4. Diskussion

▼ 55 (fortgesetzt)

DieseArbeit beinhaltet die erste umfassende Untersuchung des Einflusses von Nager-Zytomegalieviren (MCMV und RCMV) auf den Zellzyklus der Wirtszelle. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass MCMV und RCMV sowohl untereinander als auch gegenüber HCMV diverse Unterschiede bezüglich des Zellzyklusarrestes als auch der Beeinflussung bestimmter Zellzyklusregulatoren aufweisen. Insgesamt überwiegen jedoch die Ähnlichkeiten: Alle Zytomegalieviren sind in der Lage die Zellproliferation durch einen Zellzyklusblock am G1/S-Übergang zu inhibieren.

4.1  Inhibition der Zellproliferation und Position des Arrestes im Zellzyklus

Sowohl MCMV als auch RCMV inhibieren die Zellproliferation. Dies steht in Übereinstimmung mit dem antiproliferativen Effekt von HCMV auf humane Fibroblasten (Lu und Shenk, 1996). Desgleichen ist bekannt, dass auch andere Vertreter der Herpesviren wie das Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) (Roizman und Jr., 1964) und das dem HCMV biologisch nähere Humane Herpesvirus 6 (HHV-6) die Proliferation infizierter Wirtszellen hemmen (Horvat et al., 1993).

▼ 56 

Die Untersuchung der Nager-CMV ergab, dass dem durch MCMV und RCMV verursachten Proliferationsstop ein Zellzyklusarrest in G1 und G2 zugrunde liegt. Im Kontrast dazu kann HCMV nur einen G1-Arrest hervorrufen (Bresnahan et al., 1996;Dittmer und Mocarski, 1997). Bemerkenswerterweise können MCMV und RCMV im Unterschied zu HCMV (Fortunato et al., 2002;Salvant et al., 1998) auch in beiden Zellzykluskompartimenten produktiv replizieren.

Neben MCMV und RCMV beeinflusst auch das Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) die G2/M–Progression. Dies ist von Interesse, um basierend auf den Untersuchungsergebnissen der vorliegenden Arbeit Aufschluss über das Vorhandensein konservierter Mechanismen der Zellzyklusregulation innerhalb der Familie der Herpesviridae zu erhalten.

HSV-1 induziert einen Arrest in der Prometaphase (Lomonte und Everett, 1999). Dieser Prometaphase-Arrest wird durch das virale IE Protein Vmw110 verursacht. Es bewirkt den Abbau des Kinetochorproteins CENP-C, welches bei der Separation der Schwesterchromatide benötigt wird (Oegema et al., 2001). Für Nager-CMV jedoch ist weder ein Homolog zu Vmw110 bekannt, noch findet in M/RCMV-infizierten Zellen ein Eintritt in die Prophase statt (siehe Abschnitt 3.3). Somit ist es unwahrscheinlich, dass es sich bei dem in der vorliegenden Arbeit beschriebenen G2-Arrest um einen gegenüber HSV-1 konservierten Mechanismus handelt.

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Grundsätzlich ist anzumerken, dass der Zellzyklusarrest, der durch Mitglieder der Familie der Herpesviridae verursacht wirdfür die virale Replikation relevant zu sein scheint (Mocarski, 2001;Roizman und Knipe, 2001). Herpesviren verfügen über einen eigenen Replikationsapparat und sind somit nicht auf zelluläre DNA-Replikation angewiesen. Diese wird, möglicherweise um die virale Replikation zu optimieren, umgangen. Es wird angenommen, dass Herpesviren die Wirtszelle in einer bestimmten Position im Zellzyklus arretieren, in der die virale Replikation am effizientesten erfolgt (Flemington, 2001). Durch diese Arbeit wird deutlich, dass Nager-Zytomegalieviren durch einen G1- und G2-Arrest die S-Phase umgehen und zusätzlich entscheidende Zellzyklusregulatoren der Wirtszelle beeinflussen.

4.2 Mechanismus des neuartigen durch M/RCMV verursachten G2-Arrestes

Bevor mechanistische Überlegungen angestellt werden, wie es auf der zellulären Seite zur G2-Arretierung durch Nager-CMV kommen kann, erfolgt eine kurze Erläuterung der relevanten Mechanismen, die an dem G2/M- Übergang beteiligt sind: Dem Beginn der Mitose geht eine komplexe Phosphorylierungskaskade voraus, die in der Aktivierung von Zyklin B/CDK1 (in Hefe CDC2) (s. Abb. 31) endet. Inhibitorische Kinasen der Familie WEE-1/MYT-1 halten CDK1 durch Phosphorylierung an Thr-14 und Tyr-15 so lange inaktiv, bis CDK1 in der späten G2-Phase durch CDC25 dephosphoryliert wird, was zur Aktivierung und zum Beginn der Mitose führt. Die CDC25 Familie umfasst CDC25A, CDC25B, CDC25C, die jeweils unterschiedliche Aufgaben erfüllen. CDC25A unterstützt durch die Interaktion mit Zyklin A/CDK2 und Zyklin E/CDK2 primär den Eintritt in die S-Phase. Darüber hinaus wird davon ausgegangen, dass CDC25A ebenso Zyklin B/CDK1 aktiviert und somit eine Rolle am G2/M-Übergang spielen kann (Mailand et al., 2002). CDC25B reguliert einen Vorgang der Mitose, der als zentrosomale Mikrotubuli Nukleierung (centrosomal microtubule nucleation) bezeichnet wird. CDC25C führt u. a. zur Dephosphorylierung und somit zur Aktivierung von Zyklin B/CDK1 (Smits und Medema, 2001) und spielt eine wichtige Rolle im DNA-Damage-Checkpunkt (Kontrollpunkt). So wird beispielsweise durch DNA-Schädigung (etwa durch ionisierender Strahlung) die Aktivierung der Proteinkinasen CHK1 (Aktivierung präferentiell durch DNA-Einzelstrangbruch) und CHK2 (Aktivierung präferentiell durch DNA-Doppelstrangbruch) über ATM ausgelöst. Dies führt zu einem G2-Arrest und verhindert den weiteren Zellzyklusfortgang. Dabei ist die Aktivierung von CHK1 essentiell, um den Eintritt in die Mitose zu verhindern. CHK1 inhibiert durch Phosphorylierung CDC25C, und unterbindet somit die für den Mitoseeintritt erforderliche Dephosphorylierung der Thr-14 und Tyr-15 Aminosäurereste von CDK1 (Costanzo et al., 2000). Die damit induzierte Inaktivierung von CDK1 stellt den Endpunkt des DNA-Damage- Checkpunktmechanismus dar. Da die Aktivierung des DNA-Damage-Checkpunktes zu einem G2-Arrest führt, liegt die Überlegung nahe, dass M/RCMV in die Regulation dieses Checkpunktes eingreift. Möglicherweise verursacht eine CMV-vermittelte Aktivierung von Checkpunktakteuren den G2-Arrest in infizierten Zellen. Da in Nager-CMV infizierten Zellen jedoch die für den Mitoseeintritt erforderliche Dephosphorylierung von CDK1 nicht unterbunden wird, CDK1 also trotz Arrest in aktiver Form vorliegt, müssten weitere Effektoren des Checkpunktes beeinflusst werden. ATM und die CHK-Kinasen interagieren u. a. mit p53, BRCA 1, CtIP, SMC1 und Mitglieder der CDC25 Familie (Nyberg et al., 2002). Diese oder weitere Substrate könnten somit bei dem durch M/RCMV verursachten G2-Arrest eine Rolle spielen. Übereinstimmend weisen erste Versuche mit HCMV bereits daraufhin, dass der DNA-Damage-Checkpunkt durch das Virus aktiviert wird und möglicherweise eine Funktion für den G1-Arrest hat (R. Krauß, persönliche Mitteilung).

Obwohl der Eintritt in die Mitose durch CMV verhindert wird, ist CDK1 gleichzeitig in aktiver Form nachzuweisen und zeigt eine erhöhte Kinaseaktivität. Offenbar entkoppelt das Virus den Prozess des Zellzyklusfortgangs (G2-Arrest) von der Aktivierung der CDK Aktivitäten (erhöhte CDK1 Aktivität). Die erhöhte CDK1 Aktivität in infizierten Zellen würde in diesem Falle eine nicht hinreichende Rolle für den Mitoseeintritt infizierter Zellen spielen. Dieser Aspekt wird in einem späteren Abschnitt (4.5) diskutiert.

▼ 58 

Auffällig ist, dass die Infektion der Wirtszelle mit Nager-CMV in der späten S- oder frühen G2-Phase nicht zu einem G2-Arrest führt, sondern die infizierten Zellen den Zellzyklus kompletieren und erst in der folgenden G1-Phase arretieren. Offensichtlich scheint es einen Restriktionspunkt in der späten
S-Phase zu geben, nach dessen Überschreiten ein G2-Arrest in der selben Interphase nicht mehr möglich ist. Möglicherweise fehlt zu diesem Zeitpunkt ein für den G2-Arrest benötigtes virales Genprodukt oder erforderliche zelluläre Faktoren. Die Annahme eines Restriktionspunktes ist konsistent mit den Beobachtungen im HCMV-System. Für die Infektion mit HCMV wird ein solcher Punkt in der späten G1-Phase vermutet. Ursächlich wird angenommen, dass die Genexpression viraler IE Gene, welche Voraussetzung für die effektive virale Replikation ist, nur in der G1-Phase erfolgt (Fortunato et al., 2002;Salvant et al., 1998). Ist bei Infektion ein solcher Restriktionspunkt bereits überschritten, erfolgt die IE-Expression verspätet und so beginnt auch der virale Lebenszyklus und damit der Einfluss auf den Zellzyklus verspätet. Bei Nager-CMV infizierten Zellen scheint der Punkt jedoch später im Zellzyklusverlauf (späte S-Phase) platziert zu sein. Die IE-Expression vor und nach dem vermuteten Restriktionspunkt wurde im Nager-System noch nicht untersucht, wäre aber der nächste Schritt um eine Kausalität herzuleiten. Welche Bedeutung der G2-Arrest für die virale Replikation besitzt muss in weiteren Studien angegangen werden.

4.3 Virale Repression von Zyklin D1

In HCMV und M/RCMV infizierten Zellen wird Zyklin D1-CDK 4/6 reprimiert. Jedoch haben die Viren unterschiedlicher Spezies abweichende Mechanismen entwickelt, um dies zu erreichen. So erfolgt in M/RCMV infizierten Zellen die Repression von Zyklin D1 nicht auf Ebene der mRNA-Expression, wie bei HCMV (Zhu et al., 1998), stattdessen wird auf posttranslationaler Ebene die Assoziation des Zyklin D1-CDK4-Komplexes zerstört. Folglich ist keine Zyklin D1-assoziierte Kinaseaktivität nachzuweisen. Die Untersuchungsergebnisse haben gezeigt, dass keine der bekannten zellulären Regulatoren für diese Dissoziation verantwortlich sind (siehe 3.5.1). Daher ist zu vermuten, dass ein unbekannter zellulärer oder viraler Faktor, in seiner Funktion ähnlich eines Vertreters der INK4-Familie, direkt mit CDK4 interagiert (Abb. 30).

Die Bedeutung der Zyklin D1-CDK4 Repression in infizierten Zellen ist bisher nicht bekannt. Da die Zyklin E-assoziierte Kinase direkt durch die Zytomegalieviren hochreguliert wird und Zyklin D upstream von Zyklin E liegt, scheint es für CMV wenig sinnvoll zu sein Zyklin D1-CDK4 im Sinne der Regulation der Zellzyklusprogression herunterzuregulieren. Andererseits haben die Zytomegalieviren verschiedener Spezies unterschiedliche Mechanismen entwickelt um die Zyklin D-assoziierte Kinaseaktivität zu reduzieren, was die Schlussfolgerung nahe legt, dass die Reduktion der Kinaseaktivität von Bedeutung ist. Wenn jedoch die Herunterregulation für die Regulation der Zellzyklusprogression von nur untergeordneter Rolle ist, gibt es möglicherweise Zellzyklus unabhängige Funktionen von Zyklin D1-CDK4, die CMV inhibiert. Es ist bereits bekannt, dass die Zyklin D-assoziierte Kinaseaktivität einen regulierenden Einfluss auf Transkriptionsvorgängen hat und somit eine Zellzyklus unabhängige Funktionen in der Regulation der Genexpression übernimmt (Lazaro et al., 2002). Obwohl hier keine viralen Gene angeboten werden können, die von einer Regulation der Genexpression durch Zyklin D1-CDK4 betroffen sein könnten, scheint die Beeinflussung der Funktion der Zyklin D-assoziierten Kinaseaktivität außerhalb des Zellzyklus eine realistische Hypothese zu sein, die weitere Untersuchungen in diese Richtung rechtfertigt.

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Abbildung 30: Unterschiedliche Mechanismen der Zyklin D1-CDK 4/6 Repression durch CMV. HCMV verhindert die mRNA-Expression von Zyklin D1. M/RCMV unterbinden die Assoziation des Zyklin D1-CDK4-Komplexes.

4.4 Neuartige Zyklin E- Phosphorylierung in Nager-CMV infizierten Zellen

Sowohl die Infektion mit RCMV „England“ als auch mit RCMV „Maastricht“ führt zu einer Steigerung der Zyklin E-assoziierten Kinaseaktivität (bei Infektion mit MCMV war Zyklin E hingegen nur in serumlosen Zellen erhöht). Diese erhöhte Kinaseaktivität geht sowohl in infizierten als auch uninfizierten Zellen mit gleichen Mengen an Zyklin E einher. Allerdings konnte in infizierten Zellen eine phosphorylierte Form von Zyklin E nachgewiesen werden. Nach Inhibition von CDK2 mit Roscovitin, bestand die Phosphorylierung weiterhin. Es ist also davon auszugehen, dass es sich hier nicht um eine Autophosphorylierung durch die CDK2 Untereinheit handelt. Überdies ist diese Autophosphorylierung von Zyklin E (Aminosäurerest: Thr380) bekanntermaßen mit dem Abbau des Zyklins assoziiert (Clurman et al., 1996;Won und Reed, 1996). Da es keinen Hinweis gibt, dass das Zyklin E Protein in infizierten Zellen eine verkürzte Halbwertszeit hat, scheint die beobachtete Form von Zyklin E nicht für den Abbau vorgesehen zu sein. Darüber hinaus ist bisher keine weitere Phosphorylierung von Zyklin E beschrieben worden und entsprechend auch keine zelluläre Kinase bekannt, die Zyklin E phosphorylieren könnte. Vor diesem Hintergrund liegt es nahe, dass die Phosphorylierung von Zyklin E durch eine virale Kinase verursacht werden könnte.

Schließt man die erwähnte, zum Abbau führende Phosphorylierung aus, scheint eine aktivierende Phosphorylierung von Zyklin E wahrscheinlich. Diese Hypothese wird insbesondere dadurch gestützt, dass die Aktivierung von Zyklin E ein Kardinalbefund in CMV infizierten Zellen darstellt und bei HCMV unterschiedliche Mechanismen beschrieben sind, die zur Aktivierung der Zyklin E-assoziierten Kinase beitragen. So erfolgt durch IE2 die Aktivierung der Zyklin E Transkription (Bresnahan et al., 1998) und das IE1 Protein bindet das Pocketprotein p107 mit einer höheren Affinität als Zyklin E/CDK2, so dass es zur Freisetzung des Komplexes und Verfügbarkeit von zusätzlichem Zyklin E/CDK2 kommt (Zhang et al., 2003). Konsistent mit der großen Anzahl weiterer unterschiedlicher Mechanismen der Aktivierung der Zyklin E-assoziierten Kinase (Bresnahan et al., 1998;Bresnahan et al., 1997;Chen et al., 2001;McElroy et al., 2000;Sinclair et al., 2000;Wiebusch et al., 2003;Zhang et al., 2003), konnte gezeigt werden, dass für die Replikation von HCMV die CDK2 Aktivität essentiell ist (Bresnahan et al., 1997). Wenn man davon ausgeht, dass gleiches für M/RCMV gilt, wäre mit der Phosphorylierung von Zyklin E ein weiterer Mechanismus gefunden, der dem Virus die Aktivierung der Zyklin E-assoziierten Kinase sichern würde. Obwohl noch nicht formell gezeigt, erscheint dies auch deshalb wahrscheinlich, weil im Gegensatz zu HCMV, die Höhe der Zyklin E Proteinlevel in R/MCMV infizierten Zellen nicht die gesteigerte Aktivität der Zyklin E-assoziierten Kinase erklären kann. Die Frage, welche Konsequenz die durch unterschiedliche Mechanismen erreichte Aktivierung von Zyklin E für die virale Replikation hat bleibt vorerst offen.

4.5 Zyklin A, Zyklin B und CDK1

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In M/RCMV infizierten Zellen wurden, auch unter serumlosen Bedingungen, erhöhte Zyklin A- und B1-assoziierte Kinaseaktivitäten nachgewiesen. Es wurden jedoch keine erhöhten Zyklin A/B1-Proteinlevel gefunden, die eine gesteigerte Zyklin A- und B1-assoziierte Kinaseaktivitäten hätten begründen können.

Allerdings konnte nachgewiesen werden, dass CDK1, welches sowohl mit der regulatorischen Untereinheit Zyklin A als auch mit Zyklin B1 assoziiert, in infizierten Zellen in seiner aktiven unphosphorylierten Form vorliegt. Dies könnte den Anstieg der Zyklin A- und B1-assoziierten-Kinaseaktivität in infizierten Zellen erklären. Für HCMV infizierte Zellen zeigten Jault et al. (Jault et al., 1995), dass CDK1 ebenso dephosphoryliert vorliegt. Ursächlich dafür ist eine verminderte Expression der inhibitorischen Kinasen MYT-1 und WEE-1 (Sanchez et al., 2003).

Trotzdem ist es erstaunlich, dass die geringe Menge an regulatorischer Untereinheit (Zyklin A und B1) zu einer drastischen Aktivität von CDK1 führt. Es scheint also wahrscheinlich, dass es weitere bisher unentdeckt gebliebene Mechanismen gibt, die zur Hochregulation der Zyklin A- und B1-assoziierten-Kinaseaktivität in infizierten Zellen führen. Vor dem Hintergrund der physiologischen Regulation der CDK1 Aktivität bieten sich folgende Angriffspunkte, um die Aktivität von CDK1 zu beeinflussen (Abb.31):

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Um die inaktivierende Phosphorylierung aufzuheben, könnte das Virus direkt oder indirekt die
CDK-aktivierende Kinase (CAK), die durch Phosphorylierung (am Aminosäurerest Thr-160) für eine basale Aktivität von CDK1 sorgt (Morris et al., 2002), beeinflussen. Ebenso denkbar wäre, dass die inhibitorischen Kinasen WEE-1 und MYT-1 direkt oder indirekt gehemmt oder die Aktivatoren (CDC25 Familie) von CDK1 unterstützt werden. Möglicherweise interagiert das Virus auch direkt aktivierend mit CDK1. Außerdem könnte CMV zwar nicht die Verfügbarkeit von Zyklin B1 modifizieren, wohl aber seine zelluläre Lokalisation beeinflussen. Dadurch würde es im weitesten Sinne zu einer Aktivierung von CDK1 kommen.

Der Vollständigkeit halber sei erwähnt, dass Mechanismen bekannt sind, die eine unzureichende Zyklinexpression ersetzen könnten: Einige Herpesviren kodieren eigene regulatorische Untereinheiten, funktionelle Zyklinhomologe, welche CDK Aktivität induzieren (Swanton et al., 1997). Darüber hinaus wurde für HSV-1 ein virales Protein nachgewiesen, welches direkt mit CDK1 assoziiert und CDK1 aktiviert (Advani et al., 2001;Roizman und Pellett, 2001). Für die Kinase CDK2 ist solch ein Faktor ebenso bekannt. Das virale Protein E7 des Humanen Papillomavirus (HPV, kleines DNA Virus) kann sehr kleine Mengen CDK2 durch direkte Bindung aktivieren (He et al., 2003), folglich ist auch dieses Virus nicht auf zelluläres Zyklin angewiesen. Da in den hier verwendeten Zugängen jedoch die Aktivität der Kinase über die Präzipitation der zellulären regulatorischen Untereinheit (Zykline) geschah, kann diese Begründung für CMV infizierte Zellen nicht zutreffen.

Nachdem einige Mechanismen aufgezeigt wurden die das Vorliegen der aktiven unphosphorylierten Form von CDK1 und erhöhte Zyklin A- und B1-assoziierte Kinaseaktivitäten erklären könnten, werden nun mögliche Funktionen der erhöhten CDK1 Aktivität in infizierten Zellen erläutert: Advani et al. untersuchten die Bedeutung einer, durch Infektion hervorgerufenen, erhöhten CDK1 Aktivität und konnten für HSV1 zeigen, dass die viralen Faktoren ICP22 und UL13 CDK1 aktivieren, um eine optimale Expression der „späten“ Gene (gezeigt am Beispiel US 11) zu ermöglichen. Es wird angenommen, dass CDK1 mit viralen Regulatorproteinen interagiert. So besitzen einige HSV1 Glykoproteine mögliche Phosphorylierungsstellen für CDK1 (Advani et al., 2000). Des weiteren phosphoryliert das Varizella Zoster Virus das Membranprotein gI durch CDK1 (Ye et al., 1999). Außerdem kann CDK1 die Funktion und intrazelluläre Lokalisation von Transkriptionsfaktoren beeinflussen (Caelles et al., 1995;Connolly et al., 1997;El-Hodiri et al., 1997).

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Darüber hinaus ist bekannt, dass der aktivierte Zyklin B/CDK1-Komplex zu Veränderungen im Mikrotubulisystem, der Aktinfilamente und der Zelllamina führt und somit beim Mitoseeintritt die zelluläre Struktur beeinflusst. Zyklin B/CDK1 phosphoryliert u. a. Komponenten der Kernmembran und verursacht dadurch deren Zerfall (Smits und Medema, 2001). Derartige Veränderungen könnten auch für die effiziente Virusreplikation und Virusfreisetzung von Bedeutung sein, denn im Kern entstandene virale Nukleokapside müssen die Kernmembran überwinden, um nach weiterem Zusammenbau (Assembly) als Virionen freigesetzt zu werden. Eine erhöhte Aktivität von
Zyklin B/CDK1 könnte folglich für das Virus von Nutzen sein, weil das Freikommen der Nukleokapside aus dem Kern effizienter und schneller erfolgen würde und somit einen positiven Einfluss auf die Virusfreisetzung hätte. Diese Hypothese wird durch Ergebnisse von Muranyi et al. gestützt. Die Autoren konnten zeigen, dass das virale Protein M50/p35 (MCMV Protein) die Integrität der Kernmembran beeinflusst, was die Kernmembran für virale Proteine durchlässiger macht (Muranyi et al., 2002). Hier könnte eine erhöhte CDK1 Aktivität additiv oder synergistisch wirken.

Über die Notwendigkeit der erhöhten CDK1 Aktivität für die virale Replikation ist wenig bekannt. Anders als CDK2 konnte CDK1 bisher nicht selektiv in infizierten Zellen inhibiert werden.
Es kann daher keine Aussage gemacht werden, welche Bedeutung CDK1 für die Virusreplikation besitzt. Auffällig ist jedoch, dass CDK1 - wie erläutert - auch von anderen Viren hochreguliert wird. CDK1 scheint ein attraktives Beispiel dafür zu sein, dass Viren essentielle zelluläre Faktoren für die Regulation der Virusreplikation umfunktionieren. Aber erst durch Unterdrückung der Aktivität von CDK1 in infizierten Zellen mittels synthetischer Inhibitoren oder durch die Expression dominant negativer Mutanten oder si-RNAs (small interfering RNA) könnte man weiterführend die Funktion der induzierten CDK1 Aktivität in infizierten Zellen untersuchen. Damit wäre die Voraussetzung geschaffen, die Bedeutung von CDK1 für die virale Genexpression oder Virusreplikation abzuleiten.

Abbildung 31: Modellvorstellung der Regulation von CDC2 durch CMV (modifiziert nach (Advani et al., 2001).

4.6 G1-Arrest als gemeinsames Merkmal aller CMV

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Sowohl die Infektion mit HCMV als auch die Infektion mit den in dieser Arbeit untersuchten Nager-CMV führt zu einem G1-Arrest. Folgend werden die für HCMV diskutierten Mechanismen den im Nager-CMV-System gefundenen gegenübergestellt.

Bisher wurde für HCMV diskutiert, dass eine HCMV verursachte Herunterregulation von Zyklin A für den G1-Arrest verantwortlich ist. In der vorliegenden Arbeit dagegen ist eine Zyklin A Repression nicht als Grund anzusehen, da die Proteinlevel gleichbleibend (in serumlosen Zellen etwas höher) sind und die Zyklin A-assoziierte Kinase nicht reduziert ist. Eine weitere Möglichkeit ist, dass der durch HCMV verursachte Zellzyklusblock am G1/S-Übergang durch die selektive Hemmung der zellulären DNA-Synthese hervorgerufen wird. Ursache dafür ist, dass die Ladung der MCM-Helikase auf Replikationsursprünge (origin of replication, ORC) verhindert wird, obwohl alle Pre-RC-Faktoren in infizierten Zellen vorhanden sind (Biswas et al., 2003;Wiebusch et al., 2003). Zusätzlich liegt MCM2 in HCMV infizierten Zellen in seiner unphosphorylierten, inaktivierten Form vor (Wiebusch et al., 2003) und kann somit ebenso zu einem Arrest am G1/S-Übergang führen.

Durch die Untersuchung der Nager-CMV konnte gezeigt werden, dass RCMV ebenso wie HCMV das Laden der MCMs auf Replikationsursprünge verhindert. Überraschenderweise wird durch die Infektion mit MCMV die Ladung der MCMs auf Replikationsursprünge nicht verhindert. Auffällig ist jedoch das Ausbleiben der MCM2-Phosphorylierung in MCMV-infizierten Zellen. Da die Phosphorylierung von MCM2 eine notwendige Voraussetzung für die Aktivierung des Pre-RC darstellt (Masai et al., 2000), muss die Phosphorylierung von MCM2 in infizierten Zellen als hinreichender Grund für die Inhibition der zellulären DNA-Synthese in infizierten Zellen interpretiert werden (Abb. 29).

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Zur Aktivierung von MCM2 und der darauf folgenden zellulären Replikation ist der S-Phase Regulator CDC7-DBF4 erforderlich, bei dem es sich um eine direkt am Origin lokalisierte Kinase handelt. Die Phosphorylierung von MCM2 trägt zur Aktivierung des Pre-RC bei. Erst dann kann es zur Entwindung der DNA sowie zur Ladung weiterer Replikationsfaktoren wie CDC45 und der DNA-Polymerase kommen (Masai und Arai, 2002). Die Ergebnisse dieser Arbeit sind konsistent mit der Hypothese, dass CMV in den Prozess der MCM-Aktivierung eingreift. CDC7 und DBF4 sind Zielsubstrate bei Checkpunktaktivierung und werden, u. a. abhängig von der Proteinkinase Rad53 reguliert, die nach einem DNA-Schaden zu einem Zellzyklusarrest führt (Weinreich und Stillman, 1999). Möglicherweise spielt auch hier eine Checkpunktaktivierung durch das Virus eine Rolle. Um den Mechanismus der MCM-Aktivierung in CMV infizierten Zellen zu untersuchen müsste zunächst die Expression, Chromatinassoziation und Aktivität des CDC7-DBF4 Komplexes und von CDC45 untersucht werden. Denkbar wäre z. B., dass eine virale oder zelluläre viral induzierte Phosphatase in den Prozess der Pre-RC Assemblierung eingreift.

Da in MCMV infizierten Zellen keine Inhibition des replication licensing vorliegt, aber MCM2 nicht phosphoryliert und damit nicht aktiviert wird, bietet sich das Maus-System für weitere Untersuchungen des dazu führenden Mechanismus an. In RCMV infizierten Zellen konnte die Phosphorylierung der MCM-Proteine aus dem Laufverhalten nicht abgelesen werden. In Abbildung 32 ist eine Modellvorstellung der Inhibition der DNA-Synthese durch CMV zusammenfassend dargestellt.

Abbildung 32: Modellvorstellung der Inhibition der DNA-Synthese durch CMV. Dargestellt ist die Inhibierung der Pre-RC Assemblierung durch RCMV, die fehlende Aktivierung durch MCMV und die Tatsache, dass beide Schritte in HCMV negativ reguliert sind. (* Die Phosphorylierung der MCM-Proteine durch RCMV konnte aus ihren Laufverhalten nicht abgelesen werden.)

4.7 Tiermodell für HCMV- Zellzyklusregulation, ein Ausblick

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Die Aufgabe dieser Arbeit war es, den Einfluss der Nager-CMV auf den Zellzyklus zu untersuchen, um u. a. Grundlagen für ein anwendbares Tiermodell zu schaffen, welches die Untersuchung der Zellzyklusregulation durch CMV im lebenden Organismus ermöglicht.

Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass einige Mechanismen der Zellzyklusregulation zwischen dem menschlichen CMV und den Nager-CMV konserviert sind, andere, wie der G2-Arrest, nicht. Die scheinbare Konservierung einiger grundlegender Mechanismen unterstreicht die Relevanz der Zellzyklusbeeinflussung für die Replikation von Zytomegalieviren. Teilaspekte könnten somit der Untersuchung der physiologischen Signifikanz der Zellzyklusbeeinflussung im Tiermodell dienen.

Obwohl Beisser et al. davon ausgehen, dass es sich bei den beiden RCMV Stämmen „England“ und „Maastricht“ möglicherweise um zwei unterschiedliche Betaherpesviren handelt (Beisser et al., 1998) (siehe 1.5.1), konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit keine Unterschiede zwischen den beiden Stämmen, im Hinblick auf die Zellzyklusregulation, festgestellt werden. Die beiden RCMV Stämme weisen bezüglich der Zellzyklusaktivität gegenüber dem HCMV keine stärkere Ähnlichkeit auf als MCMV (siehe Tabelle 3).

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Tabelle 3: Gegenüberstellung von MCMV, RCMV und HCMV

Ein informatives Tiermodell erfordert im Folgenden erläuterte Voraussetzungen: Zuerst müsste die Identifizierung viraler Faktoren erfolgen, die bei der Zellzyklusregulation durch M/RCMV eine Rolle spielen. Den gefundenen Zellzyklusaktivitäten müssten virale Faktoren durch selektive Expression im Zellkultursystem zugeordnet werden. Naheliegend wäre die IEProteine IE1- IE3, sowie UL69 und UL82 zu untersuchen, für die bereits Zellzyklus regulatorische Aktivitäten nachgewiesen wurden (siehe 1.4.2.). Von besonderem Interesse wäre verantwortliche Faktoren für die Zyklin E Phosphorylierung sowie die Unterbindung der Assoziation von Zyklin D1-CDK4/6 auszumachen. In einem nächsten Schritt würde eine Mutationsanalyse der viralen Faktoren in einem Zellkultursystem folgen. Nach Vorliegen der Resultate könnten virale Mutanten erstellt werden, um schließlich mit der Analyse in vivo, also im lebenden Organismus zu beginnen. Damit wäre die Grundlage geschaffen, die Zellzyklusfunktion im Tiermodell zu untersuchen. Die vorliegende Arbeit hat Voraussetzungen und Möglichkeiten geschaffen sowie Grenzen sinnvoller Ansätze im Tiermodell aufgezeigt. MCMV und RCMV kommen demnach durchaus als System für die Untersuchung der Zellzyklusregulation im Tiermodell in Frage. Allerdings sollten präferentiell die zwischen H- und Nager-CMV konservierten Mechanismen im Tiermodell angegangen werden, um für die medizinisch relevante HCMV Infektion aussagekräftige Ergebnisse abzuleiten.


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13.11.2006