Resultate

Übersicht

In dieser Arbeit wurden Mäuse verwendet, die transgen für einen T-Zellrezeptor sind, der spezifisch für die ersten 11 Aminosäuren des Myelin-basischen Protein ist. Durch die transgenen Tiere, zur Verfügung gestellt von Dr. J. Lafaille, wurde es uns möglich, die Kreuzreaktivität eines T-Zellrezeptors genauer zu charakterisieren. Dies erschien sinnvoll, da Kreuzreaktivität als hypothetische Ursache für Autoimmunität gesehen wird, deren genauer Umfang aber unbekannt ist (siehe auch Seite 18). Wir wollten deswegen als erstes mikrobielle Substanzen identifizieren, die imstande sind, bei den T⁺α^- Mäusen EAE auszulösen.

Es wird davon ausgegangen, dass T-Zellen eine ursächliche Rolle für das Entstehen dieser Krankheit spielen (siehe auch Seite 25).

Da T-Zellen spezifisch durch Peptide aktiviert werden, werden mit einer speziellen Technik synthetisierte Peptide systematisch an Milzzellen der T⁺α^- Mäusen getestet und die Zellproliferation gemessen.

Ausgewählte Peptide werden später in konventioneller Methode synthetisiert, so dass eine detailliertere Analyse der T-Zellantwort möglich ist.

Der nächste Schritt ist das Untersuchen der T-Zellantwort auf bakterielle Lysate. Damit soll festgestellt werden, ob die kreuzreaktiven Peptide auch bei der Prozession der bakteriellen Proteine überhaupt oder in einer ausreichenden Konzentration entstehen, um T-Zellen suffizient zu aktivieren und Autoimmunität zu erzeugen.

Da bakterielle Lysate nicht ausschließlich Proteine, sondern eine Vielzahl anderer Stoffe enthalten, von denen unter anderem Lipopolysaccharide (LPS) eine wichtige Rolle spielen, wird der Effekt dieser Substanzen auf die Aktivierung der T-Zellen untersucht.

Jeder Effekt, der in vitro beobachtet wird, kann in dem verwendeten System schnell in vivo überprüft werden. Somit kann getestet werden, ob die Effekte zumindest in diesem transgenen System ausreichend sind, um Autoimmunität auszulösen.

Das Supertop des T⁺α^- T-Zellrezeptors

Die Definition eines Motivs, welches Peptide beschreibt, die potentiell T-Zellen einer Spezifität aktivieren können, wird Supertop genannt. Dabei ist es aber immer eine theoretische Voraussage, und um zu überprüfen, ob die im Supertop definierten Peptide tatsächlich solche T-Zellen aktivieren können, müssen sie synthetisiert und auf deren tatsächliches T-zellaktivierendes Potential überprüft werden.

Da es gegenwärtig unmöglich ist, rechnerisch zu ermitteln, welche Peptide an MHC-Moleküle und T-Zellrezeptor binden, wäre es zur Ermittlung des vollständigen Supertops eines T-Zellrezeptors also notwendig, sämtliche möglichen Peptide zu synthetisieren und auf deren Fähigkeit, T-Zellen zu aktivieren, in vitro zu testen. Jedoch gibt es 20 natürlich vorkommende Aminosäuren; ein Peptid, welches von MHC-Molekülen gebunden werden kann, besteht aus etwa 10 Aminosäuren. Damit kämen 20¹⁰ Kombinationen in Frage (etwa 10¹³=10 Billionen verschiedene Peptide).

Deswegen wird ein Supertop möglichst so definiert, dass sehr viele von den beschriebenen Peptiden T-Zellen einer Spezifität aktivieren können. Dabei muss immer bedacht werden, dass die tatsächliche Menge von Peptiden, die diese T-Zellen aktivieren kann, dann sehr viel größer ist als die Menge der im Supertop beschriebenen Peptide.

Wie bereits erwähnt, sind die transgenen T-Zellen der T⁺α^- Mäuse in dieser Studie spezifisch für das MBP_Ac1-11-Peptid (Peptidsequenz ist AcASQKRPSQRSK, wobei Ac die Azetylierung des Alanins an Position 1 des N-terminalen Ende des MBP-Proteins kennzeichnet).

Um das Supertop systematisch zu definieren, wurden Peptide auf Zellulosemembranen synthetisiert[109], die sich von dem ursprünglichen MBP_Ac1-11-Peptid in einer Position unterscheiden. Diese Synthese wurde im Institut für medizinische Immunologie der Charité in der Gruppe von Prof. J. Schneider-Mergener durchgeführt.

Da es 20 natürlich vorkommende Aminosäuren gibt, und das MBP_Ac1-11-Peptid aus 11 verschiedenen Aminosäuren besteht, sind 220 verschiedene Peptide möglich. Diese wurden auf Zellulosemembranen synthetisiert und zu Zellsuspensionen der T⁺α^- Mäuse gegeben. Die Zellproliferation wurde nach 3 Tagen durch Messung von inkorporiertem ³H-Thymidin bestimmt (siehe Seite 36).

Diese Methode wird Substitutionsanalyse genannt.

Das Ergebnis ist in Abbildung 4 dargestellt.

Eine Proliferation von mehr als das 15-fache der Negativkontrolle wurde als signifikante Proliferation gewertet. Die Summe der Substitutionen, die diesen willkürlich gewählten Wert überschritten, wurden als Supertop definiert.

Abbildung 4 Substitutionsanalyse T ⁺ a ^- Zellen: Milzzellen der T ⁺ a ^- Mäuse wurden mit Peptiden stimuliert, bei welchen eine Aminosäure des MBP _Ac1-11 -Peptids für eine andere substituiert wurde. Jede Messung wurde dreimal durchgeführt und aus den Werten das arithmetische Mittel gebildet. Die Standardabweichung betrug zwischen 15 und 20%. Die erste Zeile gibt die Sequenz des MBP_Ac1-11-Peptids wieder. Jede Spalte der Tabelle stellt eine Position des MBP_Ac1-11-Peptids dar. Die erste Spalte gibt an, welche Aminosäure substituiert wurde. Die Proliferation ist durch den Stimulationsindex (Absolutwert dividiert durch die Negativkontrolle) angegeben. Ein Stimulationsindex (=SI) von größer gleich 15 wurde als signifikante Proliferation gezählt (durch schwarzen Hintergrund hervorgehoben). Der Absolutwert der Negativkontrolle (=kein Peptid zugegeben) betrug 2893 Signale pro Minute (counts per minute, CPM), der Absolutwert der Positivkontrolle (=MBP_Ac1-11 zugegeben) betrug 198467 CPM. Der SI der Positivkontrolle betrug somit 69, der SI der Negativkontrolle 1.

Nach dieser Methode kann man das Supertop wie folgt darstellen:

[AS] - [ACHNS] - [FHMQ] - X - [R] - [PQ] - {EFWY} - X - X - X - X

Bindestriche trennen die einzelnen Positionen.

Eckige Klammern kennzeichnen an dieser Stelle erlaubte Aminosäuren, geschweifte Klammern geben Aminosäuren an, die an dieser Stelle nicht erlaubt sind. X bedeutet, alle Aminosäuren dürfen an dieser Position substituiert werden.

Wird das Supertop so definiert, gilt für die eingeschlossenen Peptide, dass keine Rücksicht auf Änderungen an anderen Positionen genommen wird, solange nur Peptide ersetzt werden, die nach dem Supertop „erlaubt“ sind.

Diese Annahme ist jedoch in vitro nicht uneingeschränkt gültig, da die verschiedenen Aminosäuren eines Peptides nicht unabhängig voneinander sind, sondern sich beeinflussen. Somit kann eine Substitution eine andere möglich machen beziehungsweise ausschließen.

Somit ist klar, dass dieses theoretische Supertop auch Peptide beschreibt, die in vitro keine T-Zellaktivierung hervorrufen können. Trotzdem stellt das theoretische Supertop eine gute Grundlage dar, Peptide zu finden, die tatsächlich die transgenen T-Zellen aktivieren können.

In dem Supertop, dass durch unsere Experimente definiert wurde, sind die für die MHC-Peptid-Bindung benötigten Aminosäuren, also die Ankerpositionen an Position 4 und 5 (siehe auch Pearson et al.[110]), nur an Position 5 konserviert. An Position 4 ist demgegenüber jede beliebige Aminosäure substituierbar, ohne dass die T-Zellaktivierung eingeschränkt würde. Dabei ist bekannt, dass das MBP_Ac1-11-Peptid ein schlechter Binder an das I-A^u-MHC-Molekül ist[111]. Diese Befunde zeigen, dass eine gute Bindung an ein MHC-Molekül eine Aktivierung von T-Zellen vereinfachen kann, jedoch nicht unbedingt notwendig sein muss.

An den Positionen 3 und 6, die für die Bindung an den T-Zellrezeptor notwendig sind[110], können nur wenige Aminosäuren substituiert werden, ohne dass die T-Zellaktivierung verloren geht.

Mikrobielle, kreuzreaktive Peptide
Um mikrobielle oder virale Peptide zu finden, die dem Supertop entsprechen, wurden die SWISS und TREMBL Datenbanken mithilfe der ExPasy Software im Internet (http://us.expasy.org/tools/scanprosite) nach dem Supertop durchsucht[112].

Es wurden 832 Peptide gefunden, die erstens dem Supertop entsprechen und zweitens in Bakterien oder Viren exprimiert werden. Diese Peptide wurden auf Zellulosemembranen synthetisiert und auf deren Fähigkeit, Milzzellen der T⁺α^--Mäuse zu Proliferation anzuregen, untersucht. Es wurde wie im vorhergehenden Versuch die Inkorporation von ³H-Thymidin gemessen. Die Signalstärke der Negativkontrolle (PBS) war 2083 CPM, die Signalstärke des MBP_Ac1-11-Peptides war 167000 CPM.

Von den 832 Peptiden erreichten 61 Peptide einen Stimulationsindex von mehr als 50 (d.h. mehr als 104134 CPM). Dieser Wert wurde willkürlich sehr hoch angesetzt, um auszuschließen, dass auch Peptide, welche die Milzzellen nur suboptimal stimulieren, als positive Peptide erfasst werden. Die 61 Peptide sind in Abbildung 5 dargestellt.

Charakterisierung der T-Zellantwort auf ausgewählte mikrobielle Peptide
Die 61 Peptide induzieren Proliferation, allerdings ist bei der oben beschriebenen Methode die Konzentration der Peptide in den Lösungen nur annäherungsweise zu bestimmen. Abgesehen von den Unterschieden in der Menge synthetisierten Peptides ist insbesondere bei unterschiedlichen Löslichkeiten zweier Peptide in Wasser mit einer unterschiedlichen Endkonzentration zu rechnen. Deswegen sind die Ergebnisse relativ ungenau, außerdem kann keine Aussage über die Dosisabhängigkeit der T-Zellaktivierung bei verschiedenen Peptiden gemacht werden.

Um bessere Vergleichbarkeit und genauere Aussagen über die Dosisabhängigkeit und der Art der von den T-Zellen produzierten Zytokine zu erreichen, war es somit erforderlich, die zu untersuchenden Peptide nach einer konventionellen Methode (Fmoc-Technik) in Pulverform zu synthetisieren und in einer definierten Konzentration zu lösen. Die Synthese der Peptide wurde von der Gruppe von Prof. J. Schneider-Mergener übernommen.

Aufgrund des erheblichen Zeit- und Kostenaufwandes konnten allerdings nicht alle 61 Peptide in Pulverform synthetisiert werden.

Wie aus Abbildung 5 erkennbar wurden Peptide aus einer Vielzahl auch häufig vorkommender Organismen wie zum Beispiel dem Darmbakterium Escherichia coli oder der Bierhefe Saccharomyces cerevisiae gefunden, die Peptide enthalten, welche die MBP_Ac1-11-spezifischen T-Zellen aktivieren können.

Wir entschieden uns, Peptide genauer zu untersuchen, die in Organismen vorkommen, die nicht im Verdacht stehen, ursächlich mit dem Entstehen von EAE oder MS in Verbindung zu stehen. Damit wäre gezeigt, dass unter speziellen Bedingungen das Auslösen von Autoimmunität durch molekulare Mimikry möglich ist. Da dann aber auch ubiquitär vorkommende Bakterien kreuzreaktiv zu dem untersuchtem T-Zellrezeptor wären, sollte es unter physiologischen Bedingungen Mechanismen geben, die das Hervorrufen von Autoimmunität durch Kreuzreaktivität eines T-Zellrezeptors verhindern.

Abbildung 5 : 61 Peptide mikrobieller oder viraler Herkunft lösen Proliferation in Milzzellen der T ⁺ a ^- -Mäuse aus. Die Messung wurde drei Mal durchgeführt und das geometrische Mittel gebildet. Angegeben ist die Signalstärke in counts per minute (CPM). Die Standardabweichung der Signalstärke betrug zwischen 15 und 20%. Die Signalstärke der Negativkontrolle betrug 2083 CPM. Peptide, die eine Proliferation hervorriefen, dass die Signalstärke 50-mal so groß wie die Negativkontrolle ist (104134 CPM), wurden als positiv gewertet. Insgesamt wurden 832 Peptide getestet. Substituierte Aminosäuren, d.h. Aminosäuren, die sich von der MBP_Ac1-11-Peptid-Sequenz unterscheiden, sind schwarz hinterlegt.

Abbildung 6 : In Pulverform synthetisierte Peptide: Die Peptide MBP _Ac1-11 , 378 und 383 lösen Proliferation von T ⁺ a ^- Milzzellen aus. Das Peptid MBP_Ac1-11 ist als Positivkontrolle synthetisiert worden. Die Peptide 200 und 387 lösen keine Proliferation aus und sind als Negativkontrolle synthetisiert worden.

Aufgrund dieser Überlegungen wurden 5 Peptide ausgewählt und synthetisiert (siehe ).
Mikrobielle Peptide induzieren Proliferation von T⁺α^- Milzzellen
Einer suffizienten Aktivierung einer T-Zelle folgt die Proliferation der Zelle. Ein starker T-Zellrezeptoragonist ist durch eine Induktion der T-Zellproliferation auch schon bei geringen Konzentrationen des Agonisten gekennzeichnet. Um Peptide auf deren Immunogenität in einem bestimmten System zu untersuchen, ist die Erstellung einer Dosis-Wirkungskurve unerlässlich.

Es wurden Milzzellsuspensionen (s. S. 34) vorbereitet. Die zu untersuchenden Peptide wurden in absteigenden Konzentrationen zu den Suspensionen zugegeben und nach drei Tagen ³H-Thymidin zugegeben und die Inkorporation des radioaktiven Thymidins 18 Stunden später untersucht.

Das Ergebnis der Untersuchung ist in dargestellt. Die Peptide 383 und 378, die in der Analyse der auf Zellulosemembranen synthetisierten Peptide Proliferation hervorrufen konnten, induzieren in diesem Experiment Proliferationen der Milzzellen, die mit der Proliferation induziert durch das MBP_Ac1-11-Peptid vergleichbar sind. Auch in niedrigeren Konzentrationsbereichen ist bei allen drei Peptiden noch Proliferation zu detektieren. Dies ist sehr wichtig, da ein Einwand gegen die Relevanz der Kreuzreaktivität sein könnte, dass die in vitro verwendeten Peptidkonzentrationen um ein Vielfaches höher sind als die in vivo erreichten und somit eine Vielzahl der in vitro entdeckten kreuzreaktiven Peptide in vivo keine Rolle spielten, da die zur T-Zellaktivierung benötigten Peptidkonzentrationen nicht erreicht werden.

In diesem System stimulieren die kreuzreaktiven Peptide auch bei niedrigen Konzentrationen die T-Zellen ähnlich wie das MBP_Ac1-11-Peptid. Das MBP_Ac1-11-Peptid kann in vivo T-Zellen aktivieren, deswegen sollten die Konzentrationen der kreuzreaktiven Peptide theoretisch auch in vivo erreicht werden können.

Abbildung 7 Proliferation der T ⁺ a ^- Milzzellen auf verschiedene Peptidkonzentrationen. T⁺α^- Milzzellen wurden mit unterschiedlichen Peptidkonzentrationen stimuliert und die Inkorporation von radioaktiv markiertem Thymidin gemessen. Es ist die Peptidkonzentration gegen die induzierte Proliferation aufgetragen.
Zytokinproduktion T⁺α^- Milzzellen induziert durch mikrobielle Peptide
CD4⁺ T-Zellen wirken auf andere Zellen durch die Produktion von Zytokinen. Außerdem werden CD4⁺ T-Zellen aufgrund der von ihnen produzierten Zytokine verschiedene Klassen eingeteilt.

Um die von den T⁺α^--Zellen synthetisierten Zytokine zu analysieren, wurden die Zytokine (IFN-γ, IL-2, TNF-α, IL-4) intrazellulär angefärbt und mittels Durchflusszytometrie ausgewertet. Das Ergebnis der intrazellulären TNF-α Färbung ist in Abbildung 8 dargestellt. Es wird deutlich, dass die Peptide 378 und 383, die Proliferation der Milzzellen hervorrufen konnten, Produktion des Zytokins TNF-α in CD4⁺-Zellen induzieren. Die Kontrollpeptide 200 und 387 induzieren keine Zytokinproduktion. IFN-γ und IL-2 wurden in ähnlich wie TNF-α durch MBP_Ac1-11 und die Peptide 383 und 378 induziert, nicht aber durch die Kontrollpeptide. IL-4 wurde durch keins der getesteten Peptide induziert (Daten nicht gezeigt).

Zusätzlich wurde mithilfe der ELISA-Technik die Dosis-Wirkungskurven für die Induktion verschiedener Zytokine angefertigt[113] (Daten hier nicht gezeigt). Dabei wurde deutlich, dass die Peptide 378 und 383 auch in geringeren Konzentrationen die Produktion der getesteten Th1-Zytokine IL-2, IFN-γ in demselben Umfang wie MBP_Ac1-11induzierten.

Th2-Zytokine (IL-4, IL-5 und IL-10) wurden weder durch MBP_Ac1-11 noch von den mikrobiellen Peptiden induziert.

Abbildung 8 TNF-a Produktion nach Stimulation mit mikrobiellen Peptiden. Milzzellen von T⁺α^-Mäusen wurden mit 10 µg/ml der angegebenen Peptide stimuliert. Nach der extrazellulären CD4-Färbung und der intrazellulären TNF-α Färbung wurde eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt. Um das Ausmaß unspezifischer Bindungen des TNF-α-Antikörper zu ermitteln, wurde mit einem isotypischen Antikörper (Ratten IgG₁) gefärbt (Isotypkontrolle). Die y-Achse kennzeichnet die Intensität der TNF-α-Färbung, die x-Achse die Intensität der CD4-Färbung. Jeder Punkt repräsentiert eine Zelle. Die Zahlen geben den Anteil TNF-α produzierender (obere Zahl) bzw. nicht produzierender (untere Zahl) CD4⁺-Zellen in Prozent an.

Abbildung 9 EAE Induktion in T ⁺ a ^- -Mäusen. 5 T⁺α^-wurden mit je 200 µg der angegebenen Peptide immunisiert. Die Peptide waren in 100 µl PBS gelöst, wurden in 100 µl Kompletten Freunds Adjuvant emulgiert Jeder Maus wurden je 100 µl des Emulgats subkutan zu beiden Seiten der Schwanzbasis injiziert. Nach 24 und 48 Stunden wurde jeder Maus 200 ng Pertussis Toxin in 100 µl PBS intravenös injiziert. Die Mäuse wurden alle 2 bis 3 Tage auf Symptome von EAE untersucht. Klinischer Index (siehe auch Seite 46): 0 - Maus gesund; 1 – Schwanz gelähmt; 2 – Teilweise Paraparese der Hinterläufe; 3 – Vollständige Paralyse der Hinterläufe; 4 – Paralyse der Hinter- und Vorderläufe; 5 – Tod. Bei einem Index von 4 wurden die Mäuse getötet und für den Rest des Experiments als Index 5 gewertet.

Die Kontrollpeptide 200 und 387 induzierten auch bei hohen Konzentrationen (bis zu 300 µg/ml) kein getestetes Zytokin in messbaren Mengen.

In vitro konnten somit keine relevanten Unterschiede betreff der Induktion von Proliferation von Milzzellen und der Produktion von Zytokinen durch CD4⁺-Zellen zwischen den mikrobiellen Peptiden 378 und 383 festgestellt werden.
Induktion von EAE durch mikrobielle Peptide
Obwohl gezeigt wurde, dass die T-Zellen der transgenen Mäuse nach Stimulation mit mikrobiellen Peptiden bezüglich der Proliferation und der Produktion von inflammatorischen Zytokinen sehr ähnlich aktiviert werden wie durch das MBP_Ac1-11-Peptid, kann durch in vitro Experimente nicht gezeigt werden, dass diese Peptide auch in vivo in der Lage sind, Autoimmunität hervorzurufen.

Deswegen wurden T⁺α^--Mäusen mit den Peptiden immunisiert und auf das Entstehen der Autoimmunkrankheit EAE hin beobachtet (Abbildung 9).

Am Tag 0 wurden die Peptide vor der Immunisierung in kompletten Freunds Adjuvant (CFA, Mineralöl mit abgetöteten Mykobakterien) emulgiert und den Mäusen seitlich der Schwanzbasis 200 µl (100 µl auf jede Seite) subkutan injiziert. Jeder Maus wurden auf diese Weise 200 µg Peptid in 100 µl PBS und 100 µl CFA injiziert.

Je 24 und 48 Stunden später wurde jeder Maus 200 ng Pertussistoxin intravenös appliziert. Dieses Toxin wird zur Auslösung von EAE in vielen Modellen verwendet, obwohl dessen genaue Wirkungsweise unbekannt ist (siehe Seite 24).

Die Mäuse wurden alle 2 bis 3 Tage auf das Auftreten von Lähmungen hin untersucht (siehe auch Seite 46).

Mit den Peptiden, die in vitro eine Aktivierung von T-Zellen auslösen konnten, konnte auch die Autoimmunkrankheit EAE in den transgenen Mäusen ausgelöst werden. Auf der anderen Seite erkrankten die Mäuse nicht an EAE, die mit PBS und mit Peptiden, die in vitro keine Aktivierung hervorriefen, immunisiert wurden.

Somit sind die EAE auslösenden Eigenschaften des MBP_Ac1-11-Peptides sowie der kreuzreaktiven mikrobiellen Peptide sowohl in vitro als auch in vivo ähnlich. Allerdings könnte es sein, dass die Peptide bei einer Prozessierung der mikrobiellen Proteine überhaupt nicht entstehen. Außerdem werden die Proteine von den Organismen nicht unbedingt in Konzentrationen synthetisiert, die ausreichend sind, um genügend kreuzreaktives Peptid entstehen zu lassen. Somit ist nicht gezeigt, dass auch die Proteine oder die Mikroben in vivo EAE auslösen können.

Induktion von EAE durch „Bystander Activation“ Antwort der T-Zellen auf Lysate von S. typhimurium
Obwohl diese mikrobiellen Peptide Induktoren der Autoimmunkrankheit EAE sind, und somit die Kreuzreaktivität des MBP_Ac1-11 T-Zellrezeptors der verwendeten Mäuse zu diesen Peptiden aufweist, bleibt die Frage, ob die Proteine der Bakterien von den antigenpräsentierenden Zellen der Maus auch so prozessiert werden, dass diese Peptide entstehen.

Um dies zu überprüfen, untersuchten wir die Eigenschaften auf die T⁺α^--T-Zellen von Lysaten von Salmonella typhimurium. Diese wurden von Dr. U. Schaible kultiviert. Nach der Anzüchtung der Bakterien wurden diese durch Ultraschall lysiert, um ein Überwachsen der Zellkulturen mit Salmonellen zu verhindern.

In diesen Bakterien kommt das kreuzreaktive Peptid 383 im periplasmatischen β-Glucosidase Vorläuferprotein vor. Dieses Bakterium wurde ausgewählt, weil es sich einfach kultivieren lässt und das Peptid 383 von uns auf dessen Fähigkeit zur Aktivierung der T-Zellen genau charakterisiert wurde. Eine Assoziation einer Salmonella typhimurium-Infektion und einer MS-Erkrankung wurde bislang noch nicht beobachtet.

Diese Lysate wurden Milzzellen zugegeben und die T-Zellproliferation untersucht. Ein minimaler Effekt wurde beobachtet (siehe Abbildung 10).
In vitro Antwort der T-Zellen auf LPS im Vergleich zu Lysaten und Peptiden
Da die bakteriellen Lysate aber auch andere immunstimulatorische Substanzen enthalten, wurden zur Kontrolle Lipopolysaccharide (LPS) den Zellkulturen zugesetzt.
Proliferation von T-Zellen
Bei Zugabe von 2µg/ml LPS zu den Zellkulturen kommt es auch zu einer geringen T-Zellproliferation (siehe Abbildung 10). Diese T-Zellantwort ist ähnlich wie die Antwort, die bei Zugabe von bakteriellen Lysaten beobachtet wird. Um zu untersuchen, ob der beobachtete Effekt auf die transgenen Mäuse beschränkt ist, wurden auch PL/J-Mäuse untersucht. Dies ist ein Inzuchtstamm, der genetisch nicht verändert wurde. Es zeigte sich, dass die T-Zellproliferation auf LPS auch bei diesen Mäusen beobachtet werden konnte.

Da die zu beobachtende proliferative Antwort der T-Zellen auf LPS und Lysat sehr klein ist und die Aussage aus einzelnen Experimenten nicht möglich, wurden die Experimente oft wiederholt. Es zeigte sich, dass die Ergebnisse reproduzierbar sind und ein geringer Anteil (etwa 1 %) der T-Zellen durch Lipopolysaccharide zur Proliferation angeregt werden.

Die Messung der durch LPS induzierten Proliferation in T⁺α^--Mäusen wurde beispielsweise 5 Mal durchgeführt. Der Mittelwert der proliferierenden T-Zellen bei LPS war 1,2% und bei PBS 0,3%. Das Konfidenzintervall für LPS war 1,0%-1,4% und bei PBS 0,2%-0,4% (p<0,015).

Zwar wird versucht, unspezifische Bindungen durch Blockade der Fcγ-Rezeptoren und durch Zugabe von Rattenimmunglobulin zu verhindern. Dennoch kann nicht ausgeschlossen werden, dass bei der Vielzahl der B-Zellen und Makrophagen, die nach LPS-Gabe proliferieren, einige den CD4 Antikörper unspezifisch binden. Dieses kann durch Untersuchung von entsprechenden Isotypkontrollen ausgeschlossen werden. Somit können selbst so geringe Unterschiede der Proliferation von CD4⁺ Zellen zwischen Negativkontrolle und LPS ein Hinweis auf einen Effekt von LPS auf die CD4⁺ Zellen sein, jedoch war es sehr wichtig, zur weiteren Überprüfung der Ergebnisse andere Aktivierungsmarker zu untersuchen.
Änderung von aktivierungsabhängigen Oberflächenmolekülen nach LPS Stimulation
Um eine bessere Aussage bezüglich der Aktivierung von CD4⁺-T-Zellen zu erhalten, wurde nach der Regulation von verschiedenen Aktivierungsmarkern geschaut. Zellaktivierungsmarker sind Moleküle, die sich bei der Aktivierung von T-Zellen verändern. Dazu gehören beispielsweise CD62L (L-Selektin), welches nach Aktivierung der Zellen weniger exprimiert wird, oder CD25 (α-Kette des IL-2-Rezeptors), welches nach Aktivierung stärker exprimiert wird als bei naiven bzw. unstimulierten Zellen.

Bei diesen Untersuchungen wurden Milzzellen von T⁺α^- -Mäusen entnommen, Zellsuspensionen hergestellt und diese mit den zu untersuchenden Substanzen wie üblich für 3 Tage stimuliert.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 11 dargestellt.

Nach Stimulation der Zellen mit LPS wird CD62L sehr viel weniger exprimiert als nach Zugabe von PBS. CD25 wird nach LPS Stimulation etwas höher exprimiert als bei der Negativkontrolle, aber bei weitem nicht so hoch wie bei Zugabe von MBP_Ac1-11 Peptid bzw. Peptid 383. Dennoch werden beide Aktivierungsmarker aber durch Zugabe von LPS beeinflusst.

Abbildung 10 Geringe T-Zellproliferation nach LPS Stimulation. Milzzellen von T⁺α^--Mäusen (A) und PL/J-Mäusen (B) wurden mit CFSE gefärbt und den angegebenen Substanzen stimuliert. PBS diente dabei als Negativkontrolle. Die Konzentrationen der verschiedenen Substanzen sind: LPS 2 µg/ml, 1x10⁶ /ml lysierte S. typhimurium , MBP 10 µg/ml. Nach 3 Tagen wurden die Zellen geblockt mit Rattenimmunglobulin und anti-Fcγ-Rezeptor, um unspezifische Bindungen zu verhindern. Die Zellen wurden gefärbt mit anti-CD4-Cy5 und B220-PE. Vor der durchflusszytometrischenMessung wurde Propidiumiodid zugegeben. B220+ und PI+ Zellen wurden bei der Analyse ausgegrenzt.

Abbildung 11 Beeinflussung der Expression von T-Zellaktivierungsmarkern durch LPS. Milzzellen von T⁺α^- Mäusen wurden mit PBS, LPS (2 µg/ml), lysierten S. typhimurium (1x10⁶), MBP (10 µg/ml) oder Peptid 383 (10 µg/ml) stimuliert. Nach drei Tagen wurden die Zellen gewaschen und mit Rattenimmungobulin und anti-Fcγ-Rezeptor blockiert. Anschließend wurden die Zellen mit anti-CD4-biotin, anti-CD62L-Cy5 und anti-CD25L gefärbt. Nach 15 min Inkubation und einem Waschschritt wurde Streptavidin-PerCP als Sekundärfärbung zugegeben. Eine durchflusszytometrische Analyse wurde durchgeführt. Nur die CD4⁺ Zellen sind angezeigt.
Die Abhängigkeit der Aktivierung von CD4⁺ T-Zellen vom TCR
Eine wesentliche Frage ist die Möglichkeit einer vom T-Zellrezeptor unabhängigen Aktivierung der CD4⁺ T-Zellen. Um dies zu untersuchen, muss der T-Zellrezeptor durch entsprechende Antikörper blockiert werden (vgl. S. 45).

Zur Hemmung der Aktivierung der T-Zellen durch den T-Zellrezeptor müssen Oberflächenmoleküle durch spezifische Antikörper blockiert werden. Wir verwendeten dazu klonotypische anti-TCR Antikörper (3H12) und CD4 (L3T4) Antikörper.

Die Ergebnisse der Blockade mit beiden Antikörpern waren ähnlich, gezeigt sind hier die Ergebnisse mit anti-CD4.

Die blockierenden Antikörper wurden nach Herstellung der Milzzellsuspension von T⁺α^- - Mäusen den Zellkulturen zugegeben und während der Inkubation der Zellen mit den verschiedenen Substanzen in der Suspension belassen.

Die Zugabe von PBS löste unabhängig von der Zugabe der Antikörper keine Proliferation der CD4⁺ T-Zellen aus (siehe Abbildung 12).

Auf der anderen Seite werden die Milzzellen bei Abwesenheit von Antikörpern durch MBP_Ac1-11-Peptid stark aktiviert. Das Vorhandensein von CD4 (bzw. 3H12)-Antikörper blockiert die Aktivierung durch das Peptid.

LPS kann, wie bereits in Abschnitt 4.5.2.2 gezeigt wurde, die Zellen unbehandelter Milzzellen in einen aktivierten Zustand (CD62L^lowCD25^high) versetzen. Diese Aktivierung ist allerdings nicht so stark wie die Aktivierung der T-Zellen durch das MBP_Ac1-11-Peptid.

Im Gegensatz zu diesem werden die Zellen durch LPS aber auch dann noch aktiviert, wenn der T-Zellrezeptor durch Antikörper blockiert ist (siehe Abbildung 12). Dies deutet darauf hin, dass die Aktivierung der CD4⁺ T-Zellen unabhängig vom T-Zellrezeptor ist. Es müssen also andere Mechanismen dafür verantwortlich sein, die eine Aktivierung der T-Zellen hervorrufen. Da die Spezifität der T-Zellen durch den T-Zellrezeptor gewährleistet ist, ist die Aktivierung der T-Zellen durch LPS definitionsgemäß eine antigenunabhängige Aktivierung.
In vitro Effekte in nicht-transgenen Mäusen
Um auszuschließen, dass sich der beobachtete Effekt von LPS auf CD4⁺ T-Zellen nur auf die transgenen T⁺α^- Mäuse beschränkt, untersuchten wir Milzzellen von PL/J Mäusen. Diese Mäuse verfügen über ein normales T-Zellrepertoire und sind auch sonst in keiner Weise genetisch verändert. Solche Mäuse werden Wildtypmäuse genannt. Milzen von diesen Mäusen wurden entnommen und präpariert (siehe Abschnitt 3.2.1.2). Nach 3 Tagen Kultur mit verschiedenen Substanzen wurde eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt. Es zeigte sich, dass in diesen Mäusen LPS einen Effekt ähnlich wie bei den T⁺α^- Mäusen auf die CD4⁺-T-Zellen ausübt (siehe Abbildung 13) und dass es sich bei dem beobachteten Effekt nicht um ein Artefakt durch den transgenen Phänotyp der T⁺α^- Mäuse handelt.

Das Peptid MBP_Ac1-11 sowie die Peptide 383 und 378 hatten in den PL/J-Mäusen erwartungsgemäß keinen Effekt, da die spezifischen T-Zellen ohne vorheriger Immunisierung in so geringer Zahl vorhanden sein sollten, dass deren Aktivierung nicht messbar ist. Allerdings ist damit nicht gezeigt, dass die Aktivierung von T-Zellen durch LPS auch in Wildtypmäusen eine Relevanz besitzt und durch ihn Autoimmunität hervorgerufen werden kann. Es ist möglich und meines Erachtens wahrscheinlich, dass sich dies auf die transgenen Mäuse beschränkt, weil hier die autoreaktiven T-Zellen eine besonders hohe Frequenz haben.

Abbildung 12 Blockade von CD4 verhindert Aktivierung der CD4 ⁺ T-Zellen durch Peptide, aber nicht durch LPS. Milzzellen von T⁺α^- Mäusen wurden in Suspension gebracht und entweder direkt in Kultur gebracht (A), oder die T-Zellrezeptoren wurden mit dem anti-CD4-Antikörper L3T4 blockiert (B). Anschließend wurden die Zellen mit PBS, MBP_Ac1-11 (10 µg/ml) oder mit LPS (2 µg/ml) stimuliert. Nach drei Tagen Inkubation wurden die Zellen resuspendiert. Nach Zugabe von anti-Fcγ-Rezeptor und Ratten IgG wurden die Zellen mit anti-MHC-II-FITC, anti-CD25-PE, CD4-biotin und CD62L-Cy5 gefärbt. Eine Sekundärfärbung mit Streptavidin-PerCP wurde durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Nur T-Helfer-Zellen (CD4⁺MHC-II^- Zellen der richtigen Größe und Granularität) sind dargestellt.

Abbildung 13 In vitro Effekt von LPS auf T-Zellaktivierung in PL/J Mäusen. PL/J Mäusen wurden die Milzen entnommen und eine Zellsuspension wurde hergestellt. Die Zellen wurden mit den angegebenen Substanzen stimuliert (MBP und Peptid 383: 10 µg/ml, LPS: 2 µg/ml, S. typhimurium Lysat: 1x10⁶ Bakterien/ml). Nach drei Tagen Inkubation wurden die Zellen gewaschen, geblockt und mit anti-CD62L-Cy5, und anti-CD4-biotin gefärbt. Anschließend wurde als Sekundärfarbstoff Streptavidin-PerCP zugegeben. Eine durchflusszytometrische Analyse wurde durchgeführt.
In vivo Antwort der T-Zellen auf LPS und bakterielle Lysate
Bei diesen geringen T-Zellproliferationen muss untersucht werden, ob es sich um ein physiologisch relevantes Phänomen handeln. Um dies zu überprüfen, ist es nötig, den Effekt von LPS und den bakteriellen Lysaten in vivo experimentell zu untersuchen.

Dazu wurden T⁺α^- -Mäuse mit LPS (50 µg/Maus) oder Lysate (1x10⁸ lysierte Bakterien/Maus), in Kompletten Freunds Adjuvant emulgiert, subkutan injiziert. 24 und 48 Stunden später wurde Pertussistoxin (200 ng/Maus) intravenös appliziert.

Als Kontrolle wurden andere Gruppen von T⁺α^- - Mäusen mit PBS als Negativkontrolle und MBP_Ac1-11-Peptid oder dem Peptid 383 als Positivkontrolle immunisiert.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 14 gezeigt.

Es wird deutlich, dass auch LPS und das bakterielle Lysat in vivo die Autoimmunkrankheit EAE in T⁺α^- Mäusen hervorrufen kann. Dass die Mäuse nicht bei jeder Form der Immunisierung krank werden, ist durch die Negativkontrolle gezeigt, denn hier werden die Mäuse auch mit den immunstimulatorisch wirkenden Adjuvantien Kompletten Freunds Adjuvant und Pertussistoxin immunisiert.

Abbildung 14 : Induktion von EAE durch LPS. T⁺α^- Mäuse wurden mit LPS (50 µg/Maus), MBP_Ac1-11 (200 µg/Maus), lysierten S. typhimurium (1x10⁸/Maus) oder PBS (100 µl/Maus) immunisiert. Alle Lösungen wurden vor Applikation in kompletten Freunds Adjuvant emulgiert und anschließend subkutan in die Schwanzbasis injiziert. 200 ng Pertussis Toxin wurden 24 und 48 Stunden später intravenös gegeben. Klinischer Index (siehe auch Seite 46): 0 - Maus gesund; 1 – Schwanz gelähmt; 2 – Teilweise Paraparese der Hinterläufe; 3 – Vollständige Paralyse der Hinterläufe; 4 – Paralyse der Hinter- und Vorderläufe; 5 – Tod. Bei einem Index von 4 wurden die Mäuse getötet und für den Rest des Experiments als Index 5 gewertet.
Histologien LPS- und MBP –immunisierter Mäuse
Abbildung 15 Histologien von an EAE erkrankten Mäusen. T⁺α^- Mäuse wurden mit LPS (50 µg/Maus) oder MBP_Ac1-11 (200 µg/Maus) immunisiert. Alle Lösungen wurden vor Applikation in komplettem Freunds Adjuvant emulgiert und anschließend subkutan in die Schwanzbasis injiziert. 200 ng Pertussis Toxin wurden 24 und 48 Stunden später intravenös gegeben. Bei einem klinischen Index von 3 wurden die Mäuse perfundiert und histologisch aufgearbeitet. Es sind mit HE, CD3, Mac-3 und B220 gefärbte Schnitte gezeigt. Die Infiltrate scheinen bei beiden Immunisierungen gleich aufgebaut zu sein. Auch bei mit S. typhimurium-Lysat immunisierte Mäusen zeigte sich kein Unterschied (Daten nicht gezeigt).

Von anderen Gruppen wurde beschrieben, dass sich das histologische Erscheinungsbild der Krankheit EAE unterschiedlich darstellen kann, wenn andere Bedingungen geschaffen werden. Speziell zeigte Dr. J. Lafaille, dass Th2-Zellen in Mäusen Infiltrate erzeugen, in denen polymorphkernige Granulozyten und Mastzellen vorherrschen, im Gegensatz zu dem Vorherrschen von Makrophagen in Infiltraten hervorgerufen von Th1-Zellen[114].

Eine wichtige Frage ist also, ob die Histologien der Infiltrate von Mäusen, nachdem sie mit LPS immunisiert wurden, sich von den Histologien der mit Peptid immunisierten Mäuse unterscheidet.

Um dies zu untersuchen, wurden Gehirne und Rückenmarke von erkrankten Mäusen bei einem klinischen Index von 3 nach verschiedenen Immunisierungen entnommen, histologisch aufbereitet und untersucht (siehe Abschnitt 3.2.3). Die Untersuchung beinhaltet die Beschreibung der Infiltrate betreffs Zusammensetzung und Lokalisation. Außerdem wird korrespondierend zu dem klinischen Index ein histologischer Index ermittelt. Dieser ist gleich der durchschnittlichen Anzahl von Infiltraten pro Rückenmarksquerschnitt.

Die Auswertung der Histologien nahm Dr. C. Stadelmann, damals Instituts für Neuropathologie der Charité, vor.

Wie in Abbildung 15 zu sehen, konnten keine Unterschiede zwischen Infiltraten von mit LPS- oder MBP-Peptid immunisierten Mäusen festgestellt werden. Auch der histologische Index unterschied sich nicht. Bei den Infiltraten und Indizes von Mäusen, die mit S. typhimurium-Lysat immunisiert wurden, wurden keine Unterschiede festgestellt, die Histologien sind aber nicht gezeigt.

Bei den Infiltraten herrschen Mac-3-positive Zellen, also Makrophagen, vor. Einige CD3-positive (T-Zellen) und einige B220-positive (B-Zellen) Zellen kommen vor.

Die Ergebnisse für mit Peptid immunisierte Mäuse decken sich mit Ergebnissen anderer Arbeiten (Seite 23), die Ergebnisse für mit LPS immunisierten Mäuse lassen keinen

Unterschied erkennen.
T-Zellabhängige Induktion von EAE durch LPS
Durch die vorhergehenden Experimente ist zwar gezeigt, dass LPS einen in vitro Effekt auf T-Zellen hat und dass LPS in T⁺α^- -Mäusen EAE auslösen kann. Allerdings könnte es auch sein, dass EAE unabhängig von T-Zellen induziert wird, sondern durch Aktivierung von Zellen des angeborenen Immunsystems.

Um dies zu untersuchen, wurden α^-/- -Mäuse mit LPS oder bakteriellen Lysaten immunisiert. Diese Mäuse stammen aus derselben Zucht wie die T⁺α^- -Mäuse. Da der transgene T-Zellrezeptor in manchen Mäusen heterozygot vorhanden ist, werden bei der Zucht gelegentlich Mäuse geboren, die den transgenen T-Zellrezeptor nicht vererbt bekommen haben. Diese Mäuse werden durch Bluttestung auf CD4⁺ Vβ8⁺-Zellen ermittelt und in einer gesonderten Zucht verpaart. Diese Mäuse besitzen keine T-Zellen, da durch das Ausschalten der T-Zellrezeptor α-Ketten kein funktioneller T-Zellrezeptor gebildet werden kann.

Diese Mäuse wurden wie oben beschrieben LPS in Adjuvant und mit Pertussistoxin i.v. immunisiert. Trotz mehrfacher Wiederholung der Experimente (insgesamt wurden 20 Mäuse immunisiert), wurde bei keiner Maus das Entstehen von EAE beobachtet. Dies zeigt, dass T-Zellen zur Induktion von EAE durch LPS nötig sind.