IV. Diskussion

Der Gesetzgeber fordert für die Zulassung eines neuen Wirkstoffes neben einer analytischen Prüfung und einer pharmakologisch-toxischen Prüfung die klinische Prüfung (Arzneimittelgesetz in der Fassung vom 1. Jan. 2002; §22 Abschnitt 2).

Aus der klinischen Prüfung muß dabei hervorgehen: „ob das Arzneimittel bei dem angegebenen Anwendungsgebiet angemessen wirksam ist, ob es verträglich ist, ob die vorgesehene Dosierung zweckmäßig ist und welche Gegenanzeigen und Nebenwirkungen bestehen (Arzneimittelgesetz in der Fassung vom 1. Jan. 2002; §24 Abschnitt 3). Dazu werden Humanstudien in unterschiedlichem Umfang und unterschiedlicher Zielsetzung durchgeführt (Phase I bis Phase IV Studie).

Die hier vorgestellte Untersuchung gehört dabei zu den Phase I Studien. Eine Phase I Studie stellt eine Erstanwendung eines neuen Wirkstoffes an gesunden Probanden dar. Phase I Studien haben die Zielsetzung, eventuell auftretende schwere Nebenwirkungen aufzudecken, sowie erste Hinweise auf eine wirksame Dosis und die Wirkungsweise des neuen Präparats zu sammeln.

IV.1. Klinische Verträglichkeit und Nebenwirkungsprofil

Der in dieser Untersuchung eingesetzte Impfstoff, bestehend aus dem Impfstamm S. typhi Ty21a(pDB1) hat sich in dieser Studie als gut verträglich und damit als relativ nebenwirkungsarm erwiesen.

Diese Aussage basiert zum einen auf der Tatsache, daß zu keinem Zeitpunkt der Untersuchung bei den Studienteilnehmern Beschwerden auftraten, die zur therapeutischen Intervention oder sogar zum Abbruch der Studie gezwungen hätten und zum anderen auf dem Vergleich des Nebenwirkungsprofils von S. typhi Ty21a(pDB1) mit den Angeben des Herstellers von Typhoral® L und der Metaanalyse von Engels et al.

Der Hersteller des Impfstoffes Typhoral® L (Chiron Behring), aus dem unser Impfstamm S. typhi Ty21a(pDB1) entwickelt wurde, gibt als Nebenwirkungen Beschwerden des Magen-Darm-Traktes, wie Übelkeit, Bauschmerzen, Bauchkrämpfe, [Seite 62↓]Erbrechen und Durchfall an, sowie gelegentliche Allgemeinreaktionen, wie Temperaturerhöhung, Schüttelfrost, Kopfschmerzen, Gliederschmerzen und Unwohlsein.

Aussagen über die Quantität der Nebenwirkungen werden in einer Metaanalyse verschiedener Feldstudien gemacht. In dieser Metaanalyse zur Effektivität und Toxizität von S. typhi Ty21a als Impfstoff gegen Typhus bei Beobachtung von insgesamt 11204 Personen ergab sich als Hauptnebenwirkung Diarrhö (5,1 % der Personen) gefolgt von Erbrechen (2,1 % der Personen). Bei 2 % der Probanden konnte Fieber als Nebenwirkung der Impfung festgestellt werden. Kopfschmerzen und unklare abdominelle Beschwerden wurden in dieser Studie als Nebenwirkungen nicht aufgeführt (Engels, Eric A. et al. 1998).

Unklare abdominelle Beschwerden und Kopfschmerzen waren die Hauptnebenwirkungen, die im Zeitraum unserer Untersuchung registriert wurden. Dabei wurden unklare abdominelle Beschwerden definiert als subjektive Empfindungen wie z.B. Tenesmen oder abdominelle Schmerzen, die nicht zu Veränderung der Stuhlgewohnheiten (in Form von z.B. Diarrhö, Obstipation), zum Auftreten von Fieber (Körpertemperatur größer 38°C) oder Veränderung der Blutparameter (s. Kapitel 2.1.; S. 31) führten. Eine weitere differentialdiagnostische Abklärung der Kopfschmerzen fand nicht statt, da die Kopfschmerzen bei keinem der Probanden therapeutische Konsequenzen hatten oder länger als einen Tag persistierten.

Über unklare abdominelle Beschwerden klagten zwei von 12 Probanden (=16,7%), über Kopfschmerzen drei der Probanden (= 25%). Einer von 12 Probanden hatte nach der ersten Verimpfung (Tag 0 der Studie) Diarrhö (= 8,3%). Allerdings trat diese Diarrhö bei Proband Nr. 9 auf, der zu der Kontrollgruppe der Studie gehörte, denen nur der Kontrollstamm S. typhi Ty21a ohne rekombinante Urease verabreicht wurde. Keines der Symptome persistierte länger als einen Tag und keiner der Probanden benötigte eine Therapie.

Im Vergleich der Ergebnisse unserer Studie mit der Literatur, lassen sich also zwei Aussagen treffen. Erstens hat die genetische Veränderung von S. typhi Ty21a –also die Einschleusung eines Plasmids, das Urease von H. pylori exprimiert - die Art der Nebenwirkungen nicht verändert. Sämtliche von uns registrierten Nebenwirkungen -[Seite 63↓]unklare abdominelle Beschwerden, Kopfschmerzen und Diarrhö werden vom Hersteller von Typhoral ebenfalls genannt.

Zweitens ergab unsere Untersuchung keinen Hinweis auf eine deutliche Veränderung der Quantität der Nebenwirkungen. Definitive Aussagen zur Quantität lassen sich allerdings auf Grund der geringen Anzahl an Probanden in einer Phase I Studie nur eingeschränkt treffen.

Im Hinblick auf das Nebenwirkungsprofil erwies sich der Impfstamm S. typhi Ty21a(pDB1) somit als gut verträglich. Für eine Anwendung an einer größeren Zahl von Probanden –bzw. in einer Phase 2 Studie- ergeben sich demnach keine Kontraindikationen.

Eine weitere Fragestellung dieser Untersuchung war, ob es durch den Kontakt zwischen Impfstoff S. typhi Ty21a(pDB1)und Organismus des Wirtes zu Veränderungen des Impfstoffes und der Plasmidstabilität kommen kann.

Hierzu wurden an den drei Tagen, die auf die letzte Impfung folgten, Stuhlproben gesammelt. Eine Anzüchtung des Impfstammes S. typhi Ty21a(pDB1)oder des Kontrollstammes S. typhi Ty21a aus dem Stuhl gelang dabei bei keinem der Probanden.

Eine Aussage zur Stabilität des Plasmids oder zu möglichen Veränderungen innerhalb der Bakterienstruktur, bzw. der Pathogenität des Bakteriums, die durch die Interaktion mit dem Wirtsorganismus induziert wurde, kann aus diesem Grund nicht gemacht werden.

Die verabreichte Impfdosis könnte eine mögliche Ursache dafür sein, daß weder Impfstamm noch Kontrollstamm in den Stuhlproben der Probanden angezüchtet werden konnte. 1-5 x 109 Bakterien des Stammes Ty21a sind notwendig, um eine intestinale Infektion und damit eine Immunantwort des Wirtes auf den Impfstoff zu erzeugen (Herrington, D. A. 1990), aber erst ab einer Impfdosis von 1x1010 Bakterien wird von einem Nachweis im Stuhl ausgegangen (Levine, M. M. 1990).

Da in unserer Studie an den drei Impftagen der Studie 6x109 (Tag 0), 7x109 (Tag 2) und 9x109 cfu (Tag 4) verabreicht wurden, lag die Impfdosis zwar immer über der Dosis, die [Seite 64↓]eine intestinale Infektion verursacht, aber auch immer unter einer Dosis, die einen Nachweis im Stuhl ermöglicht.

Anderen Studien mit rekombinanten S. typhi Impfstoffen gelang allerdings ein Nachweis im Stuhl auch schon bei einer verabreichten Impfdosis von 1x109 (Tramont, E. C. et al. 1984), so daß nicht mit Sicherheit davon ausgegangen werden kann, daß der fehlende Nachweis des Impfstammes S. typhi Ty21a(pDB1)oder des Kontrollstammes S. typhi Ty21a im Stuhl der Probanden allein mit der verabreichten Dosis zusammenhängt.

Neben der Dosis spielt für den Nachweis im Stuhl noch die Resistenz des Erregers gegenüber den unspezifischen Abwehrmechanismen des menschlichen Körpers –wie z.B. saures Milieu im Magen, Peristaltik des Magen-Darmtraktes usw.- eine Rolle. Als mögliche Ursache des fehlenden Nachweises von Impf- und Kontrollstamm im Stuhl könnte auch eine Schwächung der Erreger durch genetische Veränderung (Einschleusung des Plasmids), Lagerung und Transport in Betracht kommen.

Für Mängel bei Lagerung und Transport ergaben sich keine Hinweise. Impf- und Kontrollstamm wurden simultan zur Impfung ausgestrichen und zeigten keine morphologischen Auffälligkeiten. Eine Schwächung durch eine genetische Veränderung hätte nur den Impfstamm, nicht aber den Kontrollstamm betroffen.

Die Frage nach der Ursache des fehlenden Nachweises von Kontroll- und Impfstamm kann also retrospektiv letztlich nicht geklärt werden. Um die Frage nach der Veränderung des Impfstammes im Kontakt mit den menschlichen Organismus zu beantworten, sollten zukünftige Studien, aufbauend auf den Ergebnissen dieser Untersuchung, eine schrittweise Erhöhung der Impfdosis erproben.

IV.2. Immunogenität des Impfstammes Salmonella typhi Ty21a(pDB1)

Das zentrale Thema dieser Untersuchung war die Frage nach der Wirksamkeit des Impfstoffes. Ein Impfstoff ist letztendlich dann wirksam, wenn die Immunantwort des Wirtes so modifiziert wird, daß eine Protektion und/oder Elimination des Erregers möglich ist. Protektion bedeutet, daß ein Schutz gegenüber einer zukünftigen Infektion induziert wird. Elimination bedeutet, daß eine bereits bestehende Infektion geheilt wird.


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Eine Phase 1 Studie an gesunden Probanden kann die Frage nach eventueller Protektion oder Elimination eines neuen Impfstoffes nicht definitiv beantworten. Eine Stimulation des Immunsystems des Wirtes und damit das Potential des neuen Impfstoffes läßt sich hingegen an Hand immunologischer Untersuchungen gut erfassen.

Insgesamt gibt es in der Literatur drei Modelle eines Impfstoffes gegen H. pylori.

Das erste Modell basiert auf dem Prinzip der Verwendung eines aufgereinigten synthetischen Antigens als Impfstoff. Kreiss et al. verabreichten als Impfstoff rekombinante Urease an Erwachsene mit asymptomatischer H. pylori Infektion (Kreiss, C. et al. 1996). Eine Wirksamkeit dieses Impfstoffes gegenüber der H. pylori Infektion konnte dabei nicht festgestellt werden.

Das zweite Modell basiert ebenfalls auf der Verwendung eines aufgereinigten synthetischen Antigens als Impfstoff, allerdings in Kombination mit einem Adjuvans zur Verstärkung der Immunantwort. Michetti et al. verwendeten in einer Plazebo kontrollierten Studie aufgereinigte Urease zusammen mit hitzelabilem Enterotoxin (LT) von Escherichia coli. Verabreicht wurde dieser Impfstoff an insgesamt 26 Probanden. Alle Probanden waren zum Zeitpunkt der Studie H. pylori positiv aber ohne Anzeichen für Dyspepsie. Von den 15 Probanden, denen Urease von H. pylori plus LT von Escherichia coliverabreicht wurden (Verum-Gruppe), bekamen fünf Probanden 180mg Urease plus LT, vier Probanden 60mg Urease plus LT und sechs Probanden 20mg Urease plus LT. LT von Escherichia coliwurde in jeder Gruppe in einer Menge von 5µg verabreicht. Bei allen Probanden der Verum-Gruppe konnte eine dosisabhängige Zunahme der anti-Urease Serum IgA (Elisa-Test) und der IgA-produzierenden B-Zellen (B-Zell-Elispot) festgestellt werden. Eine Eradikation der H. pylori Infektion konnte bei keinem der Probanden festgestellt werden und bei 62,5% der Probanden wurde als Nebenwirkung Diarrhö beobachtet (Michetti, P et al. 1999).

Das dritte Modell stützt sich auf die Verwendung eines Vektors, der als carrier für ein Fremdantigen fungiert. Zwei Gruppen entwickelten zeitgleich zu unserer Gruppe einen Impfstoff der als Vektor Salmonella und als Antigen Urease benutzt.

DiPetrillo et al. benutzten als Vektor den Salmonellenstamm Ty800, den sie in einer Einmal-Dosis von 1x1010 bis 4x1010 cfu an insgesamt acht gesunde Probanden verabreichten. Bei keinem der Probanden gelang der Nachweis einer Immunantwort auf das Fremdantigen Urease in Elispot oder Elisa Tests (DiPetrillo, M. D. et al. 2000).


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Angelakopoulos et al. benutzten als Vektor den Salmonellenstamm S. typhimurium, der sechs gesunden Probanden in einer Dosis von 5x107 bis 8x107 verabreicht wurde. Der Impfstoff wurde ebenfalls nur einmalig verabreicht. Hier gelang bei drei Probanden der Nachweis einer Immunreaktion auf das Fremdantigen Urease. Allerdings wurde hier ein Testsystem verwendet, bei dem die PBMZ für 48 Stunden kultiviert wurden. Danach wurden über Elisa die spezifischen AK in den Überständen bestimmt. Nur bei einem der drei Probanden konnte im Elispot und im IgG Elisa (Serum) ein signifikanter Anstieg der spots, bzw. der OD nachgewiesen werden. Bei zwei Probanden, darunter der Proband mit dem positiven Nachweis einer Immunreaktion auf Urease, trat im Anschluß auf die Impfung hohes Fieber auf (Angelakopoulos, H. et al. 2000).

In unserer Studie gelang der Nachweis einer Immunantwort gegen den Vektor S. typhi bei insgesamt 10 von 12 Probanden. Eine signifikante Reaktion auf das Fremdantigen, native und/oder rekombinante Urease, gelang bei insgesamt 6 von 9 Probanden. Zwei der Probanden (Proband-Nr. 2 und 5) hatten eine verhältnismäßig starke Immunreaktion auf native und/oder rekombinante Urease, bei den vier anderen Probanden (Proband-Nr.: 4, 7, 10, 11) war die detektierte Immunreaktion nur knapp über dem von uns festgelegten Schwellenwert.

Eine zelluläre Immunantwort gegen das eingeschleuste Fremdantigen Urease von H. pylori konnte erstmals mit dieser Untersuchung nachgewiesen werden. Dabei ist die zelluläre Immunreaktion für die Elimination und Protektion gegenüber einer Infektion mit H. pylori von zentraler Bedeutung (Ermak, T. H. et al. 1998; Blanchard, T. G. et al. 1999).

Der Nachweis einer humoralen Immunantwort gegen das Fremdantigen Urease von H. pylori gelang nicht.

Im Vergleich zu den oben genannten Untersuchungen, ist die Entwicklung eines Impfstoffes als Kombination aus S. typhi Ty21a als Vektor und Urease von H. pylori als Fremdantigen im Hinblick auf Nebenwirkung und Wirksamkeit damit als Erfolg zu werten.


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IV.3.  Diskussion der einzelnen immunologischen Testergebnisse

Es wurden jeweils die zelluläre und die humorale Immunantwort auf den Vektor und das Fremdantigen untersucht. Dabei ist der Nachweis einer Immunreaktion gegen den Vektor Grundvoraussetzung für eine Beurteilung der Immunreaktion gegen das Fremdantigen Urease von H. pylori.

IV.3.1. Humorale Immunantwort gegen den Vektor Salmonella typhi Ty21a

Es wurden zwei Methoden für die Untersuchung der humoralen Immunantwort verwendet. Zum einen der direkte Nachweis spezifischer Plasmazellen im peripheren Blut mittels B-Zell-Elispot, zum anderen die Untersuchung der spezifischen Antikörper im Serum mittels Elisa.

Der B-Zell-Elispot erfaßt Plasmazellen, die nach dem ersten Antigenkontakt, also nach der Ausdifferenzierung von der naiven B-Zelle bis zur antikörpersezernierenden Plasmazelle, bzw. B-Gedächtniszelle, vom lokalen Lymphknoten über den ductus thoracicus und die Blutstrombahn auf dem Weg zurück zum Ort des Infektionsgeschehen sind (sog. Homing).

Im B-Zell-Elispot konnte eine Immunantwort auf Salmonellen-O-Antigen bei neun Probanden (Proband-Nr.: 2-4, 6-8, 10-12) und auf das Salmonellen-LPS-Antigen bei 10 (Proband-Nr.: 1-4, 6-8, 10-12) von 12 Probanden nachgewiesen werden.

Dies entspricht einer Rate von 83% für Salmonellen LPS und 75% für das Salmonellen-O-Antigen.

36 spots/Mio.PBMZ wurden im arithmetischen Mittel an Tag 7 der Studie bei Stimulation mit dem O-Antigen von S. typhi detektiert (Streubreite: 4-387 spots/Mio.PBMZ) und 84 spots/Mio. PBMZ bei Stimulation mit dem Salmonellen-LPS-Antigen(Streubreite: 8-352 spots/Mio. PBMZ).

Die Anzahl der spots/Mio. PBMZ in dieser Untersuchung ist in Überseinstimmung mit den Angaben in der Literatur. Allerdings variieren die Zahlen in der Literatur stark, was u.a. verursacht wird durch die unterschiedlichen Dosierungen des Impfstoffes, den [Seite 68↓]Unterschieden bei den Messungen (z.B. ASZ, die IgA produzieren, oder alle ASZ), oder den Unterschieden in der Methode (Inkubationszeit usw.).

Ein Überblick zum Elispot gibt eine Metaanalyse, in der eine Variation der gemessenen spots von „weniger als 10“ bis mehreren tausend spots beschrieben wird (Arvilommi, H. 1996).

In zwei vergleichbaren humanen Impfstudien wurden Elispots zum Einsatz gebracht. In beiden Untersuchungen wurde ein Impfmodus (Verabreichung des Impfstoffes als Suspension und an drei Tagen) verwendet, der mit unserem Impfmodus identisch ist.

In der ersten Studie wurde der Impfstamm S. typhi Ty21a an 10 gesunde Probanden verabreicht. Geimpft wurde an drei Tagen mit einem Abstand von 48 Stunden zwischen jeder Impfung. Ein signifikanter Anstieg der auf das O-Antigen von S. typhi spezifischen ASZ konnte bei 8 von 10 Probanden nachgewiesen werden. An Tag 7 waren im Mittel 6 spots/Mio.PBMZ detektierbar bei einer Streubreite von 0,25 bis 143 spots/Mio.PBMZ (Kantele, A. et al. 1986).

In der zweiten Studie, ebenfalls von Kantele et al., wurde derselbe Impfstamm an insgesamt 126 gesunde Erwachsene in verschiedenen Darreichungsformen (Suspension, Gelatinkapsel, enteric coated capsule) verabreicht. In der Probandengruppe (20 Personen), die den Impfstoff an drei Tagen mit einem Abstand von 48 Stunden bekamen, wurden im Mittel auf das O-Antigen von S. typhi 178 spots/Mio.PBMZ an Tag 7 festgestellt. Die Streubreite der spots/Mio.PBMZ war hoch. Alle 20 Probanden hatten an Tag 7 der Studie einen signifikanten Anstieg der spezifischen ASZ (Kantele, A. 1990).

Beide Studien zeigen, daß -trotz gleichem Untersucher und gleichem Impfmodus- die Anzahl der detektierten spots sehr variiert und damit eine Aussage über die Wirksamkeit anhand der Anzahl der spots nicht möglich ist. Durch die beiden Studien kann allerdings belegt werden, daß es in unserer Studie durch Transport, Lagerung, Verabreichung und Einbau des rekombinanten Antigens nicht zu einer wesentlichen Beeinträchtigung des Impf- oder Kontrollstammes gekommen ist.


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Der Vergleich der Ergebnisse der Probanden, die den Impfstamm bekamen (Verum-Gruppe) mit denen der Kontrollgruppe zeigte, daß die Integration der Urease in das Genom von S. typhi Ty21a die Immunogenität des Impfstoffes nicht beeinflußt hat. So gelang in der Verum-Gruppe der Nachweis einer humoralen Immunantwort gegen Vektorantigene bei 8 von 9 Probanden.

Eine deutlich verminderte Anzahl an Spots im B-Zell-Elispot – als Zeichen einer verminderten Immunität des Impfstamms- bei Vergleich von Verum-Gruppe zur Kontroll-Gruppe konnte ebenfalls nicht festgestellt werden.

Die große Streubreite in der Anzahl der spots/Mio. PBMZ im B-Zell-Elispot an Tag 7 der Studie - zwischen 17 und 387 spots/Mio. PBMZ für das Salmonellen-O-Antigen und 15 bis 352 spots/Mio. PBMZ für Salmonellen-LPS- spiegelt die Unterschiedlichkeit der einzelnen Probanden wieder. So ist die Immunantwort gemessen an den ASZ bei denjenigen Probanden mit relativ niedriger Anzahl an spots/Mio. PBMZ für das Salmonellen-O-Antigen auch meist niedrig für das Salmonellen-LPS. Zum Beispiel hat Proband-Nr. 7 sowohl für das Salmonellen-O-Antigen als auch für Salmonellen-LPS eine relativ geringe Anzahl an spots/Mio. PBMZ (17, bzw. 16 spots/Mio. PBMZ) während die Immunantwort für beide Antigene bei Proband 3 relativ hoch ist (387, bzw. 288 spots/Mio. PBMZ). Dies zeigt, daß Proband-Nr. 7, bezogen auf die Salmonellen-Antigene, relativ schwächer reagiert als Proband Nr. 3.

Proband-Nr. 1 reagierte im B-Zell-Elispot auf LPS nicht aber auf das O-Antigen von S. typhi. Die wahrscheinlichste Erklärung dafür ist, daß Proband-Nr. 1 auf ein anderes Epitop als das O-Antigen innerhalb des LPS-Moleküls reagiert hat.

Das LPS-Molekül setzt sich zusammen aus drei Anteilen: dem Lipoid A (Fettsäuren, Diglucosamin, Phosphat), dem Kern-Polysaccharid oder „core“ (v.a. Hepatosen) und der O-spezifischen Polysaccharidkette (repetierende Einheiten aus 3-8 Zuckern) oder dem sog. O-Antigen (Kayser, F. H. et al. 1998).

Eine Immunreaktion gegen das LPS-Molekül muß also nicht gegen das O-Antigen gerichtet sein.


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Der zweite Test zur Beurteilung der humoralen Immunreaktion auf den Vektor ist der enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa).

Im Elisa gelang der Nachweis einer Immunreaktion auf die Antigene des Vektors bei zwei Probanden (Proband-Nr. 3 und 11). Nachgewiesen wurde eine Erhöhung der Antikörper der Klasse IgG im Serum der Probanden. Als Antigen des Vektors wurden Salmonellen-LPS und Salmonellen-O-Antigen getestet.

Proband-Nr. 5, der vor der Studie bereits gegen Typhus mit Typhoral® geimpft wurde, hatte an Tag 0 der Studie im Elisa-Test Werte oberhalb des von uns definierten Schwellenwertes.

Proband-Nr. 2, der die Typhoral® -Schluckimpfung ebenfalls erhalten hatte, zeigte keine Immunreaktion im Elisa. Dies ist im Einklang der Literatur, in der beschrieben wird, daß bei einem Drittel der Personen, die eine Typhoral® -Schluckimpfung erhalten haben, eine spezifische Immunantwort nicht nachgewiesen werden kann (Levine, M. M. et al. 1987).

Die bereits vorgestellten Studien von Kantele et al. sowie eine Studie, in der Salmonella ebenfalls als Vektor für ein Fremdantigen benutzte wurde, bieten sich zum Vergleich der Elisa-Ergebnisse mit der Literatur an.

So ermittelten Kantele et al. neben den Untersuchungen der spezifischen ASZ in beiden Studien die Anzahl der Probanden bei denen eine Serokonversion festgestellt werden konnte. In der ersten Studie hatten bei Verabreichung von S. typhi Ty21a an zehn gesunde Probanden zwar acht Probanden einen signifikanten Anstieg der spezifischen ASZ, jedoch konnte bei keinem der Probanden spezifische Antikörper im Serum gefunden werden (Kantele, A. et al. 1986).

In einer weiteren Studie an 126 gesunden Probanden konnten A. Kantele bei 20 von 20 Probanden einen Anstieg spezifischer ASZ gegen Antigene von S. typhi nachweisen, allerdings nur bei 16 von 20 Probanden eine Serokonversion spezifischer IgG. Auffällig in dieser Studie war, daß nur bei Probanden mit hoher Anzahl an gemessenen spezifischen ASZ ein Nachweis spezifischer Antikörper im Serum gelang (Kantele, A. 1990).

Mit einem Typhoid-Cholera-Hybrid-Impfstoff, der an 14 Personen in einer Dosis von 1x1010 lebensfähige Bakterien an drei aufeinander folgenden Tagen verabreicht wurde. konnte der Nachweis einer signifikanten Erhöhung spezifischer Antikörper der Klasse IgG bei allen Probanden erbracht werden (Tacket, C. O. et al. 1990).


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Im Vergleich unserer Studie zu der Studie von Carol O. Tacket fällt auf, daß die Rate an Serokonversionen bei Carol O. Tacket et al. signifikant höher liegt. Eine mögliche Ursache hierfür könnte die höhere Anzahl an verabreichten Bakterien sein.

Im Gegensatz dazu korrelieren unsere Ergebnisse gut mit denen von A. Kantele et al.

Wie in unserer Studie reagieren auch bei Kantele et al. deutlich weniger Probanden bei den Elisa Untersuchungen als im Elispot.

Hierfür gibt es zwei Erklärungen. Erstens ist der B-Zell-Elispot in der Methode sensitiver. Ein Nachweis einer spezifischen Reaktion gegen ein Fremdantigen oder einen Impfstoff gelingt also unterhalb der Nachweisgrenze herkömmlicher Elisas. Zweitens weisen Untersuchungen darauf hin, daß das Immunsystem in ein systemisches und ein mucosales Kompartiment unterteilt werden kann (Arvilommi, H. 1996). Als mukosales Kompartiment wird hier der Respirationstrakt und der Gastrointestinaltrakt angesehen.

Die Immunantwort im mucosalen Kompartiment unterscheidet sich fundamental von der Immunantwort an anderen Stellen des Körpers (Abbas, A. K. et al. 1996). So führt ein Infektion, die hauptsächlich das mucosale Kompartiment betrifft, zu einer Immunantwort, die sich hauptsächlich auf das mucosale Kompartiment beschränkt. Eine solche Immunantwort ist damit zwar vorhanden aber nicht notwendigerweise im systemischen Kompartiment nachweisbar (Kantele, A. et al. 1997; Arvilommi, H. 1996).

Im Einklang mit den Ergebnissen unserer Studie zeigte sich bei Kantele et al. eine Serokonversion abhängig von der Anzahl der detektierten spezifischen ASZ im Elispot. Eine Serokonversion spezifischen IgGs im Elisa konnte nur oberhalb einer gewissen Anzahl an detektierten spots im B-Zell-Elispot nachgewiesen werden. In unserer Untersuchung konnte eine Serokonversion bei den beiden Probanden festgestellt werden, die mit 387 (Proband Nr. 3), bzw. 205 spots/Mio.PBMZ (Proband Nr. 11) ebenfalls die höchsten Werte im B-Zell-Elispot aufwiesen.

Daß die Probanden 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10 und 12 im B-Zell-Elispot auf LPS, bzw. auf das O-Antigen von S. typhi reagieren aber keine Reaktion im Elisa zeigen (d.h. keine nachweisbaren IgG Antikörper im Serum haben), könnte also daran liegen, daß bei diesen Probanden die Immunantwort sich auf den Ort der Infektion, also die intestinale Mucosa, beschränkt hat.

Bei Proband 3 und 11 war im Gegensatz dazu die Immunantwort so stark, daß sie sich [Seite 72↓]nicht ausschließlich auf die intestinale Mucosa beschränkte, sondern auch systemisch manifest wurde und damit ein Antikörpernachweis im Serum gelang. Beide Probanden gehören der Verum-Gruppe an. Hinweise auf eine eventuelle Schwächung der Immunogenität des Impfstammes ergaben sich hier also ebenfalls nicht.

Eine humoralen Immunreaktion gegen den Vektor läßt sich also bei 10 von 12 Probanden nachweisen. Acht dieser Probanden gehören der Verum-Gruppe an, denen der Impfstoff S. typhi Ty21a(pDB1) verabreicht wurde und zwei Probanden gehörten der Kontrollgruppe an, denen der Kontrollstamm S. typhi Ty21a verabreicht wurde. Bei Proband Nr. 5 und Nr. 9 läßt sich weder im sensitiven B-Zell-Elispot noch im Elisa eine Immunantwort auf den Vektor detektieren.

Der Nachweis einer humoralen Immunreaktion beweist, daß es Impf- und Kontrollstamm gelang, die Mechanismen der unspezifischen Immunantwort zu überwinden (wie z.B. Mucosa-Barriere, Komplement-System) und die spezifische Immunantwort zu stimulieren.

Der Nachweis einer Immunreaktion gegen Antigene des Vektors bedeutet dabei, daß auch das Fremdantigen Urease von H. pyloriin Kontakt zur Immunantwort des Wirtes gekommen ist. Eine spezifische Immunreaktion gegen Urease ist damit wahrscheinlich.

Die genetische Veränderung, d.h. die Einschleusung eines Urease exprimierenden Plasmids in das Genom von Salmonella typhi Ty21a, hat nicht zu einer signifikanten Verminderung der Immunogenität des Impfstammes geführt. Aus dem Vergleich mit der Literatur ergeben sich allerdings Hinweise darauf, daß die Immunreaktion gegen S. typhi noch hätte gesteigert werden können. Ob dies durch eine Erhöhung der Impfdosis zu erreichen ist und ob sich bei einer Dosisveränderung das Nebenwirkungsprofil ändert, wäre eine interessante Fragestellung für zukünftige Studien.

IV.3.2. Zelluläre Immunantwort gegen den Vektor Salmonella typhi Ty21a

Zur Anwendung kamen hier T-Zell-Elispot, Proliferationsassay, und die Messung der IFN-γ Produktion in den Überständen.


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Alle drei angewendeten Testsysteme weisen aktivierte T-Lymphozyten im peripheren Blut nach, die spezifisch für Antigen des Vektors S. typhi sind. Allgemein geht man dabei davon aus, daß nach dem ersten Antigenkontakt der naiven T-Zelle im regionalen das Infektionsgebiet drainierenden Lymphknoten, also nach der klonale Expansion und der Differenzierung in die Effektorzellen, die T-Lymphozyten ähnlich wie die B-Zellen über den Ductus thoracicus und die Blutbahn zurück zum Ort der Infektion wandern (sog. Homing). Bei einer erneuten Stimulation mit dem für den Klon spezifischen Antigen in vitro kommt es wiederum zu einer klonalen Expansion und Sekretion von Zytokinen.

T-Zellen, die spezifisch auf Antigen des Vektors Salmonella typhi oder auch auf das Fremdantigen Urease von H. pylori reagieren, lassen sich damit u.a. über den Nachweis einer Proliferation (Proliferatiosassay) bzw. der Sekretion von Zytokinen (T-Zell-Elispot, IFN-γ Elisa) bei spezifischer Stimulation nachweisen.

Im Proliferationsassay wurde die spezifische zelluläre Immunantwort über die Einlagerung von radioaktiv markierten Thymidin in das Genom gemessen.

Im T-Zell-Elispot und IFN-γ Elisa wurde eine spezifische zelluläre Immunantwort über die Detektion IFN-γ produzierender Zellen (T-Zell-Elispot) oder von IFN-γ (IFN-γ Elisa) nachgewiesen.

IFN-γ wird von T-Helfer-Zellen des Subsets TH0 und TH1 und fast allen zytotoxischen-T-Zellen gebildet. Die Transkription des Gens für die IFN-γ Produktion beginnt direkt als Konsequenz der Antigenaktivierung und wird durch IL-2 und IL-12 erhöht.

In einem geringen Maß wird IFN-γ auch von NKZ gebildet. Die TH1-Zellen spielen eine maßgebliche Rolle bei der zellvermittelten Immunität und der Überempfindlichkeits-reaktion vom verzögerten Typ, die oft nach Infektion mit intrazellulären Mikroorganismen angetroffen werden (Abbas, A. K. 1996).

S. typhi gehört zu den intrazellulären Erregern (Finlay, B. B. et al. 1989). Eine Infektion mit S. typhiführt damit zu einer TH1 basierten Immunantwort, die u.a. durch die Produktion von IFN-γ nachweisbar ist (Mutoliala, A. et al. 1990; Kagaya, K. et al. 1989).

Eine TH1 basierte Immunantwort führt über die Produktion spezifischer Zytokine durch antigenaktivierte T-Helfer-Zellen u.a. zu einer IgG2a dominierten Antikörperantwort, zu [Seite 74↓]einer Aktivierung von Makrophagen, neutrophilen Granulozyten, natürlichen Killer Zellen und zytotoxischen T-Zellen. Die Zytokine, die dies bewirken, sind v.a. IFN-γ und IL 2.

Der Nachweis von signifikanten Mengen IFN-γ in den Überständen des Proliferationsassays oder von IFN-γ produzierenden Zellen im T-Zell-Elispot zeigt damit, daß spezifische T-Zellen auf das spezifische Antigen reagieren und daß eine Entzündungsreaktion vom TH1 Typ vorhanden ist.

Der erste Test zur Untersuchung der zellulären Immunantwort ist der T-Zell-Elispot. Im T-Zell-Elispot wurde als Vektor-Antigen das H-Antigen von S. typhi getestet.

Bei zwei Probanden gelang dabei ein positiver Nachweis spezifischer T-Zellen bei Stimulation mit dem H-Antigen von S. typhi (Proband-Nr.: 2, 10). Beide Probanden gehören der Verum-Gruppe an.

Eine mögliche Erklärung für die relativ geringe Anzahl der Probanden, die auf das H-Antigen reagiert haben, ist, daß das H-Antigen von S. typhi die Fähigkeit von Monozyten/Makrophagen, Antigene zu präsentieren, vermindert. Timothy L. Wyant et al. konnten zeigen, daß bei Inkubation der PBMZ mit S. typhi flagella (entspricht dem H-Antigen) Monozyten/Makrophagen deutlich weniger in der Lage waren, lösliche Antigene aufzunehmen und daß der Oberflächenmarker CD 54, der als kostimulatorisches Signal auch bei der APZ vermittelten Stimulation der T-Helfer Zellen eine Rolle spielt, stark vermindert exprimiert wurde (Wyant, T. L. et al. 1999).

Allerdings wurde das H-Antigen von S. typhi deshalb als Testantigen verwendet, da es zur Feindiskriminierung der Salmonellen verwendet wird (Kauffmann-White-Schema) und deshalb als immunogenes Antigen bekannt ist. Als Peptid und damit als Thymus-abhängiges Antigen ist das H-Antigen auch potentiell in der Lage eine zelluläre Immunantwort zu stimulieren.

Andere Gruppen konnten so auch eine starke Antikörperproduktion und zelluläre Immunreaktion und somit eine starke Immunität gegen dieses Antigen nachweisen (Hone, D.M. et al. 1992; Tacket, C. O. et al. 1992; Sztein, M. B. et al. 1994).


[Seite 75↓]

Eine zelluläre Immunreaktion gegen andere Antigene des Vektors als das H-Antigen und eine zelluläre Immunreaktion der TH2 Subpopulation, konnte mit dem T-Zell-Elispot unserer Konfiguration nicht gemessen werden. Es ist deshalb möglich, daß noch andere Probanden eine zelluläre Immunantwort gegen den Vektor aufwiesen, die mit diesem Test aber nicht erfaßt wurde

Arbeiten, die ebenfalls den T-Zell-Elispot verwendeten, um die zelluläre Immunantwort auf eine Impfung mit Salmonellen zu messen, konnten in der Literatur nicht gefunden werden. Ein direkter Vergleich unserer Ergebnisse mit den Arbeiten anderer Gruppen ist deshalb nicht möglich.

Der zweite Test zur Untersuchung der zellulären Immunantwort ist der Proliferationsassay. Im Proliferationsassay konnte bei drei Probanden ein signifikanter Anstieg der cpm nach Stimulation mit dem H-Antigen von S. typhi nachgewiesen werden (Proband-Nr.: 1, 3, 5; = 25%). Proband Nr. 3 und 5 gehören der Verum-Gruppe an und Proband Nr. 1 der Kontrollgruppe.

Bei Untersuchung der zellulären Immunität gegen den Vektor haben damit in den beiden zur Anwendung gebrachten Untersuchungsmethoden –T-Zell-Elispot und Proliferationsassay- unterschiedliche Probanden auf die Stimulation mit dem H-Antigen von S. typhi reagiert. Auf den ersten Blick wäre ein paralleles Ergebnis beider Untersuchungsmethoden zu erwarten, da beide Testsysteme die Reaktion der T-Zellen auf Stimulation mit einem Antigen messen. Es muß jedoch in Betracht gezogen werden, daß die beiden Testsysteme völlig unterschiedliche Parameter messen.

So erfaßt der Proliferatiosassay im Gegensatz zum T-Zell-Elispot nicht nur die T-Helfer-Zellen des Subsets TH1 sondern alle antigenstimulierten und sich teilenden Zellen. Zudem konnte nachgewiesen werden, daß Effektor-T-Zellen bei längerem Kontakt mit einem Antigen untergehen (Iezzi, G. et al. 1998). Eine mögliche Ursache für die unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Tests wäre also auch darin zu suchen, daß T-Zell-Elispot und Proliferatiosassay unterschiedliche Populationen von T-Helfer-Zellen erfassen, da der Proliferationsassay eine erheblich längere Inkubationszeit mit dem Antigen aufweist als der T-Zell-Elispot.


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An Tag 0 der Studie waren zwei Probanden bei Stimulation mit dem H-Antigen positiv (Proband-Nr. 1 und 5).

Proband-Nr. 5 hatte in der Anamnese eine Typhoral-Schluckimpfung. Eine bereits existierende Immunität war damit zu erwarten. Weshalb Proband-Nr. 1 positiv reagierte ist nicht klar. Eine Impfung mit Typhoral® oder eine Infektion mit S. typhi läßt sich anamnestisch nicht ermitteln. Eine subklinische Infektion mit S. typhi könnte jedoch eine mögliche Erklärung für eine bereits an Tag 0 nachweisbare Immunität sein.

Auch Proband-Nr. 2 hatte in der Anamnese eine Typhoral®-Schluckimpfung, zeigte aber im Proliferationsassay keine Immunreaktion. Dies ist im Einklang der Literatur, in der beschrieben wird, daß bei einem Drittel der Personen, die eine Typhoral®-Schluckimpfung erhalten haben, eine spezifische Immunantwort nicht nachgewiesen werden kann (Levine, M. M. et al. 1987).

In der Literatur gibt es eine Studie, die die zelluläre Immunreaktion auf eine Impfung mit S. typhi mittels Proliferationsassay untersucht.

Sztein, M. B. et al. verabreichten den Salmonellenstamm S. typhi CVD 906 in einer zweimaligen Dosis von 5x107 an neun Probanden und den Salmonellenstamm S. typhi CVD 908 in einer einmaligen Dosis von 5x107 an sechs Probanden. In einer dritten Gruppe, bestehend aus 10 gesunden erwachsenen Probanden wurde als Impfstoff S. typhi CVD 908-CSP benutzt. Dieser Impfstamm trägt an seiner Oberfläche als Fremdantigen das „circumsporozoite protein“ von Plasmodium falciparum. Der Trägerstamm ist S. typhi CVD 908. Eine Dosis von jeweils 5x107 Bakterien wurde zu zwei Zeitpunkten - an Tag 0 und 8 der Studie – verabreicht.

Die durchgeführten Untersuchungen beinhalteten die proliferative Antwort der PBMC auf Stimulation mit Salmonellen-H-Antigen und einem Lysat aus S. typhi Bakterien.

Bei Impfung mit S. typhi CVD 906 gelang der Nachweis einer Immunreaktion auf das H-Antigen bei sieben von neun Probanden (entspricht 78 % der Probanden).

In der Gruppe mit der Verimpfung von S. typhi CVD 908 konnte eine signifikante Erhöhung der cpm bei fünf von sechs Probanden (83 %) für das H-Antigen von S. typhi nachgewiesen werden.

Bei Verimpfung des rekombinanten Impfstoffes S. typhi CVD-CSP gelang ein Nachweis einer Reaktion auf das H-Antigen bei 10 von 10 Probanden (Sztein, M. B. et al. 1994).


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Vergleicht man diese Daten mit den Daten unserer Studie, so ist der Nachweis einer Immunreaktion bei Stimulation mit Salmonellen-H-Antigen bei 25% (3 von 12 Probanden) in unsere Studie deutlich geringer als bei Sztein, M. B. et al.

Zwei Punkte lassen sich als Erklärung hierfür finden. Erstens ist das H-Antigen beider Studien nicht identisch. In unserer Studie wurden Antigene der Firma Sifin benutzt, während Sztein et al. ein selbst hergestelltes Lysat benutzten.

Zweitens gilt der Salmonellenstamm CVD als stärker immunogen als der Salmonellenstamm S. typhi Ty21a (Levine, M.M. et al. 2001, Tacket., C.O. et al. 1992).

Im Vergleich beider Studien ergibt sich aber dennoch der Hinweis darauf, daß eine stärkere Stimulation des Immunsystems durch Veränderung des Impfsystems möglich wäre. Neben der bereits besprochenen Möglichkeit der Erhöhung der Impfdosis für unseren Impfstamm S. typhi Ty21a(pDB1), darf ein Wechsel des Vektors nicht völlig unbeachtet bleiben. Interessant ist hierbei die Tatsache, daß Sztein et al. eine deutlich geringere Impfdosis verwenden (einmalige Verimpfung von 5x107 Bakterien) aber dennoch eine stärkere Stimulation des Immunsystems erreichen. Ein Impfstoff mit S. typhi CVD als Vektor und Urease von H. pylori als Fremdantigen könnte also bei geringerer Impfdosis zu einer stärkeren Stimulation des Immunsystems führen.

Der dritte Test zur Beurteilung der zellulären Immunantwort gegen den Vektor ist der IFN-γ Elisa. Der IFN-γ Elisa untersucht die Menge an gebildetem IFN-γ in den Überständen des Proliferationsassays.

Bei drei von 12 Probanden (25%) konnte ein signifikanter Anstieg der IFN-γ Produktion bei Stimulation mit dem H-Antigen von S. typhi nachgewiesen werden (Proband-Nr.: 3, 5, 11). Im arithmetischen Mittel lag die IFN-γ Produktion bei Stimulation mit dem H-Antigen von S. typhi bei 325 pg/ml (Intervall: 115-445 pg/ml).

Im Vergleich zwischen IFN-γ Elisa und dem Proliferationsassay fällt auf, daß Proband-Nr. 1 nur im Proliferationsassay, nicht jedoch im IFN-γ Elisa auf Stimulation mit dem Salmonellen-H-Antigen reagiert. Umgekehrt reagiert Proband-Nr. 11 nur im IFN-γ Elisa, nicht aber im Proliferationsassay auf Stimulation mit dem Salmonellen-H-Antigen.


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Ein paralleles Ergebnis wäre zu erwarten gewesen, da beide Systeme die zelluläre Immunreaktion auf ein spezifisches Antigen messen und –anders als beim Vergleich zwischen T-Zell-Elispot und Proliferatiosassay- hier die Inkubationszeit und das Material identisch sind. Allerdings erfaßt der IFN-γ Elisa ausschließlich T-Lymphozyten, die der TH1 Subpopulation angehören. Spezifische T-Lymphozyten des Subsets TH2 könne im Proliferationsassay zwar erfaßt werden, nicht jedoch im IFN-γ Elisa.

Die Unterschiede in den Ergebnissen könnten auch im unterschiedlichen Nachweisverfahren liegen (der Nachweis von IFN-γ mittels Elisa gegenüber Messung der Proliferation mittels Thymidineinlagerung).

In Übereinstimmung mit unserem Studienaufbau wurde in der bereits vorgestellten Studie von Sztein, M. B. et al. der Proliferationsassay ebenfalls mit dem IFN-γ Elisa kombiniert.

Dabei hatten in der Studie von Sztein, M. B. et al. vier von neun Probanden bei Impfung mit S. typhi CVD 906 eine signifikante IFN-γ Produktion bei Stimulation mit dem H-Antigen. Die absoluten Werte lagen hier bei durchschnittlich 649 pg/ml mit einer Standardabweichung von 309 pg/ml.

Bei Impfung mit S. typhi CVD 908 konnte bei vier von sechs Probanden eine signifikante IFN-γ Produktion bei Stimulation mit dem H-Antigen nachgewiesen werden mit einem Durchschnittswert von 183 pg/ml und einer Standardabweichung von 58 pg/ml.

In der letzten Impfgruppe - geimpft wurde der rekombinante Stamm S. typhi CVD 908-CSP - gelang der Nachweis einer signifikanten IFN-γ Produktion bei Stimulation mit dem H-Antigen bei drei von vier Probanden. Der Mittelwert lag hier bei 177 pg/ml, die Standardabweichung bei 51 pg/ml.

Wie bereits bei dem Vergleich der Proliferationsergebnisse beider Untersuchungen, so reagieren auch im Vergleich der IFN-γ Elisas in unserer Untersuchung deutlich weniger Probanden auf die Stimulation mit dem Salmonellen-H-Antigen.

In Übereinstimmung mit dem Vergleich der Daten der Proliferationsassays lassen sich zwei Punkte als Erklärung hierfür finden. Erstens ist das H-Antigen beider Studien nicht identisch. In unserer Studie wurden Antigene der Firma Sifin benutzt, während Sztein et al. ein selbst hergestelltes Lysat benutzten.


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Zweitens gilt der Salmonellenstamm CVD als stärker immunogen als der Salmonellenstamm S. typhi Ty21a (Levine, M.M. et al. 2001, Tacket., C.O. et al. 1992). Der von uns gemessenen arithmetische Mittelwert von 326 pg/ml (Standardabweichung: 184 pg/ml) IFN-γ paßt gut zu den Ergebnissen von Sztein, M. B. et al., auch wenn in beiden Studie unterschiedliche Mutanten von S. typhi und nicht identische Antigene zur Stimulation benutzt wurden (Sztein, M. B. et al. 1994).

Zusammenfassend komme ich zu der Beurteilung, daß in unserer Studie eine zellulär getragene Immunreaktion auf den Vektor bei sechs von zwölf Probanden nachgewiesen werden kann (Probanden Nr.: 1, 2, 3, 5, 10, 11 =50%).

Bei Proband Nr. 3 und 5 gelang der Nachweis einer zellulären Immunreaktion gegen den Vektor im IFN-γ Elisa und im Proliferatiosassay, während bei den anderen Probanden dieser Nachweis jeweils nur in einem der Untersuchungsmethoden gelang.

In der Verum-Gruppe konnte bei fünf von neun Probanden der Nachweis einer zellulären Immunreaktion auf den Vektor erbracht werden. Zwei dieser Probanden hatten zuvor eine Impfung gegen Typhus (in Form von Typhoral®) erhalten.

Im Vergleich zur Literatur ergaben sich Hinweise auf eine relativ schwache Stimulation der zellulär getragenen Immunantwort in unserer Untersuchung.

Um die zellulär getragene Immunantwort zu verstärken, gibt es zwei Möglichkeiten. Die oben bereits erwähnte Alternative der Dosissteigerung oder die Verwendung eines immunogeneren Vektors.

IV.3.3. Humorale Immunantwort gegen das Antigen Urease von Helicobacter pylori

Im B-Zell-Elispot konnten weder an Tag 7 noch an Tag 14 der Studie spezifische Plasmazellen gegen H. pylori Urease festgestellt werden.

Aus diesem Grund liegt der Schluß nahe, daß bei keinem der Probanden eine humorale Immunreaktion gegen das eingeschleuste Fremdantigen Urease von H. pylori stattgefunden hat.

Ein Versagen der Testmethode kann ausgeschlossen werden, da die Kontrollen des Elispots (Positiv- und Negativkontrollen) an allen Tagen der Untersuchung [Seite 80↓]reproduzierbare und verläßliche Ergebnisse lieferten und spezifische spots bei der Untersuchung der humoralen Immunantwort gegen Antigen des Vektors nachgewiesen werden konnten (s.o).

Daß sich der B-Zell-Elispot eignet, um eine Immunreaktion gegen Urease als eingeschleustes Fremdantigen zu detektieren, konnten Michetti et al. demonstrieren. Michetti et al. untersuchten die Immunantwort an 26 mit H. pylori nachweislich infizierten Probanden nach Impfung mit „Heat-labile Enterotoxin“ (LT) von Escherichia coli plus aufgereinigter rekombinanter Urease. Es ließ sich eine spezifischer Anstieg der IgA-ASZ gegen rekombinante Urease bei allen Probanden, die der rekombinanten Urease ausgesetzt waren (n=15), nachweisen (Michetti, P. et al. 1999).

Basierend auf der bisherigen Auswertung der Daten bietet sich als plausibelste Erklärung eine ungenügende Stimulation des Immunsystems in unserem Impfversuch an. So könnten die relativ immunogenen Antigene des Vektors (LPS und das O-Antigen von S. typhi) zwar noch zu einer Immunreaktion geführt haben, das relativ schwach immunogene Molekül Urease jedoch nicht. Für diese Hypothese spricht, daß es nicht gelang lebensfähige Bakterienkulturen des Kontrollstammes und des Impfstamms aus dem Stuhl der Probanden anzuzüchten. Dies legt nahe, daß die Bakterien sich nicht in dem Ausmaß, wie erwartet, repliziert haben und damit evt. nicht genügend Menge an Urease zur Verfügung stand. Dagegen spricht vor allem daß im T-Zell-Elispot und in den Proliferationsassays eine signifikante Immunreaktion auf Urease bei einigen Probanden nachgewiesen werden konnte (s.u.). Man könnte nun spekulieren, daß T-Zellen sensitiver auf Urease reagieren. Eine Trennung der Immunantwort in zellulär und humoral macht aber zumindest für die thymusabhängigen Antigene (Proteine, wie z.B. Urease) wenig Sinn, da es während der Aktivierung zu zahlreichen Interaktionen und gegenseitigen Stimulation zwischen B und T-Zellen kommt. So kann die B-Zelle, nach Bindung des Antigens an ihrer Oberfläche als APZ für die spezifische T-Zelle fungieren. Die T-Helfer-Zelle wiederum sezerniert die spezifischen Zytokine, welche für die Proliferation und Differenzierung von der naiven B-Zelle benötigt werden (Abbas, A. K. et al. 1996).

Interessant in diesem Zusammenhang ist noch eine Veröffentlichung von Al-Ramadi et al. In einer Studie an Mäusen, denen ein aroA¯ Stamm von S. typhimurium verabreicht wurde, konnte gezeigt werden, daß eine Immunsuppression induziert wurde. Diese [Seite 81↓]Immunsuppression äußerte sich vor allem in der Unfähigkeit der B-Zellen auf heterologe Antigene mit einer Antikörperantwort zu reagieren. Als Vermittler der Immunsuppression wurden Zellen der Makrophagen-Linie identifiziert (Al-Ramadi, B. K. et al. 1991).

Inwiefern diese Ergebnisse sich aus dem Mausmodell auf unsere Humanstudie, durchgeführt mit S. typhi Ty21a, übertragen lassen, bleibt fraglich. Eine Immunsuppression, induziert durch Salmonella, wäre jedoch eine einleuchtende Erklärung für die Tatsache, daß im B-Zell-Elispot keine Antwort auf das heterologe Antigen Urease von H. pylori entdeckt werden konnte.

In der zweiten Untersuchungsmethode zur Eruierung einer humoralen Immunantwort auf Urease von H. pylori - dem IgG Elisa - konnte ebenfalls kein Nachweis einer Erhöhung spezifischer Antikörper erbracht werden.

Zum einen erscheint dies plausibel, nachdem im B-Zell-Elispot auch keine spezifischen Plasmazellen entdeckt werden konnten, zum anderen ist wie bereits oben beschrieben eine Trennung des Immunsystems in mucosales und systemisches Kompartiment schon von mehreren Autoren beobachtet worden. Das Fehlen eines Nachweises im systemischen Kompartiment - z.B. im Serum - bedeutet damit nicht, daß im mucosalen Kompartiment keine Immunantwort stattfindet.

Zusätzlich sollen an dieser Stelle zwei Studien angeführt werden, die sich mit der Bedeutung der humoralen Immunantwort in Bezug auf die Eradikation von H. pylori beschäftigen. Beide Studien basieren auf Ergebnissen aus dem Mausmodell.

In der ersten Studie von Thomas H. Ermak et al. (Ermak, T. H. et al. 1998) wurde normalen und sog. „knock-out“ Mäusen der H. pylori Stamm X47-2Al nach Impfung mit Urease und einem Adjuvans verabreicht. Danach wurde die Anzahl der H. pylori Bakterien im Magen und die Leukozyteninfiltration gemessen. Im Vergleich zu den normalen Mäusen ergab sich bei den „knock-out“ Mäusen ohne B-Zellen, also ohne die Fähigkeit zu einer humoralen Immunantwort, dieselbe Protektion durch den Impfstoff. Dies legt nahe, daß eine Protektion gegenüber H. pylori, zumindest in der Maus, nicht von der Produktion spezifischer Antikörper abhängt.

Die zweite Studie von Thomas G. Blanchard et al. (Blanchard, T. G. et al. 1999) kommt zu demselben Ergebnis. Hier wurde den Mäusen ein Lysat aus H. felis plus Cholera [Seite 82↓]Toxin als Impfstoff oral verabreicht und danach die Protektion gegenüber einer Infektion mit H. felis beurteilt. Auch hier hatten die Mäuse ohne Fähigkeit zur Produktion von Antikörpern dasselbe Ausmaß einer Protektion wie normale Mäuse.

Ein Vergleich mit anderen Humanstudien an dieser Stelle ist nur schwer möglich, da es insgesamt nur zwei Studien gibt, die Urease als Fremdantigen und Salmonella als Vektor benutzen. In der ersten Studie von DiPetrillo et al. konnte in keiner der Untersuchungen eine Immunantwort auf rekombinante Urease festgestellt werden (DiPetrillo, M. D. et al. 2000).

In der darauf folgenden Studie von Angelakopoulos et al. basieren die Ergebnisse hauptsächlich auf einem modifizierten B-Zell-Elispot, der sich nicht mit den von uns unternommenen Untersuchungen vergleichen läßt. Die einzig vergleichbare Untersuchung in der Studie von Angelakopoulos et al. ist der IgG Elisa. Untersucht wurde die Menge an gebildetem IgG gegen rekombinante Urease. Bei einem von 6 Probanden konnte eine Erhöhung des Antikörpertiters um das Vierfache des Ausgangswertes ermittelt werden. Allerdings konnte dieses Ergebnis im Western Blot nicht bestätigt werden (Angelakopoulos, H. et al. 2000).

In der Literatur sind weitere Studien beschrieben, die zwar als Vektor Salmonella verwenden als Fremdantigen aber andere Proteine als Urease von H. pylori. So wurden attenuierte Salmonellenstämme bereits dazu benutzt eine Immunreaktion gegen Fremdantigen wie das O-Antigen von Shigella sonnei (Black, R. E et al. 1987), das O-Antigen von Vibrio cholera (Tacket, C. O. et al. 1990), das Hepatitis-B-core-Antigen (Tacket, C. O. et al. 1997) oder das circumsporozoit Protein von Plasmodium falciparum (Gonzalez, C. et al. 1994) zu induzieren. Die Induktion einer Immunantwort gegen das Fremdantigen ist dabei generell schwierig (Sirard, J. C. et al. 1999). So variiert die Anzahl der Probanden, die eine Antikörperproduktion gegen das Fremdantigen zeigen, zwischen 0% und 43% (Bumann, D. et al. 2000).

Der Nachweis einer humoralen Immunreaktion gegen Urease von H. pylori konnte also nicht erbracht werden. Dies korreliert mit der generellen Schwierigkeit eine humorale Immunantwort gegen ein eingeschleustes Fremdantigen zu induzieren.

Die Bedeutung der humoralen Immunantwort für die Elimination einer Infektion mit H. pylorierscheint –belegt durch Untersuchungen an Mäusen- zweifelhaft.


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Ob in folgenden Studien zusätzlich Proben gastrointestinaler Flüssigkeit zum Nachweis spezifischen mucosalen IgAs entnommen werden soll, muß daher v.a. auch im Hinblick auf das zusätzliche Risiko für die Probanden streng abgewogen werden.

IV.3.4. Zelluläre Immunantwort gegen das Antigen Urease von Helicobacter pylori

Vor der weiteren Besprechung der Immunantwort auf Urease ist es wichtig darauf hinzuweisen, daß sowohl rekombinante Urease als auch native Urease als Testantigene eingesetzt wurden. Rekombinante Urease wurde von einem genetisch veränderten E. coli Stamm (Stamm: BL 21) produziert und besteht nur aus der Untereinheit B. Diese Untereinheit B ist weder enzymatisch aktiv, noch in ihrer Tertiärstruktur mit der Urease von H. pylori identisch.

Die native Urease wurde aus Lysaten von H. pylori gewonnen. Sie besteht aus beiden Untereinheiten (A und B), ist enzymatisch aktiv, und die Tertiärstruktur ist erhalten.

Das „heatshockprotein“ GroEl und LPS von Escherichia coli wurden im Proliferationsassay und im T-Zell-Elispot als zusätzliche negativ Kontrollen mitgetestet, um eine Verunreinigung der Proben auszuschließen und damit eine Immunreaktion auf rekombinante oder native Urease eindeutig zurückführen zu können.

Eine nicht vorhandene Immunreaktion auf das „heatshockprotein“ GroEl und LPS von Escherichia coli beweist die Spezifität der nachgewiesenen Reaktion gegenüber rekombinanter und nativer Urease.

Im T-Zell-Elispot gelang der Nachweis einer signifikanten Reaktion bei vier Probanden bei Stimulation mit rekombinanter Urease (Proband-Nr.: 2, 5, 10, 11) und bei drei Probanden bei Stimulation mit nativer Urease (Proband-Nr.: 2, 4, 7).

Auffällig ist hier zuerst, daß nur Proband 2 sowohl auf rekombinante wie auch auf native Urease reagiert hat, während die Probanden-Nr. 5, 10 und 11 nur bei Stimulation mit rekombinanter Urease, die Probanden-Nr. 4 und 7 nur bei Stimulation mit nativer Urease einen signifikanten Nachweis einer Immunreaktion hatten.

Bei den Probanden 4 und 7 könnte man den fehlenden Nachweis einer Immunreaktion auf rekombinante Urease dadurch erklären, daß die rekombinante Urease nur aus der [Seite 84↓]Untereinheit B besteht und deshalb eine mögliche Reaktion auf Untereinheit A nicht nachgewiesen werden konnte.

Die alleinige Reaktion auf rekombinante Urease bei den Probanden 5 und 10 ist schwieriger zu erklären. Die Ursache in der unterschiedlichen räumlichen Struktur der beiden Ureasen zu suchen macht wenig Sinn, da T-Zellen auf Peptide auf MHC II Komplexe reagieren und diese Peptide linear angeordnet sind (Abbas, A. K. et al. 1996). T-Zellen reagieren also nicht auf räumliche Strukturen. Die Proband-Nr. 5 und Nr. 11 liegen mit jeweils 21 spots/Mio.PBMC nur knapp über dem von uns festgelegten Schwellenwert von 20 spots/Mio.PBMC. Proband Nr. 10 ist mit 30 spots/Mio.PBMC deutlich über dem Schwellenwert.

Von einem gesicherten Nachweis einer Immunreaktion kann man auf Basis der Daten des T-Zell-Elispots also nur bei einem Probanden, Proband Nr. 2, ausgehen. Bei den anderen Probanden gelang der Nachweis nur bei rekombinanter oder nativer Urease.

Im Proliferationsassay konnte bei einem Probanden eine signifikante Antwort auf Urease von H. pylori nachgewiesen werden. Proband-Nr. 5 reagierte dabei sowohl auf die rekombinante als auch auf die native Form der Urease mit einem Stimulationsindex an Tag 28 von 3 bzw. 6. Die Ergebnisse stimmen mit den Resultaten im T-Zell-Elispot überein, allerdings nur für rekombinante Urease. Bei Stimulation mit nativer Urease, bei der ein Stimulationsindex von 6 im Proliferationsassay ermittelt wurde, konnte bei Proband-Nr. 5 keine Reaktion im T-Zell-Elispot detektiert werden.

Wie oben bereits beschrieben, könnte eine mögliche Ursache dafür die siebenfach längere Inkubationszeit im Proliferationsassay sein.

Untersuchungen der zellulären Immunantwort auf das Fremdantigen Urease, die ebenfalls den Proliferatiosassay verwendeten, konnten in der Literatur leider nicht gefunden werden, so daß unsere Ergebnisse nicht in Relation zu Ergebnissen anderer Arbeitsgruppen gesetzt werden können.

Proband-Nr. 5 war gleichzeitig auch der einzige, der eine nachweisliche Erhöhung der IFN-γ Produktion in den Überständen hatte. Allerdings war auch hier eine IFN-γ Produktion nur bei Stimulation mit rekombinanter Urease nachweisbar.


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Bei Stimulation mit nativer Urease konnte keine signifikante Reaktion erkannt werden. Wahrscheinlich war hier, bei einem Stimulationsindex von 3, die Menge an gebildetem IFN-γ zu gering, um im Elisa erfasst zu werden, während ein Stimulationsindex von 6 ausreichte.

Betrachtet man die Ergebnisse der Untersuchungen zur zellulären Immunreaktion gegen Urease zusammenfassend, so ist bei zwei Probanden (Proband-Nr.: 2 und 5) eine klare Immunreaktion auf das Fremdantigen Urease von H. pylori nachzuweisen. Damit ist es erstmals durch die Verwendung eines rekombinanten Impfstoffes gelungen, eine zelluläre Reaktion gegen Urease von H. pylori hervorzurufen. Bei den Probanden 4, 7, 10 und 11 ist ein immunologischer Nachweis in einem der angewendeten Tests gelungen, da dieser Nachweis aber nicht in zwei oder mehr Tests gelang, würde ich hier nicht von einer sicheren Immunreaktion gegen die Urease von H. pylori sprechen.

Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Tatsache, daß sowohl Proband-Nr. 5 als auch Proband-Nr. 2 vor der Studie Kontakt zu Salmonellen hatten. Beide Probanden hatten sich bereits vor der Studie mit Typhoral® impfen lassen. Bei Proband-Nr. 5 konnte dies anhand des bereits an Tag 0 der Studie erhöhten Antikörper-Titers gegen Salmonellen-O-Antigen und anhand der Ergebnisse des Proliferationsassays gezeigt werden. Eine interessante Fragestellung für weitere Studien wäre also, ob eine Auffrischimpfung eine Immunreaktion gegen ein Fremdantigen verstärkt.


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07.01.2005