Materialien und Methoden

3.1 Materialien

3.1.1 Chemikalien und Zusätze

Ammoniumchlorid

Merck

2 β-Mercaptoethanol

Sigma-Aldrich

Antibiotikalösung; enthält 10 000 U/ml

Penizillin und 10 000 µg/ml Streptomycin

Seromed, Berlin

Bovines Serum Albumin (BSA)

ICN

Brefeldin A

Sigma-Aldrich

Ethylenediaminetetraazetische Säure (EDTA)

Merck

Fetales Kälberserum (FCS)

Sigma-Aldrich

Histopaque 1083

Sigma-Aldrich

Ionomycin

Sigma-Aldrich

L-Glutamin

Seromed

Phorbol 12-myristate13-acetat (PMA)

Sigma-Aldrich

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)

Sigma-Aldrich

RPMI 1640 mit L-Glutamin

Life Tech. Berlin

Saponin

Sigma-Aldrich

Natriumazetat

Sigma-Aldrich

Tris-HCl

Sigma-Aldrich

Trypan Blau Lösung

Sigma-Aldrich

Komplettes Freunds Adjuvant (CFA)

Sigma-Aldrich

Pertussistoxin (PT)

Sigma-Aldrich

Ethanol (70 %)

Sigma-Aldrich

Propidium Iodid

Sigma-Aldrich

Paraformaldehyd

Sigma-Aldrich

3H-Thymidin

Amersham

Szintillationsflüssigkeit

Packard

Lipopolysaccharid (von Salmonella typhimurium)

List Biological Lab.

5(6)-Carboxyfluorescein-diazetatsuccinimidylester (CFSE)

SIGMA-Aldrich


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3.1.2 Medien und Lösungen

Medien

Komplettes Zellkulturmedium (CM)

RPMI 1640, 10% FCS, 10mM, 20µM 2β Mercapto-ethanol, L-Glutamin, 100U/ml Penicillin, 100µg/ml Streptomycin

Waschmedium (WM)

RPMI, 1% FCS

Puffer

 

Erythrozyten-Lysispuffer

10mM Tris-HCL, 0.83% NH4CL

FACS Puffer

PBS, 0.5 % BSA, 0.02% NaN3

MACS Puffer

PBS, 0.5 % BSA, 0.05 % EDTA

Lösung zur Fixierung von Zellen

PBS, 2% Formaldehyd, pH 7.0

Saponin Puffer

PBS, 0.5 % BSA, 0.5% Saponin

PBS

8g NaCL, 0.2g KCL, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4 in 1L H2O, pH 7.4

  

3.1.3 Materialien


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Injektionsspritzen (10 ml)

Henke Sass Wolf GmbH

Injektionsspritzen (2 ml)

Henke Sass Wolf GmbH

Pipetten (5 ml; 10 ml; 25 ml)

Eppendorf

Mehrkanalpipette

Labsystem

Röhrchen (15 ml; 50 ml)

Greiner

Pipettierhilfe, batteriegetrieben

IBS

Mikrotiterplatten

costar

Metallsieb, Maschenweite 0,5 mm

Aesculap

Pinzette

Aesculap

Präparationsschere

Aesculap

Inkubator

heraeus

Zellerntegerät

Packard

β-Counter

Packard

96-Napf-Filterplatten

Packard

Einmalsieb (30 µm Maschenweite)

Miltenyi

Mikroskop

Zeiss

Zentrifuge

Kendro

Eppendorfröhrchen

Sarstedt

Durchflusszytometer

Becton Dickinson

Kanüle (18 G; 24 G)

Braun

Rotlicht

Phillips

Zellkulturflaschen

Corning

  

3.1.4 Mäuse

Mäuse wurden unter pathogenfreien (SPF) Bedingungen in der Tierzucht des DRFZ gezüchtet (Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin, Berlin Marienfelde).

Die folgenden Mausstämme wurden benutzt:

Stamm

Charakteristika

PL/J

H-2u Haplotyp

T+α-

H-2u Haplotyp, α/β TCR transgene Mäuse[15,99]. Diese transgenen Mäuse exprimieren den αβ TCR eines enzephalomyelitogenen T-Zellklons (clone 19)[107]. Der TCR erkennt das azetylierte Peptid der ersten 11 Aminosäuren des Myelin-basischen Proteins (MBP) in Verbindung mit dem I-Au MHC Klasse II Moleküls. Die endogenen α-Ketten des T-Zellrezeptors sind durch Einsetzen eines Neomycingens ausgeschaltet („knocked out“), so dass ausschließlich der transgene T-Zellrezeptor exprimiert wird.

α-

Da die T+α--Mäuse nicht ausschließlich homozygot für den transgenen T-Zell-Rezeptor sind, besitzt ein Teil der Nachkommen diesen T-Zell-Rezeptor nicht. Da eigene α-Ketten nicht exprimiert werden können, entstehen keine αβ T-Zellen in diesen Mäusen.

3.1.5 Bakterien

Die von uns verwendeten Bakterien, speziell Salmonella typhimurium (Wildtypstamm C5 Nalr), wurden von Dr. U. Schaible, Max-Planck-Institut für Immunologie, kultiviert und uns zur Verfügung gestellt.


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3.1.6  Peptide

 

1

         

11

Ac

A

S

Q

K

R

P

S

Q

R

S

K

Die Sequenzen der anderen Peptide sind bei den entsprechenden Experimenten angegeben und wurden analog zum MBPAc1-11 –Peptid hergestellt.

3.1.7 Antikörper

Die Antikörper wurden von Hybridomüberständen im DRFZ von Heidi Hecker-Kia und Tuula Geske gewonnen. Die Antikörper wurden anschließend mit FITC, PE, Cy5 (Amersham) oder mit Biotin (Pharmingen) oder Digoxigenin (DIG, Boehringer) gekoppelt.

3.1.7.1 Antikörper verwendet in Zellkultur

Antikörper

Klon, Koppelung, Quelle

anti-Maus CD28

Klon 37.51. Pharmingen

anti-Maus CD3

Klon 145-2C11

anti-Maus CD4

Klon GK1.5

anti-TCR (klonotypisch)

Klon 3H12, Dr. J. Lafaille


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3.1.7.2  Antikörper für durchflusszytometrische Analysen

• Antikörper gegen Oberflächenantigene

Antikörper

Klon, Bezeichnung, Quelle

anti-CD4

Klon GK1.5. FITC (Isomer 1), PE und Biotin gekoppelt

Anti-CD8

Klon 53.6.7. PE und FITC gekoppelt

Anti-CD11b

Klon M1/70.15.11. PE und FITC gekoppelt

Anti-CD11c

Klon N418. PE und Cy5 gekoppelt

Anti-B220

Klon RA3-6B2. PE und FITC gekoppelt

Anti-CD80

Klon 16-10A4. Pharmingen. PE gekoppelt

Anti-CD86

Klon GL1. Pharmingen. FITC gekoppelt

Anti-CD28

Klon 37.51. Pharmingen. PE gekoppelt

Anti-CD40L (CD154)

Klon MR1. Pharmingen. PE gekoppelt

• Antikörper gegen Zytokine

Antikörper

Klon, Bezeichnung, Quelle

anti-IFN-γ

Klon XMG1.2. Pharmingen. PE und FITC gekoppelt.

anti-TNF-α

Klon MP6-XT22. Pharmingen. PE gekoppelt

anti-GM-CSF

Klon MP1-229. Pharmingen

anti-IL-2

Klon S4B6. DIG und PE gekoppelt

anti-IL-4

Klon 11B11. PE und DIG gekoppelt

anti-IL-17

Klon TC11-18H10. Pharmingen. DIG gekoppelt

Ratten-IgG

Jackson Immunoresearch Laboratories

Klonotypischer anti-TCR (3H12)

Dr. J. Lafaille

3.1.7.3 Sekundärantikörper

Antikörper

Klon, Koppelung, Quelle

anti-DIG

FITC und Cy5 gekoppelt

anti-rat IgG

Pharmingen. FITC gekoppelt


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3.2  Methoden

3.2.1 Zellbiologische Methoden

3.2.1.1 Zellkultur

Die Präparation der Zellen und deren Verarbeitung erfolgte unter sterilen Bedingungen.

Alle Kulturen und Assays wurden in kompletten Zellkulturmedium (CM) bei 37°C in einer 5% CO2 Atmosphäre bei 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert.

3.2.1.2  Präparation von Einzelzellsuspensionen

Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet. Das Fell wurde mit 70% Ethanol gereinigt. Anschließend wurde das Fell und das Peritoneum durchschnitten und die Milz entnommen. Die Milzen wurden durch ein feines Sieb mit einem Spritzenstempel gepresst und in 40 ml Waschmedium aufgenommen. Die Flüssigkeit wurde dann mehrmals in eine Pipette aufgenommen, so dass größere Zellaggregate suspendiert wurden.

Die Zellen wurden nun bei 300 gabzentrifugiert und resuspendiert. Um kleinere Klumpen zu entfernen, wurden die Zellen durch ein 30 µm Sieb gegeben.

Nachdem die Zellen ein weiteres Mal in Waschmedium gelöst und abzentrifugiert wurden, wurden die Erythrozyten lysiert.

Danach konnten die Zellen in der gewünschten Konzentration aufgenommen werden.

3.2.1.3 Lyse der Erythrozyten

Prinzip

Erythrozyten sind anfälliger für hypotonen Schock als Leukozyten und anderen kernhaltigen Zellen. Diese Anfälligkeit nutzt man bei der selektiven Lyse der Erythrozyten durch Zugabe von Lösungen mit geringer Salzkonzentration.


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Generelles Vorgehen

Um Erythrozyten effizient lysieren zu können, werden Einzelzellsuspensionen mit Lysispuffer (0.83% NH4Cl/10mM Tris-HCl) für 6-7 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

Nach der Inkubationszeit wird das Röhrchen mit WM aufgefüllt. Anschließend werden die Zellen abzentrigugiert (bei 200g für 8 min). Das Pellet wird anschließend aufgeschüttelt und in CM aufgenommen.

3.2.1.4 Test der Viabilität von Zellen

Prinzip

Die Viabilität von Zellen kann durch Exklusion von bestimmten Farbstoffen bestimmt werden. Dieser Test beruht auf dem Prinzip, dass bestimmte Farbstoffe wie zum Beispiel Propidiumiodid und Trypan Blau nicht in der Lage sind, intakte Membranen von lebenden Zellen zu durchdringen, wohingegen diese Farbstoffe die Membranen von toten Zellen durchdringen können und sie somit anfärben.

Generelles Vorgehen

Färben von toten Zellen mit Trypan Blau:

20µl einer Einzelzellsuspension wird 1:2 mit Trypan Blau gemischt. Ein Tropfen dieser Mischung wurde auf einen Neubauer-Hämazytometer gegeben. Tote Zellen erscheinen unter dem Mikroskop blau, während lebende Zellen ungefärbt bleiben. Die ungefärbten Zellen können mit einem Mikroskop gezählt werden.

Die Gesamtzahl der lebenden Zellen kann nun wie folgt berechnet werden:

Gesamtzahl der lebenden Zellen = n x df x vol. x 104

n :Zellzahl in einem von 4 Feldern des Hämazytometer

df:Verdünnungsfaktor, in diesem Falle 3

vol.:Volumen, in welchem die Zellen gelöst sind

Färbung mit Propidiumiodid:

Die Färbungen mit Propidiumiodid (PI) werden zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen bei einer durchflusszytometrischen Analyse benutzt.


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PI färbt die doppelsträngige DNA und führt damit zu einer roten Fluoreszenz, welche proportional zu dem Nukleinsäuregehalt der Zellen ist, wenn diese Zellen blauem Licht ausgesetzt wird.

PI kann Membranen lebender Zellen nicht durchdringen, weswegen nur die DNA toter Zellen angefärbt wird.

PI wird kurz vor der durchflusszytometrischen Analyse zu den Zellen gegeben. Später werden nur die lebenden Zellen in die Auswertung einbezogen.

3.2.1.5  Messung der Zellproliferation durch 3H-Thymidin

Prinzip

Vor jeder Zellteilung muss eine Zelle neue DNA synthetisieren. Dazu kann sie die benötigten Nukleinsäuren neu synthetisieren, oder sie nimmt sie bei entsprechendem Angebot durch Transporter aus der Umgebung auf. Bei Zugabe von radioaktiven Nukleinsäuren werden diese in die DNA eingebaut und sich teilenden Zellen radioaktiv markiert.

Die drei Nukleinsäuren Alanin, Guanin und Cytosin werden auch zum Aufbau von RNA verwendet und nicht exklusiv zur Synthese von DNA verwendet. Die Nukleinsäure Thymidin wird ausschließlich für den Aufbau der DNS verwendet. Thymidin mit an die Methylgruppe gekoppeltem Tritium (3H) kann somit zur Messung der Proliferation verwendet werden. Diese Nukleinsäure wird von proliferierenden Zellen aufgenommen und in die DNA eingebaut, wo die Radioaktivität des β-Strahlers Tritium gemessen werden kann.

Der Vorteil im Vergleich zur später zu besprechenden Proliferationsmessung mit dem Farbstoff CFSE besteht in der einfacheren Durchführung und der Möglichkeit, sehr viele Substanzen auf einmal zu testen.

Generelles Vorgehen

Nach Herstellen einer Einzelzellsuspension und der Lyse der Erythrozyten (siehe oben) werden die Zellen gezählt, abzentrifugiert und in CM in einer Zelldichte von 1x106 Zellen pro Milliliter aufgenommen. Von dieser Zellsuspension werden 100 µl in jedes Näpfchen einer 96-Napf-Mikrotiterplatte mithilfe einer Mehrkanalpipette pipettiert. Im Falle der in dieser Arbeit häufig verwendeten Testung von Peptiden, die auf einer Zellulosemembran synthetisiert wurden (siehe oben), werden 5 µl der etwa 150-200 µM [Seite 37↓]Peptidlösung zur Zellpopulation zupipettiert. Ansonsten können je nach Fragestellung auch andere Substanzen zugegeben werden.

Nachdem die Zellsuspension für 3 Tage bei 37°C in einer 5% CO2 Atmosphäre inkubiert wurde, wird 1 µCi 3H-Thymidin zugegeben und die Zellen für weitere 18 Stunden inkubiert. Danach werden mittels eines Zellerntegeräts (Hewlett Packard) die Zellen in einer 96-Filter-Platte aufgefangen. Dieser Platte wird Szintillationsflüssigkeit zugegeben und die Radioaktivität mithilfe eines β-Counters gemessen.

Der gemessene Wert wird in Signale pro Minute (counts per minute, CPM) angegeben.

Um das Ergebnis zu normieren, wird jeder Wert durch den Wert der Negativkontrolle (Zellen ohne Zugabe von Peptid) dividiert. Das Ergebnis wird Stimulationsindex (SI) genannt.

3.2.1.6 Magnetische Zellaufreinigung

Prinzip

Magnetische Zellaufreinigung (magnetic cell sorting, MACS) wird zur Isolation von spezifischen Zellpopulationen durch magnetische Mikropartikel (20-100 nm Durchmesser), gebunden an Antikörper, eingesetzt. Zellen werden mit dem entsprechenden Antikörper inkubiert und anschließend gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Die Zellsuspension wird nun über eine ferromagnetische Matrix gegeben, die in einem starken magnetischen Feld liegt. Die mit magnetischen Partikeln beladenen Zellen werden in dem Magnetfeld festgehalten, während unbeladene Zellen durch die Säule gespült werden. Die beladenen Zellen können gewonnen werden, indem die Säule von dem Magnetfeld entfernt und gespült wird.

Die Zellaufreinigung mit magnetischen Partikeln kann zur Anreicherung (positive Selektion) oder zur Depletion (negative Selektion) von speziellen Zellpopulationen verwendet werden. Die Wahl der Methode hängt von der Art der Untersuchung und von der zu isolierenden Zellpopulation ab.

Generelles Vorgehen

Jeder Schritt der Zellaufreinigung wird in MACS-Puffer (PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA) durchgeführt. Es ist wichtig, das Entstehen von Luftblasen in der Säule zu verhindern. Deswegen werden alle Puffer vor dem Gebrauch durch Anlegen eines Vakuums für etwa eine halbe Stunde entgast.


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Eine Einzelzellsuspension wird vorbereitet (s. S. 34). Um verklumpte Zellaggregate zu entfernen werden die Zellen gut suspendiert und anschließend durch ein Sieb gegeben.

Die Zellen werden nun in MACS-Puffer aufgenommen, abzentrifugiert und in einer Zellkonzentration von etwa 2x108 Zellen pro ml aufgenommen. Die mit magnetischen Partikeln verbundenen Antikörper werden in der entsprechenden Verdünnung hinzugefügt. Die Zellen werden für 15 min im Kühlschrank inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen nochmals gewaschen, in einem adäquaten Volumen (meist 5 ml) MACS-Puffer aufgenommen und über die Säule mit der ferromagnetischen Matrix gegeben, der ein starkes Magnetfeld anliegt. Vor der Zugabe der Zellsuspension werden die Säulen mit MACS-Puffer durchspült. Die Menge MACS-Puffer hängt von der Größe der Säule ab. Es wurde hierbei die Menge Puffer verwendet, die vom Hersteller empfohlen wurde.

Separation von CD4+ T-Zellen

Nach Vorbereiten einer Einzelzellsuspension werden die Erythrozyten lysiert und in MACS-Puffer gewaschen (siehe oben). Resuspendiert werden sie in einer Konzentration von 2x108 Zellen/ml und wie folgt sortiert:

Wenn die Flüssigkeit vollständig durch die Säule gelaufen ist, wird die Säule von dem Magneten entfernt und über ein Zentrifugenröhrchen gesetzt. 5 ml MACS-Puffer werden auf die Säule gegeben und das Volumen wird mit einem Spritzenstempel passend zur Säule durch die Säule gespült. Damit werden auch die vorher gebundenen Zellen von der Säule getrennt.

Um eine höhere Reinheit der CD4+ Zellen zu erhalten, wird die Zellsuspension über eine zweite Säule gegeben. Die Reinheit der Zellaufreinigung wird [Seite 39↓]durchflusszytometrisch untersucht. In der Zellsuspension sollten sich über 97% CD4+ Zellen befinden.

Depletion von B220+ Zellen

In einigen Experimenten war es nötig, die B220+ Zellen aus einer Zellsuspension zu entfernen. Dazu wird zuerst wie oben beschrieben eine Zellsuspension aus einer Mäusemilz hergestellt und die Zahl der lebenden Zellen bestimmt. Die Zellen werden in der vom Hersteller empfohlenen Menge MACS-Puffer suspendiert. Nun werden die Zellen für 15 min mit einem anti-B220 Antikörper, gekoppelt an magnetische Partikel, inkubiert. Danach werden die Zellen zwei Mal in MACS-Puffer gewaschen und über eine Depletionssäule gegeben. Diese Säule muss vorher mit MACS-Puffer gespült werden. Wenn die gesamte Zellsuspension durch die Säule gelaufen ist, werden 3 Mal 3 ml durch die Säule laufen gelassen, um möglichst viele Zellen, welche die B220 Antikörper nicht gebunden haben, aus der Säule zu entfernen. Diese Zellen werden in einem Zentrifugationsröhrchen aufgefangen und stellen die B220 depletierte Zellpopulation dar.

Die Reinheit der Zellen wird durchflusszytometrisch überprüft.

Meist reicht es bei einer Zelldepletion, die Zellen über nur eine Säule zu geben. Falls das Ergebnis der Depletion nicht zufriedenstellend sein sollte, ist es möglich, das Resultat zu verbessern, indem das Eluat über eine zweite Depletionssäule gegeben wird.

3.2.1.7 Durchflusszytometrie

In dieser Arbeit wurde die Durchflusszytometrie eingesetzt, um die Expression von Oberflächenmolekülen, die Zytokinproduktion oder die Proliferation von Zellen von definierten Zellpopulationen zu untersuchen. Dazu werden die zu untersuchenden Antigene oder Zytokine mit Antikörpern gefärbt, die an einen fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt sind. Im Falle der Messung der Zellproliferation werden intrazelluläre Strukturen kovalent mit Farbstoff gefärbt, welcher keine Antikörpereigenschaften besitzt. Die Intensität der Fluoreszenz kann durchflusszytometrisch gemessen werden. In dieser Arbeit wurde ein FACSCalibur benutzt.

Fluoreszenz bedeutet, dass bestimmte Farbstoffe Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbieren und Licht anderer Wellenlänge mit einer zeitlichen Verzögerung emittieren. [Seite 40↓]Da dies spezifisch für die Farbstoffe ist, können bei einer durchflusszytometrischen Analyse mehrere Antigene mit unterschiedlichen Farbstoffen angefärbt werden und diese Antigene zueinander auf Einzelzellebene in Beziehung zueinander gesetzt werden.

Um Epitope von Oberflächenmolekülen oder Zytokine anzufärben, können entweder Antikörper, die mit Farbstoffen wie FITC, PE oder Cy5 gekoppelt sind („direkte Färbemethode“), oder Antikörper, die mit Substanzen gekoppelt sind, die erst in einem zweiten Färbeschritt an das eigentliche Fluoreszenz gebunden werden („indirekte Färbemethode“), verwendet werden. Zu letzterer Kategorie gehören Färbungen mit Antikörpern, die mit DIG oder Biotin gekoppelt sind. Dabei wird DIG mit an Fluoreszenzen gekoppelte anti-DIG Antikörper gefärbt, Biotin wird mit an Fluoreszenzen gekoppeltes Streptavidin gefärbt.

Da Biotin auch endogen von den Zellen produziert wird und somit intrazellulär vorhanden ist, sollte dieses System nicht für Intrazellulärfärbungen benutzt werden.

Es können auch Oberflächen- und Intrazellulärfärbungen an den gleichen Zellen vorgenommen werden. In einem solchen Fall werden zuerst die Oberflächenmoleküle gefärbt, dann die Zellen fixiert und die Intrazellulärfärbung vorgenommen.

Prinzip

Die Technik der Durchflusszytometrie basiert auf der Streuung von Licht und der Fluoreszenz von verschiedenen Substanzen. Damit die Streuung beziehungsweise die Fluoreszenz einzelner Zellen gemessen werden kann, werden die Zellen in einem Flüssigkeitsstrom nacheinander durch zwei Laserstrahlen (488 nm und 630 nm, 200 mW) geleitet. Das von den Zellen gestreute und emittierte Licht wird durch ein System von optischen Linsen, Spiegeln, Filtern und Photodetektoren geleitet, so dass das optische Signal in ein elektrisches Signal verwandelt werden kann. Dieses elektrische Signal kann mithilfe eines Computers weiterverarbeitet werden, so dass eine graphische Darstellung und eine statistische Auswertung der gemessenen Parameter für alle Zellen ermöglicht wird.

Der FACSCalibur ist mit einem 480 nm Argonlaser und einem 630 nm Dioden Laser ausgestattet und kann so bis zu sechs verschiedene Parameter aufnehmen:

Färbung von Oberflächenmolekülen

Die Präparation der Proben und das Färben der Oberflächenmolekülen wird in FACS-Puffer (PBS, 0.5% BSA) vorgenommen. Bei jedem Waschschritt werden die Zellen in einer Heraeus Zentrifuge bei 300g zentrifugiert.

Eine Einzelzellsuspension (s. S. 34) wird zentrifugiert und das Pellet in FACS-Puffer aufgenommen. 0,5-5x106 Zellen wurden in einem 1,5 ml Eppendorfröhrchen aufgenommen.

Der von vielen Zelltypen exprimierter Fcγ-Rezeptor kann auch die konjugierten Antikörper binden und somit die Zellen unspezifisch anfärben. Um dies zu vermeiden werden die Zellen vor der eigentlichen Färbung mit ungekoppelten anti-Fcγ-Rezeptor Antikörpern und Ratten IgG in 90 µl FACS-Puffer für 10 min bei 4°C inkubiert. Alternativ dazu ist es auch möglich, diese Rezeptoren durch Zugabe von 10% Mäuseserum zu blocken. Diese Methode wurde in dieser Arbeit aber nicht verwendet.

Anschließend werden die Primärantikörper hinzugefügt. Diese Mischung besteht aus den spezifisch an die Oberflächenmoleküle bindenden Antikörpern. Die Antikörper werden gesondert in FACS-Puffer gemischt, wobei die Menge des eingesetzten Antikörpers bei etwa 0,5 bis 7,5 µg/ml liegt und von der Affinität und Färbeintensität des Antikörpers abhängt. Von dieser Mischung werden 10 µl zu jeder Zellsuspension [Seite 42↓]gegeben. Damit ist gewährleistet, dass jede Suspension gleichviel Antikörper erhalten hat.

Die Zellen werden wiederum bei 4°C für 15 min inkubiert und anschließend zwei Mal gewaschen. Wenn auch indirekte Färbungen vorgenommen werden, wird jede Probe mit einer Mischung mit den Sekundärantikörpern inkubiert und nach der Inkubationszeit gewaschen.

Das Pellet wird vor der eigentlichen durchflusszytometrischen Analyse in 300-500 µl FACS-Puffer je nach Anzahl der Zellen aufgenommen und mit dem FACSCalibur gemessen. Die Daten wurden mit den Programmen Cell Quest oder WinMDI analysiert.

Antikörper zur Färbung von Oberflächenantigenen

Zellspezifität

Antikörper

Konzentration

Klon

Quelle

T-Zellen

α Vβ8.1,8.2 PE

1-5 µg/ml

KJ1-26.1

Pharmingen

 

α CD4 Biotin/Cy5

0,5 µg/ml

GK1.5

DRFZ

 

α CD4 FITC

0,5µg/ml

GK1.5

DRFZ

 

α ΤCR bio (klonotyp.)

0,5 µg/ml

3H12

Dr. Lafaille

 

α CD8 PE/FITC

1µg/ml

53.6.7

DRFZ

Antigen

α CD11b FITC/PE

1µg/ml

M1/70.15.11

DRFZ

präsentierende

α CD11c Cy5/PE

1-2µg/ml

N418

DRFZ

Zellen

α B220 PE/FITC

1µg/ml

RA3-6B2

DRFZ

Kostimulatorische

α CD25 FITC

5µg/ml

PC61

Pharmingen

Moleküle und

α CD62L PE

2µg/ml

MEL-14

Pharmingen

deren Liganden

    

Färbung von intrazellulären Zytokinen

Um intrazelluläre Zytokine zu färben, reicht es nicht aus, die Antikörper zu den Zellsuspensionen zuzufügen, da diese die Zellmembran nicht durchdringen könnten und somit die Zytokine nicht anfärben würden. Deswegen müssen der Färbung verschiedene andere Schritte vorausgehen. Im einzelnen sind das:


[Seite 43↓]

Stimulation der Zellen

Die Zellen werden nach Anfertigung einer Einzelzellsuspension in vitro mit den entsprechenden Substanzen stimuliert, oder mit dem polyklonal aktivierendem Phorbolester (PMA) und Ionomycin stimuliert. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 2x106 Zellen pro Milliliter suspendiert. PMA wurde in einer Konzentration von 5 ng/ml, Ionomycin in einer Konzentration von 1 µg/ml eingesetzt. Peptide wurden meist in der Konzentration von 10 µg/ml, andere Substanzen je nach Fragestellung einsetzt. Zellen wurden mit diesen Substanzen bei 37 °C in einer 5%CO2-Atmosphäre bei 95% Luftfeuchtigkeit für 6 Stunden inkubiert. Um die intrazellulären Transportprozesse zu blockieren, wird nach 4 Stunden Brefeldin A in einer Konzentration von 5 µg/ml zugefügt. Nach dieser Zeit werden die Zellen geerntet, zentrifugiert und in PBS gewaschen.

Anschließend folgt die Fixierung der Zellen.

Fixation der Zellen

Die Zellen werden durch Zugabe von 2% Paraformaldehyd fixiert. Die Zellen werden bei Raumtemperatur für 20 min inkubiert. Danach werden die Zellen zwei Mal in FACS-Puffer gewaschen. Nach dieser Fixierung können die Zellen bei 4°C für Wochen gelagert werden, wurden in dieser Arbeit aber nach 24 Stunden analysiert.

Permeabilisierung und Färbung

Alle Färbeschritte werden bei Raumtemperatur in Saponinpuffer (PBS, 0.5 % BSA, 0.5% Saponin) durchgeführt. Wie oben beschrieben werden die Fcγ-Rezeptoren durch Zugabe von anti-Fcγ-Rezeptor Antikörpern und Ratten IgG für 10 min blockiert. Danach werden die Zellen ohne Zentrifugation mit den Primärantikörpern inkubiert. Nach 15 min werden die Zellen gewaschen und bei Bedarf wird der Sekundärantikörper in Saponin hinzugefügt.

Nach diesem Schritt werden die Zellen zwei Mal in Saponin gewaschen und in 300-500 µl FACS-Puffer aufgenommen. Jetzt kann eine durchflusszytometrische Analyse vorgenommen werden.


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Antikörper zum Färben von intrazellulären Zytokinen

Primärantikörper

Konzentration

Klon

Quelle

α IFN-γ PE

1µg/ml

XMG1.2

Pharmingen

α IFN-γ FITC

2.5µg/ml

XMG1.2

Pharmingen

α TNF-α PE

0.5µg/ml

MP6-XT22

Pharmingen

α IL-2 DIG

2.5µg/ml

S4B6

DRFZ

α IL-2 PE

2µg/ml

S4B6

Pharmingen

α IL-4 DIG

2µg/ml

11B11

DRFZ

α IL-4 PE

2µg/ml

11B11

Pharmingen

Sekundärantikörper

Konzentration

Quelle

α DIG Cy5

1µg/ml

DRFZ

α Ratten IgG FITC

1µg/ml

Pharmingen

Messung der Zellproliferation mit CFSE

Prinzip

Bei der durchflusszytometrischen Messung der Proliferation wird die Eigenschaft des Farbstoffes 5(6)-Carboxyfluorescein-diazetatsuccinimidylester(CFSE) genutzt[108], sich an intrazytoplasmatische Proteine kovalent zu binden. So erhält jede Zelle eine Färbung ähnlicher Intensität. Im Falle einer Zellteilung wird an jede Tochterzelle die Hälfte des Farbstoffs weitergegeben. Die Intensität ist somit bei jeder Zellteilung um die Hälfte verringert. Diese Abnahme kann durchflusszytometrisch erkannt werden und somit die Anzahl der Zellteilungen jeder Zelle genau festgestellt werden. Der Vorteil im Vergleich zu konventionellen Proliferationsassays mithilfe radioaktiven Thymidins besteht darin, dass die Proliferation bestimmter Zellpopulationen genau ausgewertet werden kann.

Generelles Vorgehen

Um Zellen mit CFSE zu Färben, werden Einzelzellsuspensionen (s. S. 34) angefertigt. Dabei ist es kritisch, die Zellen gut zu suspendieren und durch ein feines Sieb zu geben, damit keine Klümpchen in der Suspension vorhanden sind und alle Zellen dieselbe Menge CFSE aufnehmen.


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Die Zellsuspension wird zweimal in PBS gewaschen und anschließend in einer Konzentration von bis zu 5x107 Zellen pro Milliliter aufgenommen. Nun wird CFSE in einer Endkonzentration von 2 µg/ml hinzugefügt und für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die Zellsuspension schnell in CM aufgenommen, abzentrifugiert und ein Mal in CM gewaschen.

Die Zellen sind nun mit CFSE gefärbt und werden mit den zu testenden Substanzen oder Zellen vermischt und in Kultur genommen. Nach mehreren Tagen (abhängig von der Fragestellung) können die Zellen der Kultur entnommen, Oberflächenmoleküle oder Zytokine wie oben beschrieben gefärbt und eine durchflusszytometrische Analyse vorgenommen werden.

Untersuchen der Expression des transgenen T-Zellrezeptors

Jede Maus wurde vor Verwendung in Experimenten auf die Expression des transgenen T-Zellrezeptors untersucht.

Da das Gen für den transgenen T-Zellrezeptor nicht notwendigerweise homozygot bei den T+α- Mäusen ist, gibt es Nachkommen, die diesen T-Zell Rezeptor nicht exprimieren.

Der transgene T-Zell Rezeptor besteht aus einer Vα2 und einer Vβ8 Kette. Da die endogenen α-Ketten ausgeschaltet sind und ein Rearrangieren der β-Kette nicht mehr möglich ist, exprimiert jede T-Zelle in diesen Mäusen den selben transgenen T-Zell Rezeptor.

Die zu untersuchende Maus wird für etwa 5 Minuten unter ein Rotlicht gesetzt, um die Gefäße zu erweitern. Mit einer scharfen Rasierklinge wird ein kleiner Schnitt am Schwanz der Maus gesetzt und ein mit EDTA gefülltes Röhrchen zum Auffangen der Blutstropfen unter den Schnitt gehalten. Etwa drei Blutstropfen werden gewonnen.

Dieses Blut wird abzentrifugiert. Das Zellpellet wird in 100 µl Lysispuffer aufgenommen und für 10 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Danach werden die Zellen wiederum abzentrifugiert, in 100 µl PBA aufgenommen, mit dem klonotypischen αTCR-bio (3H12) und αCD4-Cy5 gefärbt und für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend wird nach nochmaligem Waschen der Zellen der Sekundärantikörper Streptavidin-PerCP für 10 min zugegeben.

Bei vielen zu testenden Proben können alle Färbeschritte in einer 96-Napf-Mikrotiterplatte vorgenommen werden.


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Anschließend werden die Proben durchflusszytometrisch untersucht.

Mäuse mit einer Vβ8+CD4+ Zellpopulation wurden als T+α- Mäuse, Mäuse ohne jegliche T-Zellen als α- Mäuse definiert.

3.2.1.8  Blockade der T-zellrezeptorabhängigen Aktivierung der T-Zellen

Um den Effekt der T-Zellrezeptor-MHC Molekül-Bindung auf die Aktivierung zu untersuchen, werden Moleküle, die zur Aktivierung von T-Zellen über den T-Zellrezeptor nötig sind, spezifisch blockiert.

Zu diesen Molekülen gehören beispielsweise der T-Zellrezeptor selbst, CD4 oder CD3 Moleküle, oder auch die MHC Moleküle der antigenpräsentierenden Zellen. Die Blockade der MHC Moleküle ist dadurch erschwert, dass sie einem sehr schnellen Umsatz unterliegen und somit nicht dauerhaft von Antikörpern blockiert werden können.

Da es sich bei den von uns verwendeten Mäusen um Mäuse mit nur einem T-Zellrezeptor handelt und es einen Antikörper gibt, der spezifisch an diesen T-Zellrezeptor bindet, bietet sich eine Blockade mit diesem Antikörper an. Als Kontrolle wurde auch eine Blockade mit CD4 Antikörpern des Typs L3T4 verwendet, da eine Blockade von T-Zellaktivierungen mit diesem Antikörper auch in anderen Systemen etabliert ist.

Beide Antikörper wurden 50fach stärker im Vergleich zu einer FACS-Färbung eingesetzt, um eine vollständige Blockade der entsprechenden Oberflächenmoleküle zu gewährleisten.

Die Antikörper wurden nach Präparation der Zellen vor Zugabe der Peptide bzw. der anderen Substanzen in die Zellkultur zugegeben. Nach einer 10-minütigen Inkubationszeit wurden die zu testenden Substanzen direkt zu den Zellen gegeben.

3.2.2 Methoden zur EAE Induktion

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist eine Krankheit, in der es durch autoreaktive T-Zellen zu Infiltraten und Zerstörungen innerhalb der weißen Substanz des Zentralnervensystems kommt. Diese Zerstörungen bedingen fortschreitende Lähmungen bei den erkrankten Tieren. Es gibt verschiedene Mausstämme, in denen sich diese Krankheit entwickelt. Die Verläufe unterscheiden sich von Modell zu Modell häufig sehr stark voneinander.


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Rein systematisch unterscheidet man „aktiv induzierte EAE“ und „passiv induzierte EAE“.

Aktiv induziert bedeutet, dass einer Maus EAE-induzierende Substanzen wie zum Beispiel Selbstpeptide in Adjuvant gespritzt wird. Das Immunsystem der Maus wird durch diese Substanzen aktiviert und reagiert gegen das Zentralnervensystem.

Im Gegensatz dazu steht die passive Induktion der EAE: Hierbei werden einer Maus aktivierte autoreaktive T-Zellen gespritzt. Diese Zellen lösen nun innerhalb der Maus EAE aus.

3.2.2.1  Aktiv induzierte EAE

Für diese Experimente werden T+α--Mäuse verwendet. Diese Mäuse sind transgen für einen T-Zell-Rezeptor, der spezifisch für die ersten 11 Aminosäuren des Myelin-basischen Proteins (MBP) ist. Außerdem sind die endogenen TCR α-Ketten ausgeschaltet (knocked out), so dass ausschließlich selbstreaktive T-Zellen in diesen Mäusen vorkommen.

In dieser Arbeit wird durch die Induktion von EAE untersucht, ob Peptide oder andere Substanzen, die in vitro Proliferation von T-Zellen auslösen konnten, auch in vivo krankheitsinduzierend wirken.

Generelles Vorgehen

An Tag 0 wird 100 µl der zu testenden Substanz (bei Peptiden 200 µg) in 100 µl kompletten Freunds Adjuvant (Mineralöl plus Mykobakterien, Complet Freund’s Adjuvant, CFA) durch Ultraschall emulgiert.

Der zu untersuchenden Maus wird auf jede Seite der Schwanzbasis je 100 µl der Emulsion subkutan gespritzt.

24 und 48 Stunden danach wird den Mäusen in 100 µl PBS gelöstes 200 ng Pertussistoxin (PT) intravenös injiziert.


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Nun werden die Mäuse jeden zweiten Tag auf Lähmungen kontrolliert. Abhängig vom Immunogen treten nach etwa 8-14 Tagen erste Lähmungen auf. Diese werden mithilfe eines klinischen Index gewertet:

Pro Gruppe werden in jedem Experiment stets fünf oder mehr Mäuse verwendet werden, um eine signifikante Aussage zu erhalten.

Um das Ergebnis der einzelnen Mäusen in einem Ergebnis der Gesamtgruppe zu mitteln, werden die klinischen Indizes aller Mäuse addiert und durch die Anzahl der Mäuse dividiert. Obwohl dieses Verfahren statistisch nicht einwandfrei ist, da es sich bei dem klinischen Index um eine Nominalskala handelt und damit das arithmetische Mittel strenggenommen nicht berechnet werden kann, hat sich diese Auswertung bei der Beurteilung der EAE durchgesetzt und wird deswegen in dieser Arbeit auch so vorgenommen.

3.2.2.2 Passiv induzierte EAE

Bei diesen Experimenten werden α--Mäuse verwendet. Diese Mäuse stammen aus der Zucht der T+α--Mäuse. Da die T+α--Mäuse heterogen für den transgenen T-Zell-Rezeptor sein können, besitzen manche Nachkommen den transgenen T-Zell-Rezeptor nicht. Aufgrund der ausgeschalteten α-Ketten des T-Zell-Rezeptors sind diese Mäuse T-Zell-defizient. Aufgrund der nahen Verwandtschaft zu den T+α--Mäusen können Zellen dieser Mäuse in die α--Mäuse transferiert werden.


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Generelles Vorgehen

Nach Herstellen einer Einzelzellsuspension von Milzen aus T+α--Mäusen werden diese Zellen für 3 Tage mit 10 µg/ml MBPAc1-11-Peptid oder anderen Substanzen stimuliert. Danach werden die Zellen mittels magnetischer Zellaufreinigung (magnetic cell sorting, MACS) sortiert oder die Prozentzahl der T-Zellen in der Zellsuspension durchflusszytometrisch analysiert.

Die Zellen werden gezählt, zentrifugiert und 15-100x106 T-Zellen in 1 ml PBS suspendiert. 100 µl dieser Zellsuspension wird intravenös in eine α--Maus gespritzt.

Danach werden die Mäuse beobachtet und deren Krankheit wie oben beschrieben beurteilt.

3.2.3  Histologische Methoden

3.2.3.1 Perfusion und Fixation der Mäuse

Prinzip

Um auswertbare Hirnschnitte zu erhalten, ist es erforderlich, autolytische Prozesse sofort nach Entnahme der Gewebe oder nach Töten der Mäuse zu stoppen. Dies geschieht mit Paraformaldehyd, welches Proteine denaturiert und Mikroorganismen abtötet, so dass jede biologische Veränderung des Gewebes verhindert wird.

Generelles Vorgehen

Die zu perfundierende Maus wird in ein Becherglas gesetzt, in welchem sich ein mit etwa 5ml Diethylether getränktes Tuch befindet. Nachdem Apnoe bei der Maus festgestellt wird, wird die Maus dem Becherglas entnommen, die Bauchhaut eröffnet und das Zwerchfell von kaudal eingeschnitten. Der Brustkasten wird links und rechts etwa 4 mm vom Sternum durchschnitten. Es ist darauf zu achten, dass größere Blutgefässe, insbesondere die Arteria thoracica interna, nicht durchschnitten werden.

Das Herz wird freipräpariert, der linke Vorhof eröffnet und eine Kanüle eingeführt. Der rechte Vorhof wird eröffnet. Über die Kanüle wird langsam 50ml PBS in den Ventrikel gespritzt. Danach wird 50ml Paraformaldehyd (4%) in das Herz gegeben.

Da die Substanzen durch den Blutkreislauf schnell an alle Stellen des Körpers verteilt werden, wird eine gleichmäßige Fixation der Mäuse erreicht.


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Der Schädel und das Rückenmark werden freipräpariert und über Nacht in Paraformaldehyd (1%) nachfixiert. Danach werden die Gewebe in PBS gelagert.

3.2.3.2 Entwässern und Färben der Gewebe

Generelles Vorgehen

Um Gewebe histologisch untersuchen zu können, müssen sie in einen schneidbaren Zustand gebracht werden, in dünne Scheiben geschnitten und gefärbt werden.

Es gibt eine Veilzahl von Methoden der Fixation und der Färbung von Zellen, die je nach Fragestellung eingesetzt werden.

Bei unseren Experimenten kommt es auf die Beurteilung der ZNS Infiltrate der Mäuse an. Um ein schneidbares Gewebe zu erhalten, werden diese mit Paraformaldehyd (4%) fixiert und anschließend in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und in flüssigem Paraffin bei 62°C eingebettet.

Nach Anordnung der Gewebestücke in flüssigem Paraffin und deren Abkühlung kann der erhärtete Paraffinblock mithilfe eines Mikrotoms in 5-10µm dicke Scheiben geschnitten. Nachdem die Schnitte auf einen Objektträger gelegt werden, werden diese über eine absteigende Alkoholreihe in Wasser gelöst, mit Hämatoxilin und Eosin gefärbt und durch eine aufsteigende Alkoholreihe entwässert. Um die Stücke auf dem Objektträger luftdicht haltbar zu machen, wird ein Deckglas mit einem Tropfen Kanadabalsam über dem Gewebsstückchen fixiert.

3.2.3.3 Beurteilung der Hirnschnitte

Die Hirnschnitte wurden in dieser Arbeit von Dr. C. Stadelmann und Prof. W. Brück, Institut für Neuropathologie, Charité, beurteilt.

Um einen histologischen Index der experimentellen Enzephalomyelitis zu erhalten, werden alle entzündlichen Infiltrate auf jedem Rückenmarksquerschnitt zusammengezählt und durch die Anzahl der Rückenmarksquerschnitte geteilt. Die dadurch ermittelte mittlere Anzahl Infiltrate pro Querschnitt stellen ein gutes Korrelat zu dem klinischen Index dar und können so diesen absichern.

Außerdem wird die Zellzusammensetzung der Infiltrate beurteilt und deren Verteilung innerhalb des ZNS.


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05.01.2005