In der Arbeit wurde die Rolle von Bakterien für das Entstehen von Autoimmunität untersucht. Insbesondere wurde untersucht, inwieweit Bakterien entweder spezifisch (über „Kreuzreaktivität“) oder antigenunabhängig (über „Bystander-Aktivierung“) eine Aktivierung von autoreaktiven CD4+- T-Zellen induzieren können.
Es konnte gezeigt werden, dass es bei dem untersuchten, MBP-spezifischen T-Zellrezeptor multiple, natürlich vorkommende, kreuzreaktive Peptide mikrobiellen Ursprungs gibt, die eine Aktivierung der T-Zellen hervorrufen und in vivo experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) induzieren können.
Weiterhin wurde untersucht, inwieweit Lipopolysaccharid (LPS) als unspezifischer Aktivator des Immunsystems eine Aktivierung der autoreaktiven T-Zellen in vitro hervorrufen kann und inwieweit in vivo EAE durch LPS hervorgerufen werden kann.
Es wurde gezeigt, dass LPS in vitro einen kleinen Anteilder CD4+ - T-Zellen aktiviert.
Wurden den transgenen T+α- -Mäusen LPS appliziert, erkrankten diese an EAE.
Somit gibt es sowohl in vitro als auch in vivo in den T+α- -Mäusen Hinweise für eine Relevanz von „Bystander-Aktivierung“.
Abschließend wurde diskutiert, inwieweit entweder „Kreuzreaktivität“ oder „Bystander-Aktivierung“ als Auslöser für Autoimmunität unter physiologischen Bedingungen in Frage kommt. Aufgrund der in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse wurde postuliert, dass keine der beiden Mechanismen alleiniger Auslöser sei, da es aufgrund der Häufigkeit von Infektionen, kreuzreaktiven Peptiden und des Vorkommens von autoreaktiven T-Zellen auch in gesunden Individuen ansonsten sehr viel häufiger zu Autoimmunität kommen müsste.
Unter bestimmten Bedingungen könnte die Aktivierung von T-Zellen über Kreuzreaktivität oder über „Bystander-Aktivierung“ Autoimmunität auslösen oder verstärken, wenn bereits andere Mechanismen des Immubnsystems, die Autoimmunität verhindern, versagt haben.
In this thesis the role of bacteria for the induction of autoimmunity was investigated.
In detail, it was examined if bacteria activate autoreactive CD4+-T-cells antigen-specific („cross-reactivity“) or antigen-unspecific („bystander-activation“).
It was shown that the examined transgenic MBP-peptide specific T-cell-receptor recognized many natural occurring cross-reactive peptides of microbial origin, which induced an activation of the T-cells in vitro and which could induce autoimmune encephalomyelitis (EAE) in the T-cell-receptor transgenic mice in vivo.
Furthermore, it was examined, whether lipopolysaccharide (LPS) as activator of the innate immune system could induce an unspecific activation of the autoreactive T-cells in vitro and whether administration of LPS in the transgenic mice could induce EAE in vivo.
It was shown that LPS activates a small percentage of CD4+ - T-cells.
Application of LPS to the transgenic T+alpha- mice induced EAE.
Therefore, the role of bystander-activation was indicated in vitro and in vivo.
Finally, it was discussed, whether either cross-reactivity or bystander-activation could be sufficient for inducing autoimmunity under physiologic conditions.
Due to the results presented in this work, it is postulated that none of the both mechanisms could be inductor of autoimmunity alone. If one of these mechanisms was sufficient, autoimmunity in humans should be a frequent event, because infections and autoreactive T cells are both findings which occur in healthy humans very often.
However, under certain conditions either cross-reactivity or bystander-activation could trigger or exacerbate autoimmunity, when other mechanisms which inhibit autoimmunity have failed.
Jeder Organismus befindet sich in einer ständigen Auseinandersetzung mit seiner Umwelt. Insbesondere Parasiten, Bakterien und Viren, welche die körperliche Integrität des Organismus stören, stellen eine große Bedrohung dar. Im Verlauf der Evolution hat sich ein System von hochspezialisierten Zellen gebildet, das imstande ist, Mikroorganismen innerhalb des Körpers zu erkennen, zu bekämpfen und abzutöten. Dieses System wird Immunsystem genannt.
Wesentlich für dieses Immunsystem ist die Unterscheidung von lebensnotwendigem „Selbst“ und potentiell schädlichem „Fremd“. Diese Unterscheidung wird von dem Immunsystem meist effizient bewerkstelligt.
Bei einigen Individuen missdeutet das Immunsystem jedoch körpereigene Strukturen als fremd. Dieses Ereignis, bei welchem gesundes, unter Umständen lebensnotwendiges Gewebe zerstört wird, wird „Autoimmunität“ genannt.
Krankheiten wie zum Beispiel Diabetes mellitus Typ 1, rheumatoide Arthritis oder multiple Sklerose (MS) werden zu dem Formenkreis der Autoimmunkrankheiten gezählt. Jedoch sind die Gründe für das Entstehen von Autoimmunität größtenteils noch unbekannt.
Da beobachtet wurde, dass Infektionen dem Auftreten der Autoimmunität häufig vorangehen, wird ein Zusammenhang zwischen beiden Ereignissen vermutet. Andererseits werden in von autoimmunen Prozessen geschädigtem Gewebe meist keine Erreger gefunden. Deswegen wird angenommen,dass die Infektion das Immunsystem fehlleitet. Es gibt, neben anderen, zwei Hypothesen, die den Wirkmechanismus einer solchen Fehlleitung zu erklären versuchen: Zum einen die Hypothese der „molekularen Mimikry“, die besagt, dass bestimmte Infektionserreger körpereigenen Strukturen ähnlich sehen und so das Immunsystem fehlleiten. Zum zweiten die Hypothese der „Bystander-Aktivierung“. Diese besagt, dass autoreaktive T-Zellen T-zellrezeptorunabhängig stimuliert werden können, wenn andere Zellen sie durch Zytokine aktivieren, die bei einer Infektion freiwerden.
Das Ziel dieser Studie ist die Untersuchung dieser Hypothesen.
Die Erforschung des Immunsystems begann mit der Erkenntnis, dass nach Überleben gewisser Krankheiten ein lebenslanger Schutz vor diesen Krankheiten besteht. Diese Erkenntnis nutzte Jenner 1796 zur Entwicklung der Pockenvakzinierung. Nach der Entdeckung und Erforschung der Pathogenität der Bakterien durch Robert Koch im Jahre 1876 am Beispiel des Milzbrandes gelang es Pasteur, eine zweite Impfung gegen die von Viren übertragende Tollwut zu entwickeln. Obwohl diese mit den im Folgenden entwickelten Impfungen große Erfolge beim Induzieren einer spezifischen Immunantwort darstellten, geschah dies ohne genaues Verständnis des Immunsystems.
Interessanterweise kam es schon bei der von Pasteur entwickelten Vakzinierung gegen Tollwut zu den Impfzwischenfällen, aus denen schließlich das Modell entwickelt wurde, auf dem diese Arbeit beruht[1].
Die Frage war, ob das Erkennen von körperfremden Substanzen angeboren sei, oder ob es sich im Laufe einer Immunreaktion erst entwickelt. Das System, welches „anpassungsfähige“ Immunantworten hervorruft, wurde in dem Begriff „adaptive Immunität“ im Gegensatz zur „angeborenen Immunität“ zusammengefasst. Man erkannte, dass der Grund bei der Entwicklung von Immunität nicht allein in dem Vorhandensein einer ererbten „Kenntnis“ aller pathogenen Organismen liegen kann, sondern dass es ein flexibles und wandelbares System geben muss, da unzählige Krankheitserreger vorkommen, gegen die sich Immunität entwickeln kann, und da industrielle Substanzen, die wahrscheinlich im Verlauf der Evolution noch nie eine wesentliche Rolle spielten, wie p-Phenylendiamin oder Nickelsulfat, trotzdem eine starke Immunantwort hervorrufen können.
Besonders zwei Hypothesen zur adaptiven Immunität wurden diskutiert: Die erste wurde personifiziert durch Emil von Behring und Shibasabaro Kitasato, die zeigen konnten, dass man einen Schutz vor Krankheiten durch das Übertragen von Blutserum von einem Individuum auf ein anderes übertragen kann. Nach diesen Befunden sollten lösliche Substanzen in Blut und anderen Körperflüssigkeiten, sogenannte Antikörper, für den Schutz gegen Fremdorganismen verantwortlich sei (sogenannte „humorale Immunität“)[2]. Die Erkenntnisse, die man bei der Untersuchung dieses Phänomens gewann, konnten bei der Entwicklung von passiven Immunisierungen durch körperfremdes Serum weiterentwickelt werden.
1903 wurde schließlich von Almroth Wright die Verbindung beider Systeme durch Entdeckung der Phagozytose anregende („opsonierende“) Wirkung von Antikörpern vorgenommen[4]. Dennoch wird aus systematischen Gründe die Einteilung beibehalten.
Die Prinzipien der humoralen und der zellulären Immunität kommen sowohl in der angeborenen wie auch in der adaptiven Immunität vor: Zur angeborenen, humoralen Immunität werden beispielsweise die im Serum gelösten Komplementfaktoren gezählt, die in der Lage sind, Bakterien zu zerstören, wenn an diese Antikörper gebunden haben. Zur adaptiven, humoralen Immunität werden die Antikörper gezählt. Solche Antikörper werden nach einer Infektion von B-Lymphozyten (im Folgenden kurz B-Zellen genannt) produziert, wobei die B-Zellen im Verlauf einer solchen Infektion die Antikörper laufend verändern. Da gleichzeitig nur die B-Zellen überleben, deren Antikörper besonders gut an das Antigen binden, entstehen Antikörper, die mit hoher Spezifität an die Infektion verursachenden Mikroben binden. Die Fremdorganismen werden dann beispielsweise durch das Komplementsystem oder durch Makrophagen unschädlich gemacht.
Das Korrelat der zellulären Form der adaptive Immunität sind besonders die T-Zellen, die direkt Zellen zerstören, die von Viren oder intrazellulären Mikroben befallen oder maligne entartet sind, oder die andere Zellen, wie zum Beispiel B-Zellen und Makrophagen, aktivieren und somit eine Immunantwort induzieren können.
Während des Zweiten Weltkrieges untersuchte PeterMedawar das System der zellulären Immunität genauer, da man hoffte, bei Bombenopfern mit schweren Brandverletzungen Hauttransplantationen durchführen zu können. Das Hauptproblem solcher Transplantationen stellt die rasche Abstoßung der Transplantate dar[5].
Medawar stellte fest, dass Haut, die einer Maus entnommen wurde und dieser Maus an einer anderen Stelle transplantiert wurde (sogenannte autogene Transplantation), an dieser Stelle anwuchs, während Haut, die einer anderen Maus (sogenannte allogene Transplantation) transplantiert wurde, bald darauf abgestoßen wurde. Dies geschah aber nicht, wenn die Mäuse sehr nah verwandt waren, wie dies bei Inzuchtstämmen der Fall ist (sogenannte syngene Transplantation). Man entdeckte aufgrund dieser Erkenntnisse die Moleküle, welche für das Abstoßen der Haut verantwortlich sind, und
Die Komplexe von Peptid und MHC-Molekül werden an der Zelloberfläche präsentiert.
T-Zellen können an diese Komplexe binden. Diese Bindung ist notwendig für die Aktivierung und die Proliferation dieser Zellen, aber nicht ausreichend[9].
Es wurde klar, dass jeder T-Zellrezeptor eine andere Kombination von Peptid und MHC Molekül erkennt[10]. Diese Vorgänge entstehen durch Rekombination verschiedener Gensequenzen des T-Zellrezeptors, ein Vorgang, der in vielem der Rekombination von Gensequenzen der antikörperproduzierenden B-Zellen ähnelt.
Da die T-Zellen somit spezifisch mit ihrem T-Zellrezeptor an Peptide binden, die an Strukturen des angeborenen Immunsystems gebunden sind, kann man diese Synapsen als eine zentrale Verknüpfung des „angeborenen“ mit dem „adaptiven“ Immunsystems ansehen. In Übereinstimmung mit dieser Sichtweise nehmen die CD4+-T-Lymphozyten (im Folgenden kurz CD4+-T-Zellen genannt) eine zentrale Rolle gerade bei der Vermittlung zwischen den beiden Teilen des Immunsystems und bei der Entstehung von Immunität insgesamt ein.
Um diese wichtige Synapse des Immunsystems darzustellen, wird der Aufbau der MHC-Moleküle kurz beschrieben.
Die MHC-Moleküle bestehen aus einer kurzen intrazellulären, einer Transmembran- und einer Extrazellulärdomäne. Die Extrazellulärdomaine bildet eine Grube, in welche sich Peptide lagern können. Allerdings lagert nicht jedes Peptid in jeder Bindungsgrube, sondern Peptide mit bestimmten Aminosäuren an bestimmten Positionen (sogenannte Ankerpositionen) haben eine höhere Affinität zu den MHC-Molekülen und werden somit bevorzugt präsentiert (siehe Abbildung 1).
Da jedoch nur etwa zwei Positionen sogenannte Ankerpositionen sind[6,7,8], die Peptide aber bis zu 10 Aminosäuren bei MHC-I Molekülen und bis zu 15 Aminosäuren bei MHC-II lang sein können, werden sehr viele verschiedene Peptide präsentiert (bei
Es gibt zwei Klassen von MHC Molekülen. MHC-I Moleküle werden im wesentlichen von jeder kernhaltiger Körperzelle exprimiert. Nach der Translation der mRNA wird das Protein im Zytosol mit endogenen Peptiden beladen und an der Oberfläche präsentiert. Peptide aus dem Zytoplasma der Zelle gelangen so an die Zelloberfläche. Befinden sich Peptide in der Zelle, die beispielsweise viralen Ursprungs sind, können diese von CD8+-T-Lymphozyten (im Folgenden kurz CD8+-T-Zellen genannt) erkannt und die Zelle zerstört werden. Somit ist die Präsentation von Peptiden auf MHC-I-Molekülen für die Bekämpfung von intrazellulären Infektionen oder neoplastischen Zellen essentiell. Außerdem können MHC-I Moleküle über sogenannte Kreuzpräsentation beladen werden[11,12]. Dieser Weg kommt beispielsweise bei dendritischen Zellen oder Makrophagen vor, die auf diesem Weg naive CD8+ T-Zellen aktivieren können. MHC-II Moleküle werden normalerweise ausschließlich auf spezialisierten Zellen exprimiert. Diese Zellen werden antigenpräsentierende Zellen genannt. Nach der Translation der mRNA werden die MHC-II Moleküle in die Endosomen transportiert, wo sie mit Peptiden beladen werden, die durch Verdauung von extrazellulär aufgenommenen Proteinen entstehen. Somit kommen von Bakterien oder anderen Mikroorganismen, die von den antigenpräsentierenden Zellen phagozytiert wurden, Peptide an die Oberfläche. Diese können von CD4+ T-Zellen erkannt werden, wodurch diese dann wiederum eine starke Immunantwort fördern. Außerdem gibt es Hinweise darauf, dass eine Immunantwort auch über solche CD4+ T-Zellen gehemmt werden kann[13,14]. CD4+ T-Zellen stellen dadurch eine Schlüsselrolle der Immunantwort dar. Sie aktivieren B-Zellen und Makrophagen, die auf diese Weise extrazelluläre Infektionen bekämpfen oder über Kreuzpräsentation, wie oben erwähnt, CD8+ T-Zellen aktivieren können.
Die MHC Klasse 1 Moleküle besitzen eine Bindungsstelle für CD8 und die MHC Klasse 2 Moleküle eine Bindungsstelle für CD4 Oberflächenantigene. Da die Bindung von CD4 oder CD8 an den entsprechenden MHC-Komplex essentiell für die Aktivierung der T-Zellen durch den T-Zellrezeptor ist, werden CD4+ Zellen durch MHC-II Moleküle, CD8+ Zellen aber durch MHC-I Moleküle aktiviert.
Auf der Seite des adaptiven Immunsystems muss ein funktionsfähiger T-Zellrezeptor auf den T-Zellen exprimiert werden, damit Peptide auf den MHC-Molekülen erkannt werden können.
Die Ursprungszellen der T-Zellen liegen im Knochenmark. Aus diesen differenzieren sich unreife Thymozyten, die zu diesem Zeitpunkt negativ für die Expression von T-Zellrezeptor, CD4 oder CD8 sind. Diese Zellen wandern in den Thymus ein. Dort werden die verschiedenen Abschnitte des Genoms, die für den T-Zellrezeptors kodieren, neu kombiniert. Diesen Vorgang nennt man „Rearrangement“.
Der T-Zellrezeptor der αβ-T-Zellen besteht aus einer α- und einer β-Kette. Die Gene der α-Kette besteht aus 3 Regionen (der V, J und der C Region), die Gene β-Ketten noch zusätzlich aus D Regionen. Jede dieser Regionen ist nicht nur einmal kodiert, sondern die Regionen sind hintereinander mit Abweichungen bis zu 75 mal (Va Gene bei der Maus) wiederholt kodiert. Bevor eine T-Zelle reifen kann, wird eine zufällige V-Kette mit jeweils einer anderen, zufällig ausgewählten J, D und C Kette verknüpft. Aufgrund der zufälligen Koppelung der Gene („Rearrangement“) entsteht auf jeder T-Zelle ein anderer T-Zellrezeptor.Während dieses Rearrangements, welches von den Produkten
Diese Expression ist notwendig für die nun folgende Expression von CD4 und CD8 an der Oberfläche. Bei diesen doppeltpositiven T-Zellen folgt das Rearrangement der α-Kette und damit die Expression eines kompletten αβ T-Zellrezeptors.
Bindet der exprimierte T-Zellrezeptor an MHC-I Moleküle, wird nun ausschließlich CD8 exprimiert[18], umgekehrt wird nur CD4 exprimiert, wenn MHC-II Moleküle gebunden werden[19,20,21].
Ist der exprimierte T-Zellrezeptor unfähig, an MHC-Moleküle zu binden, stirbt die T-Zelle durch Apoptose ab.
Auf den Thymusepithelzellen werden Selbstpeptide an MHC-Moleküle gebunden präsentiert. Außerdem wandern antigenpräsentierende Zellen aus der Peripherie in den Thymus ein und präsentieren Selbstpeptide aus der Peripherie. Binden T-Zellen mit sehr hoher Affinität an solche Komplexe, sterben auch diese durch Apoptose ab. Diese beiden Vorgänge, negative Selektion genannt, scheint über verschiedene Wege vermittelt zu werden, so über CD30[22], CD40-CD40L und auch teilweise über CD95[23,24].
Nur bei T-Zellen, deren T-Zellrezeptor mit mittlerer Affinität an die MHC-Moleküle der Thymusepithelien bindet, findet keine Apoptose statt. Dies nennt man positive Selektion.
Nach der Reifung im Thymus gelangen die T-Zellen in den Blutkreislauf und in die sekundären Lymphorgane wie Lymphknoten, Milz und Leber. Dort kommen sie mit antigenpräsentierenden Zellen (APC) in Kontakt, die auf ihren MHC-Molekülen Peptide von Proteinen präsentieren, die von den APC bei ihrer Wanderung durch das nichtlymphatische Gewebe aufgenommen wurde.
T-Zellen aus dem Thymus, die von APC aktiviert werden, werden zu sogenannten Effektorzellen. Sie wandern jetzt aus den Lymphknoten in die Peripherie, wo CD8+ Zellen in der Lage sind, Zellen, die das entsprechende Peptid auf ihrer Oberfläche präsentieren, zu töten.
Die Rolle der CD4+ Zellen liegt darin, mithilfe von Zytokinen oder durch direkten Kontakt von Oberflächenmoleküle andere Zellen des Immunsystems zu aktivieren. B-Zellen werden zur Produktion von Antikörpern angeregt, und Makrophagen können beispielsweise nach Aktivierung durch CD4+ T-Zellen intrazelluläre Mykobakterien abtöten.
Aus aktivierten T-Zellen können Gedächtniszellen entstehen, die durch ihre lange Lebensdauer und durch ihre erhöhte Reaktivität eine wichtige Rolle bei der Abwehr erneut auftretender Infektionen spielen. Vieles über deren Entstehen ist allerdings noch unklar, und bis vor wenigen Jahren wurde sogar vermutet, dass T-Zellgedächtnis nur entsteht, da spezifische T-Zellen in höherer Frequenz vorkommen und dass dieser Effekt von der stetigen Reaktivierung der T-Zellen, also von persistierenden Infektionen, abhängt[26] . Es gelang aber, CD4+-Gedächtniszellen nach Zelltransfer in MHC-II-Klasse defizienten Mäusen nachzuweisen, wo eine Reaktivierung der T-Zellen unmöglich sein sollte[27,28]. Somit scheinen T-Gedächtniszellen in vivo vorzukommen.
Ohne das Immunsystem ist komplexeres Leben nicht vorstellbar. Doch obwohl es bei den meisten Individuen zu einer kompetenten Abwehr von gefährlichen Organismen kommt, und körpereigene Strukturen nicht nachhaltig durch die Immunreaktionen beeinträchtigt werden, gibt es Krankheiten, bei denen alles darauf hindeutet, dass sie durch eine fehlgeleitete Immunantwort hervorgerufen sind.
Eine Unterteilung der Autoimmunkrankheiten kann in organspezifisch und systemisch manifestierte Krankheiten erfolgen.
Unter systemischen Autoimmunkrankheiten versteht man Krankheiten, die sich nicht nur an einzelnen Organen manifestieren, sondern vielfältige Schädigungen des gesamten Organismus hervorrufen. Typisch für diese Gruppe ist der systemische Lupus erythematodes (SLE). Diese Krankheit wird dementsprechend nicht durch ein einzelnes
Auf der anderen Seite stehen die organspezifischen Autoimmunkrankheiten. Zu diesen werden Diabetes mellitus Typ 1, rheumatoide Arthritis oder multiple Sklerose gezählt. Bei all diesen Krankheiten ist hauptsächlich ein Organ betroffen, und es lassen sich bei zumindest einigen dieser Pathologien organspezifische Abwehrreaktionen wie spezifische Antikörper oder autoreaktive T-Zellen finden.
Da bisher spezifische Erreger innerhalb der Läsionen der obengenannten Krankheiten nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden konnten, wird als Ursache ein autoreaktiver Prozess diskutiert. Ein sehr wesentlicher Faktor, welcher auf die Schlüsselrolle von Lymphozyten bei Autoimmunkrankheiten hindeutet, sind Transferexperimente, bei welchen aktivierte selbstreaktive CD4+ Zellen von einem erkranktem Tier auf ein gesundes Tier[29,30,31,32] oder sogar von einem erkranktem Menschen auf eine immundefiziente Maus[33] übertragen werden. Ein solcher Transfer reicht bei vielen Tiermodellen aus, um Autoimmunkrankheiten hervorzurufen.
Unklar ist, was T-Zellen, die im Thymus nicht der negativen Selektion zum Opfer gefallen sind, in der Peripherie zu aktivierten, autoreaktiven T-Zellen macht.
Im folgenden werden verschiedene Hypothesen dargestellt, die versuchen, dies zu erklären.
Eine Erklärung für das Vorkommen von autoreaktiven T-Zellen in der Peripherie könnte sein, dass das Peptid, gegen welches die T-Zellen reagieren, überhaupt nicht oder in einer anderen Form im Thymus präsentiert wird. Plausibel erscheint diese Hypothese besonders bei Proteinen, die nur in bestimmten Organen produziert werden, wie dies beispielsweise bei Insulin oder Proteinen des ZNS der Fall ist, oder bei Proteinen, die erst später in der Entwicklung des Individuums, etwa in der Pubertät, exprimiert werden.
Allerdings konnte gezeigt werden, dass medulläre Thymusepithelien auch Proteine exprimieren, die sonst nur in speziellen Organen vorkommen[34]. Durch diese
Interessanterweise gibt es bei manchen Menschen einen Gendefekt im sogenannten AIRE-Protein[35,36]. Dieser Defekt führt zur autoimmunen Polyendokrinopathie Typ I. Es konnte gezeigt werden, dass dieser Defekt zu einer verminderten promisken Expression im Thymus führt[37].
Allerdings können auch ohne diesen Defekt Peptide im Thymus in einer anderen Form präsentiert werden als später in der Peripherie. Ein Beispiel hierfür ist das Myelin-basische Protein (MBP). Dieses Protein, das für die Umscheidung der Axone von Gliazellen im zentralen und peripheren Nervensystem (ZNS) exprimiert wird, scheint zusammen mit anderen Proteinen des ZNS eine wichtige Rolle bei der multiplen Sklerose zu spielen.
Das Gen dieses Proteins besteht aus mehreren Exons. Im ZNS von den Oligodendrozyten unter anderem ein an N-terminaler Position azetyliertes MBP-Protein präsentiert. Im Thymus werden jedoch andere Exons transkribiert[38,39]. Bei der multiplen Sklerose wird das MBP-Protein erkannt[40,41].
Als Tiermodell für die multiplen Sklerose gilt EAE (siehe unten), und in vielen dieser Tiermodelle erkennt ein Großteil der autoreaktiven T-Zellen ein Peptid bestehend aus den ersten N-terminalen 9 bis 11 Aminosäuren. Interessant ist, dass diese Peptide nur erkannt werden, wenn sie, genau wie im ZNS, in azetylierter Form präsentiert werden. Es ist vorstellbar, dass die Deletion im Thymus in diesem Fall versagt, weil die Expression des Proteins im Thymus eine andere ist als im ZNS.
Bestimmte Körperregionen sind für das Immunsystem nur eingeschränkt erreichbar, da diese Gewebe durch biologische Schranken abgeschirmt sind. Zu diesen Regionen gehören zum Beispiel das ZNS, das Auge oder die Testes.
Das physiologische Korrelat dieser Schranken sind einmal das Vorhandensein von tight-junctions[42], was unaktivierte Lymphozyten nicht in diese Regionen einwandern lässt. Erst wenn Lymphozyten in der Peripherie aktiviert werden, exprimieren sie Oberflächenmoleküle, mit deren Hilfe sie in die Gewebe eindringen können[43,44].
Proteine, die ausschließlich innerhalb solcher Organe produziert werden, werden Zellen des Immunsystems unter physiologischen Bedingungen nicht präsentiert.
Autoimmunität könnte aber entstehen, wenn die Schranken dieser Systeme zusammenbrechen. Ein deutlicher Hinweis auf die Relevanz der immunologischen Schranken ist das Vorkommen der sympathischen Ophthalamie. Diese Krankheit entsteht, wenn ein Auge durch Trauma verletzt istund es zu einer immunologischen Reaktion gegen Antigene dieses Auges kommt. Aufgrund dieser immunologischen Reaktion kann es nun zu einer Zerstörung des gesunden Auges kommen, da aktivierte T-Zellen in das Auge einwandern und auch hier gegen die Antigene reagieren.
Ein Durchbrechen der Schranken könnte außerdem bei Infektionen vorkommen, da in diesem Fall die immunstimulatorischen Signale innerhalb dieses Organs immunsupprimierenden Signale, also die immunologische Schranke, überwiegen.
Die Tatsache, dass immunologische Schranken durch Infektionen durchbrochen werden können, konnte in Tiermodellen gezeigt werden[47,48].
Außerdem kann es zwar nach traumatischen oder inflammatorischen Ereignissen zu akuten Demyelinisierungen kommen, ein Zusammenhang zwischen Multipler Sklerose und Enzephalitiden wurde aber bisher noch nicht beschrieben. Vielmehr wird sogar eine Neuroprotektion durch ein vorangegangenes Trauma diskutiert[49,50,51].
Da nach neueren Studien enzephalitogene T-Zellen auch im Blut gesunder Individuem[52,53,54] und sogar im ZNS gesunder Mäuse[55] vorkommen, würde man bei einem Zusammenbrechen der immunologischen Schranken aber eher ein Entstehen von Autoimmunität vermuten. Dies wird aber nicht beobachtet, also können die immunologischen Schranken nicht alleine für die Verhinderung von Autoimmunität verantwortlich sein.
Obwohl nach der oben beschriebenen Reifung der Zellen im Thymus jede T-Zelle ausschließlich einen T-Zellrezeptor exprimieren sollte, wurde beobachtet, dass in der Peripherie auch T-Zellen mit zwei unterschiedlichen T-Zellrezeptoren vorkommen[56,57]. Dies wird auf die nicht vollständige allele Exklusion der TCR α-
Es ist vorstellbar, dass durch solche T-Zellen Autoimmunität entsteht, wenn T-Zellen über einen ihrer T-Zellrezeptoren durch Fremdantigene aktiviert werden. Besitzt der zweite T-Zellrezeptor Autoantigene, würde die T-Zelle auch gegen diese körpereigenen Strukturen reagieren und so Autoimmunität hervorrufen können. In einem transgenen Mausmodell konnte diese Hypothese bestätigt werden[58].
Die oben erwähnten Hypothesen zur Entstehung von Autoimmunität haben gemein, dass zwar Mechanismen der zellulären Immunität versagen, dass aber die einzelnen T-Zellen spezifisch über die T-Zellrezeptoren aktiviert wird. Die Hypothesen, die aber in dieser Arbeit genauer untersucht werden sollen, also die Hypothese der „Molekularen Mimikry“ und die Hypothese der „Bystander-Aktivierung“ beinhalten, dass die T-Zellen nicht so spezifisch sind wie früher angenommen, dass also mehrere Peptide („Molekulare Mimikry“) bzw. ein gänzlich antigenunabhängiger Mechanismus („Bystander-Aktivierung“) zu einer Aktivierung von T-Zellen und somit eventuell zu Autoimmunität führen kann.
Wie oben beschrieben wurde, stellen die spezifisch bindenden T-Zellrezeptoren und die darauf folgende T-Zellaktivierung eine Schlüsselrolle im Funktionsgefüge des Immunsystems dar.
Eine antigenunabhängige Aktivierung der T-Zellen sollte die Unterscheidung von „Fremd“ und „Selbst“ stark erschweren, wenn nicht ganz und gar unmöglich machen. Trotzdem wurden in den letzten Jahren immer mehr Untersuchungen veröffentlicht, in denen antigenunabhängige Aktivierungen von T-Zellen beschrieben wurden[59,60,61,62,63]. Eine weitere Untersuchung dieser Phänomene scheint wichtig, gerade weil die Spezifität der T-Zellen wesentlich für das bisherige Verständnis des Funktionierens des Immunsystems war.
Im Grunde genommen gibt es drei mögliche Szenarien, welche Rolle antigenunabhängige Aktivierung von T-Zellen bei der Induktion von Autoimmunität spielt:
Antigenunabhängige Aktivierungen kommen relativ selten vor, somit kann es unter ungünstigen Umständen auf einem solchen Wege zu Autoimmunität kommen.
Antigenunabhängige Aktivierungen kommen häufig vor, es muss also Mechanismen geben, welche Autoimmunität auf einem solchen Wege wirksam verhindern.
Wesentlich scheint also die Häufigkeit des Vorkommens von antigenunabhängigen Aktivierungen von T-Zellen zu sein. Um diese zu untersuchen, müssen die Phänomene möglichst unter physiologischen Bedingungen untersucht werden.
In dieser Arbeit sollen verschiedene Untersuchungen durchgeführt werden, durch die die Häufigkeit solcher antigenunabhängigen Bindungen in einem gewissen Rahmen abgeschätzt werden können und somit Aussagen über die physiologische Relevanz gemacht werden sollen.
Im folgenden sollen die beiden in dieser Arbeit genauer untersuchten Hypothesen für antigenunabhängige Aktivierungen von T-Zellen beschrieben werden.
Für lange Zeit wurde angenommen, jeder T-Zellrezeptor sei spezifisch für genau eine Peptidsequenz. Durch die Selektion der T-Zellen im Thymus (siehe Seite 11) sollten nur T-Zellen in die Peripherie gelangen, die mit den körpereigenen MHC-Molekülen reagieren, wenn diese ein Fremdpeptid gebunden haben. Dann würden die T-Zellen proliferieren und sich somit T-Zellen anreichern, die gegen Peptide von Fremdorganismen als sogenannte Gedächtniszellen reagieren können.
Allerdings stellte man fest, dass ein T-Zellrezeptor nicht nur mit einem Peptid, sondern mit verschiedenen Peptiden reagiert, dass sogar T-Zellen durch Fremdpeptide aktiviert werden und anschließend gegen Selbstpeptide reagieren können[59,60,64,61]. Sind T-Zellen auf eine solche Weise aktiviert, sollten sie gegen Selbstantigene reagieren und Autoimmunität hervorrufen.
Dieses Phänomen wird als „Molekulare Mimikry“ bezeichnet (siehe Abbildung 2), da man sich zuerst vorstellte, dass Bakterien durch körperähnliche Proteine eine „Tarnung“ erreichen könnten. Später wurde der Begriff aber eher entgegengesetzt wie oben beschrieben eingesetzt, also für das Erkennen von körpereigenen Strukturen durch das Immunsystems aufgrund von körperähnlichen, mikrobiellen Proteinen.
Von direktem klinischen Interesse wurden solche Überlegungen unter anderem, als nach einigen Fällen von Hepatitis B-Vakzinierungen demyelinisierenden Erkrankungen auftraten[65,66]. Es wurde die Vermutung geäußert, dass der Impfstoff kreuzreaktive Peptide enthielte und auf diese Weise autoimmune Erkrankungen wie multiple Sklerose
Als zweite Ursache einer antigenunabhängigen Aktivierung wird die „Bystander-Aktivierung“ beschrieben.
Wichtig für die Aktivierung von T-Zellen ist die Bindung des T-Zellrezeptors an Peptide, welche vom MHC Molekül präsentiert werden. Dies allein reicht jedoch nicht aus, da auch kostimulatorische Moleküle, beispielsweise CD80 oder CD86, an der Oberfläche der antigenpräsentierenden Zellen notwendig sind, um eine Aktivierung der T-Zellen hervorzurufen. Die Expression von kostimulatorischen Molekülen oder inflammatorischen Zytokinen kann durch mikrobielle Substanzen wie LPS oder CpG-reiche DNA Bruchstücke verstärkt werden[71,72,73].
Wird eine T-Zelle über ihren T-Zellrezeptor und die notwendigen kostimulatorischen Signale aktiviert, ist dies eine spezifische Aktivierung.
Jedoch werden während einer Immunreaktion vielfältige Zytokine und andere immunstimulatorische Signale ausgeschüttet, die eventuell auch autoreaktive T-Zellen aktivieren könnten, die entweder überhaupt nicht über ihren T-Zellrezeptor Signale erhalten, oder während einer starken Immunantwort gegen infektiöse Erreger zufällig ein harmloses Selbstantigen erkennen. Da die Kostimulation durch die Infektion getriggert wurde, können solche T-Zellen suffizient aktiviert werden.
Eine solche Aktivierung wird „Bystander-Aktivierung“ genannt (siehe Abbildung 3).
Bei der Erforschung des Immunsystems ist die Wahl eines geeigneten Tiermodells von großer Wichtigkeit. Gut wurden die Tiermodelle der experimentell autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) charakterisiert. Mit dem Einsatz von Tieren, die transgen für einen enzephalitogenen T-Zellrezeptor und somit suszeptibel für EAE sind, sind diese Modelle ideal zur Untersuchung für das Entstehen von Autoimmunkrankheiten: Da das T-Zellrepertoire stark eingeschränkt ist, lassen sich Substanzen leicht in vitro auf die Induktion von T-Zellproliferation und die in vitro beobachteten Effekte können auf die
Auf der Suche nach einem Impfstoff gegen Tollwut injizierte Pasteur gesunden Individuen lysiertes Rückenmark und Gehirn von an Tollwut erkrankten Tieren. Einige der Individuen erkrankten aber an einer fortschreitenden Lähmung, die er postvakzinelle Enzephalomyelitis nannte[1]. Es war nicht klar, ob dies ein Effekt des Virus oder der Gehirnsubstanz war.
1933 konnte Rivers dieselben Symptome in Rhesusaffen erzeugen[74], denen er wiederholt lysierte Hirnsubstanz von Kaninchen subkutan spritzte. Da die Kaninchen nicht an Tollwut erkrankt waren, schloss man, dass dies ein Effekt der Hirnsubstanz auf den Organismus der Rhesusaffen sein muss. Er stellte fest, dass das pathologische Korrelat der Symptome entzündliche Infiltrate im zentralen Nervensystem der Affen darstellen.
Wenn die Hirnsubstanz vor der Applikation in kompletten Freudschen Adjuvant emulgiert und den Affen danach Pertussis Toxin intravenös appliziert wurde[75], reichte eine Injektion zur Induktion von EAE aus.
Auch bei anderen Tierarten konnte die Krankheit induziert werden[76,77]. Selbst durch arteigenes Hirngewebe kann die Krankheit hervorgerufen werden[77].
Da ein autoimmunes Geschehen angenommen wurde, wurde die Krankheit „experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis“ (EAE) genannt.
1960 stellte Paterson fest, dass die Krankheit in Ratten von einem Tier zum anderen übertragen werden kann, wenn man Lymphozyten des kranken Tiers dem gesunden Tier appliziert[29]. Später wurde klar, dass CD4+ T-Zellen des kranken Tiers ausreichten, um die Krankheit zu übertragen[31,78,79]. Da man auch in den entzündlichen Infiltraten CD4+ Zellen vorfindet[80] und man durch Depletion der CD4+ Zellen mit Antikörpern EAE in Tieren behandeln kann[81,82], wird eine zentrale Rolle dieses Zelltyps angenommen.
Allerdings reichen naive autoreaktive CD4-Zellen nicht aus, um EAE auszulösen. Die Zellen müssen vorher aktiviert worden sein[83].
Aufgrund gewisser Ähnlichkeiten zur chronischen disseminierten Enzephalomyelitis beziehungsweise der multiplen Sklerose, besonders den entzündlichen Infiltraten und den Lähmungserscheinungen, gilt EAE als Tiermodell für diese Erkrankung.
Trotz dieser Ähnlichkeiten der EAE zu MS ist es eher gerechtfertigt, EAE als ein Tiermodell für die akute disseminierte Enzephalomyelitis beim Menschen zu benutzen. Diese Erkrankung ist beim Menschen der MS, also der chronischen disseminierten Enzephalomyelitis, sehr ähnlich und die Differentialdiagnose beim Menschen entsprechend schwierig. Jedoch tritt die akute disseminierte Enzephalomyelitis nach Infektionen oder Vakzinierungen auf, eine entscheidende Ähnlichkeit zu EAE. Wahrscheinlich handelt es sich bei der von Pasteur entdeckten postvakzinellen Enzephalomyelitis auch um eine Sonderform der akuten demyelinisierenden Enzephalomyelitis. Inwieweit therapeutische Regimes, die für akute demyelinisierende Enzephalomyelitis entwickelt werden, auch für MS wirken, ist unklar. Da aber bisher kein alternatives Tiermodell zur Untersuchung der MS entwickelt wurde, muss auch weiterhin dieses Tiermodell verwendet werden.
Jedoch sind eventuelle Unterschiede zwischen der Autoimmunkrankheit MS und EAE für diese Arbeit, in welcher der Einfluss von Kreuzreaktivität und „Bystander-Aktivierung“ bei der Entstehung von Autoimmunität untersucht werden soll, nicht sehr wesentlich. Wie oben erwähnt, wurde die Krankheit EAE am Menschen entdeckt. Damit stellt das Tiermodell der EAE ein immunologisches Geschehen dar, welches auch beim Menschen vorkommen kann.
Somit können mit einiger Vorsicht Erkenntnisse über EAE auch für das humane Immunsystem gelten.
Wie oben bereits erwähnt, stellen die entzündlichen Infiltrate im zentralen Nervensystem im Zusammenhang mit peripheren Lähmungen den pathognomonischen Befund der EAE dar. Die klinischen Verläufe wie auch die Histologien können allerdings in verschiedenen Modellen von EAE stark variieren.
Im Gegensatz dazu kommt es bei manchen Mausstämmen mit dem MHC-Phänotyp I-As (SJL/J Mäuse), die mit PLP-Protein oder bestimmten Peptiden daraus immunisiert werden, zu schubweisen Verläufen mit vollständigen oder auch unvollständigen Remissionen. Die Histologien in diesen Modellen bestehen auch aus mononukleären, perivaskulären Infiltraten, zusätzlich aber auch aus Zonen akuter und chronischer Demyelinisierung und Fibrinablagerungen im Gehirn[86]. Der klinische Verlauf und die histologischen Befunde dieser Modelle ähneln also mehr der klassischen multiplen Sklerose als das von uns benutzte MBP-Modell.
Zusätzlich zu diesen zwei Modellen gibt es noch eine Vielzahl anderer, wie zum Beispiel auf myelinem Oligodendrogliaprotein (MOG) oder auf myelin-assoziiertem Glykoprotein (MAG) beruhende Modelle[87]. Auf diese soll aber nicht im Detail eingegangen werden.
Zur Induktion von EAE sind in unserem wie in vielen anderen Tiermodellen zwei Adjuvantien nötig: Komplettes Freunds Adjuvant und Pertussistoxin.
Die Verwendung beider Adjuvantien wurde empirisch schon in den vierziger Jahren entwickelt[88].
Inzwischen ist einiges über deren Wirkung bekannt: Komplettes Freunds Adjuvant wird vermutlich benötigt, um die Zellen des angeborenen Immunsystems, also besonders Makrophagen und dendritische Zellen, zu der Präsentation der Peptide in einem entzündlichen Milieu anzuregen. Dies ist sehr wichtig für die Entstehung von Immunreaktionen. Unterbleibt die Gabe von diesem Adjuvant, entsteht keine Autoimmunität, in manchen Modellen kommt es sogar zur Entwicklung von Anergie gegen das applizierte Antigen[89] oder zur Depletion der T-Zellen[90]. Dies wird darauf
Die Rolle von Pertussistoxin bei der Induktion von EAE ist weniger klar. Pertussistoxin besitzt eine adjuvante Wirkung bei Immunisierungen. Diese adjuvante Wirkung wird auch bei Inaktivierung der toxischen Komponente beibehalten, ist also auch bei den bei der Impfung verwendeten DPT (Diphterie-Pertussis-Tetanus) Impfstoffe noch wirksam.
Die verstärkende Wirkung von Pertussistoxin bei der Induktion von EAE wurde von Lee und Olitsky 1955 festgestellt[75].
Pertussistoxin bei Induktion von EAE wird, im Gegensatz zum Kompletten Freunds Adjuvant, nicht lokal mit dem Antigen zusammen, sondern systemisch, nämlich intravenös, appliziert. In vielen Arbeiten[85,92,93] wird vermutet, dass Pertussistoxin die Blut-Hirn-Schranke für Zellen des Immunsystems, speziell für Lymphozyten, durchlässig macht. Dies wäre insofern wichtig, weil unter physiologischen Bedingungen diese Schranke undurchlässig für ruhende Lymphozyten ist (siehe 1.5.2) und deswegen selbst Zellen, die autoreaktiv gegen Proteine des ZNS sind, keine Autoimmunität hervorrufen könnten, da sie die Selbstantigene nicht erreichen würden.
In anderen Untersuchungen[94,83] wird jedoch darauf hingewiesen, dass Pertussistoxin auch eine direkte Wirkung auf Lymphozyten besitzt.
Ein direkter Effekt auf Lymphozyten könnte beispielsweise darin bestehen, dass das homing-Verhalten der Lymphozyten dahingehend verändert wird, dass sie vermehrt ins ZNS wandern[95,96].
Dass T-Zellen kausal für das Entstehen von EAE verantwortlich sind, wurde gezeigt, indem man T-Zellen von an EAE erkrankten Tieren in gesunde Tiere transferierte[29]. Die Empfängertiere entwickelten daraufhin EAE.
Nachdem die wesentliche Rolle der CD4+ T-Zellen bei der Pathogenese der EAE entdeckt wurde, begann man mit der weiteren Charakterisierung der T-Zellen.
Dabei stellte man fest, dass enzephalitogene T-Zellen durch Proteine und Peptide, welche im ZNS exprimiert werden, aktiviert werden können[97,98].
T-Zellen, die reaktiv gegen ZNS Autoantigene sind, konnten auch nach Klonierung oder nach in vitro Stimulation EAE hervorrufen, während dies andere T-Zellen nicht konnten.
Jedoch reicht Autoreaktivität nicht aus: Werden naive, autoreaktive T-Zellen in gesunde Empfängertiere transferiert, erkranken diese nicht[31]. Selbst T-Zellrezeptor-transgene Mäuse mit vielen autoreaktiven T-Zellen erkranken in manchen Modellen nicht, solange kein zusätzlicher Stimulus erfolgt[99]. T-Zellen müssen also aktiviert werden, bevor sie EAE hervorrufen können.
Außerdem wurde gezeigt, dass MBP-spezifische T-Zellen, also T-Zellen, die durch Proteine des ZNS aktiviert werden können, im ZNS von gesunden Mäusen[99] oder im Blut von Menschen ohne neurologische Symptome vorkommen[52,53].
Trotzdem scheint ein wesentliches Kriterium für das Entstehen von EAE und eventuell auch anderen Autoimmunkrankheiten die Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen zu sein.
Wie und warum autoreaktive T-Zellen aktiviert werden und zu EAE führen, ist Gegenstand vieler Hypothesen und Thema dieser Arbeit. Einige Hypothesen wurden weiter oben erwähnt (s. S. 14 ff).
Wesentlich für das Erkennen von „Fremd“ und „Selbst“ ist das Erkennen von Peptiden auf MHC-Molekülen durch den T-Zellrezeptor. Obwohl dieser Kontakt sehr wichtig ist, sowohl für physiologische Immunantworten als auch für das Entstehen von Autoimmunität, sind Untersuchungen daran nicht trivial, da praktisch jede T-Zelle einen individuellen T-Zellrezeptor exprimiert. Deswegen konnten antigenspezifische T-Zellen einer Spezifität bisher nur sehr eingeschränkt untersucht werden. Erst in neuester Zeit können T-Zellen mithilfe von gekoppelten MHC-Peptid-Komplexen (MHC-Tetramere) spezifisch angefärbt werden[100,101,102]. Diese Untersuchungen sind aber besonders für MHC-II Moleküle aber noch nicht gut etabliert.
Um antigenspezifische T-Zellen zu untersuchen, werden deswegen auch T-Zellen mithilfe von Antigen kultiviert. Nach genügend langer Zeit erhält man eine T-Zelllinie, bei der alle T-Zellen mit dem Antigen reagieren.
Eine andere Möglichkeit, T-Zellen untersuchen zu können, bei denen man die Antigenspezifität nicht kannte, war das Verschmelzen von T-Zellen mit Thymomzellen[103,104]. Durch diese Technik entstehen unsterbliche Zellen, die den T-Zellrezeptor exprimieren.
Um die Rolle autoreaktiver T-Zellen in vivo genauer untersuchen zu können, wurden Gene von T-Zellrezeptoren aus T-Zelllinien gewonnen und in das Genom von Mäusen transferiert[99,105,106]. Viele T-Zellen exprimieren diesen T-Zellrezeptor nach deren Reifung, wodurch eine Fraktion von spezifischen T-Zellen erhalten wird, die leichter untersucht werden kann.
In dieser Arbeit wurden Mäuse verwendet, bei denen außerdem die endogenen T-Zellrezeptor α-Ketten ausgeschaltet wurden[99]. Da nun außer dem transgenen keine intakten T-Zellrezeptoren gebildet werden können, exprimieren praktisch alle T-Zellen den transgenen T-Zellrezeptor.
Der transgene T-Zellrezeptor ist spezifisch für ein Peptid bestehend aus den N-terminalen 11 Aminosäuren des Myelin-basischen Proteins (MBP), wobei die erste Aminosäure azetyliert sein muss. Das Peptid wird auf dem murinen MHC-II Molekül I-Au präsentiert. Dadurch sind sämtliche T-Zellen in diesen Mäusen autoreaktiv für ein im ZNS exprimiertes Protein.
Spontan erkranken etwa 14% der Mäuse an EAE. Dies kann ein Hinweis darauf sein, dass Fremdorganismen imstande sind, die T-Zellen zu aktivieren.
Durch das stark eingeschränkte T-Zellrezeptorrepertoire ist es möglich, die Spezifität für andere Peptide des T-Zellrezeptors genau zu untersuchen, ohne dass Reaktionen auf Fremdpeptide auf die Aktivierung nicht-autoreaktiver T-Zellen zurückgeführt werden könnte. Somit kann die Hypothese der „molekularen Mimikry“ überprüft werden, da in diesen Mäusen jede Aktivierung der T-Zellrezeptoren durch Fremdpeptide eine Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen bedeutet.
In dieser Arbeit soll der Zusammenhang zwischen Autoimmunität und Infektionen, speziell die Hypothesen der molekularen Mimikry und der „Bystander-Aktivierung“ von T-Zellen, untersucht werden.
Dabei wird folgendermaßen vorgegangen:
Zuerst soll das Ausmaß der Kreuzreaktivität des von den Mäusen exprimierten T-Zellrezeptors untersucht werden. Dazu werden Peptide auf Zellulosemembranen synthetisiert, bei denen jeweils an einer Position des MBPAc1-11-Peptids eine Aminosäure ausgetauscht wurde. An jede Position wird jede natürlich vorkommende Aminosäure gesetzt und die resultierenden Peptide in vitro zu Milzzellen gegeben. Anschließend wird die Proliferation gemessen (=Substitutionsanalyse). Durch Auswertung dieser Experimente kann das Supertop des T-Zellrezeptors festgestellt werden.
In elektronischen Datenbanken können mithilfe der Ergebnisse der Substitutionsanalyse nach Peptidsequenzen gesucht werden, die in Bakterien vorkommen. Diese Peptide und bakterielle Lysate werden auf Zellulosemembranen und in Pulverform synthetisiert, auf Proliferation von Milzzellen und auf Induktion von EAE in den transgenen Mäuse getestet.
Um die Hypothese der „Bystander-Aktivierung“ zu überprüfen, soll der Effekt von Lipopolysacchariden (LPS) auf CD4+-T-Zellen in vitro in den transgenen und in Wildtypmäusen untersucht werden. Insbesondere interessieren dabei die Proliferation und die Aktivierung der Zellen.
Schließlich sollen die in vivo-Effekte von LPS auf die transgenen Mäuse untersucht werden. Hierbei wird besonders die Induktion von EAE untersucht, da bei dieser Erkrankung die Aktivierung von CD4+-T-Zellen eine Schlüsselrolle spielt.
Mäuse wurden unter pathogenfreien (SPF) Bedingungen in der Tierzucht des DRFZ gezüchtet (Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin, Berlin Marienfelde).
Die folgenden Mausstämme wurden benutzt:
Die von uns verwendeten Bakterien, speziell Salmonella typhimurium (Wildtypstamm C5 Nalr), wurden von Dr. U. Schaible, Max-Planck-Institut für Immunologie, kultiviert und uns zur Verfügung gestellt.
Die zellulosegebundenen Peptide wurden in der Gruppe von Prof. J. Schneider-Mergener, Institut für Med. Immunologie, Charité, Berlin, synthetisiert. Es wurde dabei die automatisierte Spotsynthese (Abimed, Langenfeld, Deutschland; Software DIGEN, Jerini Biotools, Berlin, Deutschland) verwendet. Die Membranen sind Whatman No. 50 Zellulosemembranen. Die Peptidspots wurden ausgestanzt und in 200 µl sterilem Aqua bidest gelöst. Dies resultiert in einer Peptidkonzentration von etwa 150-200 µM.
Das MBP-Peptid MBPAc1-11 und die anderen konventionell hergestellten Peptide sind ein Geschenk von Prof. J. Schneider-Mergener, Institut für Med. Immunologie, Charité, Berlin. Die Sequenz des MBP-Peptides ist:
Die Sequenzen der anderen Peptide sind bei den entsprechenden Experimenten angegeben und wurden analog zum MBPAc1-11 –Peptid hergestellt.
Die Antikörper wurden von Hybridomüberständen im DRFZ von Heidi Hecker-Kia und Tuula Geske gewonnen. Die Antikörper wurden anschließend mit FITC, PE, Cy5 (Amersham) oder mit Biotin (Pharmingen) oder Digoxigenin (DIG, Boehringer) gekoppelt.
• Antikörper gegen Oberflächenantigene
• Antikörper gegen Zytokine
Die Präparation der Zellen und deren Verarbeitung erfolgte unter sterilen Bedingungen.
Alle Kulturen und Assays wurden in kompletten Zellkulturmedium (CM) bei 37°C in einer 5% CO2 Atmosphäre bei 95% Luftfeuchtigkeit inkubiert.
Die Mäuse wurden durch zervikale Dislokation getötet. Das Fell wurde mit 70% Ethanol gereinigt. Anschließend wurde das Fell und das Peritoneum durchschnitten und die Milz entnommen. Die Milzen wurden durch ein feines Sieb mit einem Spritzenstempel gepresst und in 40 ml Waschmedium aufgenommen. Die Flüssigkeit wurde dann mehrmals in eine Pipette aufgenommen, so dass größere Zellaggregate suspendiert wurden.
Die Zellen wurden nun bei 300 gabzentrifugiert und resuspendiert. Um kleinere Klumpen zu entfernen, wurden die Zellen durch ein 30 µm Sieb gegeben.
Nachdem die Zellen ein weiteres Mal in Waschmedium gelöst und abzentrifugiert wurden, wurden die Erythrozyten lysiert.
Danach konnten die Zellen in der gewünschten Konzentration aufgenommen werden.
Prinzip
Erythrozyten sind anfälliger für hypotonen Schock als Leukozyten und anderen kernhaltigen Zellen. Diese Anfälligkeit nutzt man bei der selektiven Lyse der Erythrozyten durch Zugabe von Lösungen mit geringer Salzkonzentration.
Um Erythrozyten effizient lysieren zu können, werden Einzelzellsuspensionen mit Lysispuffer (0.83% NH4Cl/10mM Tris-HCl) für 6-7 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach der Inkubationszeit wird das Röhrchen mit WM aufgefüllt. Anschließend werden die Zellen abzentrigugiert (bei 200g für 8 min). Das Pellet wird anschließend aufgeschüttelt und in CM aufgenommen.
Prinzip
Die Viabilität von Zellen kann durch Exklusion von bestimmten Farbstoffen bestimmt werden. Dieser Test beruht auf dem Prinzip, dass bestimmte Farbstoffe wie zum Beispiel Propidiumiodid und Trypan Blau nicht in der Lage sind, intakte Membranen von lebenden Zellen zu durchdringen, wohingegen diese Farbstoffe die Membranen von toten Zellen durchdringen können und sie somit anfärben.
Generelles Vorgehen
Färben von toten Zellen mit Trypan Blau:
20µl einer Einzelzellsuspension wird 1:2 mit Trypan Blau gemischt. Ein Tropfen dieser Mischung wurde auf einen Neubauer-Hämazytometer gegeben. Tote Zellen erscheinen unter dem Mikroskop blau, während lebende Zellen ungefärbt bleiben. Die ungefärbten Zellen können mit einem Mikroskop gezählt werden.
Die Gesamtzahl der lebenden Zellen kann nun wie folgt berechnet werden:
Gesamtzahl der lebenden Zellen = n x df x vol. x 104
n :Zellzahl in einem von 4 Feldern des Hämazytometer
df:Verdünnungsfaktor, in diesem Falle 3
vol.:Volumen, in welchem die Zellen gelöst sind
Färbung mit Propidiumiodid:
Die Färbungen mit Propidiumiodid (PI) werden zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen bei einer durchflusszytometrischen Analyse benutzt.
PI kann Membranen lebender Zellen nicht durchdringen, weswegen nur die DNA toter Zellen angefärbt wird.
PI wird kurz vor der durchflusszytometrischen Analyse zu den Zellen gegeben. Später werden nur die lebenden Zellen in die Auswertung einbezogen.
Prinzip
Vor jeder Zellteilung muss eine Zelle neue DNA synthetisieren. Dazu kann sie die benötigten Nukleinsäuren neu synthetisieren, oder sie nimmt sie bei entsprechendem Angebot durch Transporter aus der Umgebung auf. Bei Zugabe von radioaktiven Nukleinsäuren werden diese in die DNA eingebaut und sich teilenden Zellen radioaktiv markiert.
Die drei Nukleinsäuren Alanin, Guanin und Cytosin werden auch zum Aufbau von RNA verwendet und nicht exklusiv zur Synthese von DNA verwendet. Die Nukleinsäure Thymidin wird ausschließlich für den Aufbau der DNS verwendet. Thymidin mit an die Methylgruppe gekoppeltem Tritium (3H) kann somit zur Messung der Proliferation verwendet werden. Diese Nukleinsäure wird von proliferierenden Zellen aufgenommen und in die DNA eingebaut, wo die Radioaktivität des β-Strahlers Tritium gemessen werden kann.
Der Vorteil im Vergleich zur später zu besprechenden Proliferationsmessung mit dem Farbstoff CFSE besteht in der einfacheren Durchführung und der Möglichkeit, sehr viele Substanzen auf einmal zu testen.
Generelles Vorgehen
Nach Herstellen einer Einzelzellsuspension und der Lyse der Erythrozyten (siehe oben) werden die Zellen gezählt, abzentrifugiert und in CM in einer Zelldichte von 1x106 Zellen pro Milliliter aufgenommen. Von dieser Zellsuspension werden 100 µl in jedes Näpfchen einer 96-Napf-Mikrotiterplatte mithilfe einer Mehrkanalpipette pipettiert. Im Falle der in dieser Arbeit häufig verwendeten Testung von Peptiden, die auf einer Zellulosemembran synthetisiert wurden (siehe oben), werden 5 µl der etwa 150-200 µM
Nachdem die Zellsuspension für 3 Tage bei 37°C in einer 5% CO2 Atmosphäre inkubiert wurde, wird 1 µCi 3H-Thymidin zugegeben und die Zellen für weitere 18 Stunden inkubiert. Danach werden mittels eines Zellerntegeräts (Hewlett Packard) die Zellen in einer 96-Filter-Platte aufgefangen. Dieser Platte wird Szintillationsflüssigkeit zugegeben und die Radioaktivität mithilfe eines β-Counters gemessen.
Der gemessene Wert wird in Signale pro Minute (counts per minute, CPM) angegeben.
Um das Ergebnis zu normieren, wird jeder Wert durch den Wert der Negativkontrolle (Zellen ohne Zugabe von Peptid) dividiert. Das Ergebnis wird Stimulationsindex (SI) genannt.
Prinzip
Magnetische Zellaufreinigung (magnetic cell sorting, MACS) wird zur Isolation von spezifischen Zellpopulationen durch magnetische Mikropartikel (20-100 nm Durchmesser), gebunden an Antikörper, eingesetzt. Zellen werden mit dem entsprechenden Antikörper inkubiert und anschließend gewaschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Die Zellsuspension wird nun über eine ferromagnetische Matrix gegeben, die in einem starken magnetischen Feld liegt. Die mit magnetischen Partikeln beladenen Zellen werden in dem Magnetfeld festgehalten, während unbeladene Zellen durch die Säule gespült werden. Die beladenen Zellen können gewonnen werden, indem die Säule von dem Magnetfeld entfernt und gespült wird.
Die Zellaufreinigung mit magnetischen Partikeln kann zur Anreicherung (positive Selektion) oder zur Depletion (negative Selektion) von speziellen Zellpopulationen verwendet werden. Die Wahl der Methode hängt von der Art der Untersuchung und von der zu isolierenden Zellpopulation ab.
Generelles Vorgehen
Jeder Schritt der Zellaufreinigung wird in MACS-Puffer (PBS, 0.5% BSA, 2mM EDTA) durchgeführt. Es ist wichtig, das Entstehen von Luftblasen in der Säule zu verhindern. Deswegen werden alle Puffer vor dem Gebrauch durch Anlegen eines Vakuums für etwa eine halbe Stunde entgast.
Die Zellen werden nun in MACS-Puffer aufgenommen, abzentrifugiert und in einer Zellkonzentration von etwa 2x108 Zellen pro ml aufgenommen. Die mit magnetischen Partikeln verbundenen Antikörper werden in der entsprechenden Verdünnung hinzugefügt. Die Zellen werden für 15 min im Kühlschrank inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen nochmals gewaschen, in einem adäquaten Volumen (meist 5 ml) MACS-Puffer aufgenommen und über die Säule mit der ferromagnetischen Matrix gegeben, der ein starkes Magnetfeld anliegt. Vor der Zugabe der Zellsuspension werden die Säulen mit MACS-Puffer durchspült. Die Menge MACS-Puffer hängt von der Größe der Säule ab. Es wurde hierbei die Menge Puffer verwendet, die vom Hersteller empfohlen wurde.
Nach Vorbereiten einer Einzelzellsuspension werden die Erythrozyten lysiert und in MACS-Puffer gewaschen (siehe oben). Resuspendiert werden sie in einer Konzentration von 2x108 Zellen/ml und wie folgt sortiert:
Positivselektion der CD4 + Fraktion: Die Zellsuspension wird für 15 min bei 4°C mit anti-CD4, gekoppelt an magnetische Partikel, inkubiert. Hiernach werden die Zellen zweimal in MACS-Puffer gewaschen, in 5 ml aufgenommen und über die Säule gegeben, die vorher mit MACS-Puffer gespült wurde. Danach wird die Säule drei Mal mit 3 ml gespült, um Zellen zu entfernen, die den Antikörper nicht binden konnten. Diese Zellen können aufgefangen und als antigenpräsentierende Zellen (antigen presenting cells, APC) verwendet werden.
Wenn die Flüssigkeit vollständig durch die Säule gelaufen ist, wird die Säule von dem Magneten entfernt und über ein Zentrifugenröhrchen gesetzt. 5 ml MACS-Puffer werden auf die Säule gegeben und das Volumen wird mit einem Spritzenstempel passend zur Säule durch die Säule gespült. Damit werden auch die vorher gebundenen Zellen von der Säule getrennt.
Um eine höhere Reinheit der CD4+ Zellen zu erhalten, wird die Zellsuspension über eine zweite Säule gegeben. Die Reinheit der Zellaufreinigung wird
In einigen Experimenten war es nötig, die B220+ Zellen aus einer Zellsuspension zu entfernen. Dazu wird zuerst wie oben beschrieben eine Zellsuspension aus einer Mäusemilz hergestellt und die Zahl der lebenden Zellen bestimmt. Die Zellen werden in der vom Hersteller empfohlenen Menge MACS-Puffer suspendiert. Nun werden die Zellen für 15 min mit einem anti-B220 Antikörper, gekoppelt an magnetische Partikel, inkubiert. Danach werden die Zellen zwei Mal in MACS-Puffer gewaschen und über eine Depletionssäule gegeben. Diese Säule muss vorher mit MACS-Puffer gespült werden. Wenn die gesamte Zellsuspension durch die Säule gelaufen ist, werden 3 Mal 3 ml durch die Säule laufen gelassen, um möglichst viele Zellen, welche die B220 Antikörper nicht gebunden haben, aus der Säule zu entfernen. Diese Zellen werden in einem Zentrifugationsröhrchen aufgefangen und stellen die B220 depletierte Zellpopulation dar.
Die Reinheit der Zellen wird durchflusszytometrisch überprüft.
Meist reicht es bei einer Zelldepletion, die Zellen über nur eine Säule zu geben. Falls das Ergebnis der Depletion nicht zufriedenstellend sein sollte, ist es möglich, das Resultat zu verbessern, indem das Eluat über eine zweite Depletionssäule gegeben wird.
In dieser Arbeit wurde die Durchflusszytometrie eingesetzt, um die Expression von Oberflächenmolekülen, die Zytokinproduktion oder die Proliferation von Zellen von definierten Zellpopulationen zu untersuchen. Dazu werden die zu untersuchenden Antigene oder Zytokine mit Antikörpern gefärbt, die an einen fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt sind. Im Falle der Messung der Zellproliferation werden intrazelluläre Strukturen kovalent mit Farbstoff gefärbt, welcher keine Antikörpereigenschaften besitzt. Die Intensität der Fluoreszenz kann durchflusszytometrisch gemessen werden. In dieser Arbeit wurde ein FACSCalibur benutzt.
Fluoreszenz bedeutet, dass bestimmte Farbstoffe Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbieren und Licht anderer Wellenlänge mit einer zeitlichen Verzögerung emittieren.
Um Epitope von Oberflächenmolekülen oder Zytokine anzufärben, können entweder Antikörper, die mit Farbstoffen wie FITC, PE oder Cy5 gekoppelt sind („direkte Färbemethode“), oder Antikörper, die mit Substanzen gekoppelt sind, die erst in einem zweiten Färbeschritt an das eigentliche Fluoreszenz gebunden werden („indirekte Färbemethode“), verwendet werden. Zu letzterer Kategorie gehören Färbungen mit Antikörpern, die mit DIG oder Biotin gekoppelt sind. Dabei wird DIG mit an Fluoreszenzen gekoppelte anti-DIG Antikörper gefärbt, Biotin wird mit an Fluoreszenzen gekoppeltes Streptavidin gefärbt.
Da Biotin auch endogen von den Zellen produziert wird und somit intrazellulär vorhanden ist, sollte dieses System nicht für Intrazellulärfärbungen benutzt werden.
Es können auch Oberflächen- und Intrazellulärfärbungen an den gleichen Zellen vorgenommen werden. In einem solchen Fall werden zuerst die Oberflächenmoleküle gefärbt, dann die Zellen fixiert und die Intrazellulärfärbung vorgenommen.
Prinzip
Die Technik der Durchflusszytometrie basiert auf der Streuung von Licht und der Fluoreszenz von verschiedenen Substanzen. Damit die Streuung beziehungsweise die Fluoreszenz einzelner Zellen gemessen werden kann, werden die Zellen in einem Flüssigkeitsstrom nacheinander durch zwei Laserstrahlen (488 nm und 630 nm, 200 mW) geleitet. Das von den Zellen gestreute und emittierte Licht wird durch ein System von optischen Linsen, Spiegeln, Filtern und Photodetektoren geleitet, so dass das optische Signal in ein elektrisches Signal verwandelt werden kann. Dieses elektrische Signal kann mithilfe eines Computers weiterverarbeitet werden, so dass eine graphische Darstellung und eine statistische Auswertung der gemessenen Parameter für alle Zellen ermöglicht wird.
Der FACSCalibur ist mit einem 480 nm Argonlaser und einem 630 nm Dioden Laser ausgestattet und kann so bis zu sechs verschiedene Parameter aufnehmen:
Forward scatter (FSC): Streuung längs des Laserstrahls; proportional zur Zellgröße.
Fluoreszenz 1: proportional zur Farbintensität von Fluoreszeinisothiocynat (FITC) und CFSE. Beide haben ein Absorptionsmaximum von 492 nm und ein Emissionsmaximum von 520-530 nm.
Fluoreszenz 2: proportional zur Farbintensität von Phycoerythrin (PE) mit einem Absorptionsmaximum bei 488 nm und einem Emissionsmaximum bei 570-576 nm.
Fluoreszenz 3: proportional zur Farbintensität von Propidiumiodid (PI) und PerCP. Das Absorptionsmaximum von PI liegt bei 495 nm und das Emissionsmaximum bei 639 nm. Das Absorptionsmaximum von PerCP liegt bei 490, das Emissionsmaximum bei 675.
Fluoreszenz 4: proportional zur Farbintensität von Cy5 und Allophycocyanin mit einem Absorptionsmaximum von 625-650 nm und einem Emissionsmaximum von 660-670 nm.
Die Präparation der Proben und das Färben der Oberflächenmolekülen wird in FACS-Puffer (PBS, 0.5% BSA) vorgenommen. Bei jedem Waschschritt werden die Zellen in einer Heraeus Zentrifuge bei 300g zentrifugiert.
Eine Einzelzellsuspension (s. S. 34) wird zentrifugiert und das Pellet in FACS-Puffer aufgenommen. 0,5-5x106 Zellen wurden in einem 1,5 ml Eppendorfröhrchen aufgenommen.
Der von vielen Zelltypen exprimierter Fcγ-Rezeptor kann auch die konjugierten Antikörper binden und somit die Zellen unspezifisch anfärben. Um dies zu vermeiden werden die Zellen vor der eigentlichen Färbung mit ungekoppelten anti-Fcγ-Rezeptor Antikörpern und Ratten IgG in 90 µl FACS-Puffer für 10 min bei 4°C inkubiert. Alternativ dazu ist es auch möglich, diese Rezeptoren durch Zugabe von 10% Mäuseserum zu blocken. Diese Methode wurde in dieser Arbeit aber nicht verwendet.
Anschließend werden die Primärantikörper hinzugefügt. Diese Mischung besteht aus den spezifisch an die Oberflächenmoleküle bindenden Antikörpern. Die Antikörper werden gesondert in FACS-Puffer gemischt, wobei die Menge des eingesetzten Antikörpers bei etwa 0,5 bis 7,5 µg/ml liegt und von der Affinität und Färbeintensität des Antikörpers abhängt. Von dieser Mischung werden 10 µl zu jeder Zellsuspension
Die Zellen werden wiederum bei 4°C für 15 min inkubiert und anschließend zwei Mal gewaschen. Wenn auch indirekte Färbungen vorgenommen werden, wird jede Probe mit einer Mischung mit den Sekundärantikörpern inkubiert und nach der Inkubationszeit gewaschen.
Das Pellet wird vor der eigentlichen durchflusszytometrischen Analyse in 300-500 µl FACS-Puffer je nach Anzahl der Zellen aufgenommen und mit dem FACSCalibur gemessen. Die Daten wurden mit den Programmen Cell Quest oder WinMDI analysiert.
Antikörper zur Färbung von Oberflächenantigenen
Um intrazelluläre Zytokine zu färben, reicht es nicht aus, die Antikörper zu den Zellsuspensionen zuzufügen, da diese die Zellmembran nicht durchdringen könnten und somit die Zytokine nicht anfärben würden. Deswegen müssen der Färbung verschiedene andere Schritte vorausgehen. Im einzelnen sind das:
Die Stimulation der zytokinproduzierenden Zellen und die Zugabe eines Hemmers des intrazellulären Proteintransports während der Zellaktivierung, um eine Anreicherung der Zytokine innerhalb der Zelle zu erreichen.
Die Fixierung der Zellen, um eine Manipulation der Zellmembran zu erlauben, ohne dass deren Struktur zerstört wird.
Permeabilisierung der Zellmembran durch ein Detergenz (Saponin, Sigma) um den Durchtritt von Antikörpern zu erlauben und somit die intrazellulären Zytokine anfärben zu können.
Stimulation der Zellen
Die Zellen werden nach Anfertigung einer Einzelzellsuspension in vitro mit den entsprechenden Substanzen stimuliert, oder mit dem polyklonal aktivierendem Phorbolester (PMA) und Ionomycin stimuliert. Die Zellen wurden in einer Konzentration von 2x106 Zellen pro Milliliter suspendiert. PMA wurde in einer Konzentration von 5 ng/ml, Ionomycin in einer Konzentration von 1 µg/ml eingesetzt. Peptide wurden meist in der Konzentration von 10 µg/ml, andere Substanzen je nach Fragestellung einsetzt. Zellen wurden mit diesen Substanzen bei 37 °C in einer 5%CO2-Atmosphäre bei 95% Luftfeuchtigkeit für 6 Stunden inkubiert. Um die intrazellulären Transportprozesse zu blockieren, wird nach 4 Stunden Brefeldin A in einer Konzentration von 5 µg/ml zugefügt. Nach dieser Zeit werden die Zellen geerntet, zentrifugiert und in PBS gewaschen.
Anschließend folgt die Fixierung der Zellen.
Fixation der Zellen
Die Zellen werden durch Zugabe von 2% Paraformaldehyd fixiert. Die Zellen werden bei Raumtemperatur für 20 min inkubiert. Danach werden die Zellen zwei Mal in FACS-Puffer gewaschen. Nach dieser Fixierung können die Zellen bei 4°C für Wochen gelagert werden, wurden in dieser Arbeit aber nach 24 Stunden analysiert.
Permeabilisierung und Färbung
Alle Färbeschritte werden bei Raumtemperatur in Saponinpuffer (PBS, 0.5 % BSA, 0.5% Saponin) durchgeführt. Wie oben beschrieben werden die Fcγ-Rezeptoren durch Zugabe von anti-Fcγ-Rezeptor Antikörpern und Ratten IgG für 10 min blockiert. Danach werden die Zellen ohne Zentrifugation mit den Primärantikörpern inkubiert. Nach 15 min werden die Zellen gewaschen und bei Bedarf wird der Sekundärantikörper in Saponin hinzugefügt.
Nach diesem Schritt werden die Zellen zwei Mal in Saponin gewaschen und in 300-500 µl FACS-Puffer aufgenommen. Jetzt kann eine durchflusszytometrische Analyse vorgenommen werden.
Antikörper zum Färben von intrazellulären Zytokinen
Prinzip
Bei der durchflusszytometrischen Messung der Proliferation wird die Eigenschaft des Farbstoffes 5(6)-Carboxyfluorescein-diazetatsuccinimidylester(CFSE) genutzt[108], sich an intrazytoplasmatische Proteine kovalent zu binden. So erhält jede Zelle eine Färbung ähnlicher Intensität. Im Falle einer Zellteilung wird an jede Tochterzelle die Hälfte des Farbstoffs weitergegeben. Die Intensität ist somit bei jeder Zellteilung um die Hälfte verringert. Diese Abnahme kann durchflusszytometrisch erkannt werden und somit die Anzahl der Zellteilungen jeder Zelle genau festgestellt werden. Der Vorteil im Vergleich zu konventionellen Proliferationsassays mithilfe radioaktiven Thymidins besteht darin, dass die Proliferation bestimmter Zellpopulationen genau ausgewertet werden kann.
Generelles Vorgehen
Um Zellen mit CFSE zu Färben, werden Einzelzellsuspensionen (s. S. 34) angefertigt. Dabei ist es kritisch, die Zellen gut zu suspendieren und durch ein feines Sieb zu geben, damit keine Klümpchen in der Suspension vorhanden sind und alle Zellen dieselbe Menge CFSE aufnehmen.
Die Zellen sind nun mit CFSE gefärbt und werden mit den zu testenden Substanzen oder Zellen vermischt und in Kultur genommen. Nach mehreren Tagen (abhängig von der Fragestellung) können die Zellen der Kultur entnommen, Oberflächenmoleküle oder Zytokine wie oben beschrieben gefärbt und eine durchflusszytometrische Analyse vorgenommen werden.
Jede Maus wurde vor Verwendung in Experimenten auf die Expression des transgenen T-Zellrezeptors untersucht.
Da das Gen für den transgenen T-Zellrezeptor nicht notwendigerweise homozygot bei den T+α- Mäusen ist, gibt es Nachkommen, die diesen T-Zell Rezeptor nicht exprimieren.
Der transgene T-Zell Rezeptor besteht aus einer Vα2 und einer Vβ8 Kette. Da die endogenen α-Ketten ausgeschaltet sind und ein Rearrangieren der β-Kette nicht mehr möglich ist, exprimiert jede T-Zelle in diesen Mäusen den selben transgenen T-Zell Rezeptor.
Die zu untersuchende Maus wird für etwa 5 Minuten unter ein Rotlicht gesetzt, um die Gefäße zu erweitern. Mit einer scharfen Rasierklinge wird ein kleiner Schnitt am Schwanz der Maus gesetzt und ein mit EDTA gefülltes Röhrchen zum Auffangen der Blutstropfen unter den Schnitt gehalten. Etwa drei Blutstropfen werden gewonnen.
Dieses Blut wird abzentrifugiert. Das Zellpellet wird in 100 µl Lysispuffer aufgenommen und für 10 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Danach werden die Zellen wiederum abzentrifugiert, in 100 µl PBA aufgenommen, mit dem klonotypischen αTCR-bio (3H12) und αCD4-Cy5 gefärbt und für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend wird nach nochmaligem Waschen der Zellen der Sekundärantikörper Streptavidin-PerCP für 10 min zugegeben.
Bei vielen zu testenden Proben können alle Färbeschritte in einer 96-Napf-Mikrotiterplatte vorgenommen werden.
Mäuse mit einer Vβ8+CD4+ Zellpopulation wurden als T+α- Mäuse, Mäuse ohne jegliche T-Zellen als α- Mäuse definiert.
Um den Effekt der T-Zellrezeptor-MHC Molekül-Bindung auf die Aktivierung zu untersuchen, werden Moleküle, die zur Aktivierung von T-Zellen über den T-Zellrezeptor nötig sind, spezifisch blockiert.
Zu diesen Molekülen gehören beispielsweise der T-Zellrezeptor selbst, CD4 oder CD3 Moleküle, oder auch die MHC Moleküle der antigenpräsentierenden Zellen. Die Blockade der MHC Moleküle ist dadurch erschwert, dass sie einem sehr schnellen Umsatz unterliegen und somit nicht dauerhaft von Antikörpern blockiert werden können.
Da es sich bei den von uns verwendeten Mäusen um Mäuse mit nur einem T-Zellrezeptor handelt und es einen Antikörper gibt, der spezifisch an diesen T-Zellrezeptor bindet, bietet sich eine Blockade mit diesem Antikörper an. Als Kontrolle wurde auch eine Blockade mit CD4 Antikörpern des Typs L3T4 verwendet, da eine Blockade von T-Zellaktivierungen mit diesem Antikörper auch in anderen Systemen etabliert ist.
Beide Antikörper wurden 50fach stärker im Vergleich zu einer FACS-Färbung eingesetzt, um eine vollständige Blockade der entsprechenden Oberflächenmoleküle zu gewährleisten.
Die Antikörper wurden nach Präparation der Zellen vor Zugabe der Peptide bzw. der anderen Substanzen in die Zellkultur zugegeben. Nach einer 10-minütigen Inkubationszeit wurden die zu testenden Substanzen direkt zu den Zellen gegeben.
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist eine Krankheit, in der es durch autoreaktive T-Zellen zu Infiltraten und Zerstörungen innerhalb der weißen Substanz des Zentralnervensystems kommt. Diese Zerstörungen bedingen fortschreitende Lähmungen bei den erkrankten Tieren. Es gibt verschiedene Mausstämme, in denen sich diese Krankheit entwickelt. Die Verläufe unterscheiden sich von Modell zu Modell häufig sehr stark voneinander.
Aktiv induziert bedeutet, dass einer Maus EAE-induzierende Substanzen wie zum Beispiel Selbstpeptide in Adjuvant gespritzt wird. Das Immunsystem der Maus wird durch diese Substanzen aktiviert und reagiert gegen das Zentralnervensystem.
Im Gegensatz dazu steht die passive Induktion der EAE: Hierbei werden einer Maus aktivierte autoreaktive T-Zellen gespritzt. Diese Zellen lösen nun innerhalb der Maus EAE aus.
Für diese Experimente werden T+α--Mäuse verwendet. Diese Mäuse sind transgen für einen T-Zell-Rezeptor, der spezifisch für die ersten 11 Aminosäuren des Myelin-basischen Proteins (MBP) ist. Außerdem sind die endogenen TCR α-Ketten ausgeschaltet (knocked out), so dass ausschließlich selbstreaktive T-Zellen in diesen Mäusen vorkommen.
In dieser Arbeit wird durch die Induktion von EAE untersucht, ob Peptide oder andere Substanzen, die in vitro Proliferation von T-Zellen auslösen konnten, auch in vivo krankheitsinduzierend wirken.
Generelles Vorgehen
An Tag 0 wird 100 µl der zu testenden Substanz (bei Peptiden 200 µg) in 100 µl kompletten Freunds Adjuvant (Mineralöl plus Mykobakterien, Complet Freund’s Adjuvant, CFA) durch Ultraschall emulgiert.
Der zu untersuchenden Maus wird auf jede Seite der Schwanzbasis je 100 µl der Emulsion subkutan gespritzt.
24 und 48 Stunden danach wird den Mäusen in 100 µl PBS gelöstes 200 ng Pertussistoxin (PT) intravenös injiziert.
Nun werden die Mäuse jeden zweiten Tag auf Lähmungen kontrolliert. Abhängig vom Immunogen treten nach etwa 8-14 Tagen erste Lähmungen auf. Diese werden mithilfe eines klinischen Index gewertet:
Index 1: Der Schwanz ist gelähmt.
Index 2: Teilweise Paraparese der Hinterläufe.
Index 3: Vollständige Paralyse der Hinterläufe.
Index 4: Paralyse der Hinter- und Vorderläufe (bei diesem Zustand werden die Mäuse getötet und als Index 5 für den Rest des Experiments weitergeführt).
Index 5: Tod der Maus.
Pro Gruppe werden in jedem Experiment stets fünf oder mehr Mäuse verwendet werden, um eine signifikante Aussage zu erhalten.
Um das Ergebnis der einzelnen Mäusen in einem Ergebnis der Gesamtgruppe zu mitteln, werden die klinischen Indizes aller Mäuse addiert und durch die Anzahl der Mäuse dividiert. Obwohl dieses Verfahren statistisch nicht einwandfrei ist, da es sich bei dem klinischen Index um eine Nominalskala handelt und damit das arithmetische Mittel strenggenommen nicht berechnet werden kann, hat sich diese Auswertung bei der Beurteilung der EAE durchgesetzt und wird deswegen in dieser Arbeit auch so vorgenommen.
Bei diesen Experimenten werden α--Mäuse verwendet. Diese Mäuse stammen aus der Zucht der T+α--Mäuse. Da die T+α--Mäuse heterogen für den transgenen T-Zell-Rezeptor sein können, besitzen manche Nachkommen den transgenen T-Zell-Rezeptor nicht. Aufgrund der ausgeschalteten α-Ketten des T-Zell-Rezeptors sind diese Mäuse T-Zell-defizient. Aufgrund der nahen Verwandtschaft zu den T+α--Mäusen können Zellen dieser Mäuse in die α--Mäuse transferiert werden.
Generelles Vorgehen
Nach Herstellen einer Einzelzellsuspension von Milzen aus T+α--Mäusen werden diese Zellen für 3 Tage mit 10 µg/ml MBPAc1-11-Peptid oder anderen Substanzen stimuliert. Danach werden die Zellen mittels magnetischer Zellaufreinigung (magnetic cell sorting, MACS) sortiert oder die Prozentzahl der T-Zellen in der Zellsuspension durchflusszytometrisch analysiert.
Die Zellen werden gezählt, zentrifugiert und 15-100x106 T-Zellen in 1 ml PBS suspendiert. 100 µl dieser Zellsuspension wird intravenös in eine α--Maus gespritzt.
Danach werden die Mäuse beobachtet und deren Krankheit wie oben beschrieben beurteilt.
Prinzip
Um auswertbare Hirnschnitte zu erhalten, ist es erforderlich, autolytische Prozesse sofort nach Entnahme der Gewebe oder nach Töten der Mäuse zu stoppen. Dies geschieht mit Paraformaldehyd, welches Proteine denaturiert und Mikroorganismen abtötet, so dass jede biologische Veränderung des Gewebes verhindert wird.
Generelles Vorgehen
Die zu perfundierende Maus wird in ein Becherglas gesetzt, in welchem sich ein mit etwa 5ml Diethylether getränktes Tuch befindet. Nachdem Apnoe bei der Maus festgestellt wird, wird die Maus dem Becherglas entnommen, die Bauchhaut eröffnet und das Zwerchfell von kaudal eingeschnitten. Der Brustkasten wird links und rechts etwa 4 mm vom Sternum durchschnitten. Es ist darauf zu achten, dass größere Blutgefässe, insbesondere die Arteria thoracica interna, nicht durchschnitten werden.
Das Herz wird freipräpariert, der linke Vorhof eröffnet und eine Kanüle eingeführt. Der rechte Vorhof wird eröffnet. Über die Kanüle wird langsam 50ml PBS in den Ventrikel gespritzt. Danach wird 50ml Paraformaldehyd (4%) in das Herz gegeben.
Da die Substanzen durch den Blutkreislauf schnell an alle Stellen des Körpers verteilt werden, wird eine gleichmäßige Fixation der Mäuse erreicht.
Generelles Vorgehen
Um Gewebe histologisch untersuchen zu können, müssen sie in einen schneidbaren Zustand gebracht werden, in dünne Scheiben geschnitten und gefärbt werden.
Es gibt eine Veilzahl von Methoden der Fixation und der Färbung von Zellen, die je nach Fragestellung eingesetzt werden.
Bei unseren Experimenten kommt es auf die Beurteilung der ZNS Infiltrate der Mäuse an. Um ein schneidbares Gewebe zu erhalten, werden diese mit Paraformaldehyd (4%) fixiert und anschließend in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und in flüssigem Paraffin bei 62°C eingebettet.
Nach Anordnung der Gewebestücke in flüssigem Paraffin und deren Abkühlung kann der erhärtete Paraffinblock mithilfe eines Mikrotoms in 5-10µm dicke Scheiben geschnitten. Nachdem die Schnitte auf einen Objektträger gelegt werden, werden diese über eine absteigende Alkoholreihe in Wasser gelöst, mit Hämatoxilin und Eosin gefärbt und durch eine aufsteigende Alkoholreihe entwässert. Um die Stücke auf dem Objektträger luftdicht haltbar zu machen, wird ein Deckglas mit einem Tropfen Kanadabalsam über dem Gewebsstückchen fixiert.
Die Hirnschnitte wurden in dieser Arbeit von Dr. C. Stadelmann und Prof. W. Brück, Institut für Neuropathologie, Charité, beurteilt.
Um einen histologischen Index der experimentellen Enzephalomyelitis zu erhalten, werden alle entzündlichen Infiltrate auf jedem Rückenmarksquerschnitt zusammengezählt und durch die Anzahl der Rückenmarksquerschnitte geteilt. Die dadurch ermittelte mittlere Anzahl Infiltrate pro Querschnitt stellen ein gutes Korrelat zu dem klinischen Index dar und können so diesen absichern.
Außerdem wird die Zellzusammensetzung der Infiltrate beurteilt und deren Verteilung innerhalb des ZNS.
In dieser Arbeit wurden Mäuse verwendet, die transgen für einen T-Zellrezeptor sind, der spezifisch für die ersten 11 Aminosäuren des Myelin-basischen Protein ist. Durch die transgenen Tiere, zur Verfügung gestellt von Dr. J. Lafaille, wurde es uns möglich, die Kreuzreaktivität eines T-Zellrezeptors genauer zu charakterisieren. Dies erschien sinnvoll, da Kreuzreaktivität als hypothetische Ursache für Autoimmunität gesehen wird, deren genauer Umfang aber unbekannt ist (siehe auch Seite 18). Wir wollten deswegen als erstes mikrobielle Substanzen identifizieren, die imstande sind, bei den T+α- Mäusen EAE auszulösen.
Es wird davon ausgegangen, dass T-Zellen eine ursächliche Rolle für das Entstehen dieser Krankheit spielen (siehe auch Seite 25).
Da T-Zellen spezifisch durch Peptide aktiviert werden, werden mit einer speziellen Technik synthetisierte Peptide systematisch an Milzzellen der T+α- Mäusen getestet und die Zellproliferation gemessen.
Ausgewählte Peptide werden später in konventioneller Methode synthetisiert, so dass eine detailliertere Analyse der T-Zellantwort möglich ist.
Der nächste Schritt ist das Untersuchen der T-Zellantwort auf bakterielle Lysate. Damit soll festgestellt werden, ob die kreuzreaktiven Peptide auch bei der Prozession der bakteriellen Proteine überhaupt oder in einer ausreichenden Konzentration entstehen, um T-Zellen suffizient zu aktivieren und Autoimmunität zu erzeugen.
Da bakterielle Lysate nicht ausschließlich Proteine, sondern eine Vielzahl anderer Stoffe enthalten, von denen unter anderem Lipopolysaccharide (LPS) eine wichtige Rolle spielen, wird der Effekt dieser Substanzen auf die Aktivierung der T-Zellen untersucht.
Jeder Effekt, der in vitro beobachtet wird, kann in dem verwendeten System schnell in vivo überprüft werden. Somit kann getestet werden, ob die Effekte zumindest in diesem transgenen System ausreichend sind, um Autoimmunität auszulösen.
Die Definition eines Motivs, welches Peptide beschreibt, die potentiell T-Zellen einer Spezifität aktivieren können, wird Supertop genannt. Dabei ist es aber immer eine theoretische Voraussage, und um zu überprüfen, ob die im Supertop definierten Peptide
Da es gegenwärtig unmöglich ist, rechnerisch zu ermitteln, welche Peptide an MHC-Moleküle und T-Zellrezeptor binden, wäre es zur Ermittlung des vollständigen Supertops eines T-Zellrezeptors also notwendig, sämtliche möglichen Peptide zu synthetisieren und auf deren Fähigkeit, T-Zellen zu aktivieren, in vitro zu testen. Jedoch gibt es 20 natürlich vorkommende Aminosäuren; ein Peptid, welches von MHC-Molekülen gebunden werden kann, besteht aus etwa 10 Aminosäuren. Damit kämen 2010 Kombinationen in Frage (etwa 1013=10 Billionen verschiedene Peptide).
Deswegen wird ein Supertop möglichst so definiert, dass sehr viele von den beschriebenen Peptiden T-Zellen einer Spezifität aktivieren können. Dabei muss immer bedacht werden, dass die tatsächliche Menge von Peptiden, die diese T-Zellen aktivieren kann, dann sehr viel größer ist als die Menge der im Supertop beschriebenen Peptide.
Wie bereits erwähnt, sind die transgenen T-Zellen der T+α- Mäuse in dieser Studie spezifisch für das MBPAc1-11-Peptid (Peptidsequenz ist AcASQKRPSQRSK, wobei Ac die Azetylierung des Alanins an Position 1 des N-terminalen Ende des MBP-Proteins kennzeichnet).
Um das Supertop systematisch zu definieren, wurden Peptide auf Zellulosemembranen synthetisiert[109], die sich von dem ursprünglichen MBPAc1-11-Peptid in einer Position unterscheiden. Diese Synthese wurde im Institut für medizinische Immunologie der Charité in der Gruppe von Prof. J. Schneider-Mergener durchgeführt.
Da es 20 natürlich vorkommende Aminosäuren gibt, und das MBPAc1-11-Peptid aus 11 verschiedenen Aminosäuren besteht, sind 220 verschiedene Peptide möglich. Diese wurden auf Zellulosemembranen synthetisiert und zu Zellsuspensionen der T+α- Mäuse gegeben. Die Zellproliferation wurde nach 3 Tagen durch Messung von inkorporiertem 3H-Thymidin bestimmt (siehe Seite 36).
Diese Methode wird Substitutionsanalyse genannt.
Das Ergebnis ist in Abbildung 4 dargestellt.
Eine Proliferation von mehr als das 15-fache der Negativkontrolle wurde als signifikante Proliferation gewertet. Die Summe der Substitutionen, die diesen willkürlich gewählten Wert überschritten, wurden als Supertop definiert.
Nach dieser Methode kann man das Supertop wie folgt darstellen:
[AS] - [ACHNS] - [FHMQ] - X - [R] - [PQ] - {EFWY} - X - X - X - X
Bindestriche trennen die einzelnen Positionen.
Eckige Klammern kennzeichnen an dieser Stelle erlaubte Aminosäuren, geschweifte Klammern geben Aminosäuren an, die an dieser Stelle nicht erlaubt sind. X bedeutet, alle Aminosäuren dürfen an dieser Position substituiert werden.
Diese Annahme ist jedoch in vitro nicht uneingeschränkt gültig, da die verschiedenen Aminosäuren eines Peptides nicht unabhängig voneinander sind, sondern sich beeinflussen. Somit kann eine Substitution eine andere möglich machen beziehungsweise ausschließen.
Somit ist klar, dass dieses theoretische Supertop auch Peptide beschreibt, die in vitro keine T-Zellaktivierung hervorrufen können. Trotzdem stellt das theoretische Supertop eine gute Grundlage dar, Peptide zu finden, die tatsächlich die transgenen T-Zellen aktivieren können.
In dem Supertop, dass durch unsere Experimente definiert wurde, sind die für die MHC-Peptid-Bindung benötigten Aminosäuren, also die Ankerpositionen an Position 4 und 5 (siehe auch Pearson et al.[110]), nur an Position 5 konserviert. An Position 4 ist demgegenüber jede beliebige Aminosäure substituierbar, ohne dass die T-Zellaktivierung eingeschränkt würde. Dabei ist bekannt, dass das MBPAc1-11-Peptid ein schlechter Binder an das I-Au-MHC-Molekül ist[111]. Diese Befunde zeigen, dass eine gute Bindung an ein MHC-Molekül eine Aktivierung von T-Zellen vereinfachen kann, jedoch nicht unbedingt notwendig sein muss.
An den Positionen 3 und 6, die für die Bindung an den T-Zellrezeptor notwendig sind[110], können nur wenige Aminosäuren substituiert werden, ohne dass die T-Zellaktivierung verloren geht.
Um mikrobielle oder virale Peptide zu finden, die dem Supertop entsprechen, wurden die SWISS und TREMBL Datenbanken mithilfe der ExPasy Software im Internet (http://us.expasy.org/tools/scanprosite) nach dem Supertop durchsucht[112].
Es wurden 832 Peptide gefunden, die erstens dem Supertop entsprechen und zweitens in Bakterien oder Viren exprimiert werden. Diese Peptide wurden auf Zellulosemembranen synthetisiert und auf deren Fähigkeit, Milzzellen der T+α--Mäuse zu Proliferation anzuregen, untersucht. Es wurde wie im vorhergehenden Versuch die Inkorporation von 3H-Thymidin gemessen. Die Signalstärke der Negativkontrolle (PBS) war 2083 CPM, die Signalstärke des MBPAc1-11-Peptides war 167000 CPM.
Die 61 Peptide induzieren Proliferation, allerdings ist bei der oben beschriebenen Methode die Konzentration der Peptide in den Lösungen nur annäherungsweise zu bestimmen. Abgesehen von den Unterschieden in der Menge synthetisierten Peptides ist insbesondere bei unterschiedlichen Löslichkeiten zweier Peptide in Wasser mit einer unterschiedlichen Endkonzentration zu rechnen. Deswegen sind die Ergebnisse relativ ungenau, außerdem kann keine Aussage über die Dosisabhängigkeit der T-Zellaktivierung bei verschiedenen Peptiden gemacht werden.
Um bessere Vergleichbarkeit und genauere Aussagen über die Dosisabhängigkeit und der Art der von den T-Zellen produzierten Zytokine zu erreichen, war es somit erforderlich, die zu untersuchenden Peptide nach einer konventionellen Methode (Fmoc-Technik) in Pulverform zu synthetisieren und in einer definierten Konzentration zu lösen. Die Synthese der Peptide wurde von der Gruppe von Prof. J. Schneider-Mergener übernommen.
Aufgrund des erheblichen Zeit- und Kostenaufwandes konnten allerdings nicht alle 61 Peptide in Pulverform synthetisiert werden.
Wie aus Abbildung 5 erkennbar wurden Peptide aus einer Vielzahl auch häufig vorkommender Organismen wie zum Beispiel dem Darmbakterium Escherichia coli oder der Bierhefe Saccharomyces cerevisiae gefunden, die Peptide enthalten, welche die MBPAc1-11-spezifischen T-Zellen aktivieren können.
Wir entschieden uns, Peptide genauer zu untersuchen, die in Organismen vorkommen, die nicht im Verdacht stehen, ursächlich mit dem Entstehen von EAE oder MS in Verbindung zu stehen. Damit wäre gezeigt, dass unter speziellen Bedingungen das Auslösen von Autoimmunität durch molekulare Mimikry möglich ist. Da dann aber auch ubiquitär vorkommende Bakterien kreuzreaktiv zu dem untersuchtem T-Zellrezeptor wären, sollte es unter physiologischen Bedingungen Mechanismen geben, die das Hervorrufen von Autoimmunität durch Kreuzreaktivität eines T-Zellrezeptors verhindern.
Aufgrund dieser Überlegungen wurden 5 Peptide ausgewählt und synthetisiert (siehe ).
Einer suffizienten Aktivierung einer T-Zelle folgt die Proliferation der Zelle. Ein starker T-Zellrezeptoragonist ist durch eine Induktion der T-Zellproliferation auch schon bei geringen Konzentrationen des Agonisten gekennzeichnet. Um Peptide auf deren Immunogenität in einem bestimmten System zu untersuchen, ist die Erstellung einer Dosis-Wirkungskurve unerlässlich.
Es wurden Milzzellsuspensionen (s. S. 34) vorbereitet. Die zu untersuchenden Peptide wurden in absteigenden Konzentrationen zu den Suspensionen zugegeben und nach drei Tagen 3H-Thymidin zugegeben und die Inkorporation des radioaktiven Thymidins 18 Stunden später untersucht.
Das Ergebnis der Untersuchung ist in dargestellt. Die Peptide 383 und 378, die in der Analyse der auf Zellulosemembranen synthetisierten Peptide Proliferation hervorrufen konnten, induzieren in diesem Experiment Proliferationen der Milzzellen, die mit der Proliferation
In diesem System stimulieren die kreuzreaktiven Peptide auch bei niedrigen Konzentrationen die T-Zellen ähnlich wie das MBPAc1-11-Peptid. Das MBPAc1-11-Peptid kann in vivo T-Zellen aktivieren, deswegen sollten die Konzentrationen der kreuzreaktiven Peptide theoretisch auch in vivo erreicht werden können.
CD4+ T-Zellen wirken auf andere Zellen durch die Produktion von Zytokinen. Außerdem werden CD4+ T-Zellen aufgrund der von ihnen produzierten Zytokine verschiedene Klassen eingeteilt.
Um die von den T+α--Zellen synthetisierten Zytokine zu analysieren, wurden die Zytokine (IFN-γ, IL-2, TNF-α, IL-4) intrazellulär angefärbt und mittels
Zusätzlich wurde mithilfe der ELISA-Technik die Dosis-Wirkungskurven für die Induktion verschiedener Zytokine angefertigt[113] (Daten hier nicht gezeigt). Dabei wurde deutlich, dass die Peptide 378 und 383 auch in geringeren Konzentrationen die Produktion der getesteten Th1-Zytokine IL-2, IFN-γ in demselben Umfang wie MBPAc1-11induzierten.
Th2-Zytokine (IL-4, IL-5 und IL-10) wurden weder durch MBPAc1-11 noch von den mikrobiellen Peptiden induziert.
Die Kontrollpeptide 200 und 387 induzierten auch bei hohen Konzentrationen (bis zu 300 µg/ml) kein getestetes Zytokin in messbaren Mengen.
In vitro konnten somit keine relevanten Unterschiede betreff der Induktion von Proliferation von Milzzellen und der Produktion von Zytokinen durch CD4+-Zellen zwischen den mikrobiellen Peptiden 378 und 383 festgestellt werden.
Obwohl gezeigt wurde, dass die T-Zellen der transgenen Mäuse nach Stimulation mit mikrobiellen Peptiden bezüglich der Proliferation und der Produktion von inflammatorischen Zytokinen sehr ähnlich aktiviert werden wie durch das MBPAc1-11-Peptid, kann durch in vitro Experimente nicht gezeigt werden, dass diese Peptide auch in vivo in der Lage sind, Autoimmunität hervorzurufen.
Deswegen wurden T+α--Mäusen mit den Peptiden immunisiert und auf das Entstehen der Autoimmunkrankheit EAE hin beobachtet (Abbildung 9).
Am Tag 0 wurden die Peptide vor der Immunisierung in kompletten Freunds Adjuvant (CFA, Mineralöl mit abgetöteten Mykobakterien) emulgiert und den Mäusen seitlich der
Je 24 und 48 Stunden später wurde jeder Maus 200 ng Pertussistoxin intravenös appliziert. Dieses Toxin wird zur Auslösung von EAE in vielen Modellen verwendet, obwohl dessen genaue Wirkungsweise unbekannt ist (siehe Seite 24).
Die Mäuse wurden alle 2 bis 3 Tage auf das Auftreten von Lähmungen hin untersucht (siehe auch Seite 46).
Mit den Peptiden, die in vitro eine Aktivierung von T-Zellen auslösen konnten, konnte auch die Autoimmunkrankheit EAE in den transgenen Mäusen ausgelöst werden. Auf der anderen Seite erkrankten die Mäuse nicht an EAE, die mit PBS und mit Peptiden, die in vitro keine Aktivierung hervorriefen, immunisiert wurden.
Somit sind die EAE auslösenden Eigenschaften des MBPAc1-11-Peptides sowie der kreuzreaktiven mikrobiellen Peptide sowohl in vitro als auch in vivo ähnlich. Allerdings könnte es sein, dass die Peptide bei einer Prozessierung der mikrobiellen Proteine überhaupt nicht entstehen. Außerdem werden die Proteine von den Organismen nicht unbedingt in Konzentrationen synthetisiert, die ausreichend sind, um genügend kreuzreaktives Peptid entstehen zu lassen. Somit ist nicht gezeigt, dass auch die Proteine oder die Mikroben in vivo EAE auslösen können.
Obwohl diese mikrobiellen Peptide Induktoren der Autoimmunkrankheit EAE sind, und somit die Kreuzreaktivität des MBPAc1-11 T-Zellrezeptors der verwendeten Mäuse zu diesen Peptiden aufweist, bleibt die Frage, ob die Proteine der Bakterien von den antigenpräsentierenden Zellen der Maus auch so prozessiert werden, dass diese Peptide entstehen.
Um dies zu überprüfen, untersuchten wir die Eigenschaften auf die T+α--T-Zellen von Lysaten von Salmonella typhimurium. Diese wurden von Dr. U. Schaible kultiviert. Nach der Anzüchtung der Bakterien wurden diese durch Ultraschall lysiert, um ein Überwachsen der Zellkulturen mit Salmonellen zu verhindern.
In diesen Bakterien kommt das kreuzreaktive Peptid 383 im periplasmatischen β-Glucosidase Vorläuferprotein vor. Dieses Bakterium wurde ausgewählt, weil es sich einfach kultivieren lässt und das Peptid 383 von uns auf dessen Fähigkeit zur
Diese Lysate wurden Milzzellen zugegeben und die T-Zellproliferation untersucht. Ein minimaler Effekt wurde beobachtet (siehe Abbildung 10).
Da die bakteriellen Lysate aber auch andere immunstimulatorische Substanzen enthalten, wurden zur Kontrolle Lipopolysaccharide (LPS) den Zellkulturen zugesetzt.
Bei Zugabe von 2µg/ml LPS zu den Zellkulturen kommt es auch zu einer geringen T-Zellproliferation (siehe Abbildung 10). Diese T-Zellantwort ist ähnlich wie die Antwort, die bei Zugabe von bakteriellen Lysaten beobachtet wird. Um zu untersuchen, ob der beobachtete Effekt auf die transgenen Mäuse beschränkt ist, wurden auch PL/J-Mäuse untersucht. Dies ist ein Inzuchtstamm, der genetisch nicht verändert wurde. Es zeigte sich, dass die T-Zellproliferation auf LPS auch bei diesen Mäusen beobachtet werden konnte.
Da die zu beobachtende proliferative Antwort der T-Zellen auf LPS und Lysat sehr klein ist und die Aussage aus einzelnen Experimenten nicht möglich, wurden die Experimente oft wiederholt. Es zeigte sich, dass die Ergebnisse reproduzierbar sind und ein geringer Anteil (etwa 1 %) der T-Zellen durch Lipopolysaccharide zur Proliferation angeregt werden.
Die Messung der durch LPS induzierten Proliferation in T+α--Mäusen wurde beispielsweise 5 Mal durchgeführt. Der Mittelwert der proliferierenden T-Zellen bei LPS war 1,2% und bei PBS 0,3%. Das Konfidenzintervall für LPS war 1,0%-1,4% und bei PBS 0,2%-0,4% (p<0,015).
Zwar wird versucht, unspezifische Bindungen durch Blockade der Fcγ-Rezeptoren und durch Zugabe von Rattenimmunglobulin zu verhindern. Dennoch kann nicht ausgeschlossen werden, dass bei der Vielzahl der B-Zellen und Makrophagen, die nach LPS-Gabe proliferieren, einige den CD4 Antikörper unspezifisch binden. Dieses kann durch Untersuchung von entsprechenden Isotypkontrollen ausgeschlossen werden. Somit können selbst so geringe Unterschiede der Proliferation von CD4+ Zellen
Um eine bessere Aussage bezüglich der Aktivierung von CD4+-T-Zellen zu erhalten, wurde nach der Regulation von verschiedenen Aktivierungsmarkern geschaut. Zellaktivierungsmarker sind Moleküle, die sich bei der Aktivierung von T-Zellen verändern. Dazu gehören beispielsweise CD62L (L-Selektin), welches nach Aktivierung der Zellen weniger exprimiert wird, oder CD25 (α-Kette des IL-2-Rezeptors), welches nach Aktivierung stärker exprimiert wird als bei naiven bzw. unstimulierten Zellen.
Bei diesen Untersuchungen wurden Milzzellen von T+α- -Mäusen entnommen, Zellsuspensionen hergestellt und diese mit den zu untersuchenden Substanzen wie üblich für 3 Tage stimuliert.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 11 dargestellt.
Nach Stimulation der Zellen mit LPS wird CD62L sehr viel weniger exprimiert als nach Zugabe von PBS. CD25 wird nach LPS Stimulation etwas höher exprimiert als bei der Negativkontrolle, aber bei weitem nicht so hoch wie bei Zugabe von MBPAc1-11 Peptid bzw. Peptid 383. Dennoch werden beide Aktivierungsmarker aber durch Zugabe von LPS beeinflusst.
Eine wesentliche Frage ist die Möglichkeit einer vom T-Zellrezeptor unabhängigen Aktivierung der CD4+ T-Zellen. Um dies zu untersuchen, muss der T-Zellrezeptor durch entsprechende Antikörper blockiert werden (vgl. S. 45).
Zur Hemmung der Aktivierung der T-Zellen durch den T-Zellrezeptor müssen Oberflächenmoleküle durch spezifische Antikörper blockiert werden. Wir verwendeten dazu klonotypische anti-TCR Antikörper (3H12) und CD4 (L3T4) Antikörper.
Die Ergebnisse der Blockade mit beiden Antikörpern waren ähnlich, gezeigt sind hier die Ergebnisse mit anti-CD4.
Die blockierenden Antikörper wurden nach Herstellung der Milzzellsuspension von T+α- - Mäusen den Zellkulturen zugegeben und während der Inkubation der Zellen mit den verschiedenen Substanzen in der Suspension belassen.
Die Zugabe von PBS löste unabhängig von der Zugabe der Antikörper keine Proliferation der CD4+ T-Zellen aus (siehe Abbildung 12).
LPS kann, wie bereits in Abschnitt 4.5.2.2 gezeigt wurde, die Zellen unbehandelter Milzzellen in einen aktivierten Zustand (CD62LlowCD25high) versetzen. Diese Aktivierung ist allerdings nicht so stark wie die Aktivierung der T-Zellen durch das MBPAc1-11-Peptid.
Im Gegensatz zu diesem werden die Zellen durch LPS aber auch dann noch aktiviert, wenn der T-Zellrezeptor durch Antikörper blockiert ist (siehe Abbildung 12). Dies deutet darauf hin, dass die Aktivierung der CD4+ T-Zellen unabhängig vom T-Zellrezeptor ist. Es müssen also andere Mechanismen dafür verantwortlich sein, die eine Aktivierung der T-Zellen hervorrufen. Da die Spezifität der T-Zellen durch den T-Zellrezeptor gewährleistet ist, ist die Aktivierung der T-Zellen durch LPS definitionsgemäß eine antigenunabhängige Aktivierung.
Um auszuschließen, dass sich der beobachtete Effekt von LPS auf CD4+ T-Zellen nur auf die transgenen T+α- Mäuse beschränkt, untersuchten wir Milzzellen von PL/J Mäusen. Diese Mäuse verfügen über ein normales T-Zellrepertoire und sind auch sonst in keiner Weise genetisch verändert. Solche Mäuse werden Wildtypmäuse genannt. Milzen von diesen Mäusen wurden entnommen und präpariert (siehe Abschnitt 3.2.1.2). Nach 3 Tagen Kultur mit verschiedenen Substanzen wurde eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt. Es zeigte sich, dass in diesen Mäusen LPS einen Effekt ähnlich wie bei den T+α- Mäusen auf die CD4+-T-Zellen ausübt (siehe Abbildung 13) und dass es sich bei dem beobachteten Effekt nicht um ein Artefakt durch den transgenen Phänotyp der T+α- Mäuse handelt.
Das Peptid MBPAc1-11 sowie die Peptide 383 und 378 hatten in den PL/J-Mäusen erwartungsgemäß keinen Effekt, da die spezifischen T-Zellen ohne vorheriger Immunisierung in so geringer Zahl vorhanden sein sollten, dass deren Aktivierung nicht messbar ist. Allerdings ist damit nicht gezeigt, dass die Aktivierung von T-Zellen durch LPS auch in Wildtypmäusen eine Relevanz besitzt und durch ihn Autoimmunität hervorgerufen werden kann. Es ist möglich und meines Erachtens wahrscheinlich, dass sich dies auf die transgenen Mäuse beschränkt, weil hier die autoreaktiven T-Zellen eine besonders hohe Frequenz haben.
Bei diesen geringen T-Zellproliferationen muss untersucht werden, ob es sich um ein physiologisch relevantes Phänomen handeln. Um dies zu überprüfen, ist es nötig, den Effekt von LPS und den bakteriellen Lysaten in vivo experimentell zu untersuchen.
Dazu wurden T+α- -Mäuse mit LPS (50 µg/Maus) oder Lysate (1x108 lysierte Bakterien/Maus), in Kompletten Freunds Adjuvant emulgiert, subkutan injiziert. 24 und 48 Stunden später wurde Pertussistoxin (200 ng/Maus) intravenös appliziert.
Als Kontrolle wurden andere Gruppen von T+α- - Mäusen mit PBS als Negativkontrolle und MBPAc1-11-Peptid oder dem Peptid 383 als Positivkontrolle immunisiert.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 14 gezeigt.
Es wird deutlich, dass auch LPS und das bakterielle Lysat in vivo die Autoimmunkrankheit EAE in T+α- Mäusen hervorrufen kann. Dass die Mäuse nicht bei jeder Form der Immunisierung krank werden, ist durch die Negativkontrolle gezeigt, denn hier werden die Mäuse auch mit den immunstimulatorisch wirkenden Adjuvantien Kompletten Freunds Adjuvant und Pertussistoxin immunisiert.
Von anderen Gruppen wurde beschrieben, dass sich das histologische Erscheinungsbild der Krankheit EAE unterschiedlich darstellen kann, wenn andere Bedingungen geschaffen werden. Speziell zeigte Dr. J. Lafaille, dass Th2-Zellen in Mäusen Infiltrate erzeugen, in denen polymorphkernige Granulozyten und Mastzellen vorherrschen, im Gegensatz zu dem Vorherrschen von Makrophagen in Infiltraten hervorgerufen von Th1-Zellen[114].
Eine wichtige Frage ist also, ob die Histologien der Infiltrate von Mäusen, nachdem sie mit LPS immunisiert wurden, sich von den Histologien der mit Peptid immunisierten Mäuse unterscheidet.
Um dies zu untersuchen, wurden Gehirne und Rückenmarke von erkrankten Mäusen bei einem klinischen Index von 3 nach verschiedenen Immunisierungen entnommen, histologisch aufbereitet und untersucht (siehe Abschnitt 3.2.3). Die Untersuchung beinhaltet die Beschreibung der Infiltrate betreffs Zusammensetzung und Lokalisation. Außerdem wird korrespondierend zu dem klinischen Index ein histologischer Index ermittelt. Dieser ist gleich der durchschnittlichen Anzahl von Infiltraten pro Rückenmarksquerschnitt.
Die Auswertung der Histologien nahm Dr. C. Stadelmann, damals Instituts für Neuropathologie der Charité, vor.
Wie in Abbildung 15 zu sehen, konnten keine Unterschiede zwischen Infiltraten von mit LPS- oder MBP-Peptid immunisierten Mäusen festgestellt werden. Auch der histologische Index unterschied sich nicht. Bei den Infiltraten und Indizes von Mäusen, die mit S. typhimurium-Lysat immunisiert wurden, wurden keine Unterschiede festgestellt, die Histologien sind aber nicht gezeigt.
Bei den Infiltraten herrschen Mac-3-positive Zellen, also Makrophagen, vor. Einige CD3-positive (T-Zellen) und einige B220-positive (B-Zellen) Zellen kommen vor.
Die Ergebnisse für mit Peptid immunisierte Mäuse decken sich mit Ergebnissen anderer Arbeiten (Seite 23), die Ergebnisse für mit LPS immunisierten Mäuse lassen keinen
Unterschied erkennen.
Durch die vorhergehenden Experimente ist zwar gezeigt, dass LPS einen in vitro Effekt auf T-Zellen hat und dass LPS in T+α- -Mäusen EAE auslösen kann. Allerdings könnte
Um dies zu untersuchen, wurden α-/- -Mäuse mit LPS oder bakteriellen Lysaten immunisiert. Diese Mäuse stammen aus derselben Zucht wie die T+α- -Mäuse. Da der transgene T-Zellrezeptor in manchen Mäusen heterozygot vorhanden ist, werden bei der Zucht gelegentlich Mäuse geboren, die den transgenen T-Zellrezeptor nicht vererbt bekommen haben. Diese Mäuse werden durch Bluttestung auf CD4+ Vβ8+-Zellen ermittelt und in einer gesonderten Zucht verpaart. Diese Mäuse besitzen keine T-Zellen, da durch das Ausschalten der T-Zellrezeptor α-Ketten kein funktioneller T-Zellrezeptor gebildet werden kann.
Diese Mäuse wurden wie oben beschrieben LPS in Adjuvant und mit Pertussistoxin i.v. immunisiert. Trotz mehrfacher Wiederholung der Experimente (insgesamt wurden 20 Mäuse immunisiert), wurde bei keiner Maus das Entstehen von EAE beobachtet. Dies zeigt, dass T-Zellen zur Induktion von EAE durch LPS nötig sind.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen mikrobiellen Infektionen und Autoimmunkrankheiten untersucht. Die Hypothesen der molekularen Mimikry und der „Bystander-Aktivierung“ wurden an einem Mausmodell für die Autoimmunkrankheit experimentelle autoimmune Enzephalitis (EAE) überprüft.
In dieser Arbeit wurden Experimente zur Untersuchung der Spezifität eines I-Au/MBPAc1-11 spezifischen, murinen T-Zellrezeptors durchgeführt. Der Spezifität eines T-Zellrezeptors wird aufgrund der Schlüsselrolle der CD4+ T-Zellen im Immunsystem eine wesentliche Rolle bei der Entstehung von spezifischer Immunität gegen Bakterien einerseits, auf der anderen Seite aber auch bei der Induktion von Autoimmunität durch das Erkennen von Selbstpeptiden, zugeschrieben.
Wie in Abschnitt 4.3 dargestellt, fanden wir viele Peptide viralen und bakteriellen Ursprungs, welche in vitro die I-Au/MBPAc1-11 spezifischen T-Zellen zur Proliferation anregen und somit aktivieren. Bei näherer Untersuchung einiger dieser Peptide (siehe Abschnitt 4.4) zeigte sich, dass sich die Dosis-Wirkungskurven und die durch die Peptide induzierte Zytokinexpression sich nicht von der durch das Selbstpeptid MBPAc1-11 induzierten Aktivierung unterschied. Des weiteren waren sowohl das Selbstpeptid MBPAc1-11 als auch die Peptide mikrobiellen Ursprungs in der Lage, experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) in den von uns verwendeten transgenen T+α--Mäusen auszulösen. Auch hier war kein Unterschied im Schweregrad oder im Verlauf der induzierten Krankheit festzustellen. Somit ist erstens Autoimmunität über Kreuzreaktivität auslösbar, zweitens kommen sehr viele mikrobielle oder virale Peptide vor, die mit Selbstpeptiden an einem T-Zellrezeptor kreuzreagieren.
Es konnte im Rahmen dieser Arbeit allerdings nicht die Frage beantwortet werden, ob die kreuzreaktiven Peptide auch in vivo aus den Proteinen prozessiert werden oder ob die Proteine in einer Konzentration vorkommen, welche ausreicht, um eine suffiziente T-Zellaktivierung hervorzurufen. Ein Versuch zur Beantwortung dieser Frage wurde von uns durch die Untersuchung der Lysate von S. typhimurium unternommen. Allerdings war die Proliferation der Th-Zellen auf das Lysat nur sehr gering und wurde auch durch LPS ausgelöst. Dementsprechend kann keine Aussage darüber gemacht werden, ob
Einen Hinweis darauf, dass es Kreuzreaktivität zwischen Peptiden gibt, die in vivo prozessiert werden und in der nötigen Konzentration vorkommen, ohne dass diese Kreuzreaktivität eine beobachtbare Rolle spielt, verdeutlichte ein Ergebnis von Maier et al. in unserer Gruppe[61]: Für die Experimente wurden Mäuse verwendet, die transgen für humanes HLA-DR4 und humanes CD4 waren, wobei die endogenen MHC-II-Moleküle der Mäuse ausgeschaltet wurden. Aus diesen Mäusen wurden T-Zellklone generiert, die spezifisch für Peptide des OspA-Protein von Borrelia burgdorferii in Verbindung mit dem HLA-DR4+-Molekül sind.
T-Zellen solcher Spezifität sind möglicherweise an der Pathogenese der therapieresistenten Verlaufsform der Lyme-Arthritis beteiligt.
Diese T-Zellhybridome wurden auf Kreuzreaktivität mit Selbstpeptiden untersucht.
Interessanterweise fanden sich unter anderem Kreuzreaktivitäten zwischen dem OspA-Peptid und dem Vorläuferprotein des Insulins. Dabei war das Peptid des Proinsulins genau ein solches Epitop, welches auch bei HLA-DR4+ Diabetespatienten immundominant ist. Dies zeigt, dass dieses Peptid tatsächlich in vivo vorkommt und prozessiert wird. Dennoch ist eine Assoziation zwischen Lyme-Borreliose und Diabetes mellitus Typ I nicht beobachtet worden.
Sowohl die Ergebnisse von Maier et al. als auch unsere Ergebnisse fanden also multiple kreuzreaktive Peptide in zwei unterschiedlichen Systemen, wobei beide Methoden das Ausmaß der Kreuzreaktivität noch unterschätzen dürften. Doch selbst bei der Untersuchung dieser Peptide wurden kreuzreaktive Peptide gefunden, die in vivo prozessiert werden. Unter physiologischen Bedingungen kommen Tausende von unterschiedlichen T-Zellen vor, und es ist, auch nach Ergebnissen anderer Gruppen[59,60,113,61,115,116,117], davon auszugehen, dass jeder T-Zellrezeptor eine Vielzahl von Peptiden erkennt.
Kreuzreaktivität ist somit ein sehr häufig vorkommendes Ereignis.
Als zusätzliches Ergebnis der Arbeit ist die wichtige Aussage festzuhalten, dass es bei der Suche nach mikrobiellen Peptiden, die autoaggressive T-Zellen aktivieren können, nicht ausreicht, homologe Peptide, also Peptide gleicher oder ähnlicher Sequenz, zu bestimmen. In dieser Arbeit wurden beispielsweise 5 kreuzreaktive Peptide gefunden, die eine dem MBPAc1-11-Peptid vergleichbare Proliferation hervorrufen und nur an 2 Positionen identische Aminosäuren wie das MBPAc1-11-Peptid besitzen. Eine Suche
Auch eine Suche nach Peptiden, die strukturelle Ähnlichkeiten zu dem Ausgangspeptid besitzen, würde das Ausmaß der Kreuzreaktivität unterschätzen. Beispielsweise sind an Position 3 des von uns verwendeten Supertops die Aminosäuren Phenylalanin, Histidin, Methionin und Glutamin substituierbar, ohne dass die T-Zellaktivierung beeinträchtigt wird. So ist zwar sowohl die Seitenkette des Ausgangspeptids Glutamin als auch von Methionin unverzweigt, unpolar und relativ lang. Wird die Seitenkette des Glutamins nur um eine Methylgruppe verkürzt, also Asparagin substituiert, geht die T-Zellaktivierung verloren.
Auf der anderen Seite besteht keine offensichtliche Ähnlichkeit zwischen diesen Aminosäuren und den Aminosäuren Phenylalanin und Histidin, die eine aromatische Seitenkette besitzen. Fügt man an das Phenylalanin nur eine –OH-Gruppe, substituiert also Tyrosin, geht die T-Zellaktivierung sehr stark zurück.
Wenn man bei einer Suche nach strukturellen Ähnlichkeiten an Position 3 nur Methionin und Glutamin als Aminosäuren mit langen, unpolaren Seitenketten gelten lässt, wären nur 39 Peptide statt der 61 kreuzreaktiven Peptide gefunden worden. Allein hier hätte man die Kreuzreaktivität um ein Drittel unterschätzt.
Außerdem ist festzuhalten, dass es auch nicht genügt, Peptide zu finden, die besonders gut an MHC-Moleküle binden[118]. Die von uns untersuchte T-Zellrezeptor/MBPAc1-11/I-Au-Bindung ist im Gegenteil dadurch gekennzeichnet, dass sie besonders kurzlebig und die Affinität des T-Zellrezeptors an den MBPAc1-11/I-Au-Komplex eher schwach ist[111,119,110]. So konnte Position 4, also neben Position 5 die zweite Bindungsstelle an das MHC-Molekül, durch jede natürlich vorkommende Aminosäure ersetzt werden, ohne dass die T-Zellaktivierung beeinträchtigt wurde.
Es wurde sogar diskutiert, dass in diesem Modell die kurze Bindungszeit benötigt wird, um das Peptid immunogen zu halten und eine Toleranzinduktion zu verhindern[120].
Da es keine verwendbaren mathematischen Modelle zur Vorhersage von Kreuzreaktivität gibt, muss also zur Bestimmung kreuzreaktiver Peptide eine systematische Definition des Supertops und anschließende Überprüfung der Peptide durchgeführt werden, wie dies in dieser Arbeit durchgeführt wurde.
Inwieweit betreffen diese Ergebnisse die Vorstellungen über die Antigenerkennung durch T-Zellen? Wie oben bereits beschrieben, kommt dem T-Zellrezeptor eine Schlüsselrolle durch die Bindung an MHC/Antigen-Komplexe zu (siehe Seite 11 ff.). Wenn Kreuzreaktivität ein häufig vorkommendes Ereignis ist und somit die enge Spezifität der T-Zellrezeptoren nicht mehr gewährleistet ist, können die jetzigen Konzepte zur T-Zellrezeptor/Antigen-Erkennung noch beibehalten werden?
Um diese Frage zu diskutieren, soll noch einmal festgehalten werden, dass in dieser Arbeit zwar festgestellt wurde, dass die Spezifität der T-Zellen geringer ist als in klassischen Modellen postuliert, aber dennoch nicht jedes Peptid durch jeden T-Zellrezeptor erkannt wird. Vielmehr ist es so, dass jeder T-Zellrezeptor eine bestimmte Gruppe von Peptiden erkennt, welche sich durch manche strukturelle Gemeinsamkeiten ähneln. Somit ist ein T-Zellrezeptor schon spezifisch, wenn auch nicht für nur ein einziges Peptid.
Des weiteren ist zu sagen, dass in dieser Arbeit, aufgrund des gewählten Tiermodells, Kreuzreaktivität als negatives Ereignis, nämlich dem Entstehen von Autoimmunität, gesehen wurde.
Allerdings wird diskutiert, dass unter physiologischen Bedingungen Kreuzreaktivität zwischen Selbst- und Fremdpeptiden benötigt wird, um nach einer Infektion die entstandenen Gedächtnis-T-Zellen durch ständige, suboptimale Stimulation der T-Zellen in einem funktionsfähigem Zustand zu halten[121,122]. Naive T-Zellen würden durch eine solche suboptimale Stimulation eventuell nicht aktiviert werden, da sie eine stärkere T-Zellrezeptor-Antigen-Bindung benötigen, um aktiviert zu werden[123,124].
Für einen weiteren, sehr interessanten Beitrag, zur Diskussion der Relevanz der T-Zellrezeptor-Antigen-Bindung bei eingeschränkter Spezifität der T-Zellrezeptoren halte ich die Arbeit von Mason[125], in welcher postuliert wird, dass ohne Kreuzreaktivität eine suffiziente T-Zellantwort nicht möglich wäre, da, wenn jede T-Zelle nur ein Peptid erkennen würde, die Wahrscheinlichkeit, dass ein Fremdpeptid von einer T-Zelle erkannt würde, sehr gering wäre, da die Frequenz der für dieses Fremdprotein spezifischen T-Zellen sehr gering wäre. Demnach würden Infektionen nicht oder nur
Ich vermute, dass man in Erweiterung dieser Spekulation auch eine physiologische Immunantwort verstehen kann:
Im Thymus werden T-Zellen depletiert, die zu stark durch Selbstpeptide aktiviert werden. Unter Bedingungen ohne eine Infektion würden naive T-Zellen demnach nicht aktiviert.
Wird ein Individuum von einem Fremdorganismus infiziert, enthält dieser Organismus nicht nur ein, sondern sehr viele Fremdpeptide. Außerdem würden durch immunstimulatorische Substanzen wie LPS oder CpG oder auch durch Gewebeuntergang kostimulatorische Moleküle an den antigenpräsentierenden Zellen exprimiert. Es würden also sehr viele verschiedene T-Zellen auf einmal aktiviert und durch die Peripherie zirkulieren. Tritt eine Infektion mit demselben Fremdorganismus an einer anderen Stelle im Körper auf, würden also wiederum sehr viele T-Zellen gleichzeitig durch diesen Krankheitserreger stimuliert werden und eine Immunantwort hervorrufen.
Da unter physiologischen Bedingungen diese T-Zellantwort eben gerade sehr divers ist, erkennt jede der aktivierten T-Zellen zwar Peptide des Fremdorganismus, jedoch sind die Selbstpeptide, durch welche die T-Zellen aktiviert werden, in unterschiedlichen Geweben lokalisiert. Des weiteren werden in diesen Geweben keine kostimulatorischen Moleküle exprimiert, da dort vermutlich keine Infektion vorliegt. Die T-Zellen, die also in solchen Geweben durch Selbstpeptide aktiviert würden, würden zwar kurzzeitig eine geringgradige Inflammation und eventuell eine geringe Zellzerstörung kommen. Da in diesen Geweben aber nur sehr wenige T-Zellen aktiviert würden, würde die Frequenz der T-Zellen nicht ausreichen, um eine andauernde Inflammation hervorzurufen. Insbesondere würden solche T-Zellen durch immunsuppressive Gegenregulation, also zum Beispiel durch regulatorische T-Zellen oder durch bestimmte Oberflächenmoleküle, an der Induktion einer suffizienten Inflammation gehindert. Schließlich würden die T-Zellen entweder durch solche Mechanismen oder durch aktivierungsinduzierten Zelltod in Apoptose übergehen.
Gewebe, die besonders empfindlich für Gewebezerstörung sind, insbesondere das ZNS, sind durch die in Abschnitt 1.5.2 beschriebenen Schranken vor unkontrolliertem Eindringen von T-Zellen geschützt.
Gesetzt den Fall, es kommt zu einer Infektion in einem besonders empfindlichen Organ oder eine T-Zelle erkennt ein Selbstpeptid in dem durch den Fremdorganismus entzündeten Gewebe. Bei dem Ausmaß der Kreuzreaktivität, wie sie in dieser Arbeit gefunden wurde, wäre dies wahrscheinlich ein häufig vorkommendes Ereignis.
Die Frage ist, ob es in einem solchen Fall zu Autoimmunität käme: Es würden zur selben Zeit sehr viele T-Zellen aktiviert, des weiteren würden kostimulatorische Moleküle exprimiert.
In einem solchen Fall sollten solche T-Zellen tatsächlich durch Selbstpeptide aktiviert werden. Wesentlich ist aber, dass bei einem Rückgang der Inflammation die anderen T-Zellen verschwinden würden. Da während der Inflammation durch Fremdpeptide aktivierte T-Zellen ebenso proliferierten wie die autoreaktiven Zellen, sollte die Frequenz der autoreaktiven T-Zellen gering sein im Vergleich zu den vielen verschiedenen T-Zellen, die durch Selbstpeptide dieses Gewebes nicht aktiviert werden. Bei einem Rückgang der Inflammation genügten die selbstreaktiven T-Zellen deswegen wahrscheinlich nicht, um alleine eine Inflammation aufrechtzuerhalten, insbesondere, da auch die immunstimulierenden Substanzen des Fremdorganismus fehlen. Diese T-Zellen sollten dementsprechend durch aktivierungsinduziertem Zelltod in Apoptose übergehen.
Es soll noch einmal wiederholt werden, dass oben beschriebenes Konzept hypothetisch ist und mit dieser Arbeit nicht bewiesen werden kann. Eine Schwierigkeit, diese Hypothese zu belegen, ist, dass sämtliche Modelle, welche Kreuzreaktivitäten untersuchen, eine artifiziell hohe Anzahl von T-Zellen einer Spezifität aufweisen, da unter physiologischen Bedingungen die Frequenzen eines bestimmten T-Zellrezeptors exprimierender T-Zellen zu gering sind, um diese zu untersuchen.
Nach obiger Hypothese käme es mit solchen Modellen auch besonders häufig zu Autoimmunität, da die artifiziell hohe Frequenz dieser T-Zellen einer Spezifität eventuell
Es bleibt zu diskutieren, ob molekulare Mimikry als Auslöser von Autoimmunkrankheiten in Frage kommt oder nicht.
Nach den Ergebnissen dieser und anderer Arbeiten[59,60,113,61,115,116,117] ist Kreuzreaktivität ein sehr häufig vorkommendes Ereignis. Deswegen reicht in den allermeisten Fällen Kreuzreaktivität nicht aus, um Autoimmunität auszulösen, wenn nicht noch andere Faktoren hinzukommen (siehe auch Abschnitt 5.3).
Jedoch kann nicht ausgeschlossen werden, dass nicht doch ein Fremdorganismus vorkommt, der über Kreuzreaktivität eine Autoimmunerkrankung auslösen kann. Nach der im vorigen Abschnitt vorgeschlagenen Hypothese können mit einiger Vorsicht Voraussagen getroffen werden, wie ein Organismus beschaffen sein könnte, dass die Wahrscheinlichkeit zur Induktion von Autoimmunität durch molekulares Mimikry höher ist:
Eine Möglichkeit wäre, dass der hypothetische Fremdorganismus nur sehr wenig Fremdproteine enthält. Da eine T-Zellantwort somit auf nur wenige T-Zellklone beschränkt bliebe, würde die Frequenz einer T-Zellpopulation einer Spezifität stark ansteigen. Somit wäre die Wahrscheinlichkeit, dass die expandierenden T-Zellen im gesunden Gewebe selbstständig Inflammation auslösen können, besonders hoch. Einem solchen hypothetischen Krankheitserreger entsprächen Viren am ehesten, da sie besonders wenige Proteine enthalten und bei viralen Infekten nur wenige Peptide immundominant sind.
Eine zweite Möglichkeit wäre, dass ein Fremdorganismus an sehr vielen T-Zellepitopen kreuzreaktiv zu Peptiden in einem bestimmten Organ ist. Wenn viele verschiedene T-Zellen Selbstpeptide in diesem Organ erkennten, reichten diese T-Zellen eventuell aus, um auch Inflammation in diesem Organ hervorzurufen und zu unterhalten. Ein solches Prinzip könnte sowohl in Bakterien, Parasiten oder in Viren vorkommen. Es muss jedoch betont werden, dass zu beiden Möglichkeiten noch keine detaillierten Studien unternommen wurden.
Untersuchungen, dass durch molekulare Mimikry Autoimmunität induzierbar ist, sollten dementsprechend immer sehr sorgfältig durchgeführt werden, und es sollte mehr
Veröffentlichungen, die untersuchen, ob in einem Fremdantigen und einem Selbstantigen Kreuzreaktivität vorkommt, wenn ein epidemiologischer Zusammenhang zwischen einer bestimmten Infektion oder einem Nahrungsbestandteil und einer bestimmten Erkrankung vermutet wird, sind demnach eher kritisch zu betrachten[62,126].
Ein Ziel der Arbeit war, mikrobielle Peptide zu finden, welche die transgenen T-Zellen aktivieren können. Es wurde das Prinzip der Substitutionsanalyse verwendet. Diese beruht darauf, durch Veränderungen des Selbstpeptids an jeweils einer Aminosäure herauszufinden, welche Änderungen eine Aktivierung der T-Zellen hervorrufen können. Die erlaubten Aminosäuresubstitutionen wurden in einem Motiv, dem Supertop, zusammengefasst.
Eine solche Supertopanalyse hat den Vorteil, dass man eine größere Menge mikrobieller Peptide findet und somit das Ausmaß von Kreuzreaktivität nicht unterschätzt. Außerdem wird eine systematische, vorurteilsfreie Definition des Supertops vorgenommen.
In anderen Arbeiten wurde jede Position des bekannten Peptids ausschließlich gegen Alanin oder gegen bestimmte Peptide ersetzt und untersucht, welche Position somit nicht essentiell für die Aktivierung der T-Zellen sind[59,64]. Diese Methoden haben aber den Nachteil, dass es möglich ist, dass an der untersuchten Position eventuell Alanin „erlaubt“ ist, aber andere Aminosäuren an dieser Position keine Aktivierung zulassen. Umgekehrt könnte es sein, dass Alanin keine Aktivierung hervorruft, dafür aber Aminosäuren, die beispielsweise eine andere Polarität besitzen. Das entstehende Motiv wäre also ungenau.
Auf eine andere, sehr interessante Variante soll im folgenden näher eingegangen werden, da sie in gewissem Sinne komplementär zu der von uns verwendeten ist und sich beide Vorgehensweisen ergänzen:
In der von Hemmer und Martin[60] entwickelten Methode werden nicht einzelne Aminosäuren des bekannten Peptids verändert, sondern es wird genau eine Aminosäure unverändert gelassen. Alle anderen Positionen werden zufällige Aminosäuren gebunden, so dass man einen Mischung von vielen Millionen
Diese Proben werden in vitro zu den zu untersuchenden Zellkulturen gegeben. Die Aktivierung der Zellen wird gemessen, und es wird ermittelt, welche Aminosäure an welcher Stelle möglich ist.
Der Vorteil dieser im Vergleich zu der von uns verwendeten Methode ist, dass Aminosäuresubstitutionen an einer Position, die keine Aktivierung der T-Zellen hervorrufen, durch eine Aminosäuresubstitution an einer anderen Stelle eventuell wieder ausgeglichen werden könnten. Eine solche Möglichkeit könnte mit dem Modell von Martin herausgefunden werden, während mit unserem System eine solche Substitution ausgeschlossen werden würde.
Der Nachteil dieser Methode im Vergleich zu der unsrigen ist, dass die Peptide, die T-Zellen aktivieren können, in der entstandenen Peptidmischung in nur sehr geringen Konzentrationen vorliegen. Dadurch sind die Aktivierungen der T-Zellen sehr gering. Eventuell ist die Aktivierung so gering, dass sie nicht messbar ist und somit als negativ gewertet wird. Ein Grund für so einen Effekt könnte beispielsweise sein, dass sich bei der Synthese der Peptide bestimmte Aminosäuren besser mit dem entstehenden Peptid verbinden als andere und somit die Mischungen nicht aus wirklich zufälligen Aminosäuresubstitutionen besteht. Die Konzentration der aktivierenden Peptide könnte somit geringer sein als die der nicht aktivierenden.
Es ist außerdem nicht auszuschließen, dass antagonistische Peptide eine Aktivierung der T-Zellen durch agonistische Peptide verhindern und somit zu falsch negativen Ergebnissen führen. Antagonistische Peptide nennt man Peptide, die eine Bindung mit dem T-Zellrezeptor und dem MHC-Molekül eingehen, die T-Zelle aber nicht aktivieren oder sogar eine spätere Aktivierung der Z-Zelle verhindern, sie also anerg machen. Dies muss aber nicht unbedingt ein Nachteil sein. Solche Peptide wurden mit dieser Methode sogar gesucht, um mit diesen „Peptid-Antagonisten“ Patienten mit multipler Sklerose zu behandeln[127].
Ein Vergleich zwischen beiden Supertopanalysen wurde allerdings noch nicht unternommen, wäre aber sehr wünschenswert. Vermutlich ergänzen sich beide
Die Frage ist allerdings, ob es so wichtig ist, eine so detaillierte Untersuchung eines T-Zellrezeptors vorzunehmen. Man könnte mit keiner Methode sicher sein, dass man wirklich alle kreuzreaktiven Peptide findet. Dazu müssten alle natürlich vorkommenden Peptide an den T-Zellen getestet werden, was praktisch unmöglich ist. Außerdem muss man sich angesichts des Faktums, dass T-Zellen kreuzreaktiv für sehr viele Peptide sind fragen, ob die Kenntnis aller Peptide, die autoreaktive T-Zellen aktivieren können, nützlich wäre.
Die Besonderheit des verwendeten Modells ist, dass die verwendeten Mäuse transgen für einen T-Zellrezeptor sind, der spezifisch an das Selbstpeptid MBPAc1-11 des Myelin-basischen Proteins in Verbindung mit dem MHC-II Molekül I-Au bindet. Da außerdem die endogenen T-Zellrezeptor α-Ketten ausgeschaltet sind, werden fast ausschließlich autoreaktive T-Zellen produziert[99,13].
Werden Mäuse dieses Stamms mit MBPAc1-11 in kompletten Freunds Adjuvant und Pertussistoxin immunisiert, entwickelt sich die Autoimmunkrankheit EAE. Die alleinige Gabe von Adjuvant mit in Emulsion mit gepufferter Kochsalzlösung (PBS) plus Pertussistoxin ist nicht ausreichend, um Autoimmunität zu erzeugen[113].
Dies unterscheidet dieses Mausmodell von anderen transgenen Modellen für EAE, die spontan EAE entwickeln[105]. In einer Arbeit von Lafaille wird darauf hingewiesen, dass T-Zellen in transgenen Mäusen, die endogene β-Ketten exprimieren, dafür verantwortlich sind, dass Autoimmunität nicht spontan entsteht, denn bei Mäusen desselben Stamms, bei denen die β-Ketten ausgeschaltet sind, entsteht EAE spontan[13]. Ob diese Ergebnisse auf das von uns verwendetet Tiermodell übertragbar ist, ist allerdings nicht gezeigt, denn der genetische Hintergrund der von Lafaille verwendeten Mäuse ist ein anderer als der gemischte genetische Hintergrund der von uns verwendeten Mäuse.
Der Vorteil eines Modells, in dem die Mäuse nicht spontan krank werden, besteht darin, dass die Wirkung einzelner Substanzen auf die Induktion von EAE gezielt untersucht werden kann. Ein transgen exprimierter T-Zellrezeptor hat für unsere Untersuchungen des weiteren den Vorteil, dass die in vivo Relevanz der gefundenen Peptide ohne störenden Einfluss anderer T-Zellrezeptoren untersucht werden kann. Auf der anderen Seite muss immer bedacht werden, dass durch die hohe Frequenz von autoreaktiven T-
In dieser Arbeit wurde der Einfluss von LPS auf CD4-Zellen untersucht. Es wurde angenommen, dass LPS nicht direkt, sondern über „Bystander-Aktivierung“ auf CD4+-T-Zellen wirkt.
Unter Bystander-Aktivierung wird in dieser Arbeit verstanden, dass durch Substanzen (hier LPS) Zellen angeregt werden, die daraufhin Zytokine oder andere immunstimulatorische Substanzen exprimieren und synthetisieren, woraufhin andere Zellen (hier CD4+-Zellen), die ursprünglich nicht durch die Substanz stimuliert wurden, durch die Zytokine aktiviert werden. Wesentlich für die Definition von „Bystander-Aktivierung“ speziell bei T-Zellen ist, dass eine solche Aktivierung T-zellrezeptorunabhängig ist.
Als Hypothese zum Entstehen von Autoimmunität als infektionsabhängiger Mechanismus, der jedoch auch Exazerbationen durch unspezifische Erkrankungen erklären kann, wird Bystander-Aktivierung diskutiert[128,94].
Es sind bisher allerdings nur wenige Studien veröffentlicht worden, dass Bystander-Aktivierung alleine ausreicht, um eine Aktivierung auszulösen. Diese Experimente wurden auch hauptsächlich an murinen CD8+-Zellen oder an humanen CD4+-Zellen durchgeführt.
Auf der andern Seite wurden viele Daten publiziert, die zeigen, dass LPS als Adjuvant eine T-Zellantwort verstärken kann.
Auf die bekannten Befunde zu Bystander-Aktivierung soll im Folgenden näher eingegangen werden.
Murine CD8+ -T-Zellen, also zytotoxische T-Zellen, die nach dem klassischen Verständnis genau wie CD4+-Zellen ausschließlich über ihren T-Zellrezeptor aktiviert
Es gab sogar eine Untersuchung, die bei einem kultivierten CD8+ -T-Zelllinie eine Subpopulation von 1-3% CD8+-T-Zellen fand, die nach LPS-Stimulation direkt, also ohne Einfluss von anderen Zelltypen, proliferierte[129]. Aufgrund der langen Kultur der Linie ist unwahrscheinlich, dass es sich bei den proliferierenden Zellen um B-Zellkontaminationen oder andere Zellen handelt. Auf der anderen Seite sind Zelllinien aufgrund der langen Zeit in Zellkultur stets sehr artifizielle Systeme. Dass also ein direkter Einfluss von LPS auf CD8+-T-Zellen auch unter physiologischen Bedingungen eine Rolle spielt, kann also durch diese Untersuchung nicht geklärt werden.
Dass murine CD8+-Zellaktivierung durch Bystander-Aktivierung in vivo eine Rolle spielt, wurde durch mehrere Arbeiten von Tough et al. gezeigt. Erstens konnte gezeigt werden, dass eine T-Zellproliferation durch Injektion mit viralen Bestandteilen (dsRNA) CD8+-T-Zellen zur Proliferation angeregt werden konnten[130]. Zur Induktion von Proliferation der CD8+-T-Zellen war eine Injektion der Mäuse mit Interferon-I ausreichend.
Außerdem wurde festgestellt, dass sich die Reaktion von Gedächtnis-T-Zellen, die nach Stimulation mit Zytokinen proliferierten, von der Reaktion von naiven CD8+-T-Zellen unterscheidet[63]. Naive CD8+-T-Zellen exprimieren nur Aktivierungsmarker nach Zytokinstimulation ohne zu proliferieren, wohingegen Gedächtniszellen auch proliferieren.
In einer weiteren Arbeit wurde außerdem gezeigt, dass auch LPS, also eine bakterielle Substanz, CD8+-T-Zellen in vivo zur Proliferation anregt[131]. In dieser Arbeit wurde auch der Einfluss von LPS auf CD4+-T-Zellen untersucht. Wie in der vorliegenden Arbeit wurde eine Aktivierung von CD4+-T-Zellen anhand von einer Expression von Aktivierungsmarkern, speziell CD69, festgestellt. Jedoch wurde eine signifikante Proliferation von CD4+-T-Zellen nicht gefunden.
Diese scheinbar konkurrierenden Ergebnisse können darauf zurückzuführen sein, dass in der Arbeit von Tough et al. die Hintergrundproliferation der CD4+-T-Zellen, bedingt durch die Nachweismethode mit BrdU in vivo, sehr hoch war (etwa 30%). Dementsprechend wurde auch eine geringe Steigerung der Proliferation der CD4+-T-Zellen gefunden, in Anbetracht der hohen Hintergrundproliferation ist diese allerdings nicht signifikant.
Ein Zusammenhang zwischen den CD8+-T-Zellaktivierungen und Autoimmunität wurde allerdings nicht gefunden.
Mehrere Untersuchungen wurden zum Einfluss von Bystander-Aktivierung bei humanen CD4+ T-Zellen durchgeführt.
Es wurden, ebenso wie bei murinen CD8+-T-Zellen, Zytokine gefunden, die ohne gleichzeitige Ligation des T-Zellrezeptors in der Lage sind, Proliferation von CD4+-T-Zellen hervorzurufen.
Zum einen wurde gezeigt, dass eine Mischung aus IL-2, TNF-α und IL-6 sowohl naive (CD45RA+) als auch voraktivierte (CD45RO+) CD4+-T-Zellen in vitro zur Proliferation anregen kann[133]. Interessanterweise blieb dabei der naive Phänotyp erhalten, so dass dies dafür spricht, dass, wenn dieser Mechanismus in vivo eine Rolle spielt, am ehesten die Homöostase der T-Zellen beeinflusst und keinen wirklichen immunstimulatorischen Effekt auf die T-Zellen ausübt.
Des weiteren konnten in einer anderen Arbeit verschiedene Zytokinkombinationen unterschiedliche Proliferationen von entweder naiven CD4+-T-Zellen oder speziellen Subpopulationen von Gedächtnis-CD4+-T-Zellen auslösen, so dass dies auch hier dafür spricht, dass Bystander-Aktivierung in vivo für eine Homöostase unterschiedlicher T-Zellpopulationen sorgen könnte[134].
Bei humanen CD4+-T-Zellen wurde außerdem gezeigt, dass LPS Proliferation hervorrufen kann[135,136]. In einer dieser Arbeiten[136] wurde die Art der T-Zellaktivierung untersucht, und im Gegensatz zu der murinen CD8+-T-Zellaktivierung scheinen nicht Zytokine, sondern direkte Zell-Zellkontakte mit Monozyten und eine Kostimulation mit B7/CD28 benötigt zu werden. Eine Ligation des T-Zellrezeptors ist aber nicht notwendig, so dass es sich auch hier um eine Form von Bystander-Aktivierung handelt.
Während es nur sehr wenige Untersuchung zur Frage einer Aktivierung von CD4+-T-Zellen ausschließlich durch Bystander-Aktivierung, also ohne jegliche Ligation des T-Zellrezeptors, gibt, wurde durch viele Untersuchungen deutlich, dass zum einen T-Zellen den Effekt anderer Zelltypen auf LPS-Stimulation verstärken, und zum anderen, dass auch T-zellspezifische Funktionen durch LPS verstärkt werden können.
Dass T-Zellen die adjuvante Wirkung von LPS auf andere Zelltypen, speziell auf B-Zellen, verstärken, wurde bereits in den siebziger Jahren des 20. Jahrhunderts untersucht. Dabei wurde einmal die Antikörperproduktion nach LPS-Gabe mit oder ohne T-Zellen untersucht[137], außerdem wurden der Effekt von LPS auf B-Zellen untersucht, wenn T-Zellen von LPS-unempfindlichen Mäusen oder von LPS-empfindlichen Mäusen zugegeben wurden[138,139]. Es wurde deutlich, dass Th-Zellen von LPS-empfindlichen Mäusen benötigt werden, um eine vollständige Aktivierung von B-Zellen durch LPS zu erreichen.
Dass LPS auch CD4+-T-Zellspezifische Funktionen verstärken kann, wurde 1989 in einem Tiermodell für EAE gezeigt[140]. Lewis-Ratten wurden entweder Milzzellen transferiert, die zuvor mit Antigen oder mit LPS plus Antigen kultiviert wurden. Dabei konnte LPS die Inzidenz und den Schweregrad der EAE erheblich (um das 5-fache) verstärken.
In vitro wurde außerdem festgestellt, dass die Zugabe von LPS CD4+- T-Zellproliferation schon bei Antigenkonzentrationen hervorruft, die nicht ausreichen, um CD4+-T-Zellen ohne LPS zur Proliferation anzuregen[141].
T-Zellen verstärken also den LPS-Effekt auf andere Zellen, also beispielsweise die Antikörperproduktion durch B-Zellen, LPS wirkt aber auch als Adjuvant für T-Zellen.
Während es wenig Daten zu in vitro-Effekten von Bystander-Aktivierung auf murine CD4+-T-Zellen gibt, gibt es zwei Arbeiten, die in vivo-Effekte auf CD4+-T-zellinduzierte Autoimmunität untersuchen.
In einer Arbeit wurde die Ursache einer Diabetes mellitus-Induktion durch Coxsackie B4-Virus Infektion in verschiedenen Mausstämmen untersucht. Dabei war die Diabetes-Induktion nicht an bestimmte MHC-Moleküle verknüpft, von denen bekannt ist, dass durch sie kreuzreaktive Peptide zwischen dem Virus und den pankreatischen Inseln präsentiert werden, sondern an selbstreagierenden T-Zellen, die nicht mit dem Virus kreuzreagieren[142]. Da sich das Virus im Pankreas repliziert und in jedem Mausstamm eine Pankreatitis aufgrund der provozierten Immunantwort hervorruft, wird geschlussfolgert, dass nicht die molekulare Mimikry, sondern das Freisetzen von Antigenen durch die Immunreaktion und die anschließende Aktivierung der autoreaktiven T-Zellen für das Auslösen von autoimmunem Diabetes mellitus verantwortlich ist.
Zu dieser Arbeit ist zu sagen, dass zwar die T-zellvermittelte Autoimmunität durch die Aktivierung hervorgerufen wird, die Autoimmunität hervorrufenden T-Zellen jedoch direkt über ihren T-Zellrezeptor aktiviert werden. Demnach handelt es sich nicht um „Bystander-Aktivierung“ im engeren Sinne, sondern eher um T-Zellaktivierung durch Zusammenbruch immunologischer Schranken („Bystander Damage“).
In einer zweiten Untersuchung wurde stromale Keratitis durch Herpesviren ausgelöst. Allerdings wird diese Form der stromalen Keratitis durch T-Zellen induziert, auch wenn sie nicht responsibel gegen Herpesviren sind[143]. Die verwendeten Mäuse sind auf einem SCID-Hintergrund transgen für einen OVA-Peptid-spezifischen T-Zellrezeptor. Die T-Zellen dieser Mäuse konnten nicht durch Antigene von Herpesviren aktiviert werden. Eine Inokkulation von Viren in die Augen der Mäuse löste stromale Keratitis aus, solange die Viren sich replizierten (Inaktivierung der Viren durch Aciclovir verhinderte die stromale Keratitis). SCID-Mäuse, die keinerlei T-Zellen besitzen, entwickeln nach Inokkulation keinerlei Keratitis, womit gezeigt ist, dass es sich um eine T-zellabhängige Erkrankung handelt. Ein Transfer von T-Zellen in SCID-Mäuse führte zur Entwicklung von stromaler Keratitis, wenn die T-Zellen vorher durch OVA-Peptid aktiviert wurden.
Als weiteren Hinweis, dass es sich um Bystander-Aktivierung von T-Zellen handelt, wurde gezeigt, dass Cyclosporin A, einem Pharmakon, das die Expression
Nach diesen Daten wird die Erkrankung durch T-Zellen induziert. Jedoch werden die T-Zellen nicht über ihren T-Zellrezeptor, sondern wahrscheinlich über Zytokine aktiviert. Es handelt sich also um Autoimmunität durch Bystander-Aktivierung.
Ein Unterschied zu der in der vorliegenden Arbeit vorgeschlagenen Definition zur Hypothese der „Bystander-Aktivierung“ ist, dass eine Autoreaktivität der T-Zellen offensichtlich nicht benötigt wird, es reicht, wenn T-Zellen beliebiger Spezifität die Inflammation unterhalten. Was in diesem Falle die Wirkungsweise der T-Zellen ist, ist allerdings noch nicht untersucht.
Diese zwei Beispiele, die meiner Kenntnis nach die einzigen Beispiele sind, in denen eine Induktion von Autoimmunität durch „Bystander-Aktivierung“ gezeigt wurde, machen zum einen deutlich, dass der Begriff „Bystander-Aktivierung“ sehr unterschiedlich definiert wird. Jedoch macht auch besonders das zweite Beispiel deutlich, dass es Indizien für ein tatsächliches Vorkommen von solcherart ausgelöster Autoimmunität gibt, auch wenn es selbstverständlich fraglich ist, inwieweit „Bystander-Aktivierung“ als Ursache von Autoimmunität unter physiologischen Bedingungen eine Rolle spielt (siehe Abschnitt 5.3).
In dieser Arbeit wurde Bystander-Aktivierung an murinen CD4+-Zellen sowohl in vitro als auch in vivo untersucht. Im folgenden wird auf die Ergebnisse eingegangen.
Ein wesentlicher Marker immunologischer Aktivierung ist die Messung der Proliferation der aktivierten Zellen. Wichtig war nun, zu untersuchen, wie stark CD4+ T-Zellen auf Stimulation mit LPS reagieren. Bisher wurden nur Ergebnisse publiziert, die bei murinen CD4+ T-Zellen eine LPS-Stimulation durch induzieren von kostimulierenden Molekülen
Zur Untersuchung dieser Frage wurden CD4+-T-Zellen mit 5(6)-Carboxyfluorescein-diazetatsuccinimidylester(CFSE)[108] gefärbt. und durchflusszytometrisch untersucht.
Wir beobachteten eine Proliferation von etwa einem Prozent Th-Zellen auf LPS. Die Problematik der experimentellen Auswertung soll der Übersichtlichkeit halber weiter unten diskutiert werden.
Falls nur ein Prozent der Th-Zellen auf LPS proliferiert, stellt sich die Frage, ob dies eine physiologische Relevanz besitzen könne. Da unter physiologischen Bedingungen nur ein Bruchteil der T-Zellen ein spezielles Antigen erkennt und eine suffiziente Immunantwort hervorruft, sollte bei den von uns verwendeten transgenen Mäusen eine Aktivierung von einem Prozent der T-Zellen einer sehr starken Immunreaktion eines physiologischen T-Zellsystems entsprechen. Somit ist unter diesen Bedingungen auch plausibel, dass es zu einer Reaktion gegen das ZNS kommt, da sämtliche T-Zellen, die aktiviert wurden, auch gegen das Autoantigen MBP reagieren.
Unter physiologischen Bedingungen könnte aber aus demselben Grund Autoimmunität durch LPS unwahrscheinlich sein: Da die T-Zellaktivierung antigenunabhängig ist und somit T-Zellen unterschiedlicher Spezifität betrifft, sind die Frequenzen der T-Zellen einer Spezifität für die Induktion einer Autoimmunität eventuell zu gering.
Hypothetisch könnte es aber sein, dass unter Bedingungen, bei denen die Frequenzen spezifischer T-Zellen bereits hoch sind (z.B. bestehende Autoimmunität oder chronisch bzw. rezidivierender Infektion) diese T-Zellen durch LPS aktiviert werden.
Im negativen Fall (d.h. einer bereits bestehenden Autoimmunität) würde dies einen akuten Schub der Erkrankung bedeuten, wie dies zum Beispiel bei Patienten mit Multipler Sklerose beobachtet wird, wenn sie einen Schub nach einem Infekt erleiden.
Im positiven Fall (d.h. einer chronischen oder rezidivierender Infektionen) könnte dieser Mechanismus aber eventuell bewirken, dass T-Zellen bei erneutem Befall oder Exazerbation einer bestehenden Infektion antigenunabhängig aktiviert werden und schneller reagieren, da der Vorgang der Antigenprozessierung und –präsentation nicht benötigt wird.
Wie in Abschnitt 4.5.2.1 gezeigt, proliferieren etwas mehr CD4+ T-Zellen nach Zugabe von LPS oder Lysaten von Salmonella typhimurium zu Milzzellkulturen als nach Zugabe von PBS. Auch wenn es sich nur um einen Unterschied von etwa einem Prozent
Die statistische Signifikanz ist bei einer durchflusszytometrischen Analyse allerdings gut zu erreichen, da es sich stets um sehr viele Ereignisse handelt, die untersucht werden. So wurden bei standardmäßigen durchflusszytometrischenAnalyse zur Untersuchung solch geringer Unterschiede in der Proliferation bis zu 1 Million Zellen aufgenommen. Die Standardabweichung bei zweimaliger Messung einer Probe oder Durchführung mehrerer Proben einer Substanz unterscheiden sich erfahrungsgemäß nur sehr gering voneinander, so dass selbst geringe Unterschiede der Proliferation statistisch signifikant sind.
Auch das Durchführen mehrerer Experimente bestätigten diese Unterschiede in der Größenordnung von einem Prozent, so dass auch hier eine statistische Signifikanz gezeigt werden konnte.
Während die statistische Signifikanz also besteht, ist die sehr viel wichtigere Frage, ob ein systematischer Fehler in diesen Messungen vorkommt.
Ein großes Problem ist das Ausschließen von unspezifischen Bindungen. Da sehr viele B-Zellen und Makrophagen nach Zugabe von LPS proliferieren, würde selbst eine geringe unspezifische Bindung von CD4-Antikörper zu einer messbaren Proliferation von Zellen kommen, die nicht CD4-Zellen sind, aber als CD4-Zellen angefärbt wurden. Diese würden in der Auswertung eine geringe Proliferation von CD4-Zellen vortäuschen, die nicht vorhanden ist.
Um unspezifische Bindungen zu verhindern, wurden alle Proben für durchflusszytometrischeAnalysen mit anti-Fcγ-Rezeptor und Ratten IgG geblockt. Allerdings ist durch einen solchen Block nicht auszuschließen, dass es trotzdem zu unspezifischen Bindungen kommt.
Es wurde versucht, dieses Problem zu eliminieren, indem einmal positiv auf CD4 gefärbt und andererseits negativ auf B220 oder ähnlicher Oberflächenmoleküle gefärbt wurde. B220 gefärbte Zellen wurden nicht mitbeurteilt, so dass Zellen, die unspezifisch Antikörper binden, CD4 und B220 positiv wären und nicht in die Auswertung einflössen.
Aufgrund dieser Maßnahmen ist unwahrscheinlich, dass es sich bei den vorliegenden Ergebnissen bezüglich der CD4-Proliferation auf LPS nur um ein Artefakt handelt. Außerdem wurde im Folgenden nach anderen Markern für die Th-Zellaktivierung nach LPS-Stimulation gesucht.
Zur Untersuchung der Frage, ob LPS noch andere Effekte auf Th-Zellen bewirkt, und da die Fraktion an Zellen, die proliferieren, sehr klein ist, war es sehr wichtig, andere Aktivierungsmarker zu untersuchen.
Wir untersuchten die Expression des Aktivierungsmarkers CD25 (die α-Kette des IL-2 Rezeptors) und CD62L (L-Selektin). CD25 wird von aktivierten T-Zellen exprimiert, wohingegen CD62L von naiven T-Zellen besonders stark exprimiert wird und aktivierte Zellen diesen Marker nur sehr wenig exprimieren. Da beide Marker bei Aktivierung entgegengesetzt reagieren, kann man auch den Einfluss von unspezifischen Bindungen begrenzen, wenn man den Anteil an Zellen untersucht, bei denen CD25 vermehrt und CD62L vermindert exprimiert werden. Bei unspezifischen Bindungen von Antikörper würde man vermuten, dass sowohl CD25 als auch CD62L verstärkt exprimiert werden, da beide Antikörper gebunden werden sollten.
Bei den Untersuchungen dieser Aktivierungsmarker wurde klar, dass sehr viel mehr T-Zellen ihr Profil der Aktivierungsmarker ändern als proliferieren. Es ist bekannt, dass T-Zellen empfindlicher mit Änderungen der Aktivierungsmarker als mit Zytokinproduktion oder Proliferation reagieren[123]. Bei unseren Experimenten zeigt sich, dass durch LPS sehr viele Th-Zellen (etwa 90%) ihren naiven (CD62LhiCD25-) Phänotyp verlieren, aber von diesen Th-Zellen nur sehr wenig proliferieren. Es scheint also, dass LPS für die meisten Th-Zellen ein eher schwacher Induktor für Aktivierung ist. Auf der anderen Seite sind noch zu wenig Untersuchungen gemacht worden, um zu beurteilen, ob sich
Insbesondere CD62L als besonders empfindlich reagierender Marker zeigte eine starke Änderung auf LPS-Gabe. Bei der Negativkontrolle waren in dem gezeigten Experiment 54% der T-Zellen CD62L-positiv, wohingegen nur 5,4% der T-Zellen positiv waren, wenn sie mit LPS stimuliert wurden. Dieses repräsentative und reproduzierbare Ergebnis macht deutlich, dass es zu einer Aktivierung von T-Zellen kommt, denn ein so deutliches Ergebnis lässt sich durch eine unspezifische Bindung von Antikörpern nicht erklären.
Die Hochregulierung von CD25 war wiederum nicht sehr ausgeprägt, aber dennoch deutlicher als die Proliferation von T-Zellen auf LPS-Stimulation. Von den „naiven“ T-Zellen nach PBS-Stimulation exprimierten 5% CD25 auf ihrer Oberfläche. Nach LPS-Gabe erhöhte sich dieser Anteil auf 7,5%. Auch dies zeigt, dass die Aktivierung von T-Zellen durch LPS wie ein schwacher antigenspezifischer Stimulus wirkt.
Die Untersuchung der Proliferation und der Oberflächenmoleküle in vitro ergaben eine schwache Aktivierung von CD4+ T-Zellen. In unserem Modell war es möglich, die Relevanz dieser Aktivierung auch in vivo zu untersuchen. Dazu wurden die T+α- -Mäuse mit LPS oder bakteriellen Lysaten subkutan immunisiert. Wie auf Seite 68 gezeigt, entwickelten die Mäuse Lähmungen, die etwas schwächer ausgeprägt waren als Lähmungen nach MBP-Peptid Applikation. Die induzierte EAE unterschied sich aber signifikant von der Negativkontrolle mit PBS.
Somit ist LPS in der Lage, in den von uns verwendeten transgenen Mäusen, wo annähernd alle T-Zellen einen T-Zellrezeptor exprimieren, EAE zu induzieren. Die Frage, in wieweit dies tatsächlich durch „Bystander-Aktivierung“ oder andere Mechanismen geschieht, wird weiter unten diskutiert.
Wie auf Seite 25 beschrieben, wird den CD4+-T-Zellen eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese von EAE zugeschrieben. In Zusammenhang mit den in vitro Versuchen, die weiter oben in dieser Arbeit besprochen wurden, ist es also möglich, dass durch das
In unserem Modell mit sehr hohen Frequenzen von autoreaktiven T-Zellen käme es dann zu einer antigenunabhängigen Aktivierung dieser autoreaktiven Zellen, die nun als aktivierte Zellen in das ZNS gelangen und EAE auslösen. Ein solcher Mechanismus ist auf Seite 20 als „Bystander-Aktivierung“ diskutiert worden. Das Interessante an einem solchen Mechanismus wäre, dass Bakterien, ohne dass sie Peptidhomologien oder Peptidähnlichkeiten mit körpereigenen Proteinen besitzen, Autoimmunität über T-Zellen hervorrufen könnten, wenn die T-Zellen autoreaktiv sind.
Epidemiologisch gibt es auf der anderen Seite Belege, dass Schübe von Multipler Sklerose gehäuft nach Infektionen auftreten[144,145]. Dabei ist aber kein Beleg gefunden worden, der die Induktion von Schüben auf einen bestimmten Erreger zurückführen kann. Somit ist es wahrscheinlich, dass ein antigenunabhängiger Stimulus für diese Exazerbation der Multiplen Sklerose verantwortlich ist. Ein solcher antigenunabhängiger Stimulus wäre die Aktivierung von Th-Zellen durch LPS oder andere unspezifische Aktivatoren des Immunsystems.
Allerdings muss auch in Betracht gezogen werden, dass die in dieser Arbeit gezeigten Daten diese Hypothese nicht vollständig belegen können.
Aufgrund unserer Daten ist nicht auszuschließen, dass andere Zellen des Immunsystems nach Applikation von LPS ins ZNS wandern, oder dass das LPS selbst über die Blutbahn zum ZNS gelangt und es hier durch den einen oder den anderen Mechanismus zu einer geringgradigen Inflammation im ZNS kommt. Für einen Effekt auf die Blut-Hirn-Schranke durch LPS auch nach subkutaner Applikation von LPS gibt es Hinweise von anderen Gruppen, wobei sich die Auswirkungen von LPS bei unterschiedlichen Mausstämmen stark unterscheiden[146,147,148]. Eine solche Beeinträchtigung der Blut-Hirn-Schranke könnte zu Migration von Th-Zellen in das ZNS und zu Freisetzung von MBP führen, so dass es zu einer Aktivierung der Th-Zellen und letztendlich EAE entsteht.
Die abschließende Klärung dieser Frage könnte über ein Modell geklärt werden, bei dem durch LPS stimulierte und anschließend gereinigte CD4+-T-Zellen passive EAE hervorgerufen wird. Dieses Modell konnte allerdings in unserem System nicht etabliert werden.
Abschließend bleibt zu diskutieren, inwieweit die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse auch unter physiologischen Bedingungen eine Rolle spielen, ob also durch „Kreuzreaktivität“ oder „Bystander-Aktivierung“ tatsächlich Autoimmunität ausgelöst werden kann.
In Anbetracht der Ergebnisse dieser und anderer Arbeiten[59,60,113,61,115,116,117] ist anzunehmen, dass Kreuzreaktivität tatsächlich ein sehr häufig vorkommendes Phänomen ist. In dieser Arbeit wurden kreuzreaktive Peptide systematisch gesucht, ohne dass speziell nach Bakterien gesucht wurde, die eventuell mit MS in Zusammenhang stehen. Auf diese Weise wurden auch mikrobielle Peptide identifiziert, die in ubiquität vorkommenden Bakterien synthetisiert werden. Somit halten wir es für eher unwahrscheinlich, dass „Kreuzreaktivität“ ein alleiniger Grund beim Entstehen von Autoimmunität ist. Unter diesem Aspekt sind viele Arbeiten zu sehen, die Zusammenhänge zwischen speziellen Bakterien und Autoimmunkrankheiten postulieren: Die meisten dieser Arbeiten suchen gezielt nach Peptiden in einem bestimmten Bakterien und einem bestimmten Organ, die kreuzreaktiv T-Zellklone aktivieren können. Allerdings ist nach unseren Ergebnissen davon auszugehen, dass es nicht sehr unwahrscheinlich ist, eine solche Kreuzreaktivität zu finden, da ein solcher Befund nicht sehr spezifisch ist.
Demgegenüber steht die Frage, ob die gefundenen Peptide auch tatsächlich in vivo aus den Proteinen prozessiert werden, oder ob die Ursprungsproteine in einer Konzentration vorkommen, die ausreichend ist, um eine immunologische Reaktion hervorzurufen. Sicherlich kommen sehr viele der gefundenen Peptide in vivo aus diesem Grunde nicht vor. Wie bereits auf Seite 72 beschrieben, gibt es für ein anderes Modell[61] zumindest ein Beispiel, das zweifelsfrei zeigt, dass ein bakterielles, immunodominantes T-Zellepitop von Borrelia burgdorferi mit einem humanem immunodominanten Epitop des Proinsulins kreuzreagiert. Jedoch ist keinerlei Assoziation zwischen einer Borrelieninfektion und Diabetes mellitus Typ 1 beschrieben. Auch ist zu bedenken, dass in allen Untersuchungen die Menge von kreuzreagierenden Peptiden unterschätzt wird, und es sehr viele verschiedene T-Zellrezeptoren unter physiologischen Bedingungen gibt. Es ist meines Erachtens also wahrscheinlich, dass von den kreuzreaktiven Peptiden einige prozessiert werden.
Eine weitere Frage ist, ob die T-Zellen, wenn sie von Bakterien aktiviert wurden und mit einem bestimmten Selbstpeptid kreuzreagieren, noch in einer Frequenz vorkommen, die ausreicht, um Autoimmunität hervorzurufen. Es könnte zum Beispiel sein, dass bei einem Erkennen von Infektionserregern durch sehr viele T-Zellen verschiedener Spezifität jede individuelle T-Zelle mit einem Selbstpeptid kreuzreagiert. Wenn aber jede T-Zelle ein anderes Selbstpeptid erkennt, würden die für eine suffiziente Immunantwort ausreichende Frequenzen an aktivierten T-Zellen nur an dem Infektionserreger, nicht aber an den im ganzen Körper verteilten Selbstpeptiden erreicht.
Des weiteren untersuchten wir die Hypothese der „Bystander-Aktivierung“. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass es sowohl in vitro als auch in vivo zu „Bystander-
Allerdings ist bekannt, dass Schübe von autoimmunen Erkrankungen ausgelöst werden können, wenn es zu einer Infektion kommt[149]. Bei diesen Prozessen, wenn sich also eine Autoimmunität gerade bildet oder bereits gebildet hat, autoreaktive T-Zellen also in hoher Konzentration im Blut vorhanden sind, dann können diese T-Zellen eventuell über einen der diskutierten Mechanismen aktiviert werden und eine Verstärkung der Erkrankung bewirken.
Ein hypothetischer Mechanismus, wie Autoimmunität dennoch durch beide Mechanismen unter physiologischen Bedingungen ausgelöst werden könnte, wird in Abbildung 16 dargestellt. Bei chronischer oder repetetiver Infektion mit einem Erreger könnte es zur Akkumulation von T-Zellen einer Spezifität und somit einer Kreuzreaktivität kommen. Werden diese T-Zellen jetzt aktiviert, beispielsweise durch „Bystander-Aktivierung“, könnte Autoimmunität ausgelöst werden. Aufgrund der Tatsache, dass innerhalb des Verständnisses des Immunsystems der Spezifität der T-Zellen eine sehr große Rolle zukommt, wäre es sehr interessant, zu untersuchen, inwieweit es verhindert wird, dass es unter physiologischen Bedingungen nicht zu Autoimmunität kommt, obwohl, wie diskutiert, der T-Zellrezeptor flexibler ist als bisher gedacht und obwohl T-Zellen eventuell auch unspezifisch aktiviert werden können. Eine interessante, wenn auch spekulative, Diskussion wurde darüber von Mason geführt[125] (siehe auch Seite 75). Allerdings ist eine Beantwortung dieser Fragen derzeit nicht möglich, auch wenn einer solchen bei dem Verständnis des Funktionierens des physiologischen Abwehrprozesses von Fremdorganismen in meinen Augen eine sehr große Rolle zukäme.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von Bakterien für das Entstehen von Autoimmunität untersucht. Insbesondere wurde untersucht, inwieweit Bakterien entweder spezifisch (über „Kreuzreaktivität“) oder antigenunabhängig (über „Bystander-Aktivierung“) eine Aktivierung von autoreaktiven CD4+- T-Zellen induzieren können.
Weiterhin wurde untersucht, inwieweit LPS als unspezifischer Aktivator des Immunsystems eine Aktivierung der autoreaktiven T-Zellen in vitro hervorrufen kann und inwieweit in vivo EAE durch LPS hervorgerufen werden kann.
Es wurde gezeigt, dass LPS in vitro einen kleinen Anteilder CD4+ - T-Zellen aktiviert.
Wurden den transgenen T+α- -Mäusen LPS appliziert, erkrankten diese an EAE.
Somit gibt es sowohl in vitro als auch in vivo in den T+α- -Mäusen Hinweise für eine Relevanz von „Bystander-Aktivierung“.
Abschließend wurde diskutiert, inwieweit entweder „Kreuzreaktivität“ oder „Bystander-Aktivierung“ als Auslöser für Autoimmunität unter physiologischen Bedingungen in Frage kommt. Aufgrund der in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse wurde postuliert, dass keine der beiden Mechanismen alleiniger Auslöser sei, da es aufgrund der Häufigkeit von Infektionen, kreuzreaktiven Peptiden und des Vorkommens von autoreaktiven T-Zellen auch in gesunden Individuen ansonsten sehr viel häufiger zu Autoimmunität kommen müsste.
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Thomas Kamradt
Bert Maier
Marc Molinger
Carmen Infante-Duarte
Orissa Bender
Martin Baumgart
Johannes Falk
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Michael Ahmadi
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Tobias Nolden
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und alle vom Tierstall
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Ulrich Schaible
Andreas Radbruch
Meinen Eltern,
Hendrik, Kristin
und ganz besonders
Diana, Frederik und Jannik
„Wir untersuchen die Steine, aber nicht die Berge, wir haben das
Material, beachten aber nicht, wie es zusammengehört.“
Alexander von Humboldt
Zur Person
Ausbildung
Veröffentlichungen und Kongresse
Stipendien und Auszeichnungen
Das Forschungsvorhaben wurde über die gesamte Zeit durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich 421, C2) gefördert und wurde in den jährlich stattfindenden Treffen meist durch Axel Nogai vertreten.
Hiermit erkläre ich, Axel Nogai, geboren am 3. August 1975, dass diese Dissertation von mir selbst ohne die unzulässige Hilfe Dritter verfasst wurde, auch in Teilen keine Kopie anderer Arbeiten darstellt und die benutzten Hilfsmittel sowie die Literatur vollständig angegeben sind.
Axel Nogai