Otto-Knapp, Ralf : Die Regulation antioxidativer Enzyme nach Ozonexposition am Kulturmodell der menschlichen Nasenschleimhaut

Aus der Abteilung für klinische Immunologie und Asthmapoliklinik
Charite
Campus Virchow Klinikum
Prof. Dr. G. Kunkel


Dissertation
Die Regulation antioxidativer Enzyme
nach Ozonexposition
am Kulturmodell der menschlichen Nasenschleimhaut

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)

An der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt Universität zu Berlin

Vorgelegt von Ralf Otto-Knapp

Dekan: Prof. Dr. J. D. Dudenhausen

Gutachter:
Prof. Dr. G. Kunkel
Prof. Dr. H. Lode
Prof. Dr. R. Loddenkemper

eingereicht: 29.11.2000

Datum der Promotion: 29.06.2001

Zusammenfassung

Die antioxidativen Enzyme Katalase (KAT), Glutathion-Peroxidase (GPX), Glutathion-Reduktase (GR), Superoxid-Dismutase (SOD) und Glutathion-S-Transferase (GST) sind an der intrazellulären Abwehr von oxidativem Stress beteiligt. Diverse Arbeitsgruppen fanden eine Hochregulation der antioxidativen Enzyme (AOEs) nach Exposition auf Ozon. In der vorliegenden Studie sollte an einem von Schierhorn und Mitarbeitern entwickelten Kulturmodell der nasalen Mukosa des Menschen untersucht werden, ob Aktivitätsänderungen der AOEs nach Ozonexposition in vitro zu verzeichnen sind. Zu diesem Zweck wurde die nasale Mukosa von 67 Patienten, die sich wegen nasaler Atmungsbehinderung einer Conchotomie unterzogen hatten, 24 Stunden bei 37 °C und 5% CO2 kultiviert und parallel unter den selben Bedingungen einer zusätzlichen Ozonkonzentration von 120 ppb ausgesetzt. Tendenzielle Aktivitätsänderungen durch Ozon ließen sich bei der GPX (13.8 auf 17.7 mU/mg Protein, 28% Steigerung) und der SOD (8.4 auf 9.7 U/mg Protein, 15% Steigerung) feststellen. Diese Aktivitätszunahmen wiesen jedoch keine Signifikanz auf. Aktivtätsänderungen bei KAT, GR und GST durch die Ozonexposition wurden nicht gefunden. Alter der Patienten, Geschlecht und Zigarettenrauchen nahmen den Ergebnissen dieser Studie nach keinen Einfluß auf die Regulation der AOEs nach Ozonexposition.

Die Deletion der Glutathion-S-Transferase M1, die bei etwa 50% der mitteleuropäischen Bevölkerung zu finden ist, veränderte die Regulation der SOD nach in vitro Ozonexposition. Die GST-defizienten Patienten dieser Studie beantworteten die Ozonexposition mit einer signifikanten Hochregulation der SOD (p<0.01), während die Patienten, für die keine GSTM1-Defizienz gefunden wurde, keine signifikante Änderung der enzymatischen SOD-Aktivität nach Ozon aufwiesen. Für die KAT, GPX, GR und GST war die GSTM1-Defizienz bezüglich ihrer Aktivitätsänderungen nach Ozon ohne Relevanz.

Schlußfolgerungen: Am Modell der menschlichen Nasenschleimhaut in vitro ließ sich keine signifikante Änderung der antioxidativen Enzymaktivitäten nach 24-stündiger Ozonexposition von 120 ppb beobachten. Vermutlich spielen die antioxidativen Enzyme keine Rolle bei der Abwehr einer oxidativen Ozonbelastung dieser Dauer und Konzentration. Bei Glutathion-S-Transferase M1 Defizienz findet eine Hochregulation der Superoxid-Dismutase nach Ozonexposition statt. Dieses Ergebnis könnte auf eine modulierte enzymatische Regulation durch den GSTM1-Polymorphismus hinweisen.

Abstract

Antioxidant enzymes as catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX), superoxide dismutase (SOD) and glutathione S-transferase (GST) are thought the primary cellular defense mechanism against reactive oxygen species. Ozone, a highly reactive oxidant, is known to cause respiratory symptoms at ambiental doses. A number of studies have shown the mucosa of the respiratory tract to be the first target site of ozone toxicity. Other animal studies demonstrated an upregulation of mucosal antioxidant enzymes after ozone exposition. Concerning to the antioxidant defense mechanisms of the human nasal mucosa no studies are found so far.

The purpose of this study was to determine if in vitro ozone exposure of human nasal mucosa results in changes in the activity of CAT, GPX, SOD, GST and glutathione reductase (GR). Nasal mucosa from 67 patients was cultivated in a specially designed in vitro organ culture and exposed to 120 ppb ozone for 24 hours. The results were compared with the histamin release which is known to be upregulated from human nasal mucosa after ozone exposition (60-200 ppb).

Schlagwörter:
Antioxidative Enzyme, Ozon, GSTM1, Kulturmodell menschlicher nasaler Mukosa

Keywords:

Keywords:
antioxidative enzymes, ozone, GSTM1, culture modell of human nasal mucosa


Seiten: [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [98] [99] [100]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteDie Regulation antioxidativer Enzyme nach Ozonexposition am Kulturmodell der menschlichen Nasenschleimhaut
1 Einleitung
1.1Oxidativer Stress
1.1.1Ozon (03) als Bestandteil des saisonalen photochemischen Smogs
1.1.2Physiologische Auswirkungen der Ozonbelastung
1.1.3Biochemische Grundlagen der Ozonwirkung am Epithel
1.1.4Zellulärer oxidativer Stress und seine physiologischen Abwehrmechanismen
1.2Antioxidative Enzyme (AOEs)
1.2.1Katalase (KAT)
1.2.2Glutathion-Redoxzyklus
1.2.3Die Superoxid-Dismutase (SOD)
1.2.4Glutathion-S-Transferase (GST)
1.2.5Polymorphismus der Glutathion-S-Transferase M1 (GSTM1)
1.2.6Die Bedeutung der antioxidativen Enzyme als Abwehrmechanismus bei Ozonexposition
1.3Histamin als Mediator der ozoninduzierten Lungensymptomatik
1.4Das Kulturmodell der Nasenschleimhaut
1.5Zielsetzung der Arbeit
2 Material und Methoden
2.1Beschreibung des Kollektivs
2.2Materialgewinnung und Aufarbeitung
2.2.1Organkultur und Ozonexposition
2.2.2Aufbereitung der Proben zur enzymatischen Analyse
2.3Bestimmung des Proteingehaltes
2.4Bestimmung der enzymatischen Aktivitäten im Zelllysat
2.4.1Katalase
2.4.2Glutathion-Peroxidase
2.4.3Glutathion-Reduktase
2.4.4Superoxid-Dismutase
2.4.5Glutathion-S-Transferase
2.5Bestimmung des Histamingehaltes aus dem Kulturüberstand
2.6Klassifizierung des GSTM1-Polymorphismus
2.6.1Aufreinigung der DNS aus Nasenschleimhautgewebe
2.6.2Bestimmung des GSTM1-Genes
2.7Statistik
3 Ergebnisse
3.1Veränderungen bei der Histaminfreisetzung durch 24 Stunden 120 ppb Ozonexposition
3.2Veränderungen der Aktivität antioxidativer Enzyme durch 24 Stunden 120 ppb Ozonexposition
3.2.1Katalase
3.2.2Glutathion-Peroxidase
3.2.3Glutathion-Reduktase
3.2.4Superoxid-Dismutase
3.2.5Glutathion-S-Transferase
3.3Vergleich der Enzymregulation mit individuellen Faktoren
3.3.1Geschlecht der Patienten
3.3.2Raucher und Nichtraucher
3.3.3Alter der Patienten
3.4Der Polymorphismus der GSTM1
3.4.1Regulation antioxidativer Enzyme bei GSTM1-Defizienz
3.4.2Die Regulation der SOD bei GSTM1-Defizienz
4 Diskussion
4.1Höhe der enzymatischen Gesamtaktivitäten
4.1.1Katalase
4.1.2Glutathion-Peroxidase
4.1.3Glutathion-Reduktase
4.1.4Superoxid-Dismutase
4.1.5Glutathion-S-Transferase
4.2Veränderungen antioxidativer Enzymaktivitäten durch 24-stündige Ozonexposition (120 ppb)
4.2.1Katalase
4.2.2Glutathion-Peroxidase
4.2.3Glutathion-Reduktase
4.2.4Superoxid-Dismutase
4.2.5Glutathion-S-Transferase
4.2.6Geschlechterspezifische Unterschiede
4.2.7Unterschiede zwischen Rauchern und Nichtrauchern
4.2.8Altersabhängige Unterschiede
4.3Hochregulation der Superoxid-Dismutase bei GSTM1 - Defizienz
4.3.1SOD-Hochregulation durch Substratakkumulation bei GSTM1-Defizienz
4.3.2Beeinflussung der SOD-Aktivität über die Modulation der physiologischen Signaltransduktion
4.3.3Hochregulation der SOD durch unabhängige Faktoren
4.4Nicht enzymatische Wege der antioxidativen Abwehr
Bibliographie Literaturverzeichnis
Danksagung
Lebenslauf
Selbständigkeitserklärung

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Die Tabelle zeigt die zweiseitigen asymptotischen Signifikanzen (Mann-Whitney-U-Test) für die unabhängigen Variablen der prozentualen Enzymaktivitätsänderungen durch 24 Stunden 120 ppb Ozon gruppiert nach Geschlecht.
Tabelle 2: Die Werte der Tabelle geben die zweiseitigen asymptotischen Signifikanzen nach dem Mann-Whitney-U-Test für zwei unabhängige Variablen beim Vergleich von Rauchern und Nichtrauchern hinsichtlich ihrer prozentualen Enzymaktivitätsänderungen durch 24 Stunden 120 ppb Ozonexposition gegenüber der Vergleichsprobe wieder.
Tabelle 3 und Tabelle 4 geben die zweiseitigen asymptotischen Signifikanzen nach dem Wilcoxon-Test für zwei verbunde Stichproben an. Dargestellt werden die Signifikanzen der enzymatischen Aktivitätsänderungen von Vergleichsproben, CO2 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C und 5% CO2), zu ozonexponierten Proben, CO2 + O3 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C, 5% CO2 und 120 ppb Ozon). Tabelle 3.3 zeigt die Aktivitätsänderungen von GSTM1-defizienten Patienten und Tabelle 3.4 von Patienten mit genetisch vorhandener GSTM1.
Tabelle 4:
Tabelle 5: Die Referenzwerte der enzymatischen Aktivitäten werden präsentiert als Mittelwert ± SD

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Die Grafik zeigt den Transport von Wasserstoff aus dem Pentosephosphatweg über die Glutathion-Reduktase zum Glutathion, welches in reduzierender Weise Wasserstoffperoxide und organische Peroxide entgiftet 40 .
Abbildung 2: Die Grafik stellt einen Ausschnitt aus dem komplexen Zusammenspiel der antioxidativen Enzyme Katalase (Cat), Glutathion-Peroxidase (GSH-Px) und Superoxid-Dismutase (SOD) bei der intrazellulären Abwehr von oxidativem Stress dar 58 .
Abbildung 3: Schematische Darstellung der Kultivierungsmethode anhand einer Kulturschale.
Abbildung 4: Die Abbildung zeigt die ersten drei Schritte der Amplifikation einer DNS-Sequenz, die mittels Primer erkannt wird. Mit steigender Anzahl von Zyklen wird der gesuchte Abschnitt exponentiell vermehrt
Abbildung 5: Die Abbildung zeigt die Histaminkonzentration im Kulturmedium von Kontrolle (1 Stunde Vorinkubation), CO2 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C und 5% CO2) und CO2 + O3 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C, 5% CO2 und 120 ppb Ozon). Bei einer Fallzahl von n=42 wurde der Median der untersuchten Proben dargestellt. Die obere Grenze der Box zeigt die 25te und die untere die 75te Perzentile. Minimum und Maximum werden durch die Balken präsentiert
Abbildung 6: Die Abbildung zeigt die enzymatische Katalase-Gesamtaktivität von Kontrolle, CO2 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C und 5% CO2) und CO2 + O3 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C, 5% CO2 und 120 ppb Ozon). Bei einer Fallzahl von n = 67 wurde der Median der untersuchten Proben dargestellt. Die obere Grenze der Box zeigt die 25te und die untere die 75te Perzentile. Minimum und Maximum werden durch die Balken präsentiert.
Abbildung 7: Die Abbildung zeigt die enzymatische Glutathion-Peroxidase-Gesamtaktivität von Kontrolle, CO2 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C und 5% CO2) und CO2 + O3 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C, 5% CO2 und 120 ppb Ozon). Bei einer Fallzahl von n = 12 wurde der Median der untersuchten Proben dargestellt. Die obere Grenze der Box zeigt die 25te und die untere die 75te Perzentile. Minimum und Maximum werden durch die Balken präsentiert.
Abbildung 8: Die Abbildung zeigt die enzymatische Glutathion-Reduktase-Gesamtaktivität von Kontrolle, CO2 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C und 5% CO2) und CO2 + O3 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C, 5% CO2 und 120 ppb Ozon). Bei einer Fallzahl von n = 67 wurde der Median der untersuchten Proben dargestellt. Die obere Grenze der Box zeigt die 25te und die untere die 75te Perzentile. Minimum und Maximum werden durch die Balken präsentiert.
Abbildung 9: Die Abbildung zeigt die enzymatische Superoxid-Dismutase-Gesamtaktivität von Kontrolle, CO2 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C und 5% CO2) und CO2 + O3 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C, 5% CO2 und 120 ppb Ozon). Bei einer Fallzahl von n = 20 wurde der Median der untersuchten Proben dargestellt. Die obere Grenze der Box zeigt die 25te und die untere die 75te Perzentile. Minimum und Maximum werden durch die Balken präsentiert.
Abbildung 10: Die Abbildung zeigt die enzymatische Glutathion-S-Transferase-Gesamtaktivität von Kontrolle, CO2 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C und 5% CO2) und CO2 + O3 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C, 5% CO2 und 120 ppb Ozon). Bei einer Fallzahl von n = 51 wurde der Median der untersuchten Proben dargestellt. Die obere Grenze der Box zeigt die 25te und die untere die 75te Perzentile. Minimum und Maximum werden durch die Balken präsentiert.
Abbildung 11: Die Abbildung zeigt die prozentuale enzymatische Aktivitätssteigerung durch 24 Stunden 120 ppb Ozon gegenüber der Vergleichsprobe in Abhängigkeit vom Alter des jeweiligen Patienten als Streudiagramm.
Abbildung 12: Die Abbildung zeigt exemplarisch die photografische Darstellung der durch die Elektrophorese kenntlich gemachten DNS-Fragmente nach PCR-Analyse. Die untere Bande ist artifiziell, bei der mittleren Bande handelt es sich um humanes beta-Globin und die obere Bande stellt, falls vorhanden, das 625 bp Fragment des humanen GSTM1-Genes dar.
Abbildung 13: Die Abbildung zeigt die Gesamtaktivität an Superoxid-Dismutase bei GSTM1 Defizienz bzw. vorhandener GSTM1 als Median. Dargestellt sind Kontrolle, CO2 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C und 5% CO2) und CO2 + O3 (Vorinkubation + 24 Stunden bei 37 °C, 5% CO2 und 120 ppb Ozon). Die Fallzahl betrug n = 12 (GSTM1-Defizienz) bzw. n = 8 (GSTM1 vorhanden). Die obere Grenze der Box zeigt die 25te und die untere die 75te Perzentile. Minimum und Maximum werden durch die Balken präsentiert.

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Wed Sep 12 12:33:25 2001