3. Ergebnisse

▼ 30 (fortgesetzt)

3.1  Inhibition der Zellproliferation durch MCMV und RCMV

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Um den Einfluss von Nager-Zytomegalieviren auf den Zellzyklus zu untersuchen, wurden unterschiedliche Zellen mit den gebräuchlichsten M/RCMV Stämmen: MCMV, Stamm „Smith“, RCMV, Stamm „Maastricht“ und RCMV Stamm „England“ infiziert.

Am Beginn der Experimente stand die Messung des Einflusses dieser Viren auf die Zellproliferation.
Es wurden sowohl asynchron proliferierende verschiedene immortalisierte Zelllinien wie NIH-3T3 und Rat1 als auch primäre embryonale Fibroblasten von Ratte (REF) und Maus (MEF) infiziert. So konnten mögliche zelllinienspezifische Effekte und unterschiedliches Proliferationsverhalten der Zellen mit in die Untersuchungen einbezogen werden. An dem steigenden Verlauf des Graphen der uninfizierten Zellen (Abb. 8) kann man erkennen, dass die Zellen so ausplatiert wurden, dass die uninfizierten Zellen stetig über drei Tage proliferieren konnten. Über den beobachteten Zeitraum verdreifachte sich die Zahl der primären Zellen, während die immortalisierten Zellen wesentlich schneller proliferierten.
Die Proliferationskurve der NIH-3T3 Zellen erreichte bereits nach 48 Stunden ein gleichbleibendes Niveau. Die infizierten Zellen (infiziert mit MOI = 10) zeigten keine Zunahme der Zellzahl (Abb. 8).
Da im Lichtmikroskop kaum tote Zellen gesehen wurden, war dies ein erster Hinweis darauf, dass die Ursache für den Proliferationsstop eher auf eine unterbundene Zellproliferation als auf eine erhöhte Apoptoserate zurückzuführen war. Diese Vermutung wird im weiteren Verlauf dieser Arbeit durch Zellzyklusprofile infizierter Zellen belegt (siehe Abschnitt 3.2).

Bereits 8-12 h nach Infektion wird deutlich, dass alle Nager-CMV die Zunahme der Zellzahl komplett inhibieren. Dieser Effekt wird schon in der frühen Phase der Infektion beobachtet und impliziert, dass early oder immediate-early Virionproteine eine Rolle bei der Vermittlung dieses Effektes spielen könnten. Sowohl bei immortalisierten als auch bei primären Zellen konnte der gleiche antiproliferative Einfluss durch die Infektion beobachtet werden; dies zeigt, dass es sich offenbar nicht um zelllinienspezifische Effekte handelt. Zusammengenommen schlagen die Ergebnisse der Untersuchungen vor, dass Nager-CMV die Zellproliferation inhibieren, was in Übereinstimmung mit dem antiproliferativen Effekt von HCMV auf humane Vorhautfibroblasten steht (Lu und Shenk, 1996).

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Abbildung 8: Zellproliferationskurven von infizierten und uninfizierten Zellpopulationen. Asynchron proliferierende NIH-3T3 Zellen, MEFs, Rat1 Zellen, REFs und immortalisierte REFs wurden mit M/RCMV (MOI=10) infiziert und zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet. Anschließend wurde die Zellzahl in der Neubauerzählkammer bestimmt. In den Diagrammen ist die errechnete Zellzahl gegen die Erntezeitpunkte aufgetragen.

3.2 Blockierung der Zellzyklusprogression durch MCMV und RCMV

Um herauszufinden, ob dem beobachteten Proliferationsstop ein Block in einer bestimmten Zellzyklusphase zugrunde lag, wurden mittels durchflußzytometrischer Bestimmung des DNA-Gehalts Zellzyklusprofile infizierter und nicht infizierter Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten erstellt.
Um anhand der Stärke der Fluoreszenz den relativen DNA-Gehalt der Zellen im Durchflußzytometer zu messen, wurde die DNA der Zellen mit Propidiumjodid angefärbt. In eine Messung flossen ungefähr 10.000 einzelne Zellen ein. Daraufhin wurden DNA-Histogramme erstellt, in denen der relative DNA-Gehalt gegen die Zellzahl aufgetragen ist (Abb. 9). Das Zellzyklusprofil asynchron proliferierender Zellen zeigt zwei Peaks, die durch ein Plateau verbunden sind. Der erste Peak beinhaltet die Zellen der G1-Phase, der zweite die Zellen der G2- und M-Phase und das Plateau enthält die Zellen der S-Phase. Zellen, die sich ganz am Ende oder Anfang der S-Phase befinden, können durch diese Methode allerdings nicht von den G1- bzw. G2-Zellen abgegrenzt werden.

Die uninfizierten Zellen (Abb. 9, Diagramme der oberen Reihe) zeigen ein normales Zellzyklusverteilungsmuster von proliferierenden Zellen; auffallend ist hierbei ein größerer Anteil an Zellen in der S-Phase, der am ehesten auf die schnelle Proliferation der immortalisierten Zellen zurück zu führen ist. Im Verlauf des Experiments arretieren die uninfizierten Zellen aufgrund der Zelldichte frühzeitig nach 24 h in Rat1-Zellen bzw. nach 48 h in 3T3-Zellen, zu erkennen am gleichbleibenden G1-Anteil der Proliferationskurven.

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Die Infektion der Zellen mit M/RCMV hat eine Änderung dieser Verteilung zur Folge: Bereits in den ersten 9 Stunden steigt der Anteil der G1-Zellen in den RCMV infizierten Populationen an (Abb. 9A). Es handelt sich bei RCMV E infizierten Zellen um einen Anstieg von 39% auf 73% und bei mit RCMV M infizierten Zellen auf 62%. Durch gleichzeitige Beobachtung der Zellen mit dem Lichtmikroskop wurde deutlich, dass die Anreicherung der G1-Zellen dabei nicht auf eine Kontaktinhibition zurückgeführt werden konnte (daher nicht gezeigt).

Bei den MCMV infizierten Zellen war ein geringerer Anstieg der G1-Population zu beobachten
(Abb. 9B): von 29% auf 40%. Bemerkenswert ist, dass in den MCMV infizierten Zellen, im Gegensatz zu den RCMV infizierten Zellen, ein Anstieg des G2-Peaks von 11% auf 50% zu beobachten ist, was ein wahrscheinlicher Grund für den geringeren Anstieg des G1-Peakes in diesen Zellen darstellt, und erstmals andeutet, dass die Infektion mit Nager-CMV zu einem G2-Arrest führt.

Nach 24 Stunden ist in den infizierten Zellpopulationen eine Verbreiterung und Verschiebung des
G1-Peaks in die S-Phase, entlang der Achse des DNA-Gehalts, zu beobachten. Dieser Befund impliziert, dass G1-Zellen eine zusätzliche DNA-Last erfahren und deutet somit auf den Beginn der viralen DNA-Synthese hin. Diese Konstellation ist typisch auch für HCMV infizierte Zellen (Dittmer und Mocarski, 1997;Jault et al., 1995;Lu und Shenk, 1996). Diese zusätzliche DNA-Synthese kann im weiteren Verlauf dieser Arbeit durch die Behandlung mit Ganciclovir unterbunden werden (siehe 3.4), was die virale Genese dieser DNA-Last belegt. So lässt sich zusammenfassend feststellen, dass die RCMV infizierten Zellen vorwiegend in G1 und die MCMV infizierten Zellen in G1 und darüber hinaus vor allem auch in G2/M akkumulieren. Zusätzlich ist eine Abnahme der S-Phase-Zellen zu beobachten.

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Abbildung 9: Zellzyklusverteilung M/RCMV infizierter Zellen. Die jeweilige Zellpopulation wurde zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet. Durch Propidiumjodidfärbung und anschließende durchflußzytometrische Bestimmung des DNA-Gehalts wurde dann ihre Zellzyklusverteilung ermittelt. Gezeigt sind DNA-Histogramme, in denen die prozentuale Verteilung auf die einzelnen Zellzyklusphasen (G0,G1/S/G2, M) vermerkt ist.

Wie oben gezeigt scheint es den Nager-CMV möglich zu sein, die Zellzyklusprogression infizierter Zellen in der G1- und G2/M-Phase zu unterbrechen. Um dies eindeutig zu belegen und Unterschiede aus zu schließen, die lediglich aus der ungleichmäßigen Zellzyklusverteilung der asynchron proliferierenden Ausgangspopulation resultieren, wurden in einem nächsten Experiment die Zellen vor der Infektion chemisch synchronisiert. Dabei wurde nach einem Schema verfahren, in dem Zellen durch Nocodazol reversibel in der Mitose arretiert werden. Nach Aufhebung des Nocodazolblocks durchlaufen die Zellen synchron die folgenden Zellzyklusphasen und wurden dann entweder in der späten M/frühen G1 oder in der frühen S-Phase infiziert (Abb. 10). Nocodazol ist ein viel benutzter, synthetischer Inhibitor der Mikrotubuliformierung (De Brabunder 1976). Aufgrund fehlender Ausbildung der mitotischen Spindel kommt es zu einem reversiblen Block in der Prometaphase der Mitose (Zieve 1980).

24 h nach dem Ausplatieren wurden die Fibroblasten für 12 h mit Nocodazol behandelt, was zu dem o.g. Zellzyklusblock in der Mitose führte (Abb. 10, 36 h). Nach der Entfernung von Nocodazol konnten die Zellen aus diesem reversiblen Zellzyklusblock ihre Zellzyklusprogression wieder aufnehmen und erreichten so nach 38 h die späte M- und frühe G1-Phase (M/G1) (Abb. 10, 38 h) und nach 45 h die frühe S-Phase (Abb. 10, 45 h). Die so synchronisierten Zellen wurden dann in der M/frühen G1 oder in der frühen S-Phase mit den verschiedenen CMV Stämmen infiziert und die Zellzyklusverteilung wurde 12 h und 24 h nach der Infektion untersucht (siehe Abb. 11).

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Abbildung 10: Synchronisation der Zellen mit Nocodazol. Zellen wurden durch 50 ng/ml Nocodazol reversibel in der Prometaphase der Mitose arretiert. Die solchermaßen synchronisierten Zellen wurden in der Folge in
M/G1- oder in früher S-Phase infiziert (MOI=10). Die gezeigten DNA-Histogramme demonstrieren den Erfolg der Synchronisierung und die Zellzyklusverteilung zu den Zeitpunkten der Infektion.

12 h nach Restimulation in M/G1 haben uninfizierte Kontrollzellen überwiegend die G2-Phase erreicht (Abb. 11, 38 h nach Ausplatierung/12 h/uninfiziert). Nach 24 h (Abb. 11, 38 h nach Ausplatierung/24 h/uninfiziert) befindet sich der größte Teil dieser Ausgangspopulation wieder in der G1-Phase und die Proliferation wird normal fortgesetzt.

Im Gegensatz zu uninfizierten Zellen erreichen in M/G1 mit M/RCMV infizierte Zellen zum überwiegenden Teil nicht die G2-Phase, statt dessen akkumulieren sie 12 h nach Infektion in der
G1-Phase (Abb. 11, 38 h nach Ausplatierung/12h/+ CMV). Dies deutet darauf hin, dass die mit M/RCMV infizierten Zellen in der G1-Phase arretieren. Wie bereits in Abschnitt 3.2 beschrieben, setzt nach 24 h die virale Replikation ein, was keine weitere Analyse der genauen Zellzyklusprogression erlaubt.

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Kontrollzellen, die 45 h nach dem Ausplatieren (also 9 h nach Restimulation) in der späten G1/frühen S-Phase sind, erreichen nach 57 h (Abb. 11, 45 h nach Ausplatierung/12 h/uninfiziert) synchron erneut die G1-Phase und proliferieren normal weiter. Im Gegensatz dazu zeigen die Zellzyklusprofile der in der späten G1/frühen S-Phase infizierten Zellen einen G2/M-Arrest. Da auch diese Zellen, ohne die
G1-Phase wieder zu erreichen, virale DNA produzieren, zeigt dies, dass die Nager-CMV, im Gegensatz zu HCMV (Salvant et al., 1998), Zellen in der frühen S-Phase infizieren und die virale DNA-Synthese starten können.

Interessanterweise verursacht eine Infektion von Zellen in der späten S-Phase (46,5 h nach dem Ausplatieren) hingegen keinen G2/M-Phase-Arrest (Abb. 12). Wie die Kontrollzellen (Abb. 12, uninfiziert) erreichen infizierte Zellen deshalb nach der Synchronisation wieder die G1-Phase (Abb. 11, 45 h nach Ausplatierung/+ CMV). Offensichtlich machte es einen entscheidenden Unterschied für die weitere Zellzyklusprogression bzw. den viralen Infektionszyklus, ob Zellen am Beginn oder am Ende der S-Phase infiziert werden.

Diese Ergebnisse veranschaulichen (Abb. 12), dass sowohl MCMV als auch beide RCMV Stämme in der Lage sind, Zellen in der G1- und G2/M-Phase zu arretieren. Dies steht im Kontrast zu HCMV, welches Zellen nur in der G1-Phase blockiert.

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Abbildung 11: MCMV und RCMV arretieren Zellen in G1 und G2/M. Zellen wurden wie bereits in Abb. 10 beschrieben in M/G1 bzw. früher S-Phase infiziert. Zu den genannten Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet, mit Propidiumjodid gefärbt und ihr DNA-Gehalt durchflußzytometrisch bestimmt. Gezeigt ist die Zellzyklusverteilung M/RCMV infizierter und nicht infizierter Zellen in DNA- Histogrammen.

Abbildung 12: Die Infektion in der späten S-Phase ist für den G2/M-Arrest nicht ausreichend. Es wurde wie in Abb. 11 beschrieben verfahren. Die Zellen wurden 46,5 h nach dem Ausplatieren infiziert, als sie sich in der späten S-Phase befanden. Gezeigt ist die Zellzyklusverteilung M/RCMV infizierter und nicht infizierter Zellen in DNA-Histogrammen.

Um diese Zellzykluseinflüsse von MCMV und RCMV durch weitere unabhängige Experimente zu bestätigen wurde getestet, ob eine Infektion serumarretierter Zellen diese daran hindern, nach Serumrestimulation wieder in den Zellzyklus einzutreten und diesen zu durchlaufen.

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Um die Zellen in G0 zu akkumulieren, wurde den Zellen 72 h das Serum entzogen. Nach der dann folgenden Infektion und Serumrestimulationwurde dem Zellkulturmedium das Thymidin-Analog BrdU hinzugefügt. Dadurch wurde bis zur Ernte in neu synthetisierte DNA BrdU inkorporiert. Eine DNA-Neusynthese war auf diese Weise durch BrdU-spezifische Antikörper nachzuweisen.
Eine Doppelfärbung der geernteten Zellen mit Propidiumjodid und direkt FITC-markierten
BrdU-Antikörpern macht darüber hinaus eine eindeutige Darstellung aller Zellzyklusphasen möglich. Dargestellt sind die Ergebnisse in Density Dot Blots, in denen der DNA-Gehalt gegen die Menge an eingebautem BrdU aufgetragen ist.

In uninfizierten Zellen ist bereits nach 12 h BrdU nachzuweisen. Sie haben also begonnen, ihre DNA zu replizieren (Abb. 13B, Diagram 2) und verteilen sich nach 16h über die gesamte S-Phase (Abb. 13A,
2 und 13B, 3), was sich an der Verschiebung entlang der BrdU-Achse erkennen lässt. Im Gegensatz dazu sind die infizierten Zellpopulationen zu frühen Zeitpunkten noch BrdU-negativ (Abb. 13B Diagramm 5 und 8), d. h., es wurden anstatt der BrdU-Einbau signalisierten FITC-Fluoreszenzen nur die Autofluoreszenzen von G1-Zellen gemessen. Eine DNA-Synthese infizierter Zellen ist erst nach 16 h zu beobachten und reflektiert dann sowie nach 20 h, am ehesten die virale DNA-Replikation.
Zum Nachweis viraler DNA siehe auch Abb. 13, Diagramme 5A und 6B, 9B, 7B und 10B. Vor dem Hintergrund der bisherigen Versuche unterstützen somit auch diese Ergebnisse die Sichtweise, dass Zellen, die aus der G0/G1-Phase kommen, durch die Infektion mit M/RCMV in der G1-Phase arretieren.

Abbildung 13: BrdU-Einbau infizierter Zellen. Zellen wurde 72 h das Serum entzogen, um sie in G0 zu akkumulieren. Nach der dann folgenden Infektion mit MCMV (A) bzw. RCMV (B) in Anwesenheit von Serum wurde dem Zellkulturmedium das Thymidin-Analog BrdU zugefügt. Eine Doppelfärbung der geernteten Zellen mit Propidiumjodid und FITC-markiertem BrdU-Antikörper machte somit die Darstellung der DNA-Neusynthese möglich. Dargestellt sind die Ergebnisse in Density Dot Blots, in denen der DNA-Gehalt gegen die Menge an eingebautem BrdU aufgetragen ist.

3.3 Der späte Zellzyklusarrest liegt in der G2-Phase und nicht in der Mitose

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Die bisher gezeigten durchflußzytometrischen Analysen lassen offen, ob der durch M/RCMV hervorgerufene Zellzyklusarrest in der G2-Phase oder der Mitose stattfindet. Um diesen späten Zellzyklusarrest in diesem Sinne genauer zu charakterisieren, wurden im Folgenden infizierte Zellen auf die Anwesenheit von Mitosemarkern untersucht.

Als ein erster Marker bietet sich die Untersuchung des Zustandes der Chromosomen an. In der ersten Phase der Mitose, der Prophase, erfolgt neben der Auflösung der Kernmembran und der Wanderung der Zentriolen zu den Polen auch die Kondensation der Chromosomen. Durch entsprechende Chromosomenpräparation ist es möglich, den Zustand der Chromosomenkondensation zu beurteilen.
So wurden NIH-3T3 Zellen und Rat1 Zellen, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben, mit Nocodazol synchronisiert, in der frühen S-Phase infiziert und nach 12 h, als die Zellen in G2/M arretiert waren, geerntet und der Chromosomenpräparation unterzogen. Ein Teil der verwendeten Zellen wurde mittels Durchflußzytometrie analysiert, um sicher zu sein, dass die Zellpopulation dem durch M/RCMV induzierten Proliferationsstop in G2/M unterlag. Es zeigt sich dabei, dass die für die Analyse verwendeten infizierten Zellen zu mehr als 90% in der M/G2-Phase arretiert waren (Daten nicht gezeigt). Als Kontrollzellen dienten NIH-3T3 und Rat1 Zellen, die 12 h mit Nocodazol behandelt worden waren. Es konnte gezeigt werden, dass die Chromosomen dieser Kontrollzellen bereits kondensiert waren (Abb. 14, nocodazolbehandelte Kontrolle).

Im Gegensatz dazu ergab die Analyse der CMV-arretierten Zellen noch keine Chromosomenkondensation (Abb. 14, + CMV). Das bedeutet, dass sich die infizierten Zellen noch in der Interphase des Zellzyklus befinden müssen und somit in G2 arretiert waren.

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Abbildung 14: Chromosomenpräparate infizierter Zellen. Nocodazol behandelte Zellen wurden in der frühen
S-Phase infiziert, zum Zeitpunkt des G2/M-Arrestes geerntet und wie bereits beschrieben durchflußzytometrisch analysiert. Dann erfolgte die hier gezeigte Chromosomenpräparation und die Färbung des Zellmaterials mit dem Giemsa-Farbstoff.

Dieses Ergebnis sollte mit einer unabhängigen Methode bestätigt werden. Im Kontrast zu der Histon H1 Phosphorylierung, die während des gesamten Zellzyklus erfolgt, wird die stärkere Phosphorylierung des Histon H3 nur im Zusammenhang mit der Chromosomenkondensation, somit zu Beginn der Mitose, gefunden (Hendzel et al., 1997). Die H3 Phosphorylierung kann also ebenfalls als Marker für die frühe Mitose benutzt werden.

Die durch CMV in G2/M arretierten Zellen wurden mit einem phosphospezifischen Anti-Histon H3 Antikörper inkubiert, und die dann folgende Doppelfärbung mit Propidiumjodid und einem
FITC-konjugierten Antikörper machte die Darstellung des phosphorylierten Histon H3 mittels Durchflusszytometrie möglich. Dargestellt sind die Ergebnisse in Density Dot Blots, in denen die Zellgröße gegen das phosphorylierte Histon H3 aufgetragen ist. Während die uninfizierten, nocodazolbehandelten Kontrollzellen deutlich die Phosphorylierung von Histon H3 erkennen lassen, kann in den infizierten Zellen keine phosphorylierte Form von Histon H3 nachgewiesen werden
(Abb. 15). Somit zeigen beide Ergebnisse, dass der durch M/RCMV verursachte späte Zellzyklusarrest in der G2-Phase erfolgt, bevor die Zellen in die Mitose eintreten.

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Abbildung 15: Histon H3 Phosphorylierung. Die Zellen wurden wie in Abb. 14 beschrieben infiziert. Die durch CMV in G2 arretierten Zellen wurden nach der Ernte mit einem phosphospezifischen Histon H3 Antikörper behandelt und das Signal des phosphospezifischen Histon H3 Antikörpers wurde im Durchflußzytometer gemessen. Als Kontrolle dienten nocodazolbehandelte Zellen. In den gezeigten Dot Blots ist die Zellgröße gegen die Histon H3 Phosphorylierung aufgetragen.

3.4 MCMV und RCMV replizieren sowohl in G1 als auch in G2

Bisher konnte gezeigt werden, dass MCMV und RCMV in der Lage sind, Zellen in G1 und G2 zu arretieren. In den gezeigten Zellzyklusprofilen infizierter Zellen ist jedoch außerdem eine zusätzliche DNA-Synthese beobachtet worden. Deshalb sollte in den folgenden Experimenten untersucht werden, ob es sich bei dieser DNA tatsächlich um virale DNA handelt und ob MCMV und RCMV
(im Gegensatz zu HCMV) auch von G2 aus ihr Genom replizieren können. Um eindeutig zwischen viraler und zellulärer DNA-Replikation unterscheiden zu können, erfolgte die Behandlung von Zellen mit spezifischen Inhibitoren der viralen DNA Replikation. Ganciclovir (GCV) wird in die DNA eingebaut und hemmt dadurch spezifisch die virale DNA-Polymerase, nicht aber die zelluläre. Foscarnet (PFA), das ebenso die virale DNA-Polymerase hemmt, blockiert die Bindungsstellen von Pyrophosphat. Asynchron proliferierende Zellen wurden wie gewohnt infiziert. Nach der Absorptionszeit wurden in den ersten Versuchen 50 μM Gancyclovir zugegeben. Anschließend wurden die Zellen zu entsprechenden Zeitpunkten geerntet und ihr DNA-Gehalt mit Hilfe der Propidiumjodidfärbung durchflußzytometrisch bestimmt. Neben infizierten Zellen wurden auch uninfizierte Zellen mit GCV behandelt, was zeigte, dass der Wirkstoff per se keinen Effekt auf die Zellzyklusverteilung hat (Daten hier nicht gezeigt). Nur in MCMV und nicht in RCMV infizierten Zellen konnte die virale DNA-Synthese durch GCV Zugabe gehemmt werden (Abb. 16). In Abbildung 16A wurde eine dreidimensionale Darstellung der DNA-Histogramme gewählt, um einen besseren Vergleich der Kurven zu ermöglichen. Zusätzlich sind in Abb. 16B die Ergebnisse in Density Dot Blots dargestellt. 12 h nach der Infektion mit MCMV befindet sich der größte Teil der Zellen in der G1 und G2-Phase, während sich die S-Phase entleert hat. Die Zellzyklusverteilung stimmt also mit den bisherigen Beobachtungen überein. Nach 24 h ist die virale Replikation bereits zu erkennen: der G1 und G2 Peak verschiebt und verbreitert sich horizontal auf der Abszisse, was dafür spricht, dass sowohl von der G1 als auch von der G2–Phase aus virale Replikation beginnt (Abb. 16A). Deutlicher werden diese Ergebnisse durch die Darstellung in Abb. 16B, die Signalein den Diagrammen 2, 3 und 4 „wandern“ die Abszisse entlang hin zum Bereich des höheren DNA-Gehalts; 36 bzw. 48h nach Infektion sind die Effekte jeweils massiv verstärkt. Diese Effekte werden durch die Behandlung mit GCV gänzlich unterdrückt, und die Analysen ergeben normale Zellzyklusprofile proliferierender Zellen (Abb. 16A und 16B/+MCMV +GCV). Dies zeigt, dass die neu synthetisierte DNA tatsächlich viralen Ursprungs ist. In den infizierten Zellen sind 36 h nach Infektion zwei Peaks zu beobachten, die GCV unterdrückt und somit durch die Anhäufung viraler DNA verursacht werden. Der erste entsteht zwischen 2N und 4N DNA-Gehalt und der zweite hinter dem 4N DNA-Gehalt. Diese Ergebnisse belegen somit, dass MCMV sowohl in G1 als auch in G2 arretierten Zellen DNA replizieren kann.

Abbildung 16: Virale, GCV sensitive DNA-Synthese in G1- und G2-Zellen. NIH-3T3 Zellen wurden wie beschrieben in An- bzw. Abwesenheit von Gancyclovir (GCV) infiziert. Zu den genannten Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet und ihre Zellzyklusverteilung analysiert. Die Ergebnisse wurden sowohl als DNA-Histogramme dreidimensional (A) als auch als Density Dot Blots (B) dargestellt.

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Im Gegensatz zu diesen eindeutigen Befunden mit MCMV, konnte die virale Synthese weder von RCMV E noch von RCMV M durch GCV gestoppt werden (Abb. 17 A und B). Die RCMV infizierten Zellen zeigen das bereits beschriebene typische Zellzyklusbild infizierter Zellen mit zusätzlichen Peaks der Zellzykluskurven an den Stellen zwischen 2N und 4N und größer 4N (Abb. 17 A und B + RCMV). Dieses Bild konnte jedoch durch die Zugabe von GCV nicht beeinflusst werden (Abb. 17 A und B +RCMV +GCV), die virale DNA-Synthese konnte also nicht durch GCV gehemmt werden.

Abbildung 17: GCV hat keinen Einfluss auf RCMV infizierte Zellen.Rat1 Zellen wurden wie beschrieben in
An- bzw. Abwesenheit von Gancyclovir (GCV) infiziert. Zu den genannten Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet und ihre Zellzyklusverteilung analysiert. Die Ergebnisse wurden dreidimensional in DNA-Histogrammen dargestellt.

Für GCV ist aus der Literatur (Brideau et al., 2002) und aus eigenen Versuchen bekannt, dass es die virale Replikation von RCMV nicht eindeutig verhindern kann, deswegen wurde auf den Hemmstoff Foscarnet (PFA) zurückgegriffen. Es wurde wie oben beschrieben verfahren, wobei nach der Absorptionszeit den Zellen nun 300 μg/ml PFA zugesetzt wurde.

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Eigene Beobachtungen zeigten, dass durch den Zusatz von PFA kein Einfluss auf MCMV infizierte Zellen erzielt wird (Daten nicht gezeigt). Bei den RCMV infizierten Zellen konnte eine Inhibition der viralen DNA-Synthese beobachtet werden. Aus Abb. 18 wird deutlich, dass in den infizierten Zellen (Diagramme 1, 2, 3, 4) eine Verschiebung des DNA-Gehalts weit hinter den Bereich des
4N DNA-Gehalts von G2 Zellen (gekennzeichnet durch die vertikale Linie) erfolgt, was auf virale DNA-Synthese (wie bereits beschrieben) hinweist.

Werden die infizierten Zellen mit PFA behandelt, nimmt die Dichte der Zellen in diesem Bereich ab (Abb. 18, Diagramme 5, 6, 7 und 8). Es ist bekannt, dass verschiedene Hemmstoffe unterschiedlich sensitiv sind (Brideau et al., 2002). Da Inhibitoren also nicht immer gleich zu wirken scheinen, weist die nicht qualitative Wirkung von PFA in Analogie zum Maussystem darauf hin, dass es sich auch hierbei mit hoher Wahrscheinlichkeit um virale DNA handelt.

Abbildung 18: PFA reduziert virale DNA-Replikation. Rat1 Zellen wurden wie beschrieben in An- bzw. Abwesenheit von Foscarnet (PFA) infiziert. Zu den genannten Zeitpunkten wurden die Zellen geerntet und ihre Zellzyklusverteilung analysiert. Die Ergebnisse wurden als auch als Density Dot Blots dargestellt, in denen der relative DNA-Gehalt gegen die relative Zellzahl aufgetragen ist. Die vertikale Linie markiert die Stelle des
4 N DNA-Gehalts von Zellen die sich in der G2-Phase des Zellzyklus befinden.

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Da virale DNA-Replikation sowohl von der G1- als auch von der G2-Phase aus beobachtet werden konnte, stellte sich nun die Frage, ob in den G1- und in den G2-arretierten Zellen auch jeweils infektiöse Virionen gebildet werden. Um diese Frage zu klären wurde nach dem in Abbildung 10 vorgestellten Protokoll vorgegangen. Der Überstand der so in G1 und G2 arretierten Zellpopulationen wurde mittels Plaque-Assays auf den Gehalt infektiöser Virusnachkommen untersucht. Es wurden alle Nager-CMV in die Analyse einbezogen. In Abb. 19 sind die Ergebnisse der Titrationen (in PFU/ml) gegen die Erntezeitpunkte aufgetragen. Die Diagramme (Abb. 19) zeigen, dass die Menge an infektiösen Virionen in G1- und G2- arretierten Zellen nahezu gleich ist. Das demonstriert eindeutig, dass MCMV und RCMV nicht nur Zellen in G1 und G2 arretieren und dort virale DNA replizieren sondern im Unterschied zu HCMV (Fortunato et al., 2002;Salvant et al., 1998) in beiden Zellzyklusphasen auch produktiv replizieren können.

Abbildung 19: Produktion infektiöser Virionen von M/RCMV in G1- und G2-Zellen.Gezeigt sind die Titer der infektiösen Virusnachkommen von Überständen infizierter in G1 und G2 arretierter Kulturen, die mithilfe des Plaque-Assays ermittelt wurden. Zellen wurden wie in Abb. 11 dargestellt infiziert. Zu den genannten Zeitpunkten wurden die Überstände geerntet und in Plaque-Assays analysiert.

3.5 Deregulation molekularer Zellzyklusregulatoren durch M/RCMV

Im weiteren Verlauf dieser Arbeit erfolgte die Untersuchung der molekularen Grundlagen, des durch M/RCMV verursachten Zellzyklusarrestes. Der durch HCMV verursachte G1-Arrest geht mit veränderten Zyklin-assoziierten Kinaseaktivitäten und Beeinflussung unterschiedlicher Zellzyklusregulatoren einher. Aus diesem Grund wurde besonderes Augenmerk auf die Analyse der unterschiedlichen Zykline, den dazugehörigen Zyklin-assoziierten Kinasen und verschiedener Zellzyklusregulatoren gelegt, um zu eruieren welche Mechanismen zwischen den Zytomegalieviren konserviert sind.

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Der Einfluss von M/RCMV auf die Glieder des Zellzyklus wurde untersucht indem Extrakte von infizierten in G1 arretierten Fibroblasten erstellt wurden, die dann mittels in vitro Kinaseassays auf die Aktivitäten der Zyklin D1, E, A und B1-assoziierten Kinasen analysiert wurden. Um einen Einblick zu bekommen wie die Zyklin-assoziierten Kinaseaktivitäten in infizierten Zellen reguliert werden, wurde außerdem die Zyklin-Proteinexpression (Zyklin D1, E, A und B1), die CKI-Proteinexpression (p15, p16, p17, p19) und der Phosphorylierungszustand von CDK1 bestimmt.

3.5.1  Repression der Zyklin D1-assoziierten Kinaseaktivität

Passend zum Zellzyklusverlauf wurde mit der Analyse von Zyklin D1 und der Zyklin D1-assoziierten Kinaseaktivität begonnen. Obwohl in infizierten Zellen die Zyklin D1-assoziierte Kinaseaktivität fehlte (Abb. 20A, Bahn 2 und 4), konnten in serumbehandelten infizierten und uninfizierten Zellen gleiche Zyklin D1-Proteinlevel nachgewiesen werden (Abb. 20B, Bahn 1 und 2).

Abbildung 20: Einfluss von M/RCMV auf die Expression von Zyklin D1 und die Zyklin D1-assoziierte Kinaseaktivität. Quieszente Zellen wurden in An- bzw. Abwesenheit von Serum infiziert. Die Zellen wurden nach 16 Stunden, wenn serumrestimulierte Zellen die S-Phase erreicht hatten, geerntet und Proteinextrakte wurden erstellt. In diesen wurde mit Hilfe von in vitro- Kinaseassays die Zyklin-assoziierten Kinaseaktivitäten (A) mit GST-Rb als Substrat bestimmt. Des weiteren wurden die Extrakte auf Zyklinexpression (B) in Immunoblotanalysen mit Zyklin-spezifischen Antikörpern untersucht.

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Um eine mögliche Ursache für die reduzierte Zyklin D1- assoziierte Kinaseaktivität zu finden, wurde in den folgenden Experimenten untersucht, ob die katalytische Untereinheit der Kinase, CDK4, in infizierten Zellextrakten exprimiert und an Zyklin D1 gebunden ist.

Überraschenderweise konnte, trotz der fehlenden Kinaseaktivität, kein Unterschied zwischen der CDK4-Expression in uninfizierten und infizierten Zellen gefunden werden (Abb. 21A). Um zu testen, ob Zyklin D1 mit CDK4 in vivo assoziiert ist, folgte eine Koimmunpräzipitation von CDK4 über Zyklin D1. In uninfizierten serumrestimulierten Zellen kann Zyklin D1-assoziiertes CDK4 nachgewiesen werden (Abb. 21B, Bahn 1). In den infizierten Zellen allerdings scheint Zyklin D1 keinen Komplex mit CDK4 zu bilden (Abb. 21B, Bahn 2 und 4).

Dies zeigt, dass in infizierten Zellen CDK4 prinzipiell exprimiert wird, aber nicht an Zyklin D1 bindet. Was eine Voraussetzung für die Funktion der Kinase wäre. Dies könnte eine mögliche Ursache für die nicht nachzuweisende Zyklin D1-assoziierte Kinaseaktivität sein.

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Abbildung 21: Einfluss von M/RCMV auf CDK4. Es wurden in Abb. 20 beschriebene Zellextrakte verwendet Diese wurden unmittelbar (A) oder nach erfolgter Zyklin D1-Immunpräzipitation (B) auf CDK4 Expression in Immunoblotanalysen untersucht.

Die CKI der INK4- Familie hemmen die Aktivität des Zyklin D/CDK4 Kinase-Komplexes, indem sie die Bindung der Kinase an Zyklin D verhindern (siehe Abb. 12). Um zu überprüfen, ob die fehlende Bindung von CDK4 an Zyklin D1 durch eine in infizierten Zellen höhere Expression von CKI hervorgerufen wird, wurden die Expressionslevel der CKI der INK4-Familie (p15, p16, p18 und p19) untersucht. Da NIH-3T3 Zellen kein funktionelles p16Ink4a exprimieren konnte die Relevanz dieses Zellzyklusregulators ausgeschlossen werden, um dies praktisch zu belegen wurden stattdessen Zellextrakte von infizierten MEFs und infizierte RAT1 Zellen verwendet. Es konnten in infizierten, serumbehandelten Zellen in keinem Falle höhere p16 Level nachgewiesen werden als in den uninfizierten Kontrollextrakten (Abb. 22A). P15 (Abb. 22B), wird in nachweisbaren Mengen nur in quieszenten uninfizierten Zellen exprimiert (Abb. 22B, Bahn 3).

Abbildung 22: Zelluläre Zellzyklusregulatoren p16 und p15 sind nicht für verminderte Zyklin D1-assoziierte Kinaseaktivität verantwortlich. Es wurden in Abb. 20 beschriebene Zellextrakte verwendet Diese wurden mit einem p16-spezifischen (A) und p15-spezifischen (B) Antikörper in Immunoblotanalysen untersucht.

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P18 konnte weder in uninfizierten noch in infizierten Zellen nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Die Analyse der Expression von p19 erwies sich ebenfalls als schwierig, eine spezifische Bande war nur in uninfizierten serumbehandelten Zellen darstellbar (Abb. 23, Bahn 1).

Nachdem die Inhibitoren der INK4- Familie in infizierten Zellen nicht stärker exprimiert waren, wurde p21 als möglicher Vertreter der CIP/KIP- Familie als letzter Kandidat in die Analyse einbezogen. Da p21 sowohl CDK1 als auch CDK2 inhibieren kann, war in Anbetracht der bestehenden CDK1 Aktivität in infizierten Zellen (siehe 3.5.3) nicht davon auszugehen, dass p21 verstärkt exprimiert wird. Darüberhinaus würde p21 nicht den Zyklin D1/CDK- Komplex zerstören. Obwohl CDK2 in infizierten Zellen aktiv ist (s.u.) und in immortalisierten Rat1 Zellen nicht funktionell, musste eine Überexpression von p21 wenigstens in Mauszellen ausgeschlossen werden. Der Nachweis ergab in uninfizierten und infizierten NIH-3T3 Zellen nahezu gleiche Proteinexpression (Abb. 23B), was wie erläutert zu erwarten war.

Nach diesen Ergebnissen ist also davon auszugehen, dass die bekannten zellulären Regulatoren nicht für die verminderte Zyklin D1-assoziierte Kinaseaktivität in infizierten Zellen verantwortlich sind und das M/RCMV möglicherweise direkt mit CDK4 interagiert.

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Abbildung 23: P19 und p21 Expression in infizierten Zellen. Es wurden in Abb. 20 beschriebene Zellextrakte verwendet Diese wurden mit einem p19-spezifischen (A) und p21-spezifischen (B) Antikörper in Immunoblotanalysen untersucht.

3.5.2 Einfluss von MCMV und RCMV auf die Zyklin E Expression

Bei der Analyse der Zyklin E-assoziierten Kinaseaktivität war auffällig, dass diese durch RCMV Infektion anstieg (Abb. 24, A, Bahn 2 und 4). Die genannte Kinaseaktivität lag deutlich über der zyklierender und quieszenter Zellen (Abb. 24, A, Bahn 1 und 3).

Um zu prüfen, ob die erhöhte Zyklin E-assoziierte Kinaseaktivität durch erhöhte Proteinexpression der regulatorischen Untereinheit erklärt werden kann, wurden Immunoblotanalysen durchgeführt.
Diese ergab, dass alle hier getesteten CMV zwar gleiche Mengen an Zyklin E, aber eine Zyklin E-Form mit einer herabgesetzten Mobilität in der Gelelektrophorese induzierten (Abb. 24 B, Bahn 2 und 4).

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Abbildung 24: Einfluss von M/RCMV auf die Expression von Zyklin E und die Zyklin E-assoziierte Kinaseaktivität. Quieszente Zellen wurden in An- bzw. Abwesenheit von Serum infiziert. Die Zellen wurden nach 16 Stunden geerntet und Proteinextrakte wurden erstellt. In diesen wurde mit Hilfe von in vitro- Kinaseassays die Zyklin-assoziierten Kinaseaktivitäten mit H1 als Substrat bestimmt (A). Des weiteren wurden die Extrakte auf Zyklinexpression in Immunoblotanalysen mit Zyklin-spezifischen Antikörpern (B) untersucht.

In der Annahme, das Zyklin E in infizierten Zellen posttranslational möglicherweise durch Phosphorylierung modifiziert wird, wurden, um dies zu untersuchen, die Extrakte uninfizierter und infizierter Zellen vor der Immunoblotanalyse mit Phosphatase behandelt. Die Phosphatase würde eine bestehende Phosphorylierung des Proteins aufheben und so zu einem schnelleren Laufverhalten von Zyklin E in der Gelelektrophorese führen. Dies war der Fall. In den infizierten Phosphatase-behandelten Extrakten (Abb. 25, Bahn 4) war im Gegensatz zu den infizierten unbehandelten (Abb. 25, Bahn 3) Extrakten ein schnelleres Laufverhalten von Zyklin E zu beobachten. In der Tat lagen die Zyklin E Banden der infizierten Zellen nach Phophatase-Behandlung auf der gleichen Höhe wie die
Zyklin E Banden uninfizierter Extrakte (Abb. 25, Bahn 1 und 2). Wodurch gezeigt werden konnte, dass Zyklin E in mit Nager-CMV infizierten Zellen phosphoryliert vorliegt.

Abbildung 25: Phosphorylierte Zyklin E Form in MCMV/RCMV infizierten Zellen. Die Zellen wurden wie bereits beschrieben synchronisiert und nach 16 h geerntet. Zur Erstellung der Extrakte wurde ein Extraktionspuffer ohne Phosphataseinhibitoren verwendet. Vor der Immunoblotanalyse wurden die Extrakte mit Phosphatase behandelt oder unbehandelt belassen und dann mit einem Zyklin E-spezifischen Antikörper analysiert. (*kürzere Exposition)

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Über die Phosphorylierung von Zyklin E ist nur bekannt, dass diese am Aminosäurerest Thr380 durch CDK2 erfolgen kann und eine Voraussetzung des proteasomalen Abbaus von Zyklin E ist (Won und Reed, 1996). Da jedoch die „steady state“ Proteinmenge von Zyklin E in infizierten Zellen nicht vermindert ist, sollte geprüft werden, ob CDK2 überhaupt für die Phosphorylierung verantwortlich ist. Um dies zu testen, wurden infizierte Zellen mit dem synthetischen CDK2-Hemmstoff Roscovitin
(15 μM) (Bresnahan et al., 1997;Meijer, 1996) behandelt. Durch die Behandlung mit Roscovitin wurde allerdings kein schnelleres Laufverhalten von Zyklin E in infizierten Zellen beobachtet (Abb. 26A, Bahn 2), so dass trotz der Hemmung von CDK2 eine Phosphorylierung von Zyklin E in den infizierten Zellen erfolgte. Als Kontrolle für das effiziente Wirken von Roscovitin wurden die geernteten Zellen im Durchflußzytometer gemessen. Die in Abb. 26B dargestellten Histogramme zeigen, dass die Roscovitin behandelten Zellen in G1 arretieren, was auf die fehlende CDK2 Aktivität zurückgeführt werden kann.

Abbildung 26: Zyklin E wird nicht durch CDK2 phosphoryliert. Infizierte Zellen wurden mit dem synthetischen CDK2-Hemmstoff Roscovitin (15 μM) behandelt, anschließend wurden Zellextrakte erstellt und in Immunoblotanalysen mit einem Zyklin E-spezifischen Antikörper behandelt, als Kontrolle wurden unbehandelte Zellen verwendet (A). Um das effiziente Wirken von Roscovitin nachzuweisen wurden die geernteten Zellen im Durchflußzytometer gemessen. Die dargestellten Histogramme zeigen, dass die Roscovitin behandelten Zellen in G1 arretieren (B).

Es scheint sich also bei der beobachteten Phosphorylierung von Zyklin E nicht um eine durch CDK2 verursachte Autophosphorylierung zu handeln. Da eine ähnliche Phosphorylierung von zellulärem Zyklin E nicht beschrieben wurde, wird sie am ehesten entweder direkt oder indirekt durch die Nager-CMV verursacht. Obwohl dieser Punkt nicht direkt adressiert wurde, könnte die Phosphorylierung darüber hinaus ein möglicher Mechanismus für die erhöhte Zyklin E Kinaseaktivität sein.

3.5.3 Einfluss von MCMV und RCMV auf Zyklin A, Zyklin B1 und CDK1

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Es ist bekannt, dass durch die Infektion mit HCMV die Zyklin B1-assoziierte Kinaseaktivität hochreguliert, die Zyklin A-assoziierte Kinaseaktivitität hingegen herunterreguliert wird. Die Analysen in M/RCMV infizierten Zellen hingegen ergaben, dass die Zyklin A- und B1- assoziierten Kinaseaktivitäten im M/RCMV induzierten Zellzyklusarrest auch unter serumlosen Bedingungen durch die Infektion induziert werden (Abb. 27A, Bahn 2 und 4).

Die dazugehörigen Zyklin-Proteinlevel können diese gesteigerte Aktivität allerdings nicht erklären: In Abwesenheit von Serum erfolgt in infizierten Zellen zwar eine Induktion von Zyklin A und B1
(Abb. 27B, Bahn 3 und 4), in den serumbehandelten Zellen sind die Proteinlevel jedoch nahezu gleich, im Fall von Zyklin A (Abb. 27B, Zyklin A, Bahn 1 und 2), bzw. sogar etwas verringert (Zyklin B1) (Abb. 27B, Zyklin B1, Bahn 1 und 2).

Abbildung 27: Einfluss von M/RCMV auf die Expression von Zyklin A und B1 und die Zyklin A- und
B1-assoziierte Kinaseaktivität. Quieszente Zellen wurden in An- bzw. Abwesenheit von Serum infiziert. Die Zellen wurden nach 16 Stunden geerntet und Proteinextrakte wurden erstellt. Es wurden mit Hilfe von
in vitro- Kinaseassays die Zyklin-assoziierten Kinaseaktivitäten mit Histon H1 als Substart bestimmt (A). Außerdem wurden die Extrakte auf Zyklinexpression (B) in Immunoblotanalysen mit Zyklin-spezifischen Antikörpern untersucht. (*nach längerer Expositionen wird auch die Bande in – Serum + Virus sichtbar)

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Sowohl Zyklin A als auch Zyklin B1 können mit der katalytischen Untereinheit CDK1 (CDC2) assoziieren. Da die in Abb. 27B dargestellten Proteinlevel die gesteigerte Zyklin A- und B1-assoziierte Kinaseaktivität in infizierten Zellen nicht erklären können, soll untersucht werden, ob die Nager-CMV die Aktivität von CDK1 direkt beeinflussen können. Der Zyklin/CDK1-Komplex wird erst in der
G2-Phase durch die Phosphatase CDC25 aktiviert und bis dahin wird CDK1 durch die Phosphorylierung von Tyr15 durch die Wee1 Kinase inaktiv gehalten (Lew und Kombluth, 1996).
In dem folgenden Experiment wurden infizierte Zellen auf das Vorhandensein der inhibitorischen Phosphorylierung von CDK1 untersucht, dazu wurde in den Immunoblotanalysen ein Tyr15-phosphospezifischer CDK1 Antikörper verwendet. Wie zu erwarten konnte die inhibitorische Phosphorylierung in serumrestimulierten uninfizierten Zellen, die noch nicht die G2-Phase erreicht hatten (durchflußzytometrische Analysen hier nicht gezeigt) nachgewiesen werden (Abb. 28, Bahn 2, 6 und 11). Die phosphorylierte Form von CDK1 konnte in den serumrestimulierten, infizierten Zellen jedoch nicht nachgewiesen werden (Abb. 28, Bahn 3, 7 und 12). Auch in Abwesenheit von Serum konnte eine phosphorylierte Form von CDK1 in infizierten Zellen im Gegensatz zu uninfizierten Zellen nicht nachgewiesen werden (Abb. 28, längere Exposition, Bahn 5 und 9). Da die Banden der infizierten Zellen gleiches Laufverhalten aufweisen, wie die Banden der phosphatasebehandelten Kontrollextrakte (Abb. 28, Bahn 1), ist davon auszugehen, dass CDK1 in infizierten Zellen in aktiver unphosphorylierter Form vorhanden ist. Dies könnte den Anstieg der Zyklin A- und B1-asssoziierten-Kinaseaktivität in infizierten Zellen erklären.

Abbildung 28: CDK1 liegt in M/RCMV infizierten Zellen in seiner aktiven, unphosphorylierten Form vor. Zellextrakte (erstellt wie in Abb. 27 beschrieben) wurden in Immunoblotanalysen mit einem phosphospezifischen CDK1-Antikörper analysiert. Als Kontrolle dienten Extrakte, die vor der Analyse mit Phosphatase behandelt worden waren. In der längeren Exposition (*) sind die Banden, der Extrakte quieszenter Zellen deutlicher zu erkennen.

3.6 RCMV, aber nicht MCMV verhindert replication licensing

Die bisherigen Analysen ergaben, dass M/RCMV die Zellproliferation hemmen, in dem sie die Zellen in G1 und G2 arretieren. HCMV arretiert Zellen ebenso in G1 und verhindert den Beginn der zellulären DNA-Synthese, indem es die Assemblierung des Prereplikationskomplexes (Pre-RC) auf Chromatin verhindert (Biswas et al., 2003;Wiebusch et al., 2003).

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Um zu überprüfen, ob dieser Mechanismus zwischen den CMV konserviert ist und eventuell eine Erklärung für den beobachteten G1-Arrest darstellen könnte, wurde die Integrität des Pre-RC in
M/RCMV infizierten Zellen untersucht. Dazu wurden exemplarisch zwei Faktoren des Pre-RC analysiert: i) CDC6, ein chromatinassoziierter Faktor, der als essentielles MCM-Ladeprotein fungiert (Donovan et al., 1997) (Liang et al., 1995;Piatti et al., 1996;Piatti et al., 1995) und ii) MCM2, als Bestandteil des MCM-Helikase-Komplexes, der für den Beginn der DNA-Synthese ebenfalls chromatinassoziiert benötigt wird und als limitierender Faktor des regulierenden licensing angesehen wird (Labib et al., 2000).

Zuerst wurden Ganzzellextrakte von infizierten und uninfizierten Zellen erstellt, die 16 h nach Serumrestimulation geerntet wurden. Zu diesem Zeitpunkt befanden sich infizierte Zellen arretiert in der G1, uninfizierten Zellen in der S-Phase. Folgend wurden die Zellextrakte auf MCM2 und CDC6 Expression untersucht. In serumbehandelten uninfizierten und infizierten Zellen konnten gleiche MCM2 Proteinlevel im Gesamtzellextrakt nachgewiesen werden (Abb. 29A, Bahn 1,2, 5, 6, 9 und 10). In quieszenten Zellen wurde MCM2 durch die Infektion induziert (Abb. 29A, Bahn 4, 8 und 12). Gleiche Ergebnisse erbrachte die Analyse mit einem CDC6 spezifischen Antikörper (Daten hier nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass zwei essentielle Faktoren, die für die Assemblierung des
Pre-RC benötigt werden, in infizierten Zellen exprimiert werden. Doch da die Voraussetzung für die DNA-Replikation nur durch das Binden dieser Faktoren an Chromatin geschaffen wird, wurden in einem nächsten Schritt Chromatinextrakte von den gleichen Zellpopulationen erstellt, und die Chromatinassoziation von MCM2 und CDC6 in infizierten Zellen untersucht. Wie zu erwarten erfolgt in uninfizierten serumstimulierten Zellen, die sich am Beginn der S-Phase befinden, eine Bindung des Ladefaktors CDC6 und des MCM2-Proteins an Chromatin (Abb. 29B, Bahn 1, 5 und 9).
In den Chromatinextrakten MCMV infizierter Zellen können MCM2 und CDC6 serumunabhängig nachgewiesen werden (Abb. 29B, Bahn 10 und 12), jedoch fällt auf, dass es sich in den infizierten, serumbehandelten Zellen (Abb. 29B, Bahn 10) um die unphosphorylierte MCM2-Form zu handeln scheint, die ungewöhnlicherweise ein langsameres Laufverhalten aufweist (Fujita et al., 1998;Masai et al., 2000;Todorvo et al., 1995). Bei der unphosphorylierten MCM2-Form handelt es sich um die inaktivierte Form. Was auf eine mögliche MCM2 Inaktivierung durch MCMV hinweist (Wiebusch et al., 2003). Diese Daten implizieren somit, dass die Pre-RC Assemblierung durch MCMV nicht zerstört wird, sondern möglicherweise eine Inaktivierung von MCM2 nach Assemblierung erfolgt. Im Gegensatz zu MCMV infizierten Zellen, ist nach RCMV Infektion hingegen der Prozess des replication licensing inhibiert. Wie zuvor bereits für HCMV beschrieben (Wiebusch et al., 2003), zeigte sich auch für RCMV infizierte Zellen, dass der MCM Ladefaktor CDC6 Chromatin assoziiert ist, aber es kommt letztlich nicht zur Ladung von MCM2 (Abb. 29B, Bahn 2, 4, 6 und 8).

Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass in RCMV, nicht aber in MCMV, infizierten Zellen die Formierung des Pre-RC Komplexes verhindert wird und somit die zelluläre
DNA Replikation auf der Ebene des replication licensing inhibiert wird.

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Abbildung 29: RCMV nicht aber MCMV verhindert replication licensing. Quieszente Fibroblasten wurden serumrestimuliert und/oder infiziert. Sowohl Ganzzellextrakte als auch Chromatinextrakte wurden erstellt und es wurde die MCM2 Expression (A) sowie die MCM2 und CDC6 Chromatinbindung (B) überprüft.


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13.11.2006