5 Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen mikrobiellen Infektionen und Autoimmunkrankheiten untersucht. Die Hypothesen der molekularen Mimikry und der „Bystander-Aktivierung“ wurden an einem Mausmodell für die Autoimmunkrankheit experimentelle autoimmune Enzephalitis (EAE) überprüft.

5.1 Aussagen über Molekulare Mimikry

5.1.1  Aussagen über die Spezifität des T-Zellrezeptors

In dieser Arbeit wurden Experimente zur Untersuchung der Spezifität eines I-Au/MBPAc1-11 spezifischen, murinen T-Zellrezeptors durchgeführt. Der Spezifität eines T-Zellrezeptors wird aufgrund der Schlüsselrolle der CD4+ T-Zellen im Immunsystem eine wesentliche Rolle bei der Entstehung von spezifischer Immunität gegen Bakterien einerseits, auf der anderen Seite aber auch bei der Induktion von Autoimmunität durch das Erkennen von Selbstpeptiden, zugeschrieben.

Wie in Abschnitt 4.3 dargestellt, fanden wir viele Peptide viralen und bakteriellen Ursprungs, welche in vitro die I-Au/MBPAc1-11 spezifischen T-Zellen zur Proliferation anregen und somit aktivieren. Bei näherer Untersuchung einiger dieser Peptide (siehe Abschnitt 4.4) zeigte sich, dass sich die Dosis-Wirkungskurven und die durch die Peptide induzierte Zytokinexpression sich nicht von der durch das Selbstpeptid MBPAc1-11 induzierten Aktivierung unterschied. Des weiteren waren sowohl das Selbstpeptid MBPAc1-11 als auch die Peptide mikrobiellen Ursprungs in der Lage, experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) in den von uns verwendeten transgenen T+α--Mäusen auszulösen. Auch hier war kein Unterschied im Schweregrad oder im Verlauf der induzierten Krankheit festzustellen. Somit ist erstens Autoimmunität über Kreuzreaktivität auslösbar, zweitens kommen sehr viele mikrobielle oder virale Peptide vor, die mit Selbstpeptiden an einem T-Zellrezeptor kreuzreagieren.

Es konnte im Rahmen dieser Arbeit allerdings nicht die Frage beantwortet werden, ob die kreuzreaktiven Peptide auch in vivo aus den Proteinen prozessiert werden oder ob die Proteine in einer Konzentration vorkommen, welche ausreicht, um eine suffiziente T-Zellaktivierung hervorzurufen. Ein Versuch zur Beantwortung dieser Frage wurde von uns durch die Untersuchung der Lysate von S. typhimurium unternommen. Allerdings war die Proliferation der Th-Zellen auf das Lysat nur sehr gering und wurde auch durch LPS ausgelöst. Dementsprechend kann keine Aussage darüber gemacht werden, ob [Seite 73↓]Lysate die Th-Zellen ausschließlich durch LPS oder auch durch kreuzreaktive Peptide aktivieren.

Einen Hinweis darauf, dass es Kreuzreaktivität zwischen Peptiden gibt, die in vivo prozessiert werden und in der nötigen Konzentration vorkommen, ohne dass diese Kreuzreaktivität eine beobachtbare Rolle spielt, verdeutlichte ein Ergebnis von Maier et al. in unserer Gruppe[61]: Für die Experimente wurden Mäuse verwendet, die transgen für humanes HLA-DR4 und humanes CD4 waren, wobei die endogenen MHC-II-Moleküle der Mäuse ausgeschaltet wurden. Aus diesen Mäusen wurden T-Zellklone generiert, die spezifisch für Peptide des OspA-Protein von Borrelia burgdorferii in Verbindung mit dem HLA-DR4+-Molekül sind.

T-Zellen solcher Spezifität sind möglicherweise an der Pathogenese der therapieresistenten Verlaufsform der Lyme-Arthritis beteiligt.

Diese T-Zellhybridome wurden auf Kreuzreaktivität mit Selbstpeptiden untersucht.

Interessanterweise fanden sich unter anderem Kreuzreaktivitäten zwischen dem OspA-Peptid und dem Vorläuferprotein des Insulins. Dabei war das Peptid des Proinsulins genau ein solches Epitop, welches auch bei HLA-DR4+ Diabetespatienten immundominant ist. Dies zeigt, dass dieses Peptid tatsächlich in vivo vorkommt und prozessiert wird. Dennoch ist eine Assoziation zwischen Lyme-Borreliose und Diabetes mellitus Typ I nicht beobachtet worden.

Sowohl die Ergebnisse von Maier et al. als auch unsere Ergebnisse fanden also multiple kreuzreaktive Peptide in zwei unterschiedlichen Systemen, wobei beide Methoden das Ausmaß der Kreuzreaktivität noch unterschätzen dürften. Doch selbst bei der Untersuchung dieser Peptide wurden kreuzreaktive Peptide gefunden, die in vivo prozessiert werden. Unter physiologischen Bedingungen kommen Tausende von unterschiedlichen T-Zellen vor, und es ist, auch nach Ergebnissen anderer Gruppen[59,60,113,61,115,116,117], davon auszugehen, dass jeder T-Zellrezeptor eine Vielzahl von Peptiden erkennt.

Kreuzreaktivität ist somit ein sehr häufig vorkommendes Ereignis.

Als zusätzliches Ergebnis der Arbeit ist die wichtige Aussage festzuhalten, dass es bei der Suche nach mikrobiellen Peptiden, die autoaggressive T-Zellen aktivieren können, nicht ausreicht, homologe Peptide, also Peptide gleicher oder ähnlicher Sequenz, zu bestimmen. In dieser Arbeit wurden beispielsweise 5 kreuzreaktive Peptide gefunden, die eine dem MBPAc1-11-Peptid vergleichbare Proliferation hervorrufen und nur an 2 Positionen identische Aminosäuren wie das MBPAc1-11-Peptid besitzen. Eine Suche [Seite 74↓]nach homologen Peptiden würde demnach nur eine geringe Anzahl der Peptide finden, die tatsächlich kreuzreaktiv sind.

Auch eine Suche nach Peptiden, die strukturelle Ähnlichkeiten zu dem Ausgangspeptid besitzen, würde das Ausmaß der Kreuzreaktivität unterschätzen. Beispielsweise sind an Position 3 des von uns verwendeten Supertops die Aminosäuren Phenylalanin, Histidin, Methionin und Glutamin substituierbar, ohne dass die T-Zellaktivierung beeinträchtigt wird. So ist zwar sowohl die Seitenkette des Ausgangspeptids Glutamin als auch von Methionin unverzweigt, unpolar und relativ lang. Wird die Seitenkette des Glutamins nur um eine Methylgruppe verkürzt, also Asparagin substituiert, geht die T-Zellaktivierung verloren.

Auf der anderen Seite besteht keine offensichtliche Ähnlichkeit zwischen diesen Aminosäuren und den Aminosäuren Phenylalanin und Histidin, die eine aromatische Seitenkette besitzen. Fügt man an das Phenylalanin nur eine –OH-Gruppe, substituiert also Tyrosin, geht die T-Zellaktivierung sehr stark zurück.

Wenn man bei einer Suche nach strukturellen Ähnlichkeiten an Position 3 nur Methionin und Glutamin als Aminosäuren mit langen, unpolaren Seitenketten gelten lässt, wären nur 39 Peptide statt der 61 kreuzreaktiven Peptide gefunden worden. Allein hier hätte man die Kreuzreaktivität um ein Drittel unterschätzt.

Außerdem ist festzuhalten, dass es auch nicht genügt, Peptide zu finden, die besonders gut an MHC-Moleküle binden[118]. Die von uns untersuchte T-Zellrezeptor/MBPAc1-11/I-Au-Bindung ist im Gegenteil dadurch gekennzeichnet, dass sie besonders kurzlebig und die Affinität des T-Zellrezeptors an den MBPAc1-11/I-Au-Komplex eher schwach ist[111,119,110]. So konnte Position 4, also neben Position 5 die zweite Bindungsstelle an das MHC-Molekül, durch jede natürlich vorkommende Aminosäure ersetzt werden, ohne dass die T-Zellaktivierung beeinträchtigt wurde.

Es wurde sogar diskutiert, dass in diesem Modell die kurze Bindungszeit benötigt wird, um das Peptid immunogen zu halten und eine Toleranzinduktion zu verhindern[120].

Da es keine verwendbaren mathematischen Modelle zur Vorhersage von Kreuzreaktivität gibt, muss also zur Bestimmung kreuzreaktiver Peptide eine systematische Definition des Supertops und anschließende Überprüfung der Peptide durchgeführt werden, wie dies in dieser Arbeit durchgeführt wurde.


[Seite 75↓]

5.1.2  Konsequenzen für das Verständnis der T-Zellrezeptor-Antigen-Erkennung

Inwieweit betreffen diese Ergebnisse die Vorstellungen über die Antigenerkennung durch T-Zellen? Wie oben bereits beschrieben, kommt dem T-Zellrezeptor eine Schlüsselrolle durch die Bindung an MHC/Antigen-Komplexe zu (siehe Seite 11 ff.). Wenn Kreuzreaktivität ein häufig vorkommendes Ereignis ist und somit die enge Spezifität der T-Zellrezeptoren nicht mehr gewährleistet ist, können die jetzigen Konzepte zur T-Zellrezeptor/Antigen-Erkennung noch beibehalten werden?

Um diese Frage zu diskutieren, soll noch einmal festgehalten werden, dass in dieser Arbeit zwar festgestellt wurde, dass die Spezifität der T-Zellen geringer ist als in klassischen Modellen postuliert, aber dennoch nicht jedes Peptid durch jeden T-Zellrezeptor erkannt wird. Vielmehr ist es so, dass jeder T-Zellrezeptor eine bestimmte Gruppe von Peptiden erkennt, welche sich durch manche strukturelle Gemeinsamkeiten ähneln. Somit ist ein T-Zellrezeptor schon spezifisch, wenn auch nicht für nur ein einziges Peptid.

Des weiteren ist zu sagen, dass in dieser Arbeit, aufgrund des gewählten Tiermodells, Kreuzreaktivität als negatives Ereignis, nämlich dem Entstehen von Autoimmunität, gesehen wurde.

Allerdings wird diskutiert, dass unter physiologischen Bedingungen Kreuzreaktivität zwischen Selbst- und Fremdpeptiden benötigt wird, um nach einer Infektion die entstandenen Gedächtnis-T-Zellen durch ständige, suboptimale Stimulation der T-Zellen in einem funktionsfähigem Zustand zu halten[121,122]. Naive T-Zellen würden durch eine solche suboptimale Stimulation eventuell nicht aktiviert werden, da sie eine stärkere T-Zellrezeptor-Antigen-Bindung benötigen, um aktiviert zu werden[123,124].

5.1.3  Hypothetisches Konzept zum Verständnis des Immunsystems bei eingeschränkter Spezifität des T-Zellrezeptors

Für einen weiteren, sehr interessanten Beitrag, zur Diskussion der Relevanz der T-Zellrezeptor-Antigen-Bindung bei eingeschränkter Spezifität der T-Zellrezeptoren halte ich die Arbeit von Mason[125], in welcher postuliert wird, dass ohne Kreuzreaktivität eine suffiziente T-Zellantwort nicht möglich wäre, da, wenn jede T-Zelle nur ein Peptid erkennen würde, die Wahrscheinlichkeit, dass ein Fremdpeptid von einer T-Zelle erkannt würde, sehr gering wäre, da die Frequenz der für dieses Fremdprotein spezifischen T-Zellen sehr gering wäre. Demnach würden Infektionen nicht oder nur [Seite 76↓]sehr spät erkannt und die Antwort entsprechend schwach sein, die Immunantwort wäre insuffizient.

Ich vermute, dass man in Erweiterung dieser Spekulation auch eine physiologische Immunantwort verstehen kann:

Im Thymus werden T-Zellen depletiert, die zu stark durch Selbstpeptide aktiviert werden. Unter Bedingungen ohne eine Infektion würden naive T-Zellen demnach nicht aktiviert.

Wird ein Individuum von einem Fremdorganismus infiziert, enthält dieser Organismus nicht nur ein, sondern sehr viele Fremdpeptide. Außerdem würden durch immunstimulatorische Substanzen wie LPS oder CpG oder auch durch Gewebeuntergang kostimulatorische Moleküle an den antigenpräsentierenden Zellen exprimiert. Es würden also sehr viele verschiedene T-Zellen auf einmal aktiviert und durch die Peripherie zirkulieren. Tritt eine Infektion mit demselben Fremdorganismus an einer anderen Stelle im Körper auf, würden also wiederum sehr viele T-Zellen gleichzeitig durch diesen Krankheitserreger stimuliert werden und eine Immunantwort hervorrufen.

Da unter physiologischen Bedingungen diese T-Zellantwort eben gerade sehr divers ist, erkennt jede der aktivierten T-Zellen zwar Peptide des Fremdorganismus, jedoch sind die Selbstpeptide, durch welche die T-Zellen aktiviert werden, in unterschiedlichen Geweben lokalisiert. Des weiteren werden in diesen Geweben keine kostimulatorischen Moleküle exprimiert, da dort vermutlich keine Infektion vorliegt. Die T-Zellen, die also in solchen Geweben durch Selbstpeptide aktiviert würden, würden zwar kurzzeitig eine geringgradige Inflammation und eventuell eine geringe Zellzerstörung kommen. Da in diesen Geweben aber nur sehr wenige T-Zellen aktiviert würden, würde die Frequenz der T-Zellen nicht ausreichen, um eine andauernde Inflammation hervorzurufen. Insbesondere würden solche T-Zellen durch immunsuppressive Gegenregulation, also zum Beispiel durch regulatorische T-Zellen oder durch bestimmte Oberflächenmoleküle, an der Induktion einer suffizienten Inflammation gehindert. Schließlich würden die T-Zellen entweder durch solche Mechanismen oder durch aktivierungsinduzierten Zelltod in Apoptose übergehen.

Gewebe, die besonders empfindlich für Gewebezerstörung sind, insbesondere das ZNS, sind durch die in Abschnitt 1.5.2 beschriebenen Schranken vor unkontrolliertem Eindringen von T-Zellen geschützt.


[Seite 77↓]

Während einer unkomplizierten Infektionen in der Peripherie käme es also eventuell zu Gewebsuntergängen in verschiedenen Organen aufgrund von Kreuzreaktivität, solange die Organe nicht durch spezielle Schranken geschützt sind. Die entstandenen Schäden wären aber in diesem hypothetischen Modell nicht gravierend und könnten vom Individuum regeneriert werden, solange die selbstreagierenden T-Zellen einen gewissen Grenzwert nicht überschreiten und eine Inflammation nicht selbstständig auslösen können.

Gesetzt den Fall, es kommt zu einer Infektion in einem besonders empfindlichen Organ oder eine T-Zelle erkennt ein Selbstpeptid in dem durch den Fremdorganismus entzündeten Gewebe. Bei dem Ausmaß der Kreuzreaktivität, wie sie in dieser Arbeit gefunden wurde, wäre dies wahrscheinlich ein häufig vorkommendes Ereignis.

Die Frage ist, ob es in einem solchen Fall zu Autoimmunität käme: Es würden zur selben Zeit sehr viele T-Zellen aktiviert, des weiteren würden kostimulatorische Moleküle exprimiert.

In einem solchen Fall sollten solche T-Zellen tatsächlich durch Selbstpeptide aktiviert werden. Wesentlich ist aber, dass bei einem Rückgang der Inflammation die anderen T-Zellen verschwinden würden. Da während der Inflammation durch Fremdpeptide aktivierte T-Zellen ebenso proliferierten wie die autoreaktiven Zellen, sollte die Frequenz der autoreaktiven T-Zellen gering sein im Vergleich zu den vielen verschiedenen T-Zellen, die durch Selbstpeptide dieses Gewebes nicht aktiviert werden. Bei einem Rückgang der Inflammation genügten die selbstreaktiven T-Zellen deswegen wahrscheinlich nicht, um alleine eine Inflammation aufrechtzuerhalten, insbesondere, da auch die immunstimulierenden Substanzen des Fremdorganismus fehlen. Diese T-Zellen sollten dementsprechend durch aktivierungsinduziertem Zelltod in Apoptose übergehen.

Es soll noch einmal wiederholt werden, dass oben beschriebenes Konzept hypothetisch ist und mit dieser Arbeit nicht bewiesen werden kann. Eine Schwierigkeit, diese Hypothese zu belegen, ist, dass sämtliche Modelle, welche Kreuzreaktivitäten untersuchen, eine artifiziell hohe Anzahl von T-Zellen einer Spezifität aufweisen, da unter physiologischen Bedingungen die Frequenzen eines bestimmten T-Zellrezeptors exprimierender T-Zellen zu gering sind, um diese zu untersuchen.

Nach obiger Hypothese käme es mit solchen Modellen auch besonders häufig zu Autoimmunität, da die artifiziell hohe Frequenz dieser T-Zellen einer Spezifität eventuell [Seite 78↓]ausreichten, eine Inflammation aufrechtzuerhalten, was unter physiologischen Bedingungen nicht vorkäme.

5.1.4 Molekulare Mimikry – Auslöser für Autoimmunität?

Es bleibt zu diskutieren, ob molekulare Mimikry als Auslöser von Autoimmunkrankheiten in Frage kommt oder nicht.

Nach den Ergebnissen dieser und anderer Arbeiten[59,60,113,61,115,116,117] ist Kreuzreaktivität ein sehr häufig vorkommendes Ereignis. Deswegen reicht in den allermeisten Fällen Kreuzreaktivität nicht aus, um Autoimmunität auszulösen, wenn nicht noch andere Faktoren hinzukommen (siehe auch Abschnitt 5.3).

Jedoch kann nicht ausgeschlossen werden, dass nicht doch ein Fremdorganismus vorkommt, der über Kreuzreaktivität eine Autoimmunerkrankung auslösen kann. Nach der im vorigen Abschnitt vorgeschlagenen Hypothese können mit einiger Vorsicht Voraussagen getroffen werden, wie ein Organismus beschaffen sein könnte, dass die Wahrscheinlichkeit zur Induktion von Autoimmunität durch molekulares Mimikry höher ist:

Eine Möglichkeit wäre, dass der hypothetische Fremdorganismus nur sehr wenig Fremdproteine enthält. Da eine T-Zellantwort somit auf nur wenige T-Zellklone beschränkt bliebe, würde die Frequenz einer T-Zellpopulation einer Spezifität stark ansteigen. Somit wäre die Wahrscheinlichkeit, dass die expandierenden T-Zellen im gesunden Gewebe selbstständig Inflammation auslösen können, besonders hoch. Einem solchen hypothetischen Krankheitserreger entsprächen Viren am ehesten, da sie besonders wenige Proteine enthalten und bei viralen Infekten nur wenige Peptide immundominant sind.

Eine zweite Möglichkeit wäre, dass ein Fremdorganismus an sehr vielen T-Zellepitopen kreuzreaktiv zu Peptiden in einem bestimmten Organ ist. Wenn viele verschiedene T-Zellen Selbstpeptide in diesem Organ erkennten, reichten diese T-Zellen eventuell aus, um auch Inflammation in diesem Organ hervorzurufen und zu unterhalten. Ein solches Prinzip könnte sowohl in Bakterien, Parasiten oder in Viren vorkommen. Es muss jedoch betont werden, dass zu beiden Möglichkeiten noch keine detaillierten Studien unternommen wurden.

Untersuchungen, dass durch molekulare Mimikry Autoimmunität induzierbar ist, sollten dementsprechend immer sehr sorgfältig durchgeführt werden, und es sollte mehr [Seite 79↓]verlangt werden, als der ausschließliche Nachweis einer trivialen Kreuzreaktivität auf Peptid-Ebene.

Veröffentlichungen, die untersuchen, ob in einem Fremdantigen und einem Selbstantigen Kreuzreaktivität vorkommt, wenn ein epidemiologischer Zusammenhang zwischen einer bestimmten Infektion oder einem Nahrungsbestandteil und einer bestimmten Erkrankung vermutet wird, sind demnach eher kritisch zu betrachten[62,126].

5.1.5 Methoden zur Definition eines Supertops

Ein Ziel der Arbeit war, mikrobielle Peptide zu finden, welche die transgenen T-Zellen aktivieren können. Es wurde das Prinzip der Substitutionsanalyse verwendet. Diese beruht darauf, durch Veränderungen des Selbstpeptids an jeweils einer Aminosäure herauszufinden, welche Änderungen eine Aktivierung der T-Zellen hervorrufen können. Die erlaubten Aminosäuresubstitutionen wurden in einem Motiv, dem Supertop, zusammengefasst.

Eine solche Supertopanalyse hat den Vorteil, dass man eine größere Menge mikrobieller Peptide findet und somit das Ausmaß von Kreuzreaktivität nicht unterschätzt. Außerdem wird eine systematische, vorurteilsfreie Definition des Supertops vorgenommen.

In anderen Arbeiten wurde jede Position des bekannten Peptids ausschließlich gegen Alanin oder gegen bestimmte Peptide ersetzt und untersucht, welche Position somit nicht essentiell für die Aktivierung der T-Zellen sind[59,64]. Diese Methoden haben aber den Nachteil, dass es möglich ist, dass an der untersuchten Position eventuell Alanin „erlaubt“ ist, aber andere Aminosäuren an dieser Position keine Aktivierung zulassen. Umgekehrt könnte es sein, dass Alanin keine Aktivierung hervorruft, dafür aber Aminosäuren, die beispielsweise eine andere Polarität besitzen. Das entstehende Motiv wäre also ungenau.

Auf eine andere, sehr interessante Variante soll im folgenden näher eingegangen werden, da sie in gewissem Sinne komplementär zu der von uns verwendeten ist und sich beide Vorgehensweisen ergänzen:

In der von Hemmer und Martin[60] entwickelten Methode werden nicht einzelne Aminosäuren des bekannten Peptids verändert, sondern es wird genau eine Aminosäure unverändert gelassen. Alle anderen Positionen werden zufällige Aminosäuren gebunden, so dass man einen Mischung von vielen Millionen [Seite 80↓]verschiedenen Peptiden in einer Probe erhält, die sich nur an einer Position gleichen. An jeder Position wird jetzt jede natürlich vorkommende Aminosäure unverändert gelassen. Bei einer theoretischen Länge des bekannten Peptids von 10 Aminosäuren würde man also 10 Aminosäuren x 20 natürlich vorkommende Aminosäuren = 200 Proben erhalten.

Diese Proben werden in vitro zu den zu untersuchenden Zellkulturen gegeben. Die Aktivierung der Zellen wird gemessen, und es wird ermittelt, welche Aminosäure an welcher Stelle möglich ist.

Der Vorteil dieser im Vergleich zu der von uns verwendeten Methode ist, dass Aminosäuresubstitutionen an einer Position, die keine Aktivierung der T-Zellen hervorrufen, durch eine Aminosäuresubstitution an einer anderen Stelle eventuell wieder ausgeglichen werden könnten. Eine solche Möglichkeit könnte mit dem Modell von Martin herausgefunden werden, während mit unserem System eine solche Substitution ausgeschlossen werden würde.

Der Nachteil dieser Methode im Vergleich zu der unsrigen ist, dass die Peptide, die T-Zellen aktivieren können, in der entstandenen Peptidmischung in nur sehr geringen Konzentrationen vorliegen. Dadurch sind die Aktivierungen der T-Zellen sehr gering. Eventuell ist die Aktivierung so gering, dass sie nicht messbar ist und somit als negativ gewertet wird. Ein Grund für so einen Effekt könnte beispielsweise sein, dass sich bei der Synthese der Peptide bestimmte Aminosäuren besser mit dem entstehenden Peptid verbinden als andere und somit die Mischungen nicht aus wirklich zufälligen Aminosäuresubstitutionen besteht. Die Konzentration der aktivierenden Peptide könnte somit geringer sein als die der nicht aktivierenden.

Es ist außerdem nicht auszuschließen, dass antagonistische Peptide eine Aktivierung der T-Zellen durch agonistische Peptide verhindern und somit zu falsch negativen Ergebnissen führen. Antagonistische Peptide nennt man Peptide, die eine Bindung mit dem T-Zellrezeptor und dem MHC-Molekül eingehen, die T-Zelle aber nicht aktivieren oder sogar eine spätere Aktivierung der Z-Zelle verhindern, sie also anerg machen. Dies muss aber nicht unbedingt ein Nachteil sein. Solche Peptide wurden mit dieser Methode sogar gesucht, um mit diesen „Peptid-Antagonisten“ Patienten mit multipler Sklerose zu behandeln[127].

Ein Vergleich zwischen beiden Supertopanalysen wurde allerdings noch nicht unternommen, wäre aber sehr wünschenswert. Vermutlich ergänzen sich beide [Seite 81↓]Methoden, so dass eine wirklich ausführliche Untersuchung eines T-Zellrezeptors beide Analysen durchführen müsste.

Die Frage ist allerdings, ob es so wichtig ist, eine so detaillierte Untersuchung eines T-Zellrezeptors vorzunehmen. Man könnte mit keiner Methode sicher sein, dass man wirklich alle kreuzreaktiven Peptide findet. Dazu müssten alle natürlich vorkommenden Peptide an den T-Zellen getestet werden, was praktisch unmöglich ist. Außerdem muss man sich angesichts des Faktums, dass T-Zellen kreuzreaktiv für sehr viele Peptide sind fragen, ob die Kenntnis aller Peptide, die autoreaktive T-Zellen aktivieren können, nützlich wäre.

5.1.6 Diskussion des verwendeten Mausmodells

Die Besonderheit des verwendeten Modells ist, dass die verwendeten Mäuse transgen für einen T-Zellrezeptor sind, der spezifisch an das Selbstpeptid MBPAc1-11 des Myelin-basischen Proteins in Verbindung mit dem MHC-II Molekül I-Au bindet. Da außerdem die endogenen T-Zellrezeptor α-Ketten ausgeschaltet sind, werden fast ausschließlich autoreaktive T-Zellen produziert[99,13].

Werden Mäuse dieses Stamms mit MBPAc1-11 in kompletten Freunds Adjuvant und Pertussistoxin immunisiert, entwickelt sich die Autoimmunkrankheit EAE. Die alleinige Gabe von Adjuvant mit in Emulsion mit gepufferter Kochsalzlösung (PBS) plus Pertussistoxin ist nicht ausreichend, um Autoimmunität zu erzeugen[113].

Dies unterscheidet dieses Mausmodell von anderen transgenen Modellen für EAE, die spontan EAE entwickeln[105]. In einer Arbeit von Lafaille wird darauf hingewiesen, dass T-Zellen in transgenen Mäusen, die endogene β-Ketten exprimieren, dafür verantwortlich sind, dass Autoimmunität nicht spontan entsteht, denn bei Mäusen desselben Stamms, bei denen die β-Ketten ausgeschaltet sind, entsteht EAE spontan[13]. Ob diese Ergebnisse auf das von uns verwendetet Tiermodell übertragbar ist, ist allerdings nicht gezeigt, denn der genetische Hintergrund der von Lafaille verwendeten Mäuse ist ein anderer als der gemischte genetische Hintergrund der von uns verwendeten Mäuse.

Der Vorteil eines Modells, in dem die Mäuse nicht spontan krank werden, besteht darin, dass die Wirkung einzelner Substanzen auf die Induktion von EAE gezielt untersucht werden kann. Ein transgen exprimierter T-Zellrezeptor hat für unsere Untersuchungen des weiteren den Vorteil, dass die in vivo Relevanz der gefundenen Peptide ohne störenden Einfluss anderer T-Zellrezeptoren untersucht werden kann. Auf der anderen Seite muss immer bedacht werden, dass durch die hohe Frequenz von autoreaktiven T-[Seite 82↓]Zellen eventuell Regulationsmechanismen außer Kraft gesetzt werden, die unter physiologischen Bedingungen Autoimmunität verhindern. Deswegen sind die in diesen Mäusen ermittelten Befunde nicht ohne weiteres auf Organismen mit normalem T-Zellrepertoire übertragbar.

5.2 Aussagen über Bystander-Aktivierung

5.2.1 Definition der Bystander-Aktivierung

In dieser Arbeit wurde der Einfluss von LPS auf CD4-Zellen untersucht. Es wurde angenommen, dass LPS nicht direkt, sondern über „Bystander-Aktivierung“ auf CD4+-T-Zellen wirkt.

Unter Bystander-Aktivierung wird in dieser Arbeit verstanden, dass durch Substanzen (hier LPS) Zellen angeregt werden, die daraufhin Zytokine oder andere immunstimulatorische Substanzen exprimieren und synthetisieren, woraufhin andere Zellen (hier CD4+-Zellen), die ursprünglich nicht durch die Substanz stimuliert wurden, durch die Zytokine aktiviert werden. Wesentlich für die Definition von „Bystander-Aktivierung“ speziell bei T-Zellen ist, dass eine solche Aktivierung T-zellrezeptorunabhängig ist.

Als Hypothese zum Entstehen von Autoimmunität als infektionsabhängiger Mechanismus, der jedoch auch Exazerbationen durch unspezifische Erkrankungen erklären kann, wird Bystander-Aktivierung diskutiert[128,94].

Es sind bisher allerdings nur wenige Studien veröffentlicht worden, dass Bystander-Aktivierung alleine ausreicht, um eine Aktivierung auszulösen. Diese Experimente wurden auch hauptsächlich an murinen CD8+-Zellen oder an humanen CD4+-Zellen durchgeführt.

Auf der andern Seite wurden viele Daten publiziert, die zeigen, dass LPS als Adjuvant eine T-Zellantwort verstärken kann.

Auf die bekannten Befunde zu Bystander-Aktivierung soll im Folgenden näher eingegangen werden.

5.2.1.1 Untersuchungen zu Bystander-Aktivierung an murinen T-Zellen

Murine CD8+ -T-Zellen, also zytotoxische T-Zellen, die nach dem klassischen Verständnis genau wie CD4+-Zellen ausschließlich über ihren T-Zellrezeptor aktiviert [Seite 83↓]werden, können nach mehreren Untersuchungen auch über Bystander-Aktivierung stimuliert werden.

Es gab sogar eine Untersuchung, die bei einem kultivierten CD8+ -T-Zelllinie eine Subpopulation von 1-3% CD8+-T-Zellen fand, die nach LPS-Stimulation direkt, also ohne Einfluss von anderen Zelltypen, proliferierte[129]. Aufgrund der langen Kultur der Linie ist unwahrscheinlich, dass es sich bei den proliferierenden Zellen um B-Zellkontaminationen oder andere Zellen handelt. Auf der anderen Seite sind Zelllinien aufgrund der langen Zeit in Zellkultur stets sehr artifizielle Systeme. Dass also ein direkter Einfluss von LPS auf CD8+-T-Zellen auch unter physiologischen Bedingungen eine Rolle spielt, kann also durch diese Untersuchung nicht geklärt werden.

Dass murine CD8+-Zellaktivierung durch Bystander-Aktivierung in vivo eine Rolle spielt, wurde durch mehrere Arbeiten von Tough et al. gezeigt. Erstens konnte gezeigt werden, dass eine T-Zellproliferation durch Injektion mit viralen Bestandteilen (dsRNA) CD8+-T-Zellen zur Proliferation angeregt werden konnten[130]. Zur Induktion von Proliferation der CD8+-T-Zellen war eine Injektion der Mäuse mit Interferon-I ausreichend.

Außerdem wurde festgestellt, dass sich die Reaktion von Gedächtnis-T-Zellen, die nach Stimulation mit Zytokinen proliferierten, von der Reaktion von naiven CD8+-T-Zellen unterscheidet[63]. Naive CD8+-T-Zellen exprimieren nur Aktivierungsmarker nach Zytokinstimulation ohne zu proliferieren, wohingegen Gedächtniszellen auch proliferieren.

In einer weiteren Arbeit wurde außerdem gezeigt, dass auch LPS, also eine bakterielle Substanz, CD8+-T-Zellen in vivo zur Proliferation anregt[131]. In dieser Arbeit wurde auch der Einfluss von LPS auf CD4+-T-Zellen untersucht. Wie in der vorliegenden Arbeit wurde eine Aktivierung von CD4+-T-Zellen anhand von einer Expression von Aktivierungsmarkern, speziell CD69, festgestellt. Jedoch wurde eine signifikante Proliferation von CD4+-T-Zellen nicht gefunden.

Diese scheinbar konkurrierenden Ergebnisse können darauf zurückzuführen sein, dass in der Arbeit von Tough et al. die Hintergrundproliferation der CD4+-T-Zellen, bedingt durch die Nachweismethode mit BrdU in vivo, sehr hoch war (etwa 30%). Dementsprechend wurde auch eine geringe Steigerung der Proliferation der CD4+-T-Zellen gefunden, in Anbetracht der hohen Hintergrundproliferation ist diese allerdings nicht signifikant.


[Seite 84↓]

Diese Ergebnisse wurden in dem Sinne diskutiert, dass die Bystander-Aktivierung zur Homöostase der T-Zellen, also als Stimulus für eine Regeneration besonders der Gedächtniszellen, benötigt wird. In einer anderen Arbeit wurde dieser Mechanismus der Homöostase der CD8+-T-Zellen durch Bystander-Aktivierung näher untersucht, und es konnte gezeigt werden, dass IL-15 für diesen Mechanismus benötigt wird[132].

Ein Zusammenhang zwischen den CD8+-T-Zellaktivierungen und Autoimmunität wurde allerdings nicht gefunden.

5.2.1.2 Untersuchungen zu Bystander-Aktivierung an humanen CD4+-Zellen

Mehrere Untersuchungen wurden zum Einfluss von Bystander-Aktivierung bei humanen CD4+ T-Zellen durchgeführt.

Es wurden, ebenso wie bei murinen CD8+-T-Zellen, Zytokine gefunden, die ohne gleichzeitige Ligation des T-Zellrezeptors in der Lage sind, Proliferation von CD4+-T-Zellen hervorzurufen.

Zum einen wurde gezeigt, dass eine Mischung aus IL-2, TNF-α und IL-6 sowohl naive (CD45RA+) als auch voraktivierte (CD45RO+) CD4+-T-Zellen in vitro zur Proliferation anregen kann[133]. Interessanterweise blieb dabei der naive Phänotyp erhalten, so dass dies dafür spricht, dass, wenn dieser Mechanismus in vivo eine Rolle spielt, am ehesten die Homöostase der T-Zellen beeinflusst und keinen wirklichen immunstimulatorischen Effekt auf die T-Zellen ausübt.

Des weiteren konnten in einer anderen Arbeit verschiedene Zytokinkombinationen unterschiedliche Proliferationen von entweder naiven CD4+-T-Zellen oder speziellen Subpopulationen von Gedächtnis-CD4+-T-Zellen auslösen, so dass dies auch hier dafür spricht, dass Bystander-Aktivierung in vivo für eine Homöostase unterschiedlicher T-Zellpopulationen sorgen könnte[134].

Bei humanen CD4+-T-Zellen wurde außerdem gezeigt, dass LPS Proliferation hervorrufen kann[135,136]. In einer dieser Arbeiten[136] wurde die Art der T-Zellaktivierung untersucht, und im Gegensatz zu der murinen CD8+-T-Zellaktivierung scheinen nicht Zytokine, sondern direkte Zell-Zellkontakte mit Monozyten und eine Kostimulation mit B7/CD28 benötigt zu werden. Eine Ligation des T-Zellrezeptors ist aber nicht notwendig, so dass es sich auch hier um eine Form von Bystander-Aktivierung handelt.


[Seite 85↓]

Die Ergebnisse der Arbeiten über Aktivierung humaner CD4+-T-Zellen durch Bystander-Aktivierung wurden aus offensichtlichen Gründen sämtlich in vitro durchgeführt, was eine Aussage über die Konsequenz unter physiologischen Bedingungen einschränkt. Somit kann hier keine Aussage darüber getroffen werden, ob Autoimmunität durch diesen Mechanismus hervorgerufen werden kann.

5.2.1.3 Einfluss von LPS auf murine CD4+-T-Zellen – Adjuvante Wirkung

Während es nur sehr wenige Untersuchung zur Frage einer Aktivierung von CD4+-T-Zellen ausschließlich durch Bystander-Aktivierung, also ohne jegliche Ligation des T-Zellrezeptors, gibt, wurde durch viele Untersuchungen deutlich, dass zum einen T-Zellen den Effekt anderer Zelltypen auf LPS-Stimulation verstärken, und zum anderen, dass auch T-zellspezifische Funktionen durch LPS verstärkt werden können.

Dass T-Zellen die adjuvante Wirkung von LPS auf andere Zelltypen, speziell auf B-Zellen, verstärken, wurde bereits in den siebziger Jahren des 20. Jahrhunderts untersucht. Dabei wurde einmal die Antikörperproduktion nach LPS-Gabe mit oder ohne T-Zellen untersucht[137], außerdem wurden der Effekt von LPS auf B-Zellen untersucht, wenn T-Zellen von LPS-unempfindlichen Mäusen oder von LPS-empfindlichen Mäusen zugegeben wurden[138,139]. Es wurde deutlich, dass Th-Zellen von LPS-empfindlichen Mäusen benötigt werden, um eine vollständige Aktivierung von B-Zellen durch LPS zu erreichen.

Dass LPS auch CD4+-T-Zellspezifische Funktionen verstärken kann, wurde 1989 in einem Tiermodell für EAE gezeigt[140]. Lewis-Ratten wurden entweder Milzzellen transferiert, die zuvor mit Antigen oder mit LPS plus Antigen kultiviert wurden. Dabei konnte LPS die Inzidenz und den Schweregrad der EAE erheblich (um das 5-fache) verstärken.

In vitro wurde außerdem festgestellt, dass die Zugabe von LPS CD4+- T-Zellproliferation schon bei Antigenkonzentrationen hervorruft, die nicht ausreichen, um CD4+-T-Zellen ohne LPS zur Proliferation anzuregen[141].

T-Zellen verstärken also den LPS-Effekt auf andere Zellen, also beispielsweise die Antikörperproduktion durch B-Zellen, LPS wirkt aber auch als Adjuvant für T-Zellen.


[Seite 86↓]

5.2.2  Bystander-Aktivierung als Auslöser CD4+-T-Zellvermittelter Autoimmunität

Während es wenig Daten zu in vitro-Effekten von Bystander-Aktivierung auf murine CD4+-T-Zellen gibt, gibt es zwei Arbeiten, die in vivo-Effekte auf CD4+-T-zellinduzierte Autoimmunität untersuchen.

In einer Arbeit wurde die Ursache einer Diabetes mellitus-Induktion durch Coxsackie B4-Virus Infektion in verschiedenen Mausstämmen untersucht. Dabei war die Diabetes-Induktion nicht an bestimmte MHC-Moleküle verknüpft, von denen bekannt ist, dass durch sie kreuzreaktive Peptide zwischen dem Virus und den pankreatischen Inseln präsentiert werden, sondern an selbstreagierenden T-Zellen, die nicht mit dem Virus kreuzreagieren[142]. Da sich das Virus im Pankreas repliziert und in jedem Mausstamm eine Pankreatitis aufgrund der provozierten Immunantwort hervorruft, wird geschlussfolgert, dass nicht die molekulare Mimikry, sondern das Freisetzen von Antigenen durch die Immunreaktion und die anschließende Aktivierung der autoreaktiven T-Zellen für das Auslösen von autoimmunem Diabetes mellitus verantwortlich ist.

Zu dieser Arbeit ist zu sagen, dass zwar die T-zellvermittelte Autoimmunität durch die Aktivierung hervorgerufen wird, die Autoimmunität hervorrufenden T-Zellen jedoch direkt über ihren T-Zellrezeptor aktiviert werden. Demnach handelt es sich nicht um „Bystander-Aktivierung“ im engeren Sinne, sondern eher um T-Zellaktivierung durch Zusammenbruch immunologischer Schranken („Bystander Damage“).

In einer zweiten Untersuchung wurde stromale Keratitis durch Herpesviren ausgelöst. Allerdings wird diese Form der stromalen Keratitis durch T-Zellen induziert, auch wenn sie nicht responsibel gegen Herpesviren sind[143]. Die verwendeten Mäuse sind auf einem SCID-Hintergrund transgen für einen OVA-Peptid-spezifischen T-Zellrezeptor. Die T-Zellen dieser Mäuse konnten nicht durch Antigene von Herpesviren aktiviert werden. Eine Inokkulation von Viren in die Augen der Mäuse löste stromale Keratitis aus, solange die Viren sich replizierten (Inaktivierung der Viren durch Aciclovir verhinderte die stromale Keratitis). SCID-Mäuse, die keinerlei T-Zellen besitzen, entwickeln nach Inokkulation keinerlei Keratitis, womit gezeigt ist, dass es sich um eine T-zellabhängige Erkrankung handelt. Ein Transfer von T-Zellen in SCID-Mäuse führte zur Entwicklung von stromaler Keratitis, wenn die T-Zellen vorher durch OVA-Peptid aktiviert wurden.

Als weiteren Hinweis, dass es sich um Bystander-Aktivierung von T-Zellen handelt, wurde gezeigt, dass Cyclosporin A, einem Pharmakon, das die Expression [Seite 87↓]insbesondere die Freisetzung von Interleukin 2 und damit eine T-Zellrezeptor-induzierte Aktivierung der CD4+-T-Zellen hemmt, die Induktion der stromalen Keratitis nicht beeinflussen konnte, aber die Keratitis konnte durch Rapamycin therapiert werden, einem Pharmakon, welches unter anderem die Interaktion von T-Zellen mit multiplen Zytokinen hemmt.

Nach diesen Daten wird die Erkrankung durch T-Zellen induziert. Jedoch werden die T-Zellen nicht über ihren T-Zellrezeptor, sondern wahrscheinlich über Zytokine aktiviert. Es handelt sich also um Autoimmunität durch Bystander-Aktivierung.

Ein Unterschied zu der in der vorliegenden Arbeit vorgeschlagenen Definition zur Hypothese der „Bystander-Aktivierung“ ist, dass eine Autoreaktivität der T-Zellen offensichtlich nicht benötigt wird, es reicht, wenn T-Zellen beliebiger Spezifität die Inflammation unterhalten. Was in diesem Falle die Wirkungsweise der T-Zellen ist, ist allerdings noch nicht untersucht.

Diese zwei Beispiele, die meiner Kenntnis nach die einzigen Beispiele sind, in denen eine Induktion von Autoimmunität durch „Bystander-Aktivierung“ gezeigt wurde, machen zum einen deutlich, dass der Begriff „Bystander-Aktivierung“ sehr unterschiedlich definiert wird. Jedoch macht auch besonders das zweite Beispiel deutlich, dass es Indizien für ein tatsächliches Vorkommen von solcherart ausgelöster Autoimmunität gibt, auch wenn es selbstverständlich fraglich ist, inwieweit „Bystander-Aktivierung“ als Ursache von Autoimmunität unter physiologischen Bedingungen eine Rolle spielt (siehe Abschnitt 5.3).

5.2.3 Bystander-Aktivierung – Ergebnisse dieser Arbeit

In dieser Arbeit wurde Bystander-Aktivierung an murinen CD4+-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo untersucht. Im folgenden wird auf die Ergebnisse eingegangen.

5.2.3.1 In vitro Effekte der Lysate und LPS

Proliferation durch LPS und bakteriellen Lysaten

Ein wesentlicher Marker immunologischer Aktivierung ist die Messung der Proliferation der aktivierten Zellen. Wichtig war nun, zu untersuchen, wie stark CD4+ T-Zellen auf Stimulation mit LPS reagieren. Bisher wurden nur Ergebnisse publiziert, die bei murinen CD4+ T-Zellen eine LPS-Stimulation durch induzieren von kostimulierenden Molekülen [Seite 88↓]als verstärkend einer Th-Zellantwort beschrieben. Diese Stimulation war aber nicht hinreichend, um eine Proliferation der Th-Zellen auszulösen.

Zur Untersuchung dieser Frage wurden CD4+-T-Zellen mit 5(6)-Carboxyfluorescein-diazetatsuccinimidylester(CFSE)[108] gefärbt. und durchflusszytometrisch untersucht.

Wir beobachteten eine Proliferation von etwa einem Prozent Th-Zellen auf LPS. Die Problematik der experimentellen Auswertung soll der Übersichtlichkeit halber weiter unten diskutiert werden.

Falls nur ein Prozent der Th-Zellen auf LPS proliferiert, stellt sich die Frage, ob dies eine physiologische Relevanz besitzen könne. Da unter physiologischen Bedingungen nur ein Bruchteil der T-Zellen ein spezielles Antigen erkennt und eine suffiziente Immunantwort hervorruft, sollte bei den von uns verwendeten transgenen Mäusen eine Aktivierung von einem Prozent der T-Zellen einer sehr starken Immunreaktion eines physiologischen T-Zellsystems entsprechen. Somit ist unter diesen Bedingungen auch plausibel, dass es zu einer Reaktion gegen das ZNS kommt, da sämtliche T-Zellen, die aktiviert wurden, auch gegen das Autoantigen MBP reagieren.

Unter physiologischen Bedingungen könnte aber aus demselben Grund Autoimmunität durch LPS unwahrscheinlich sein: Da die T-Zellaktivierung antigenunabhängig ist und somit T-Zellen unterschiedlicher Spezifität betrifft, sind die Frequenzen der T-Zellen einer Spezifität für die Induktion einer Autoimmunität eventuell zu gering.

Hypothetisch könnte es aber sein, dass unter Bedingungen, bei denen die Frequenzen spezifischer T-Zellen bereits hoch sind (z.B. bestehende Autoimmunität oder chronisch bzw. rezidivierender Infektion) diese T-Zellen durch LPS aktiviert werden.

Im negativen Fall (d.h. einer bereits bestehenden Autoimmunität) würde dies einen akuten Schub der Erkrankung bedeuten, wie dies zum Beispiel bei Patienten mit Multipler Sklerose beobachtet wird, wenn sie einen Schub nach einem Infekt erleiden.

Im positiven Fall (d.h. einer chronischen oder rezidivierender Infektionen) könnte dieser Mechanismus aber eventuell bewirken, dass T-Zellen bei erneutem Befall oder Exazerbation einer bestehenden Infektion antigenunabhängig aktiviert werden und schneller reagieren, da der Vorgang der Antigenprozessierung und –präsentation nicht benötigt wird.

Probleme der Auswertung dieser Experimente

Wie in Abschnitt 4.5.2.1 gezeigt, proliferieren etwas mehr CD4+ T-Zellen nach Zugabe von LPS oder Lysaten von Salmonella typhimurium zu Milzzellkulturen als nach Zugabe von PBS. Auch wenn es sich nur um einen Unterschied von etwa einem Prozent [Seite 89↓]handelt, ist dieses Ergebnis rein statistisch gesehen signifikant und war reproduzierbar (zur statistischen Auswertung siehe 4.5.2.1).

Die statistische Signifikanz ist bei einer durchflusszytometrischen Analyse allerdings gut zu erreichen, da es sich stets um sehr viele Ereignisse handelt, die untersucht werden. So wurden bei standardmäßigen durchflusszytometrischenAnalyse zur Untersuchung solch geringer Unterschiede in der Proliferation bis zu 1 Million Zellen aufgenommen. Die Standardabweichung bei zweimaliger Messung einer Probe oder Durchführung mehrerer Proben einer Substanz unterscheiden sich erfahrungsgemäß nur sehr gering voneinander, so dass selbst geringe Unterschiede der Proliferation statistisch signifikant sind.

Auch das Durchführen mehrerer Experimente bestätigten diese Unterschiede in der Größenordnung von einem Prozent, so dass auch hier eine statistische Signifikanz gezeigt werden konnte.

Während die statistische Signifikanz also besteht, ist die sehr viel wichtigere Frage, ob ein systematischer Fehler in diesen Messungen vorkommt.

Ein großes Problem ist das Ausschließen von unspezifischen Bindungen. Da sehr viele B-Zellen und Makrophagen nach Zugabe von LPS proliferieren, würde selbst eine geringe unspezifische Bindung von CD4-Antikörper zu einer messbaren Proliferation von Zellen kommen, die nicht CD4-Zellen sind, aber als CD4-Zellen angefärbt wurden. Diese würden in der Auswertung eine geringe Proliferation von CD4-Zellen vortäuschen, die nicht vorhanden ist.

Um unspezifische Bindungen zu verhindern, wurden alle Proben für durchflusszytometrischeAnalysen mit anti-Fcγ-Rezeptor und Ratten IgG geblockt. Allerdings ist durch einen solchen Block nicht auszuschließen, dass es trotzdem zu unspezifischen Bindungen kommt.

Es wurde versucht, dieses Problem zu eliminieren, indem einmal positiv auf CD4 gefärbt und andererseits negativ auf B220 oder ähnlicher Oberflächenmoleküle gefärbt wurde. B220 gefärbte Zellen wurden nicht mitbeurteilt, so dass Zellen, die unspezifisch Antikörper binden, CD4 und B220 positiv wären und nicht in die Auswertung einflössen.

Aufgrund dieser Maßnahmen ist unwahrscheinlich, dass es sich bei den vorliegenden Ergebnissen bezüglich der CD4-Proliferation auf LPS nur um ein Artefakt handelt. Außerdem wurde im Folgenden nach anderen Markern für die Th-Zellaktivierung nach LPS-Stimulation gesucht.


[Seite 90↓]

Ein anderes Problem ist, dass CD4 nicht ausschließlich auf Th-Zellen vorkommt, sondern beispielsweise auch auf dendritischen Zellen, die auf LPS reagieren. Um auszuschließen, dass es sich bei den beobachteten Zellen um solche Zellen handelt, führten wir verschiedene Kontrollfärbungen durch, die unser Ergebnis, dass Th-Zellen auf LPS reagieren, bestätigten. Diese Kontrollfärbungen bestanden in der Doppelfärbung CD3 und CD4, in der Färbung der β-Kette des transgenen T-Zellrezeptors mit einem Antikörper gegen Vβ8 zusammen mit CD4 und schließlich in der Färbung eines klonotypischen Antikörpers gegen den transgenen T-Zellrezeptors und CD4. Diese Färbungen schließen mit großer Sicherheit aus, dass es sich um andere, spezifisch angefärbte Zelltypen handelt.

5.2.3.2 Beeinflussung von Oberflächenmolekülen

Zur Untersuchung der Frage, ob LPS noch andere Effekte auf Th-Zellen bewirkt, und da die Fraktion an Zellen, die proliferieren, sehr klein ist, war es sehr wichtig, andere Aktivierungsmarker zu untersuchen.

Wir untersuchten die Expression des Aktivierungsmarkers CD25 (die α-Kette des IL-2 Rezeptors) und CD62L (L-Selektin). CD25 wird von aktivierten T-Zellen exprimiert, wohingegen CD62L von naiven T-Zellen besonders stark exprimiert wird und aktivierte Zellen diesen Marker nur sehr wenig exprimieren. Da beide Marker bei Aktivierung entgegengesetzt reagieren, kann man auch den Einfluss von unspezifischen Bindungen begrenzen, wenn man den Anteil an Zellen untersucht, bei denen CD25 vermehrt und CD62L vermindert exprimiert werden. Bei unspezifischen Bindungen von Antikörper würde man vermuten, dass sowohl CD25 als auch CD62L verstärkt exprimiert werden, da beide Antikörper gebunden werden sollten.

Bei den Untersuchungen dieser Aktivierungsmarker wurde klar, dass sehr viel mehr T-Zellen ihr Profil der Aktivierungsmarker ändern als proliferieren. Es ist bekannt, dass T-Zellen empfindlicher mit Änderungen der Aktivierungsmarker als mit Zytokinproduktion oder Proliferation reagieren[123]. Bei unseren Experimenten zeigt sich, dass durch LPS sehr viele Th-Zellen (etwa 90%) ihren naiven (CD62LhiCD25-) Phänotyp verlieren, aber von diesen Th-Zellen nur sehr wenig proliferieren. Es scheint also, dass LPS für die meisten Th-Zellen ein eher schwacher Induktor für Aktivierung ist. Auf der anderen Seite sind noch zu wenig Untersuchungen gemacht worden, um zu beurteilen, ob sich [Seite 91↓]die durch LPS aktivierten Th-Zellen von durch schwache antigenspezifische Stimuli aktivierten Th-Zellen phänotypisch unterscheiden.

Insbesondere CD62L als besonders empfindlich reagierender Marker zeigte eine starke Änderung auf LPS-Gabe. Bei der Negativkontrolle waren in dem gezeigten Experiment 54% der T-Zellen CD62L-positiv, wohingegen nur 5,4% der T-Zellen positiv waren, wenn sie mit LPS stimuliert wurden. Dieses repräsentative und reproduzierbare Ergebnis macht deutlich, dass es zu einer Aktivierung von T-Zellen kommt, denn ein so deutliches Ergebnis lässt sich durch eine unspezifische Bindung von Antikörpern nicht erklären.

Die Hochregulierung von CD25 war wiederum nicht sehr ausgeprägt, aber dennoch deutlicher als die Proliferation von T-Zellen auf LPS-Stimulation. Von den „naiven“ T-Zellen nach PBS-Stimulation exprimierten 5% CD25 auf ihrer Oberfläche. Nach LPS-Gabe erhöhte sich dieser Anteil auf 7,5%. Auch dies zeigt, dass die Aktivierung von T-Zellen durch LPS wie ein schwacher antigenspezifischer Stimulus wirkt.

5.2.4 Ergebnisse von Bystander-Aktivierung in vivo

5.2.4.1 Induktion von EAE durch Lysate und LPS

Die Untersuchung der Proliferation und der Oberflächenmoleküle in vitro ergaben eine schwache Aktivierung von CD4+ T-Zellen. In unserem Modell war es möglich, die Relevanz dieser Aktivierung auch in vivo zu untersuchen. Dazu wurden die T+α- -Mäuse mit LPS oder bakteriellen Lysaten subkutan immunisiert. Wie auf Seite 68 gezeigt, entwickelten die Mäuse Lähmungen, die etwas schwächer ausgeprägt waren als Lähmungen nach MBP-Peptid Applikation. Die induzierte EAE unterschied sich aber signifikant von der Negativkontrolle mit PBS.

Somit ist LPS in der Lage, in den von uns verwendeten transgenen Mäusen, wo annähernd alle T-Zellen einen T-Zellrezeptor exprimieren, EAE zu induzieren. Die Frage, in wieweit dies tatsächlich durch „Bystander-Aktivierung“ oder andere Mechanismen geschieht, wird weiter unten diskutiert.

5.2.4.2 Hypothesen zum Entstehen der Autoimmunität durch LPS

Wie auf Seite 25 beschrieben, wird den CD4+-T-Zellen eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese von EAE zugeschrieben. In Zusammenhang mit den in vitro Versuchen, die weiter oben in dieser Arbeit besprochen wurden, ist es also möglich, dass durch das [Seite 92↓]LPS die Zellen der angeborenen Immunität und die B-Zellen proliferieren, Zytokine produzieren und diese die T-Zellen antigenunabhängig aktivieren.

In unserem Modell mit sehr hohen Frequenzen von autoreaktiven T-Zellen käme es dann zu einer antigenunabhängigen Aktivierung dieser autoreaktiven Zellen, die nun als aktivierte Zellen in das ZNS gelangen und EAE auslösen. Ein solcher Mechanismus ist auf Seite 20 als „Bystander-Aktivierung“ diskutiert worden. Das Interessante an einem solchen Mechanismus wäre, dass Bakterien, ohne dass sie Peptidhomologien oder Peptidähnlichkeiten mit körpereigenen Proteinen besitzen, Autoimmunität über T-Zellen hervorrufen könnten, wenn die T-Zellen autoreaktiv sind.

Epidemiologisch gibt es auf der anderen Seite Belege, dass Schübe von Multipler Sklerose gehäuft nach Infektionen auftreten[144,145]. Dabei ist aber kein Beleg gefunden worden, der die Induktion von Schüben auf einen bestimmten Erreger zurückführen kann. Somit ist es wahrscheinlich, dass ein antigenunabhängiger Stimulus für diese Exazerbation der Multiplen Sklerose verantwortlich ist. Ein solcher antigenunabhängiger Stimulus wäre die Aktivierung von Th-Zellen durch LPS oder andere unspezifische Aktivatoren des Immunsystems.

Allerdings muss auch in Betracht gezogen werden, dass die in dieser Arbeit gezeigten Daten diese Hypothese nicht vollständig belegen können.

Aufgrund unserer Daten ist nicht auszuschließen, dass andere Zellen des Immunsystems nach Applikation von LPS ins ZNS wandern, oder dass das LPS selbst über die Blutbahn zum ZNS gelangt und es hier durch den einen oder den anderen Mechanismus zu einer geringgradigen Inflammation im ZNS kommt. Für einen Effekt auf die Blut-Hirn-Schranke durch LPS auch nach subkutaner Applikation von LPS gibt es Hinweise von anderen Gruppen, wobei sich die Auswirkungen von LPS bei unterschiedlichen Mausstämmen stark unterscheiden[146,147,148]. Eine solche Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke könnte zu Migration von Th-Zellen in das ZNS und zu Freisetzung von MBP führen, so dass es zu einer Aktivierung der Th-Zellen und letztendlich EAE entsteht.

Die abschließende Klärung dieser Frage könnte über ein Modell geklärt werden, bei dem durch LPS stimulierte und anschließend gereinigte CD4+-T-Zellen passive EAE hervorgerufen wird. Dieses Modell konnte allerdings in unserem System nicht etabliert werden.


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5.3  Ausblick: Autoimmunität durch Bakterien

Abschließend bleibt zu diskutieren, inwieweit die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse auch unter physiologischen Bedingungen eine Rolle spielen, ob also durch „Kreuzreaktivität“ oder „Bystander-Aktivierung“ tatsächlich Autoimmunität ausgelöst werden kann.

In Anbetracht der Ergebnisse dieser und anderer Arbeiten[59,60,113,61,115,116,117] ist anzunehmen, dass Kreuzreaktivität tatsächlich ein sehr häufig vorkommendes Phänomen ist. In dieser Arbeit wurden kreuzreaktive Peptide systematisch gesucht, ohne dass speziell nach Bakterien gesucht wurde, die eventuell mit MS in Zusammenhang stehen. Auf diese Weise wurden auch mikrobielle Peptide identifiziert, die in ubiquität vorkommenden Bakterien synthetisiert werden. Somit halten wir es für eher unwahrscheinlich, dass „Kreuzreaktivität“ ein alleiniger Grund beim Entstehen von Autoimmunität ist. Unter diesem Aspekt sind viele Arbeiten zu sehen, die Zusammenhänge zwischen speziellen Bakterien und Autoimmunkrankheiten postulieren: Die meisten dieser Arbeiten suchen gezielt nach Peptiden in einem bestimmten Bakterien und einem bestimmten Organ, die kreuzreaktiv T-Zellklone aktivieren können. Allerdings ist nach unseren Ergebnissen davon auszugehen, dass es nicht sehr unwahrscheinlich ist, eine solche Kreuzreaktivität zu finden, da ein solcher Befund nicht sehr spezifisch ist.

Demgegenüber steht die Frage, ob die gefundenen Peptide auch tatsächlich in vivo aus den Proteinen prozessiert werden, oder ob die Ursprungsproteine in einer Konzentration vorkommen, die ausreichend ist, um eine immunologische Reaktion hervorzurufen. Sicherlich kommen sehr viele der gefundenen Peptide in vivo aus diesem Grunde nicht vor. Wie bereits auf Seite 72 beschrieben, gibt es für ein anderes Modell[61] zumindest ein Beispiel, das zweifelsfrei zeigt, dass ein bakterielles, immunodominantes T-Zellepitop von Borrelia burgdorferi mit einem humanem immunodominanten Epitop des Proinsulins kreuzreagiert. Jedoch ist keinerlei Assoziation zwischen einer Borrelieninfektion und Diabetes mellitus Typ 1 beschrieben. Auch ist zu bedenken, dass in allen Untersuchungen die Menge von kreuzreagierenden Peptiden unterschätzt wird, und es sehr viele verschiedene T-Zellrezeptoren unter physiologischen Bedingungen gibt. Es ist meines Erachtens also wahrscheinlich, dass von den kreuzreaktiven Peptiden einige prozessiert werden.


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Abbildung 16 : Hypothetische Induktion von Autoimmunität durch Molekulare Mimikry und Bystander-Aktivierung. Obwohl auch im gesunden Individuum autoreaktive T-Zellen vorhanden sind, ist deren Frequenz normalerweise zu gering, um eine klinisch manifeste Autoimmunität hervorzurufen. Bei Infektion mit Bakterien, die kreuzreaktive Peptide enthalten, könnten diese T-Zellen proliferieren. Bei rezidivierender oder chronischer Infektion würde deren Frequenz im Gesamtrepertoire besonders zunehmen. Ab einer bestimmten Frequenz würde dann ein Reiz wie eine unspezifische Aktivierung durch Bystander-Aktivierung ausreichen, um Autoimmunität auszulösen. Kreuzreaktive Peptide in den Bakterien wären nicht mehr nötig, um Exazerbationen hervorzurufen. In einem solchen Modell würde eine Behandlung von spezifischen Infektionen bei bereits bestehender Autoimmunität keine wesentliche Wirkung erzielen. Es käme auf unspezifische Infektionsverhütung an, wie dies auch klinisch beschrieben ist. Nach diesem Modell kämen auch Assoziationen zwischen bestimmten Infektionen und Autoimmunität vor, in diesen Krankheitserregern kämen kreuzreaktive Peptide vor. Da es allerdings nach unseren Befunden viele Infektionserreger mit kreuzreaktiven Peptiden geben sollte, würden Assoziationen nicht nur zwischen einer Infektion und einer Autoimmunkrankheit gefunden werden, sondern mehrere Infektionen könnten zu dem Entstehen von Autoimmunität beitragen. Auch dies wird klinisch gefunden.

Eine weitere Frage ist, ob die T-Zellen, wenn sie von Bakterien aktiviert wurden und mit einem bestimmten Selbstpeptid kreuzreagieren, noch in einer Frequenz vorkommen, die ausreicht, um Autoimmunität hervorzurufen. Es könnte zum Beispiel sein, dass bei einem Erkennen von Infektionserregern durch sehr viele T-Zellen verschiedener Spezifität jede individuelle T-Zelle mit einem Selbstpeptid kreuzreagiert. Wenn aber jede T-Zelle ein anderes Selbstpeptid erkennt, würden die für eine suffiziente Immunantwort ausreichende Frequenzen an aktivierten T-Zellen nur an dem Infektionserreger, nicht aber an den im ganzen Körper verteilten Selbstpeptiden erreicht.

Des weiteren untersuchten wir die Hypothese der „Bystander-Aktivierung“. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass es sowohl in vitro als auch in vivo zu „Bystander-[Seite 95↓]Aktivierung“ von T-Zellen kommen kann. Allerdings gilt auch hier: Wenn LPS alleine Autoimmunität auslösen könnte, wenn autoreaktive T-Zellen vorhanden sind, wären autoimmune Erkrankungen sehr viel häufiger. Wie bereits erwähnt, werden auch in gesunden Individuen autoreaktive T-Zellen gefunden, und LPS ist eine Substanz, die ubiquitär vorkommt. Als alleiniger Auslöser sollte somit auch der Mechanismus der „Bystander-Aktivierung“ nicht in Betracht kommen.

Allerdings ist bekannt, dass Schübe von autoimmunen Erkrankungen ausgelöst werden können, wenn es zu einer Infektion kommt[149]. Bei diesen Prozessen, wenn sich also eine Autoimmunität gerade bildet oder bereits gebildet hat, autoreaktive T-Zellen also in hoher Konzentration im Blut vorhanden sind, dann können diese T-Zellen eventuell über einen der diskutierten Mechanismen aktiviert werden und eine Verstärkung der Erkrankung bewirken.

Ein hypothetischer Mechanismus, wie Autoimmunität dennoch durch beide Mechanismen unter physiologischen Bedingungen ausgelöst werden könnte, wird in Abbildung 16 dargestellt. Bei chronischer oder repetetiver Infektion mit einem Erreger könnte es zur Akkumulation von T-Zellen einer Spezifität und somit einer Kreuzreaktivität kommen. Werden diese T-Zellen jetzt aktiviert, beispielsweise durch „Bystander-Aktivierung“, könnte Autoimmunität ausgelöst werden. Aufgrund der Tatsache, dass innerhalb des Verständnisses des Immunsystems der Spezifität der T-Zellen eine sehr große Rolle zukommt, wäre es sehr interessant, zu untersuchen, inwieweit es verhindert wird, dass es unter physiologischen Bedingungen nicht zu Autoimmunität kommt, obwohl, wie diskutiert, der T-Zellrezeptor flexibler ist als bisher gedacht und obwohl T-Zellen eventuell auch unspezifisch aktiviert werden können. Eine interessante, wenn auch spekulative, Diskussion wurde darüber von Mason geführt[125] (siehe auch Seite 75). Allerdings ist eine Beantwortung dieser Fragen derzeit nicht möglich, auch wenn einer solchen bei dem Verständnis des Funktionierens des physiologischen Abwehrprozesses von Fremdorganismen in meinen Augen eine sehr große Rolle zukäme.


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05.01.2005