2.11) aufgetrennt und mit dem Zyklin E spezifischen Antikörper (Tab. 2) analysiert.

2.17  Chromosomenpräparation

Zum Spreiten der Chromosomen wurden die Zellen in 0,4% iger Kaliumchlorid (KCl) Lösung aufgenommen und für 10 Minuten mehrfach inkubiert. Nach der Behandlung mit der hypotonen Lösung folgte die Fixation mit Methanol und Eisessig (im Verhältnis 3:1).

Anschließend wurden Tropfpräparate erstellt. Nach der Giemsafärbung wurden die Präparate eingedeckt und mit einem Axiovert S100 Mikroskop der Firma Zeiss aufgenommen.


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HTML-Version erstellt am:
13.11.2006