II. Material und Methoden

II.1. Material

II.1.1. Antigene

II.1.1.1. Urease

Native Urease (Untereinheit A und B), gewonnen aus H. pylori Lysaten, und rekombinante Urease (Untereinheit B), gewonnen aus Lysaten von rekombinanten Escherichia coli Bakterien, wurden dazu verwendet, um im T-Zell-Elispot, im B-Zell-Elispot, dem Proliferationsassays und im enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa) eine spezifische Antwort gegen native und rekombinante Urease zu ermitteln.

Die Aufreinigung aus den Lysaten wurde von Robert Hurwitz (Proteinservicegruppe, Max Plack Institut für Infektionsbiologie) vorgenommen und soll hier nur kurz skizziert werden.

II.1.1.1.1. Native Urease

Die H. pylori-Bakterien des Stammes P76 wurden zuerst in 40 mM Phosphatpuffer, pH 7,6, 1 mM EDTA suspendiert und dann mittels French Press (2 x 20.000psi) lysiert.

Die im Lysat gelöste Urease wurde ca. 100fach durch Q-Sepharose-Chromatographie angereichert und weiter gereinigt durch eine MonoQ-FPLC (Pharmacia) Säule.

Elution erfolgte durch linearen NaCl-Gradienten in 40 mM Phosphatpuffer, 1mM EDTA.

Die Fraktionen mit der höchsten Urease-Aktivität wurden gepoolt, konzentriert durch Ammoniumsulfat Präzipitation und weiter aufgereinigt durch Gel-Filtration auf einer Superdex 200 HR26/60 Säule (Pharmacia) in Phosphat buffered saline (PBS)/1mM EDTA

Die Aktivität der Urease wurde mittels phenol red assay bestimmt, wie bei Hamilton-Miller und Gargan beschrieben (Hamilton-Miller, J. M. et al. 1979).

Mittels Limulus Amebocyte Lysate Assay wurde die Konzentration an Endotoxin mit 150 ng/mg Urease ermittelt

II.1.1.1.2. Rekombinante Urease

Die Urease Untereinheit B wurde in Escherichia coli Bakterien überexprimiert, so daß das rekombinante Protein mittel 8M Urea von Einschlußkörperchen extrahiert werden [Seite 26↓]mußte. Die Aufreinigung erfolgte durch nickel-nitrilotriacetic acid metal affinity chromatography (Qiagen) unter denaturierenden Bedingungen. Die elutierten Proteine wurden durch Dialyse gegen PBS zurückgefaltet und durch Gel Filtration Chromatographie auf einer Superose 12Hr10/30 Säule (Pharmacia) gereinigt.

Die Endotoxin Konzentration wurde mit 120 ng/ml wie oben beschrieben ermittelt.

II.1.1.2. andere Antigene und Reagenzien

Salmonellen-O-Antigen

Sifin; Nr.: TS 1602

Salmonellen-H-Antigen

Sifin; Nr.: TS 1603

Salmonellen-LPS

Sigma; Nr.: L-2375

Tetanustoxin

Chiron Behring; Nr.: 00HG005

Escherichia coli LPS

Proteinservicegruppe MPI, Berlin

Protein GroEl

Proteinservicegruppe MPI, Berlin

PHA-L

Sigma; Nr.: L-4144

ConA

Sigma; Nr.: C-5275

Hybrimax

Sigma; Nr.: A-4668

Gentamycin

Invitrogen; Nr.: 15710-049

Streptomycin

Fluka; Nr.: 85880

Interleukin 2

Tebu; Nr.: 200-02

[3H] Thymidin

Amersham; TRK 637

II.1.2. Antikörper

Anti-Human-IgG

Sigma; Product No.: I-8010

Biotin- SP-conjugated Anti-Human-

IgG, M, A

JIR; Code: 309-065-003

Anti human IFN-γ

R&D Systems; Nr.: MAB 285

Biotinylierter Anti human IFN-γ

R&D Systems; Nr.: BAf 285

Peroxidase conjugated anti-Human

IgG (H+L)

JIR; Nr.: 309-035-082

Anti human IFN-γ

Biosource; Nr.: 58.123.08

Biotinylierter Anti human IFN-γ

Biosource; Nr.: 58.123.02


[Seite 27↓]

II.1.3.  Lösungen

RPMI 1640 Medium

Gibco; Nr.: 21875-034

Phosphat buffered saline (PBS)

Sigma; Nr.: L-8754

FICOLL-Separation-Solution

Biochrom KG; Nr.: L 6115

Human Serum AB

PAA; Nr.: C15-021

Bovine Serum Albumin (BSA)

SERVA; Nr.: 47321

Schwefelsäure

Max Planck Institut Berlin

Phosphatase - konjugiertes Streptavidin

Dianova, Nr.: 016-030-084

BCIP/NBT bufferedSubstrat Tabletten

Sigma, Product No. B5655

  

Substratlösung (Elisa)

 

TMB Peroxidase Substrate

Kirkegaard Pery, Nr.: 50-76-01

Peroxidase Solution B (H2O2)

Kirkegaard Pery, Nr.: 50-65-00

Carbonatpuffer (Elispot Coating buffer)

NaHCO3 2,93g

Na2C03 1,5g

ad 1l Aqua dest.; entspricht: 0,05M Carbonate pH 9,6) (Wien)

Blocking buffer

3% BSA (B-Zell-Elispot)

oder 1% BSA (T-Zell-Elispot)

ad 1l PBS

Waschlösung

0.05 % Tween

ad 1l PBS

Standard Diluent

PBS

0,5% BSA

0,1% Tween


[Seite 28↓]

II.1.4.  weitere Materialien und Reagenzien

SARSTEDT-Monovetten

 

Neubauer-Zählkammer

 

Kryotubes

NUNCTM Kryotubes

Soja(Merck)-LB Medien

Max Planck Institut Berlin

LB Agar

Life technologies; Nr.: 22700-025

Zentrifuge

Kendro Lab. Product

96 well NUNC Platte

NUNCTM Brand Product

Brutschrank

NUAIRETM US Autoflow

Microbeta scintillation counter

Packard topcount

Cellulose-ester-membrane-bottemed Platten

MultiScreen®

Elisa-Waschgerät

TECAN

Elispot-Reader

Bioreader®, Bio-Sys GmbH

Elisa-Reader

SpectraMax 250, Molecular Devices

II.1.5. Charakterisierung des Kontrollstammes Salmonella typhi Ty21a

Der Salmonellenstamm S. typhi Ty21a ist eine Mutante des pathogenen Stammes S. typhi Ty2. Er gehört nach dem Kauffmann-White-Schema zur Gruppe D1 mit den O-Antigenen 9,12. Ty21a entstand durch Behandlung von Ty2 mit N-methyl-N`-nitro-N-nitroguanidin und anschließender Selektion der Vi¯ Mutante.

Ein Charakteristikum von S. typhi Ty21a ist der Mangel an UDP-Galaktose-4-Epimerase. Als Folge davon kann die Biosynthese ganzer Zellwand-Lipopolysaccharide nur unter Bedingungen stattfinden, die gleichzeitig zu einer Lyse und Inaktivierung des Bakteriums durch Anhäufung toxischer Mengen an Galaktose-1-Phosphat und UDP-galaktose führen (Gilman, R. H. et al. 1977).


[Seite 29↓]

Unter physiologischen Bedingungen beim Menschen kann S. typhi Ty21a als lebender Organismus fast nie länger als einen Tag, jedoch niemals länger als zwei bis drei Tage nach Verabreichung im Stuhl nachgewiesen werden.

Dies macht S. typhi Ty21a zum Modell eines Vektors für Fremdantigene, der durch eine kurz andauernde Infektion zwar eine Immunantwort garantiert, durch die Autolyse nach spätestens drei Tagen aber keine Infektion hervorruft.

Neben der UDP-galaktose-4-epimerase sind noch andere Enzyme des Galaktosestoffwechsels in ihrer Aktivität vermindert. Die Galaktose-Permease ist um 50%, die Galaktose-1-Phosphat-Uridyl-Transferase um 35% und Galaktokinase um 15% in ihrer Aktivität vermindert. Dies hat zur Folge, daß Galaktose nicht verstoffwechselt werden kann und so bereits eine Konzentration von 0,1% Galaktose im Nährmedium zur Lyse des Bakteriums führt. Nur in Anwesenheit von Galaktose ist S.typhi Ty21a zur LPS-Bildung fähig, was die Immunantwort des Wirtes aktiviert. Dieses LPS wird smooth-type LPS genannt. Ohne Galaktose im Nährmedium ist Ty21a zwar fähig zu wachsen, es wird dann aber nur sog. rough-type LPS gebildet, welches die Immunantwort des Wirtes nicht oder nur in geringem Maße aktiviert.

S. typhi Ty21a ist ein stabiler Doppelmutant. Reversionen wurden weder bei Wachstum in vitro noch bei Wachstum in vivo beobachtet (Germanier und Furer 1983).

II.1.6. Charakterisierung des Impfstammes Salmonella typhi Ty21a(pDB1)

Der Impfstamm S. typhi Ty21a(pDB1) basiert auf dem oben bereits beschriebenen Ausgangsstamm S. typhi Ty21a. Zuerst wurde nach der Methode von Morona et al. eine thyminabhängige Spontanmutante von S. typhi Ty21a selektiert (Morona, R. et al. 1991). Der resultierende Stamm hat die Bezeichnung Ty21a thyA. Als nächster Schritt wurde in Ty21a thyA ein Plasmid integriert, welches den genetischen Code zur Expression von Urease und zur Produktion von Thymidilat Synthase trägt. Dieses Plasmid wurde durch Modifikation des Urease-Expressionsplasmids pYZ97 (Gomez-Duarte, O. G.. et al. 1998) gewonnen. Diesem Expressionsplasmid wurde das Beta-Lactamase-Gen, das eine Resistenz gegen Ampicillin vermittelt, vollständig deletiert und das Thymidilat-Synthase-Gen aus Escherichia coli K12 eingesetzt (Belfort, M. et al. 1983). Das resultierende Plasmid „pDB1“, das in den Salmonellenstamm Ty21a thyA [Seite 30↓]integriert wurde, komplementiert die Thymidinabhängigkeit von Ty21a thyA. Der resultierende Stamm mit Expression von Urease und ohne Thymidinabhängigkeit bzw. bekannter Antibiotikaresistenz trägt die Bezeichnung Ty21a(pDB1).

Als Nachweis zur Identität des Trägerstammes wurden folgende Qualitätskontrollen verwendet:

  1. Der Impfstamm S. typhi Ty21a(pDB1)wurde mit dem Ausgangsstamm S. typhi Ty21a und weiteren im Labor verwendeten Bakterienstämmen (Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Escherichiacoli) durch random primed PCR (Polymerase Chain Reaction) und anschließender Auftrennung über Polyacrylamid-Gelelektrophorese verglichen. Das Bandenmuster war identisch zwischen S. typhi Ty21a(pDB1)und S. typhi Ty21a und unterscheidet sich vom Bandenmuster von Escherichiacoli und Salmonella enteritidis bzw. typhimurium.
  2. Die Antibiotikaresistenz des Impfstammes gegenüber im Labor verwendeten Antibiotika wurde überprüft. Antibiotikaresistenzen, bei denen S. typhi Ty21a und S. typhi Ty21a(pDB1) halbmaximal wachsen unterschieden sich höchstens um den Faktor 1,5.
  3. Die Galaktosesensitivität von S. typhi Ty21a und S. typhi Ty21a(pDB1) wurde über Aufzucht auf Minimalmedium (M9 mit Zusätzen von Casein-Hydrollysat, Vit B1 und Tryptophan) nachgewiesen. Eine Zugabe von 0,1% Galaktose zum Medium verhinderte das Wachstum von S. typhi Ty21a und S. typhi Ty21a(pDB1).
  4. Das Plasmid pDB1 wurde über eine Silica-Säule aufgereinigt und die Identität dieses Plasmids über Restriktionskartierung und PCR mit Urease-spezifischen Primern nachgewiesen.
  5. Die Expression der Urease Einheiten A und B wurde über Gelelektrophorese nachgewiesen. Die Identität der Ureaseeinheit B wurde auf einem Western Blot mit Hilfe eines Urease-spezifischen Kaninchen-Serums nachgewiesen.
  6. Die Stabilität der Expression der Urease Untereinheiten A und B wurde mit SDS- Gelelektrophorese von vier aufeinander folgenden Übernachtkulturen mit jeweils 10000-facher Verdünnung gezeigt. Die Expression war über vier Passagen stabil.


[Seite 31↓]

II.2.  Methoden

II.2.1. Aufbau der klinischen Studie zur Untersuchung eines rekombinanten Impfstoffes gegen Helicobacter pylori am Menschen

Für die Untersuchung wurden 12 Probanden ausgewählt. Sechs der Probanden waren Frauen und sechs Männer. Die Probanden waren zum Zeitpunkt der Impfung „gesund“ im Sinne von nicht klinisch auffällig. Alle 12 Probanden wurden einer Voruntersuchung unterzogen, die die Anamnese und körperliche Untersuchung sowie die Bestimmung hämatologischer und klinisch-chemischer Blutparameter beinhaltete. Im einzelnen wurden folgende Werte untersucht:

Hämatologische Parameter:

1. Hämoglobin-Konzentration
2. Hämatokrit
3. Mean corpuscular volume (MCV)
4. Mean corpuscular hemoglobin concentration MCHC
5. Leukozyten
6. Thrombozyten

Gerinnungsparameter:

7. Thromboplastinzeit (Quick)
8. International norm ratio (INR)
9. Partielle Thromboplastinzeit (PTT)

Elektrolyte:

10. Natrium
11. Kalium

Leberwerte:

12. Gesamtbilirubin
13. Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT)
14. Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT)
15. Gamma-Glutamyl-Transferase (γ-GT)
16. Alkalische Phosphatse (AP)

Ausscheidungsparameter:

17. Harnsäure
18. Serumkreatinin

Pankreaswerte:

19. Lipase und Amylase

Entzündungsparameter:

20. C-reaktives-Protein (CRP)


[Seite 32↓]

Keiner der Proband hatte zuvor eine Infektion mit S. typhi oder Salmonellatyphimurium oder mit H. pylori. Nur zwei der Probanden, Proband Nr. 2 und 5, hatten eine Impfung mit Typhoral® (Salmonella enterica, Serovar typhi Ty21a) erhalten. Eine Infektion mit H. pylori wurde durch einen kommerziellen Elisa (Vita Diagnostika GmbH, Freiburg) ausgeschlossen. Der Ausschluß einer akuten Infektion wurde durch den [ 13C] Harnstoff Atem Test (IRIS, Wagner Analysentechnik, Bremen) erbracht. Die StudienteilnehmerInnen waren zum Zeitpunkt der Studie nicht schwanger.

Das Alter der Probanden lag zwischen 19 und 34 Jahren mit einem durchschnittlichen Alter von 25,5 Jahren.

II.2.1.1. Einschlußkriterien:

  1. Alter zwischen 18 bis 50 Jahren
  2. Schriftliches Einverständnis zur Teilnahme an der Studie

II.2.1.2. Ausschlußkriterien

Folgende Personen werden nicht in die Studie aufgenommen:

  1. Personen mit anamnestischen Hinweisen auf eine Überempfindlichkeit gegenüber einem der Inhaltsstoffe der Prüfsubstanz oder chemisch verwandten Substanzen.
  2. H. pylori Infektion in der Anamnese
  3. Antibiotikaallergie
  4. Schwangerschaft bzw. Verdacht auf Gravidität
  5. Erkrankung der Gallenblase in der Anamnese

II.2.1.3. Studienmedikation und Gruppeneinteilung

Nach einer zufälligen Verteilung (double blind) bekamen Probanden den Urease [Seite 33↓]Untereinheit A und B exprimierenden attenuierten Stamm S. typhi Ty21a(pDB1)(Impfstamm) oder den attenuierten Stamm S. typhi Ty 21a (Kontrollstamm) geimpft. Ty21a ist der herkömmliche Impfstoff gegen Typhus und diente in dieser Studie als Kontrollvariable. Erst nach Auswertung der Ergebnisse wurde die Verteilung Kontrolle versus Verum bekannt gegeben. Die Verteilung war wie folgt: Probanden 1, 6, 9 bekamen den Kontrollstamm S. typhi Ty 21a, Probanden 2-5, 7, 8 und 10-12 den Impfstamm (Verum) S. typhi Ty21a(pDB1).

Sowohl S. typhi Ty21a(pDB1) als auch S. typhi Ty21a wurden als lebende Organismen in Form einer Schluckimpfung verabreicht.

Jede Impfdosis sollte aus 1010 frisch geernteten lebenden Organismen bestehen, die in 30ml einer 1,3 % Bicarbonatlösung suspendiert wurden.

Die Verabreichung des Impfstoffes (Impf- oder Kontrollstamm) fand am 28.02.2000 (Tag 0), 01.03.2000 (Tag 2) und am 03.03.2000 (Tag 4), zwischen 9 und 12 Uhr statt. Die Probanden mußten für mindestens 90 Minuten keine feste oder flüssige Nahrung zu sich genommen haben. Vor der Verabreichung S. typhi Ty21a(pDB1) und S. typhi Ty21a wurden 120ml einer 1,3%igen Bicarbonat-Lösung verabreicht. Bicarbonat neutralisiert die Magensäure. Damit wurde gewährleistet, daß eine relativ höhere Zahl der Bakterien lebendig das Duodenum erreicht.

Verträglichkeitsstudie, Aufzucht und Verabreichung von S. typhi Ty21a(pDB1) und S. typhi Ty21a fand an der Universitätsklinik Freiburg, chirurgisch Abteilung, Prof. Dr. Dr. von Specht statt.

II.2.1.4. immunologische und mikrobiologische Untersuchungen

Die humorale Immunantwort gegen den Impfstamm S. typhi Ty21a(pDB1) und den Kontrollstamm S. typhi Ty21a wurde mittels B-Zell-Elispot und Elisa untersucht.

Die zelluläre Immunantwort gegen den Impfstamm S. typhi Ty21a(pDB1) und den Kontrollstamm S. typhi Ty21a wurde mittels T-Zell-Elispot, Proliferationsassay und IFN-γElisa untersucht.

Serum für den Elisa und periphere Blut mononukleäre Zellen (PBMZ) für den B- und T-Zell-Elispot sowie den Proliferationsassay und den und IFN-γElisa wurden aus dem heparinisiertem Vollblut der Probanden gewonnen.


[Seite 34↓]

Heparinisiertes Vollblut wurde an den Tagen 0, 7, 14 und 28 abgenommen. Hierbei wurde der erste Tag der Verabreichung als Tag 0 festgelegt.

Die experimentellen Untersuchungen der spezifischen B-Zellen (B-Zell-Elispot) wurden am Tag 0 und Tag 7 und 14 durchgeführt, die Untersuchung der spezifischen T-Zellen (T-Zell-Elispot) und der Proliferationsassay am Tag 0, 7 und 28.

Das Blut für Tag 0 wurde vor dem Verabreichen der Bakterienstämme abgenommen und gilt für alle drei genannten Untersuchungen als Nullwert der Studie.

B-Zell-Elispot, T-Zell-Elispot und Proliferationsassay fanden im Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie Tübingen, Prof. Dr. Meyer statt. Der Transport des heparinisierten Blutes von Freiburg nach Tübingen dauerte im Durchschnitt zwei Stunden. Während dieser Zeit wurde das Blut auf Umgebungstemperatur gehalten.

Von jedem Probanden wurden nach Verabreichung der letzten Impfung drei Stuhlproben gesammelt und mikrobiologisch auf Ausscheidung von Kontroll- oder Impfstamm untersucht. Die mikrobiologischen Untersuchungen des Stuhls wurden vom Labor der Universitätsklinik Freiburg durchgeführt.

Vorversuche und Etablierung der Methoden fanden am Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin, Abteilung molekulare Biologie, Prof. Dr. Meyer statt.

II.2.1.5. Beobachtung der Verträglichkeit des Impfstoffes

Die Probanden wurden nach jeder der drei Impfungen für vier Stunden klinisch überwacht.

Für einen Zeitraum von zwei Tagen nach der Impfung wurden auftretende lokale oder systemische Nebenwirkungen in einen Überwachungsbogen eingetragen und den Studienärzten (Dr. med. Mansouri, Dr. med. Metzger) mitgeteilt. Aufgelistet im Fragebogen waren folgende klinische Auffälligkeiten: Bauchschmerzen, Appetitlosigkeit, Übelkeit, Erbrechen, Durchfall, Kopfschmerzen, Gliederschmerzen, allergische Reaktionen, Hautauschlag, Juckreiz und Atemnot.

Die Körpertemperatur wurde jeweils für zwei Tage nach Verabreichung axillar gemessen, Auffälligkeiten (Temp>38°C) wurden dokumentiert und den Studienärzten mitgeteilt.


[Seite 35↓]

Anamnese und körperliche Untersuchung sowie die Bestimmung hämatologischer (Blutbild) und klinisch-chemischer (Kreatinin, S-GOT, S-GTP) Blutparameter wurden an Tag 0, 7, 14, 28 durchgeführt (vgl. Auflistung S. 31).

Zusätzlich wurden mikrobiologische Untersuchungen des Stuhls von drei Stühlen im Anschluß an die letzte Impfung und beim Auftreten von Diarrhöen durchgeführt.

Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Studie siehe Anhang Abb. 2

II.2.2. Anzucht des Impfstammes Salmonella typhi Ty21a(pDB1) und des Kontrollstammes Salmonella typhi Ty21a

Die Anzucht und Lagerung des Impfstammes S. typhi Ty21a(pDB1)und des Kontrollstammes S. typhi Ty21a fand im Max-Planck-Institut Berlin, Marienfelde statt. Nach der Inokulation der Bakterien auf jeweils 400ml Soja (Merck)-LB Medien wurden die Bakterien bis zu einer optische Dichte (OD) von 0,5 – 0,6 (Wellenlänge 600nm) bei 37°C und einer Frequenz 200 rounds per minute (rpm) im Schüttler herangezogen. Danach wurden die Bakterien geerntet, erneut in Soja-LB bis zu einer OD von 0,5 resuspendiert, mit 85% Gylcerol gemischt und tiefgefroren (minus 80°C) in 1ml Alliquots gelagert.

II.2.2.1. Vorversuche zur Bestimmung der Wachstumskurve

Um die Zeit zum Erreichen der angestrebten Impfdosis von 1x1010 „colony forming units“ (cfu) pro ProbandIn zu ermitteln, wurden unter standardisierten Bedingungen an mehreren Tagen Wachstumskurven erstellt. Hierzu wurden jeweils 800µl desImpfstammes S. typhi Ty21a(pDB1) und des Kontrollstammes S. typhi Ty21a auf 400ml Soja (Merck)-LB Medien mit 0.001 % Galactose verimpft und bei 200rpm und 37°C im Schüttler bebrütet. In regelmäßigen Abständen (eine Stunde) wurde die OD gemessen und die Bakteriendichte bestimmt. Die Bakteriendichte wurde ermittelt, indem zu jedem Zeitpunkt der OD-Messung eine Verdünnungsreihe (Verdünnung: 1:10 bis 1: 1000000; Verdünnungsfaktor 10) angelegt wurde und von dieser Verdünnungsreihe ausgehend [Seite 36↓]–über Ausstreichen der Suspension auf LB-Platten (LB Agar, Cat.-No.: 22700-025; Life Technologies) und Bebrütung im Brutschrank bei 37°C und einer Luftfeuchtigkeit von 5% für 24 Stunden - die cfu bestimmt wurden. Durch diesen Versuchsaufbau gelang es erstens die OD zu bestimmen, bei der die gewünschte Bakteriendichte zur Verabreichung an die Probanden vorhanden ist, und zweitens die Zeit zu ermitteln, die Impf- und Kontrollstamm benötigen um eben diese optische Dichte zu erreichen.

II.2.2.2. Anzucht und Vorbereitung am Impftag

Am Abend vor jedem Impftag wurden dann 800µl des tiefgefrorenen Impfstamms und des Kontrollstamms aufgetaut und in 400ml Soja-LB plus 0,001% Galaktose verimpft. Bei einer Temperatur von 37°C und einer Frequenz von 200rpm wurden die Bakterien nun im Schüttler bis zu einer OD von 1 (Wellenlänge 600nm) herangezogen, danach geerntet, in PBS gewaschen und in PBS bis zu einer angestrebten Dichte von 2x109 cfu/ml resuspendiert. Vor Verabreichung des Impf- bzw. des Kontrollstamms wurden 5ml dieser Suspensionen mit 25ml 1,3 % Bicarbonatlösung vermischt.

II.2.3. Gewinnung der mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut (PBMZ)

Venöses Blut wurde morgens aus der Vena mediana cubiti entnommen und in standardisierten heparinisierten SARSTEDT-Monovetten gesammelt. Das entnommene Blut wurde in einem Verhältnis von 1:1 mit RPMI (RPMI 1640 Medium/ with L-Glutamine, Cat.-No.: 21875-034, Gibco-BRL, Life-Technologies) verdünnt.

In mit 15ml “FICOLL-Separation-Solution” gefüllte 50 ml Röhrchen wurde dann langsam 30ml verdünntes Blut aufgeschichtet so daß ein Volumenverhältnis von 1:2 FICOLL zu heparinisiertem Blut entstand. Bei einer Zentrifugation von 600g, 20 Minuten bei 20°C wurden die PBMZ von Serum und Erythrozyten getrennt und danach mit einer Pipette entnommen. Die entnommenen Zellen wurden in 45ml RPMI resuspendiert und bei einer Zentrifugation von 300g, 12 Minuten bei 10°C erneut getrennt. Die Überstände wurden verworfen und die PBMZ in einem Röhrchen gepoolt und dann in 10 ml RPMI [Seite 37↓]erneut resuspendiert und bei einer Zentrifugation von 300g, 12 Minuten 4°C getrennt. Dies entspricht dem Vorgang des Waschens der mononukleären Zellen.

Nach Abschütten des Überstandes wurden die PBMZ dann in einem definierten Volumen aufgenommen und nach einer 1:20 Verdünnung in einer Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Zum Auftragen auf die 96-well-Platten wurden PBMZ für den B-Zell-Elispot und für den T-Zell-Elispot in RPMI resuspendiert. Für die Proliferationsmessung wurden die PBMZ in RPMI plus 10% AB-Serum (Human Serum AB, Cat.-No.: C15-021, PAA Laboratories GmbH), 1% Hybrimax, 1% Gentamycin, 1% Streptomycin und Interleukin 2 in einer Konzentration von 30 U/ml resuspendiert.

II.2.4. Proliferationsassay

Im Proliferationsassay wird der Grad der Aktivierung immunkompetenter Zellen über das Ausmaß der Proliferation bestimmt. Die proliferative Tätigkeit dieser Zellen wird durch Zugabe von radioaktiv markiertem Thymidin ermittelt. Der Thymidineinbau liefert ein quantitatives Maß für die DNA-Syntheserate, die der Zellteilungsrate direkt proportional ist.

In diesem Essay wurde sowohl die Immunantwort auf den Vektor (H-Antigen von S. typhi) als auch die Immunantwort auf rekombinante und native Urease untersucht.

Rekombinante und native Urease wurden benutzt, um einen möglichen Unterschied zwischen nativer und rekombinanter Urease in Bezug auf die Immunantwort zu eruieren.

Auf eine 96 well NUNC Platte (NUNC™: Nunc-Immuno™ Plate MaxiSorp™ Surface) wird zuerst eine Zellzahl von 250 000 PBMZ pro well in 100µl Medium aufgetragen. Das Medium besteht aus RPMI plus 10% AB-Serum, 1% Gentamycin, 1% Strepto-mycin, 1% Hybrimax sowie Interleukin 2 in einer Konzentration von 30 U/ml.

Die Zellen wurden dann durch Zugabe einer definierten Menge Antigen stimuliert. Als Stimulantien wurden hier verwendet:


[Seite 38↓]

  1. Salmonellen-H-Antigen: 104,105 und 106 Bakterien pro ml
  2. native Urease: 0,2/5/10 µg/ml
  3. rekombinante Urease: 0,2/5/10 µg/ml
  4. Tetanustoxin: 1/5/10 Lytic Factors
  5. Escherichia coli LPS: 60 pg/ml, 15 ng/ml und 250 ng/ml
  6. Protein GroEl: 0,5 µg/ml und 50 mg/ml
  7. PHA: 1,5 und 10 μg/ml
  8. Negativkontrolle: unstimulierte Zellen

LPS von Escherichiacoli war in geringer Konzentration (120 ng/ml) in der Lösung der rekombinanten Urease enthalten, das Protein GroEl in geringer Konzentration in der Lösung der nativen Urease. Beide Antigene wurden in gereinigter Form als Negativkontrolle verwendet, um eine spezifische Reaktion auf Urease zweifelsfrei nachzuweisen.

Die Reaktion gegen Tetanustoxoid wurde als zusätzlich Positivkontrolle und als Vergleichswert für eine Immunantwort gegen ein Fremdprotein untersucht.

Die Antigene wurden in 100 µl Medium doppelt konzentriert auf die Zellen gegeben, so daß am Ende pro well ein Volumen von 200 µl und eine Konzentration der Stimulantien, wie oben beschrieben, entstand.

Pro unterschiedlicher Konzentration der Stimulantien wurden drei wells belegt.

Als nächster Schritt wurden die Platten für bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Drei bzw. fünf Tage nach Auftragen der Zellen wurde 50µl pro well Überstand abgenommen und bei minus 70°C tiefgefroren. In den Überständen wurde später mittels der Elisa-Methode die Konzentration an Interferon gamma (IFN-γ) ermittelt. Nach Abnahme der Überstände an Tag 5, wurde 25µl pro well einer Verdünnung des radioaktiv markierten Thymidins ([3H] Thymidin, Amersham, U.K.) zugegeben. Die Verdünnung bestand aus 24,5ml Medium (s.o) plus 0.5ml radioaktiv markiertem Thymidin (entspricht 1µCi).

Die Platten wurden dann für weitere zwei Tage im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert und danach bei minus 20°C tiefgefroren.

Das während der Proliferation der Zellen inkubierte radioaktiv markierte [3H]Thymidin wurde mit counts per minute (cpm) durch einen Microbeta counter (Microplate scintillation counter, Packard topcount) gemessen. Es wurde darauf geachtet, immer sämtliche Proliferationsassays einer Person (d.h. Proliferationsassay von Tag der [Seite 39↓]Studie: 0, 7, 28) gleichzeitig auszuwerten, um unspezifische Effekte auf die Auswertung möglichst gering zu halten.

II.2.5. B-Zell-Elispot

Der B-Zell-Elispot untersucht das Auftreten spezifischer Antikörper sezernierender Zellen (B-Zellen) im peripheren Blut. Die B-Zellen wurden über die Sekretion der Antikörper detektiert. Dabei wurden sowohl nach B-Zellen gesucht, die spezifisch für den Vektor waren (LPS und O-Antigen von S. typhi) als auch nach B-Zellen, die spezifisch für rekombinante und native Urease waren. Rekombinante und native Urease wurde benutzt um einen möglichen Unterschied zwischen nativer und rekombinanter Urease in Bezug auf die Immunantwort zu eruieren.

Zuerst wurden die speziell für den Test benutzten Cellulose-ester-membrane-bottemed Platten (MultiScreen®, 96-Well-filtration-Plate) mit unterschiedlichen Antigenen, beschichtet. Dies entspricht dem sog. “coating”. Die Antigene wurden in einem Carbonatpuffer (NaHCO3 2,93g; Na2C03 1,5g ad 1l Aqua dest.; entspricht: 0,05M Carbonate pH 9,6) gelöst. Dieser Puffer wird im folgenden “Elispot coating buffer” genannt. Die Antigene wurden in folgender Konzentration aufgetragen:

  1. Salmonellen LPS: 5 µg/ml
  2. Salmonellen O-Antigen (intakte Bakterien: 108 Zellen pro ml in PBS)
  3. Rekombinante Urease: 20 µg/ml
  4. Native Urease ( aufgereinigt aus H. pylori Lysat; Stamm: p76/ 20 µg/ml)
  5. Anti-human-IgG als positiv Kontrolle: 4µg/ml (Sigma, Anti-human-polyvalent-immunoglobunies, developed in rabbit, Product No.: I-8010)
  6. Neg. Kontrolle: no coating

Die Antigene wurden über Nacht bei einer Temperatur von 4°C im Kühlschrank inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Platten mit einem Standardprogramm im Elisa-Waschgerät (TECAN) gewaschen. Ein Waschzyklus entspricht 9 Waschschritten mit je [Seite 40↓]300µl Volumen pro well und einer Einwirkzeit von drei Sekunden. Zum Waschen wurde PBS verwendet. Jede Platte wurde mit 2 Zyklen gewaschen, zwischen den Waschschritten wurden die Platten auf saugfähiges Papier gestellt und danach eine Stunde lang bei Raumtemperatur in 300 µl PBS pro well stehen gelassen.

Nach Entfernen des PBS, wurde dann zum “Blocken” der freien Bindungsplätze Bovine Serum Albumin (BSA) in einer Konzentration von 3% in PBS mit 200 µl pro well auf die Platte aufgetragen und bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Danach wurden die Platten, wie oben beschrieben, mit zwei weiteren Waschzyklen gewaschen und dann die PBMZ aufgetragen.

Die PBMZ wurden in einer Konzentration von 500 000, 250 000, 100 000 und 10 000 (Positivkontrolle) Zellen pro well auf die Platten gegeben und für vier Stunden bei einer Temperatur von 37°C inkubiert.

Nach vier Stunden wurden die Zellen verworfen und die Platten mit PBS, 0.05 % Tween 20 gewaschen. Es folgten zwei weitere Waschzyklen.

In einer Verdünnung von 1:100 000 wurde dann der Detektions-Antikörper (DIANOVA, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.; Biotin-SP-konjugated AffiniPure Rabbit anti-Human IgG,M,A) mit Spezifität gegen die drei Immunglobulin Isotypen Ig G, Ig A und Ig M in Konjugatpuffer aufgetragen.

Die Platten wurde eine Stunde bei Raumtemperatur mit dem Detektions-Antikörper inkubiert und nach erneutem zweimaligem Waschen mit PBS, 0.05 % Tween wurde die Streptavidin konjugierte alkalische Phosphatase zugegeben (DIANOVA, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.; Phosphatase - conjugated Streptavidin, Code Number: 016-030-084). Die alkalische Phosphatase wurde 1:10 000 verdünnt und ebenfalls eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Abschließend, nach einem weiteren Waschschritt, wurde als Substrat für die alkalische Phosphatase BCIP/NBT buffered Substrat Tabletten (Sigma, Product No. B5655) in 10 ml destilliertem Wasser hinzugegeben. Die Platte wurde dann bei 37°C im Brutschrank erneut inkubiert und danach mit destilliertem Wasser gereinigt.

Die Platten wurden mit Hilfe eines einen Elispot-Reader (Bioreader®, Bio-Sys GmbH) ausgewertet. Ein „Spot“ entspricht dabei einem B-Lymphozyten, der spezifische Antikörper gegen das jeweilige Antigen sezerniert.


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II.2.6.  T-Zell-Elispot

Der T-Zell-Elispot dient zur Untersuchung spezifischer T-Zellen. Die T-Zellen werden mit einem bestimmten Antigen inkubiert. Eine Reaktion der T-Zellen wird über Sekretion von IFN-γdetektiert.

Es wurde sowohl nach T-Zellen spezifisch für den Vektor (H-Antigen von S. typhi) als auch nach T-Zellen spezifisch für rekombinante und native Urease gesucht. Rekombinante und native Urease wurde benutzt, um einen möglichen Unterschied zwischen nativer und rekombinanter Urease in Bezug auf die Immunantwort zu eruieren.

Als erster Schritt wurden die Cellulose-ester-membrane-bottemed Platte (MultiScreen®, 96-Well-filtration-Plate) mit anti-human IFN-γ (R&D Systems, purified mouse monoklonal IgG(2a); Nr.: MAB 285) in einer Konzentration von 5 µg/ml, 100 µl pro well in “Elispot coating buffer”(s.o.) beschichtet und über Nacht im Kühlschrank bei 4°C inkubiert.

Am nächsten Morgen wurden die Platten mit dem oben beschrieben Verfahren gewaschen und für eine Stunde bei Raumtemperatur in PBS inkubiert. Nach erneutem Waschen (s.o.) wurde für zwei Stunden bei 37°C im Inkubator die Platte geblockt. Der Blocking-Puffer hat eine Konzentration von 1% BSA/PBS. Anschließend wurden nach erneutem Waschen (s.o) die zuvor durch Ficoll aufgereinigten Zellen aufgetragen. Es wurden Konzentrationen von 500 000, 250 000, 100 000, 50 000 und 10 000 Zellen pro well benutzt.

Die Zellen wurden in 100µl RPMI pro well aufgenommen.

Als nächstes wurden die Zellen in den wells mit verschiedenen Antigenen verschiedener Konzentration stimuliert:

Stimulantien:

  1. Salmonellen-H-Antigen: 106 /ml
  2. Native Urease: 10µg/ml
  3. Rekombinante Urease: 10µg/ml
  4. TT: 5 LF
  5. LPS von Escherichia coli: 15ng/ml
  6. GroEl: 0,5 µg/ml
  7. Pos. Kontrolle: ConA: 1µg/ml, PMA/Iono: 100ng/0,5ng
  8. Neg. Kontrolle: unstimulierte Zellen


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Die Antigene wurden für 24 Stunden bei einer Temperatur von 37°C im Brutschrank inkubiert.

Am nächsten Tag wurden die Zellen verworfen und die Platten wurden wie oben beschrieben zweimal, diesmal mit Tween-Zusatz, gewaschen. Danach wurde der zweite Antikörper oder „detection“-Antikörper (Biotinylated purified goat IgG, Nr.: BAF285) in einer Konzentration von 0.1 µg/ml, 100 µl pro well zugegeben. Die Platte und der detection-Antikörper wurde für zwei Stunden bei einer Temperatur von 37°C im Brutschrank inkubiert, danach erneut mit Tween-Zusatz gewaschen und die alkalische Phosphatase (DIANOVA, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.; Phosphatase-conjugated Streptavidin, Code Number: 016-030-084) mit einer Verdünnung 1:10 000 zugegeben. Die Inkubationszeit betrug hier eine Stunde und wurde bei einer Temperatur von 37°C im Brutschrank durchgeführt.

Abschließend, nachdem die Platten erneut mit PBS, 0.05% Tween 20 gewaschen waren, wurde als Substrat BCIP/NBT buffered Substrat Tabletten (Sigma, Product No. B5655) in 10 ml destilliertem Wasser verwendet. Die Platte wurde dann bei 37°C im Brutschrank erneut inkubiert und danach mit destilliertem Wasser gereinigt.

Die Platten wurden durch einen Elispot-Reader (Bioreader®, Bio-Sys GmbH) ausgewertet. Ein “Spot” entspricht dabei einem T-Lymphozyten, der durch das spezifische Antigen aktiviert wurde.

II.2.7. Enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa)

Elisa-Tests wurden zur Bestimmung der Antikörper gegen native und rekombinante Urease und gegen Salmonellen-O-Antigen und Salmonellen LPS durchgeführt. Zusätzlich wurde dieser Test dazu verwendet Interferon-Gamma (IFN-γ) in den Überständen des Proliferationsassay zu quantifizieren.

Es wurde bei der Auswertung darauf geachtet, möglichst alle Personen zu allen Tagen der Studie (Tag 0, 7, 14, 28) gleichzeitig zu testen, um die Möglichkeit der Beeinträchtigung der Ergebnisse durch unspezifischer Effekte (z.B. unterschiedliche Medien, unterschiedliche Temperatur) zu minimieren.

Im folgenden soll zuerst der Elisa zur Bestimmung der Antikörper im Serum der Probanden gegen native und rekombinante Urease und gegen Salmonellen-O-Antigen [Seite 43↓]und Salmonellen LPS besprochen werden. Bestimmt wurden hierbei der Antikörpertyp IgG.

II.2.7.1. Messung der spezifischen Antikörper im Serum

Verwendet wurden 96-well Platten der Firma NUNC™: Nunc-Immuno™ Plate MaxiSorp™ Surface.

Die 96-well Platten wurden mit 100 µl/well gecoated und über Nacht bei 4°C im Kühlschrank belassen. Als Coating-Antigen wurden 5 µg/ml native, bzw. rekombinante Urease oder 108 Bakterien/ml Salmonellen-O-Antigen, bzw. 5 µg/ml Salmonellen-LPS benutzt. Die Negativkontrolle enthielt 1 % BSA/PBS als Coating-Antigen. Die Antigene wurden in „Elispot coating-buffer“ (s.o) gelöst.

Am nächsten Morgen wurde die Platten mittels Elisa-Washer (s.o.) mit dem Programm Nr. 3 gewaschen. Dieses Programm verwendet pro Waschschritt 400 µl PBS/0.05 % Tween Waschlösung pro well bei einer Einwirkzeit von einer Sekunde. Jede Platte wurde hierbei drei Mal gewaschen.

Danach wurden die Platten mit 1 % BSA/PBS für zwei Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler geblockt.

Nach einem weiteren Waschschritt mit Programm Nr. 3 wurde danach 50 µl/well des Serum in einer Verdünnung von 1:200 für Salmonellen-O-Antigen und Salmonellen LPS, 1:200 und 1:800 für native und rekombinante Urease aufgetragen und für weitere zwei Stunden auf dem Schüttler bei Raumtemperatur belassen. Die Plattenbelegung war dabei so, daß pro Proband (1-12) und Tag der Studie (0, 7, 14, 21, 28) vier wells einer Verdünnung bei Salmonellen-O-Antigen und Salmonellen LPS, bzw. zwei wells einer Verdünnung bei native und rekombinante Urease zur Verfügung standen. Als Positivkontrolle wurden jeweils bereits getestete Seren mit hohen Antikörper-Titern benutzt. Bei der Negativkontrolle wurde als Coating-Lösung anstatt des Antigens 1 % BSA/PBS verwendet.

Die Platten wurden dann erneut mit Programm Nr. 3 gewaschen.

Als nächster Schritt wurde 50 µl/well des „Detection“-Antikörper (Peroxidase-conjugated AffiniPure Rabbit Anti-Human IgG (H+L), Code Number: 309-035-082, Jackson [Seite 44↓]ImmunoResearch Laboratories, Inc.) auf die Platten gegeben und diese erneut bei Raumtemperatur auf einem Schüttler für eine Stunde belassen.

Die Platten wurden dann wieder mit Programm Nr. 3 gewaschen und danach 100 µl/well Substratlösung (50 µl TMB Peroxidase Substrate, Product Code 50-76-01; 50 µl/well Peroxidase Solution B (H2O2), Product Number: 50-65-00; Kirkegaard Pery Laboratories) hinzu pipettiert. Die Substratlösung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Schüttler belassen und dann mit 50 µl/well Schwefelsäure (1M) gestoppt. Die Daten wurden mittels Elisa-Reader (SpectraMax 250, Molecular Devices) gemessen und mit der Software SoftMax Pro ausgewertet.

II.2.7.2. Messung der Zytokine in den Überständen

Wie bereits oben beschrieben, wurden an Tag drei und fünf nach Auftragen der Zellen jeweils 50 µl Überstände von den Platten des Proliferationsassay abgenommen und bei –20°C tiefgefroren.

Die Messung des durch spezifische Stimulation (s.o.) von den PBMZ sezernierten IFN-γ wurde mittels Elisa vorgenommen. Benutzt wurde hierbei ein Standard Elisa Kit (Human-IFN-γ-CytoSetsTM, BioSource).

Für den Elisa wurden 96-well Platten der Firma NUNC™: Nunc-Immuno™ Plate MaxiSorp™ Surface verwendet.

Im ersten Schritt wurden diese Platten mit dem sog. „capture“-Antikörper (Human-IFN-γ- CytoSetsTM, Coating Antibody, Product-No.: 58.123.08) gecoated. Nach der Verdünnung auf 2 µg/ml mit „Standard Diluent“ (PBS plus 0,5% BSA u. 0,1% Tween) wurde der capture antibody in einem Volumen von 50 µl pro well hinzugegeben.

Die Platten wurden dann über Nacht bei 4°C im Kühlschrank belassen.

Am nächsten Tag wurden die Platten mit einem Elisa-Washer gewaschen und danach für zwei Stunden bei Raumtemperatur geblockt. Blocking Puffer und Waschprogramm entsprechen denen des Urease- bzw. Salmonellen-Antigen-Elisa.

Nach erneutem Waschen wurde ein Volumen von 25 µl RPMI pro well aufgetragen und mit 25 µl der aufgetauten Überstände pro well vermischt, so daß eine Verdünnung der Überstände mit dem Verdünnungsfaktor zwei entstand und ein Volumen von 50 µl pro well resultierte.


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Die Belegung der Elisa-Platten entsprach dabei der Belegung der Proliferationsassays

Die verdünnten Überstände wurden bei Raumtemperatur für zwei Stunden auf den Platten belassen.

Nach einem erneuten Waschschritt wurde der zweite oder „detection“-Antikörper (Human-IFN-γ-CytoSetsTM, Detection Antibody, Product-No.: 58.123.02) in einer Verdünnung von 1:2000 und einer Konzentration von 0,4 µl mit einem Volumen von 50 µl pro well aufgetragen. Die Platten wurden dann für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur auf dem Schüttler belassen und danach die Substratlösung (50 µl/well TMB Peroxidase Substrate, Product Code 50-76-01; 50 µl/well Peroxidase Solution B (H2O2), Product Number: 50-65-00; Kirkegaard Pery Laboratories) in einem Volumen von 100 µl pro well hinzu pipettiert.

Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Stop-Lösung (1M Schwefelsäure) hinzugegeben und die Platten dann bei einer Wellenlänge von 450 nm mittels ELISA-Reader (SpectraMax 250, Molecular Devices) gemessen und mit der Software SoftMax Pro ausgewertet.

Auf jeder Elisa-Platte wurden 8 Doppelwells verwendet, um eine Standardkurve für IFN-γ zu ermitteln. Dazu wurde der von Biosource gelieferte Standard mit einer Konzentration von 2 ng/ml IFN-γ jeweils um den Faktor zwei verdünnt, daß am Ende eine Konzentration von 0,05625 ng/ml IFN-γ resultierte

Nach Vergleich mit den Standardkurven wurden für IFN-γ Konzentrationen von mehr als 100 pg/ml als eine positive Antwort gewertet.

Signifikante Unterschiede in der Höhe der IFN-γ Produktion vor und nach Impfung wurden mittels Wilcoxon Rangsummentest ermittelt.


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07.01.2005