Pilotstudie zur Evaluierung eines Impfstoffes mit Salmonella typhi Ty21a als Träger für rekombinante Urease von Helicobacter pylori Oliver Palme I.I.1-2I.2-3I.2-1.i)4ii)iii)5I.3-67618#463I.3-1.8I.3-2.i)910ii)11I.4-12I.4-1.I.4-2.13I.4-3.14I.4-4.15I.5-I.5-1.16I.5-2.I.5-3.17I.6-18I.7-19I.7-1.20I.7-2.21I.7-3.22I.7-4.23I.8-2425II.II.1-II.1-1.i)Native UreaseRekombinante Urease26ii)II.1-2.II.1-3.27II.1-4.28II.1-5.29II.1-6.30II.2-31II.2-1.32i)ii)iii)33iv)34v)35II.2-2.i)36ii)II.2-3.37II.2-4.3839II.2-5.40II.2-6.4142II.2-7.43i)44ii)45III.46III.1-47III.2-III.3-48III.3-1.i)49619#411619#412ii)50III.3-2.i)51619#412619#412ii)52III.4-III.4-1.i)53619#412ii)54619#357619#350III.4-2.55i)56618#384ii)57619#412619#412III.4-3.58i)59619#412ii)60619#41261IV.IV.1-626364IV.2-6566IV.3-67IV.3-1.6869707172IV.3-2.73747576777879IV.3-3.80818283IV.3-4.848586V.87Abkürzungsverzeichnis 1 VI Referenzen888990919293949596979899100101102103104105106 VII Danksagung107 VIII Anhang108109110111112618#463113IX Eidesstattliche Erklärung X Lebenslauf114deInhaltsverzeichnisHilfe Einleitung

Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein ubiquitär verbreitetes, gramnegatives Bakterium, das erstmals im April 1982 aus der Magenbiopsie eines Patienten des Royal Perth Hospital in West Australien angezüchtet werden konnte (Warren and Marshall 1983). Der Erreger wurde zuerst Campylobacter pyloridis, später dann Campylobacter pylori benannt. Im Jahr 1989 erhielt der Keim die korrigierte taxonomische Bezeichnung H. pylori (Goodwin, C. S. 1994).

Bis zum Zeitpunkt der Entdeckung von H. pylori galt es als unmöglich, daß ein Mikroorganismus im sauren Milieu des Magens überleben kann. Der Nachweis einer Besiedlung des Magens durch ein Bakterium und Hinweise aus Selbstversuchen auf einen Zusammenhang zwischen einer Infektion mit H. pylori und dem klinischen Bild einer Gastritis, machten erstmals eine infektiöse Genese verschiedener Krankheiten des oberen Gastrointestinaltraktes vorstellbar. Seitdem wurden zahlreiche Studien zu Epidemiologie und klinischer Bedeutung der H. pylori Infektion unternommen. Die weltweite Verbreitung sowie die Assoziation der chronischen H. pylori Infektion mit Krankheiten wie Gastritis und Magenkarzinom unterstreichen die Bedeutung dieses Bakteriums.

Epidemiologie

Infektionen mit H. pylori kommen weltweit vor und betreffen alle Bevölkerungsgruppen. Insgesamt geht man von einer weltweiten Infektionsrate von 50% aus (Goodman, K. J. et al. 2001).

Die Prävalenz der H. pylori Infektion variiert in Abhängigkeit von der geographischen Region, dem Alter, der ethnischen Zugehörigkeit und dem sozioökonomischen Status (Brown, L. M. 2000). Die Infektionsrate ist in sog. „Entwicklungsländern“ am höchsten (Bangladesh: 92%, Elfenbeinküste: 70-80%; Pounder, R. E. et al. 1995 und Brown, L. M. 2000), zeigt aber auch in Industrienationen wie z.B. in Japan Raten bis zu 80% (The Eurogast Study Group 1993). In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, daß die Prävalenz der Infektion mit zunehmendem Alter ansteigt, und daß pro Lebensjahr 1% Neuinfizierte zu erwarten sind. Neuinfektionen finden v.a. im Kindes- bzw. Jugendalter statt (Bodhidatta, L. 1993). Außerdem wurde beobachtet, daß die Infektionen in „clustern, wie z.B. familiär gehäuft, auftreten können (Drumm, B. et al. 1990).

Der Übertragungsmodus der Infektion ist noch nicht abschließend geklärt. Sowohl eine fäkal-orale als auch eine oral-orale Übertragung werden diskutiert (Megraud, F. 1995), aber auch andere Übertragungswege, wie z.B. eine Infektion durch Trinkwasser, Gemüse oder Tiervektoren könnten eine Rolle spielen (Brown, L. M. 2000).

Mikrobiologie von Helicobacter pylori

Vor der Besprechung der einzelnen Krankheitsbilder möchte ich die mikrobiologischen Charakterisierung von H. pylori sowie die bisherigen Erkenntnisse über die immunologischen Vorgänge einer Infektion mit H. pylori darstellen. Mikrobiologie und Immunologie spielen nicht nur für das Verständnis der H. pylori assoziierten Krankheiten eine Rolle sondern sind auch für die Entwicklung eines Impfstoffes von zentraler Bedeutung.

Helicobacter pylori ist wie Helicobacter felis und andere Helicobacterarten ein Teil der Gattung Helicobacter. Zusammen mit der Gattung Wolinella bildet Helicobacter die Familie der Helicobacteraceae. Die Familie der Helicobacteraceae befindet sich zusammen mit der Familie Campylobacteriaceae in der Ordnung der Campylobacterales, die zur Klasse der Epsilonproteobacteria gehört (Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology).

Das Bakterium kommt in einfach gebogener oder spiralförmiger (mit maximal drei Windungen) Zellform vor und besitzt unipolar 3-6 Flagellen, die als besonderes morphologisches Merkmal von einer membranartigen Hülle umgeben sind (Owen, R. J. 1998).

H. pylori wächst am besten auf serumhaltigen Festnährböden unter mikroaerophilen Bedingungen (90% N2, 5%CO2, 5%02). Auf solchen Platten bilden die Bakterien nach 3-5 Tagen bis zu 1,5 mm große glänzende, transparente Kolonien (Kayser, F. H. et al. 1998).

Identifizierungsmerkmale von H. pylori sind neben den beschriebenen morphologischen Eigenschaften der positive Test für Urease, Katalase und Oxidase. Des weiteren zeichnet sich Helicobacter pylori durch das Fehlen der Nitratreduktase und der Hippurat-Hydrolyse, den Nachweis der Gamma-Glutamyltranspeptidase und durch eine Resistenz gegen Nalidixinsäure sowie eine Sensibilität gegenüber Cefalotidin aus (Malfertheiner, P. 2000).

H. pylori hat mit 1,7 Mio. Basenpaaren ein relativ kleines Genom (Bukanov, N. O. et al.1994). Dies korreliert mit den hohen Nährstoffansprüchen dieses Bakteriums. Ungefähr 50 % der Stämme tragen Plasmide, deren Funktion bisher jedoch nicht aufgeklärt werden konnte (Marais, A. et al. 1999, Suerbaum, S. 2000).

Ungewöhnlich ist die hohe genetische Variabilität von H. pylori Stämmen (Suerbaum, S. 2000). Rekombinationen zwischen verschiedenen H. pylori Stämmen, aber auch Neumutationen werden hierfür verantwortlich gemacht (Wang, G. et al. 1999). Die biologische Relevanz der hohen genetischen Variabilität ist bis jetzt noch ungeklärt.

Virulenzfaktoren von Helicobacter pylori Urease

Zwei Schutzmechanismen -ein saurer pH (pH: 2) und die Magenperistaltik verhindern normalerweise eine Kolonisation des Magens. H. pylori ist dabei das einzige Bakterium, das zu einer Besiedlung des Magens in der Lage ist.

Ein Schutz gegen die Magensäure bietet die Produktion von Urease.

Urease spaltet das im Magensaft in geringen Mengen vorkommende Ammoniak in CO2 (Kohlendioxid) und NH3 (Ammoniak), letzteres neutralisiert die Magensäure.

H. pylori kann so in einer pH-neutralen Nische des Magens, geschützt vor den aggressiven Effekten der Salzsäure, überleben. Für eine Kolonisation des Magens ist Urease damit absolut essentiell (Segal, E. D. et al. 1992; Solnick, J. V. et al. 1995).

Die Urease wird vom Bakterium sezerniert, wobei der genaue Mechanismus der Ausschleusung bis jetzt noch nicht aufgeklärt werden konnte (Mobley, H. L. T. et al. 1995; Vanet, A. et al. 1998).

Neben der Funktion der Säureneutralisation gibt es aus Tierversuchen Hinweise auf weitere Funktionen der Urease. So konnte nachgewiesen werden, allerdings bislang nur in vitro, daß der aus Harnsäure freigesetzte Ammoniak als Stickstoffquelle zur Aminosäuresynthese bei H. pylori dient (Williams, C. L. et al. 1996).

Smoot et al. weisen der Urease noch eine immunmodulatorische Bedeutung zu. Diese Autoren diskutieren des weiteren über einen eventuellen Zusammenhang zwischen der Urease und der Entstehung von Gewebeschäden im Magen. Dieser Mechanismus wird wahrscheinlich durch Hydroxylionen vermittelt. Hydroxylionen entstehen bei der Reaktion von Wasser mit Ammoniak und sind für Epithelzellen toxisch (Smoot, D. T. et al. 1990).

Die Urease von H. pylori ist mit 550kDa ein relativ großes Molekül und läßt sich in insgesamt 12 Untereinheiten unterteilen. Man unterscheidet jeweils 6 Untereinheiten UreA mit ca. 26 kDa und 6 Untereinheiten UreB mit ca. 61 kDa. Zusätzlich enthält jedes Molekül Urease zwei Nickelatome, ohne die das Enzym nicht aktiv ist (Labigne, S. R. et al. 1991).

 Vakuolisierendes Zytotoxin VacA

Das vakuolisierende Zytotoxin VacA ist ein Protein in der Größe von 95 kDa (Cover and Blaser 1992). Es zeigt keine Aminosäurensequenzhomologien mit anderen bekannten Toxinen (Dundon, W. G. et al. 2001).

Das Toxin wird aus der Bakterienzelle in das umgebende Milieu sezerniert (Schraw, W. et al. 1999). Es führt in Zellkulturen zu einer charakteristischen Schädigung in Form einer Vakuolisierung des Zytoplasmas. Diese Vakuolisierung wird durch die Bildung transmembranöser Kanäle in intrazellulären Kompartimenten und durch eine Membranfusion verursacht (Dundon W. G. et al. 2001).

Das VacA Gen ist in allen H. pylori Stämmen vorhanden. VacA wird jedoch nicht von allen Stämmen gebildet (Cover T. L. 1996).

Anhand unterschiedlicher Signalsequenzen von VacA wurden zwei Genotypen –Genotyp S1 und Genotyp S2- unterschieden.

Die ursprüngliche Annahme, daß diese Genotypen mit einem unterschiedlichen Ausmaß an sezerniertem VacA und damit mit einem unterschiedlichen klinischen Bild der Infektion assoziiert sind (Atherton, J. C. et al. 1997), konnte nicht verifiziert werden (Graham, D. Y. et al. 2000; Yamaoka, Y. et al. 1999).

 Zytotoxin-assoziiertes Gen A: CagA

Die Transkription und Translation des Zytotoxin-assoziierten Gens CagA führt zur Bildung eines 128-140kDa Proteins, dem sog. CagA-Antigen. Das CagA-Antigen ist bekannt für seine starke Immunogenität (Covacci, A. et al. 1993; Tummuru, M. K. et al. 1993)

Die Bildung des CagA-Antigens ist statistisch korreliert mit der Bildung des VacA-Zytotoxins. CagA ist jedoch nicht bei allen H. pylori Stämmen vorhanden. Durch mehrere Studien wurde mittlerweile belegt, daß CagA positive Stämme von H. pylori eine stärkere Immunantwort induzieren als CagA negative Stämme.

Durch die verstärkte Freisetzung von Entzündungsmediatoren sind CagA positive Stämme signifikant häufiger mit dem Auftreten der Ulkuskrankheit (Tham, K. T. et al. 2001), des MALT-Lymphoms (Eck, M. et al. 1997) und des Magenkarzinoms assoziiert (Parsonnet, J. et al. 1997).

Neuere Studien weisen nach, daß das CagA-Protein über ein Typ IV Sekretionsmechanismus in die Epithelzellen des Magens transloziert wird und dort den Phosphorilierungsgrad bestimmter Proteine beeinflußt (Odenbreit, S. et al. 2000 und Backert, S. et al. 2000). Wie diese Veränderungen innerhalb der Magenepithelzelle mit der Auslösung einer starken Immunantwort in Zusammenhang stehen, ist bislang jedoch unbekannt (Dundon, W. G. et al. 2001).

H. pylori Stämme werden, je nachdem ob sie das VacA und das CagA Antigen produzieren, in zwei große Gruppen unterteilt. Typ I Stämme von H. pylori produzieren –im Gegensatz zu Typ II Stämmen- sowohl das CagA Antigen als auch das VacA Antigen (Xiang, Z. et al. 1995).

Pathogenese und immunologische Reaktion einer Helicobacter pylori Infektion

Der Verlauf einer H. pylori Infektion läßt sich aus dem Zusammenspiel von Virulenzfaktoren des Keimes und der Immunantwort des Wirtes ableiten.

Der erste Schritt einer Infektion mit H. pylori ist die orale Aufnahme der Bakterien und deren chemotaktische Orientierung zum gastralen Mukus hin sowie das aktive Eindringen des Bakteriums in den Mukus.

Dabei sezerniert H. pylori Enzyme (z.B. Urease, Phospholipase C u.a.), was dem Bakterium eine Passage des sauren Mukus und der dem Magenepithel aufliegenden Phospholipidschicht ermöglicht. Einige Bakterien adhärieren direkt am Magenepithel, während der größte Teil der Bakterien sich in der dem Magenepithel anliegenden Mukusschicht ohne direkten Kontakt zum Epithel aufhält (Shimizu, T. et al. 1996; Schreiber, S. et al. 1999). Welche Rezeptoren und Liganden für die spezifische Adhärenz ursächlich sind, ist Gegenstand aktueller Forschung (Clyne, M. et al. 1997).

Direkte Faktoren, wie die Sekretion verschiedener Enzyme (wie z.B. Urease, Phospholipase), führen im Zusammenspiel mit indirekten Faktoren, wie der Immunreaktion des Wirtes auf die Infektion, aber auch der Adhärenz von H. pylori an das Magenepithel, zu einer entzündlichen Veränderung der Magenschleimhaut, die für das Überleben des Bakteriums notwendig ist.

Die Immunreaktion des Wirtes wird dabei durch Freisetzung zahlreicher entzündlicher Mediatoren (Interleukine, Interferone, TNFα) moduliert (Genta, R. M. 1997).

Gelingt H. pylori die Persistenz im Magen – d.h., kommt es nicht zu einer Selbstheilung und damit zu einer Elimination des Bakteriums – entwickelt sich eine chronische Gastritis.

Die meisten Infizierten bleiben dabei asymptomtisch und die Entzündung der Mucosa kann nur histologisch nachgewiesen werden. In 10 bis 20% der Fälle entwickeln die Betroffenen jedoch gastrointestinale Erkrankungen wie z.B. die Ulkuskrankheit aber auch das Magenkarzinom (s. Abb. 1)

Das Ausmaß der Gastritis, d.h. das Ausmaß der subjektiv empfundenen Beschwerden und das Ausmaß der gastralen Läsionen, ist dabei interindividuell sehr verschieden.

Diese Variabilität läßt sich dadurch erklären, daß es einerseits unterschiedlich pathogene Stämme von H. pylori gibt, und daß sich andererseits die Immunantwort des Wirtes von Individuum zu Individuum unterscheidet (Shimoyama, T. et al. 1998). Außerdem ist eine Schädigung des Magenepithels von zusätzlichen exogenen Faktoren, wie Medikamenteneinnahme, Alkohol-, Koffein- und Nikotin- Zufuhr und endogenen Faktoren wie psychogenem Streß, verminderter gastraler Durchblutung und Vitamin-C-Mangel abhängig (Harrisons Innere Medizin, 1995).

Generell läßt sich die Immunantwort auf eine H. pylori Infektion in eine unspezifische und eine spezifische Reaktion unterteilen.

Abb. 1 : Pathogenese einer H. pylori Infektion

Die unspezifische Immunreaktion

Eine unspezifische Immunreaktion läßt sich in verschiedene Bestandteile unterteilen. Neben den physiko-chemischen Barrieren der Haut und Schleimhäute, spielen Effektormoleküle (z.B. das Komplementsystem), Effektorzellen (z.B. Makrophagen, neutrophile Granulozyten und natürliche Killer-Zellen (NKZ)) und von den Effektorzellen gebildete Mediatoren (Interferone, Tumor-Nekrose-Faktor und andere) eine Rolle (Abbas, A. K. et al. 1996).

Der erste direkte Kontakt von H. pylori mit dem Epithel der Magenschleimhaut führt zur Aktivierung der unspezifischen Immunreaktion.

Es kommt dabei zu intrazellulären Veränderungen in den Magenepithelzellen. Diese Veränderungen stellen sich als Reorganisation von Actin und somit als eine Veränderung des Zytoskeletts dar.

Zusätzlich wird eine vermehrte Expression des IL-8-Gens und damit eine vermehrte Sekretion von IL-8 induziert (Crabtree, J. E. et al. 1994; Crowe, S. E. et al. 1995).

Auf diese Stimuli hin wird die Immunantwort des Wirtes eingeleitet, die eine deutliche Infiltration der Magenschleimhaut mit neutrophilen Granulozyten gekennzeichnet ist.

Diese bilden dann selbst die Quelle von entzündungsfördernden Zytokinen, wie IL-1, TNFα und IL-8 (Strieter, R. M. et al. 1992).

Auch Mastzellen spielen eine Rolle bei der Einleitung der unspezifischen Reaktion auf den Erreger. Bei der Degranulation der Mastzellen kommt es über die Freisetzung von Mediatoren (z.B. Histamin) zur Permeabiltätssteigerung des Endothels, zur Induktion der Zytokinsekretion aus peripheren Monozyten, zur Stimulation der Adhärenz von Neutrophilen an das endotheliale Epithel und zur Chemotaxis und Aktivierung von Neutrophilen und Monozyten (Yoshida, N. et al. 1993).

Bakterielle Bestandteile, die die Degranulation der Mastzellen bewirken, sind u.a. Lipopolysaccharide (LPS) und LPS- freie Oberflächenkomponenten von H. pylori (Mai, U. E. H. et al. 1991), sowie das sog. H. pylori neutrophil activating Protein (HP-NAP) (Kurose, I. et al. 1994).

Die Aufnahme bakterieller Produkte wird durch die Infiltration der Magenschleimhaut, durch neutrophile Zellen und durch das vakuolisierende Zytotoxin begünstigt (Tufano, M. A. et al. 1994).

Diese bakteriellen Bestandteile können von Antigen präsentierenden Zellen (APZ) –wie z.B. Makrophagen/Monozyten- aufgenommen werden. APZ selbst können über die Präsentation der Antigene an Lymphozyten die spezifische Immunreaktion einleiten.

Die spezifische Immunreaktion

Die spezifische Immunantwort gegen H. pylori wird i.A. in eine humorale und eine zelluläre Immunantwort unterteilt.

Humorale Immunantwort gegen Helicobacter pylori

B-Lymphozyten sind die Vermittler der humoralen Immunität. Nach spezifischer Aktivierung durch eine APZ und unterstützt durch T-Helfer-Lymphozyten, beginnen B-Lymphozyten mit der klonalen Expansion und Differenzierung zu Plasmazellen. Die Plasmazelle sezerniert Antikörper, die die Effektoren der spezifischen humoralen Immunität darstellen.

Alle Patienten mit chronischer H. pylori Gastritis reagieren mit der Bildung von spezifischem IgM, IgA und IgG Antikörpern auf eine chronische Infektion mit H. pylori (Malfertheiner, P. 2000).

Alle drei Antikörperklassen lassen sich dabei i.A. sowohl lokal (im Magengewebe) als auch systemisch (im Serum) nachweisen (Valnes, K. et al. 1989).

Der Nachweis von spezifischen IgG hat dabei für die Diagnostik und die Überprüfung des Therapieerfolges mehr Bedeutung als der Nachweis von spezifischem IgA oder spezifischem IgM (Rathbone, B. J. et al. 1986).

Eine IgM Sekretion wird generell nur in der akuten Phase der Infektion nachgewiesen (Sobala, G. M. et al. 1991).

Sowohl bei der mucosalen IgA Antwort als auch bei der systemischen IgG Antwort wurde eine deutliche Heterogenität bezüglich der spezifischen Antigene beobachtet (Von Wulffen, H. et al. 1988).

Die Bedeutung der spezifischen Antikörper für die Infektabwehr und die Immunpathologie der Gastritis ist noch unklar. So haben Studien an „knockout“ Mäusen, die keine Antikörper produzieren können, gezeigt, daß für die effektive Bekämpfung einer H. pylori Infektion die humorale Immunreaktion nicht von zentraler Bedeutung ist (Ermak, T. H. et al. 1998; Blanchard, T. G. et al. 1998).

Es wird vermutet, daß v.a. die mucosalen IgA Antikörper protektive Funktionen ausüben. So konnte in vitro gezeigt werden, daß anti-VacA-Antikörper vom IgA Subtyp eine Vakuolisierung des Epithels verhindern (Figura, N. et al. 1994).

Weitere Funktionen der IgA Antikörper sind u.a. eine Verhinderung der bakteriellen Adhäsion und Motilität und eine Toxinneutralisation (Crabtree, J. E. 1996).

Spezifische IgM und IgG Antikörper führen zu einer Opsonisierung von H. pylori, was die Phagozytose des Bakteriums erleichtert (Malfertheiner, P. 2000).

Im Rahmen dieser Antikörper-vermittelten Immunreaktionen wird vermutet, daß es zu Kreuzreaktionen zwischen Antigenen von H. pylori und der Magenmucosa kommen kann, was zu autoimmun induzierten Schäden führen könnte.

Dies gilt sowohl für das O-Antigen von H. pylori, das strukturelle Ähnlichkeiten mit den Lewis X-Ketten von Zelloberflächenstrukturen hat (Aspinall, G. O. et al. 1994), als auch für das Hsp-Protein von H. pylori, daß, wie andere bakterielle Hitzeschockproteine auch, eine hohe Homologie zu humanen Hitzeschockproteinen aufweist (Macchia, G. et al. 1993). Die Ausheilung der Gastritis nach erfolgreicher Eradikation deutet jedoch darauf hin, daß diese Kreuzreaktionen zumindest langfristig, d.h. über das Abklingen der Infektion hinaus, keine wesentliche Bedeutung haben.

 zelluläre Immunantwort gegen Helicobacter pylori

Träger der zellulären Immunität sind die T-Lymphozyten. Nach spezifischer Aktivierung durch eine APZ kommt es zur klonalen Expansion und Differenzierung des T-Lymphozyten. Man unterscheidet:

  1. T-Suppressor-Lymphozyten

  2. T-Zytotoxische-Lymphozyten und

  3. T-Helfer-Lymphozyten.

T-Suppressor-Lymphozyten können die Aktivierung der funktionell kompetenten, antigenspezifischen T-und/oder B-Lymphozyten regulieren und hemmen (Abbas, A. K. et al. 1996).

T-Zytotoxische-Lymphozyten lysieren Zellen, die fremde Antigene produzieren und diese auf dem „major histocompatibility complex (MHC)“ I präsentieren.

T-Helfer-Lymphozyten sind von zentraler Bedeutung für die Elimination einer Infektion mit H. pylori. Die Aufgabe dieser Zellen besteht u.a. darin, die Proliferation von T-Zellen, B-Zellen und Makrophagen über die Sekretion verschiedener Zytokine anzuregen (Abbas, A. K. et al. 1996). T-Helfer-Lymphozyten werden nach dem Muster ihrer Zytokinproduktion in Subpopulationen unterteilt. So unterscheidet man u.a. die Klasse der Th-1-Zellen und die Klasse der Th-2-Zellen.

Th-1-Zellen produzieren v.a. Interferon-γ (IFN-γ) und Interleukin 2 (IL-2). Das sind Zytokine, die Antigen-unabhängig die Phagozyten aktivieren (Scott, P. et al. 1995) und sowohl eine zellvermittelte Immunität als auch eine Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (sog. „delayed type hypersensitivity (DTH)“) induzieren können (Abbas, A. K. et al. 1996). Die Th1 vermittelte Immunantwort wird oft auch als inflammatorische Immunantwort bezeichnet.

Im Gegensatz dazu zeichnen sich Th-2-Zellen durch die Sekretion von IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 u.a. Zytokine aus. IL-4 stimuliert die IgE-Antikörperproduktion, IL-5 aktiviert u.a. eosinophile Granulozyten und IL-10 und IL-13 können zusammen mit IL-4 die zellvermittelte (also die Th-1-induzierte) Immunität hemmen (Abbas, A. K. et al. 1996). Diese Th2 vermittelte Antwort wird deshalb oft auch als antiinflammatorisch bezeichnet.

Man geht heute davon aus, daß eine Einteilung der T-Helfer-Lymphozyten in Th-1- und Th-2-Zellen eine zu vereinfachte Darstellung ist. Vielmehr stellen die Th1- und die Th-2-Subpopuationen die zwei extremen Varianten einer Vielzahl unterschiedlicher Subpopulationen an T-Helfer-Lymphozyten dar, wobei jede dieser Subpopulation ein unterschiedlichem Muster an Zytokinen sezerniert (Kelso, A. 1995).

Die zelluläre Immunantwort des Wirtes auf eine H. pylori Infektion scheint eher eine Th1-vermittelte Immunität aufzuzeigen. Karttunen et al. konnten nachweisen, daß es während einer Infektion mit H. pylori zu einer Zunahme IFN-γ produzierender T-Lymphozyten in der Mucosa des Magens kommt (Karttunen, R. et al. 1995) und Tarkkanen et al. wiesen nach, daß Leukozyten aus dem peripheren Blut bei Stimulation mit H. pylori IFN-γ produzieren (Tarkkanen, J. et al. 1993).

Untersuchungen im Mausmodell deuten darauf hin, daß eine gleichzeitig stattfindende Th-2 Aktivierung dem Zweck dient, eine überschießende Immunantwort zu verhindern (Mohammadi, M. et al. 1997).

Ob eine Th1 basierte Immunantwort oder aber eine Th2 basierte Immunantwort für die Elimination von H. pylori und damit für die Verlaufsform der Infektion von Bedeutung ist, ist gegenwärtig noch Gegenstand der Diskussion.

Für eine Th2 basierte Immunantwort spricht eine Studie von Radcliff et al. Hier konnte durch Untersuchungen an Il-4 „knockout“- Mäusen (Mäuse, die kein IL-4 mehr produzieren konnten) gezeigt werden, daß eine Protektion gegenüber einer Infektion mit Helicobacter felis und H. pylori bei diesen Mäusen nicht mehr möglich war (Radcliff, F. et al.1996).

Auf der anderen Seite konnten die selben Untersucher nachweisen, das es bei IFN-γ„knockout“ Mäusen ebenfalls zu einer verminderten Protektion gegenüber Infektion mit Helicobacter kommt (Radcliff, F. et al.1997).
Helicobacter pylori assoziierte Krankheiten Gastritis

Eine Gastritis ist eine Magenschleimhautentzündung, bei der die normale Histioanatomie und Physiologie des Magens gestört ist. Sie geht mit den klinischen Zeichen Übelkeit, Erbrechen, Druckgefühl und Aufstoßen einher. Es werden akute und chronische Formen unterschieden. In Deutschland existieren zwei Klassifikations-systeme zur weiteren Differenzierung der chronischen Gastritiden. Zum einen das „ABC“-System und zum anderen das aktualisierte Sydneysystem. Gemäß dem „ABC“ System werden die chronischen Gastritiden weiter unterteilt in Typ A (autoimmune Pathogenese), Typ B (bakterielle Pathogenese), Typ C (chemische-toxische Pathogenese) Gastritiden und Sonderformen. Das aktualisierte Sydneysystem trifft eine Unterteilung der chronischen Gastritis gemäß Ätiologie, Topographie und Morphologie. Zudem unterscheidet man, je nach Schweregrad der histologischen Schädigung, oberflächliche, transmuköse und atrophische Gastritiden (Riede-Schäfer 1995). Klinisch wird die Gastritis nach der sog. Sidney-Klassifikation unterteilt (Herold, G. 2000)

Die ersten Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen H. pylori und Gastritis lieferten die Selbstversuche der Entdecker des Bakteriums (Marshall and Warren 1885 and Morris, A. et al. 1987). Inzwischen gilt es, belegt durch epidemiologische Studien, Tierversuche (Krakowka, S. et al. 1987) und therapeutische Studien mit Langzeitbeobachtungen (McCarthy, C. et al. 1995), als sicher, daß ein kausaler Zusammenhang zwischen einer Infektion mit H. pylori und der klinischen Manifestation einer Gastritis besteht.

Eine akute Gastritis, ausgelöst durch eine akute Infektion mit H. pylori, ist selten zu beobachten (Riede-Schäfer 1995). Dagegen sind durchschnittlich 85% der chronischen Gastritiden verursacht durch eine chronische Infektion mit H. pylori (Typ B) (Herold, G. 2000).

Komplikationen der chronischen Gastritis (Typ B) sind v.a. Gastroduodenalulcera, Magenkarzinom, Autoimmungastritis und MALT-Lymphome (Herold, G. 2000).

 Ulkuskrankheit

Per definitionem ist ein Ulkus ein Substanzdefekt, der die lamina muscularis mucosae der Schleimhaut überschreitet. Als Ulkuskrankheit bezeichnet man die Symptomatik von Magengeschwüren (ulcus ventriculi) und Zwölffingerdarmgeschwüren (ulcus duodeni). Der stechende epigastrische Schmerz ist die Hauptsymptomatik der Ulkuskrankheit. Allerdings zeigt etwa die Hälfte der Patienten mit nachgewiesenem Ulcus duodeni oder ventriculi keinerlei Ulkussymptomatik ((Harrison et al. 1995)).

Als Ursachen für die Ulkuskrankheit gelten:

  1. Infektion mit H. pylori,

  2. Medikamente wie z.B. nicht steroidale Antirheumatika (NSAR),

  3. Hypersekretion der Magensäure (z.B. beim Zollinger-Ellison-Syndrom)

  4. Anastomoseulkus nach Magenoperation,

  5. Tumore

  6. systemischer Morbus Crohn.

Die H. pylori Infektion gilt als die häufigste Ursache der Ulkuskrankheit. So wird bei fast 100% der Patienten mit Duodenalulkus und bei 80-90% der Patienten mit Magenulkus über einen Nachweis von H. pylori berichtet (Vaira, D. et al. 1997).

Das Risiko an einem Duodenalulkus zu erkranken ist für Patienten mit einer Typ-B-Gastritis 10fach erhöht.

Die signifikante Reduzierung eines Ulkusrezidivs und die erfolgreiche Therapie der Ulkuskrankheit (bei Nachweis von H. pylori) durch eine medikamentöse H. pylori Eradikation gelten als Beweis für die Kausalität von H. pylori in der Ulkuspathogenese.

 Magenlymphom

Magenlymphome gehören zu den Non-Hodgkin-Lymphomen. Nach der Kieler Klassifikation sind sie der Gruppe des monozytoiden Lymphoms oder MALT (mucosa associated lymphatic tissue) Lymphoms zuzuordnen. Die MALT-Lymphome bestehen aus einem neoplastischen Infiltrat zentrozytenartiger und/oder monozytoider B-Zellen, welches das Mucosaepithel durchsetzt, und aus Lymphfollikeln mit reaktiven Keimzentren, die später verschwinden (Riede-Schäfer 1995). Nach der REAL-Klassifikation (revidierte europäisch-amerikanische Lymphomklassifikation) werden MALT-Lymphome zu den extranodalen Marginalzonen-Lymphomen zugeordnet (Riede-Schäfer 1995, Tumorzentrum Berlin 1998).

MALT-Lymphome machen etwa 7% aller malignen Magentumore aus und etwa 2% aller Lymphome im Gastrointestinaltrakt (Harrison 1995). Der Magen ist jedoch für Lymphome die häufigste Lokalisation außerhalb des Lymphknotens.

Altersgipfel ist das 6. Lebensjahrzehnt. Zur klinischen Symptomatik gehören epigastrischer Schmerz, frühes Sättigungsgefühl und allgemeine Müdigkeit. Prädisponierend sind Läsionen, die mit einer follikulären Hyperplasie des MALT einhergehen (Harrison 1995).

Da lymphatisches Gewebe in der normalen Magenmucosa nicht vorhanden ist, muß es – z.B. durch eine chronische Infektion - erst erworben werden. Untersuchungen konnten zeigen, daß sich Lymphfollikel und lymphatische Aggregate bei einer Infektion mit H. pylori bilden (Stolte, M. et al. 1989) und daß die Dichte der Gastritis assoziierten lymphozytären Infiltration bei keinem Typ der Gastritis so ausgeprägt ist, wie bei der H. pylori Gastritis.

Richtungsweisend für einen Zusammenhang zwischen H. pylori Infektion und Magenlymphom waren folgende Befunde. Einmal konnte die Rückbildung eines bereits manifestierten niedrigmalignen Magenlymphoms durch Beseitigung der chronischen H. pylori Infektion gezeigt werden (Bayerdorffer, E. et al. 1995). Zum anderen konnte in zellbiologischen Untersuchungen gezeigt werden, daß in Zellkultur gebrachte Lymphomzellen aus Gastrektomie-Präparaten durch Zugabe von H. pylori aktiviert wurden (Hussel, T. et al. 1993). Die Aktivierung war spezifisch für den individuellen H. pylori Stamm des Patienten und war abhängig von der Anwesenheit normaler T-Zellen in der Kultur.

Magenkarzinom

Das Magenkarzinom wird histologisch nach der WHO-Klassifikation in verschiedene Subtypen unterteilt. Es werden das undifferenzierte, das kleinzellige, das adeno-squamöse, das Plattenepithel- und das Siegelringkarzinom unterschieden. Außerdem wird in der Gruppe der Adenokarzinome der papilläre, tubuläre und der muzinöse Typ unterschieden (Herold, G. 2000).

Nach dem Wachstumsmuster werden in der Laurèn-Klassifikation drei unterschiedliche Ausbreitungsformen unterschieden. Der expansiv wachsende und der gut begrenzte intestinale Typ, der infiltrativ wachsende, schlecht begrenzte diffuse Typ und der Mischtyp als Kombination beider zuvor genannter Typen (Herold, G. 2000). 35% der Magenkarzinome liegen im Antrum, 30% in der kleinen Kurvatur, 25% in der Kardia und 10% verteilen sich über den übrigen Magen.

Das Magenkarzinom hat in Deutschland eine Inzidenz von 20 pro 100 000 Einwohner (Herold, G. 2000). Weltweit kommt es am häufigsten in China und Japan vor. Der Altersgipfel liegt jenseits des 50. Lebensjahres. Männer sind fast doppelt so häufig betroffen wie Frauen. Die klinische Symptomatik ist meist diskret und unbestimmt.

Im Zusammenhang mit dem Magenkarzinom wurde H. pylori 1994 von der International Agency for Research on Cancer der WHO in die Gruppe I der definitiven Karzinogene eingeordnet (Logan, R. P. 1994; International Agency for Research on Cancer 1994).

Eine exakte Aufklärung der durch H. pylori induzierten Karzinogenese steht noch aus. Man geht heute jedoch davon aus, daß H. pylori mutagene Effekte auslösen kann und es dadurch über die intestinale Metaplasie zur Dysplasie und zur Entwicklung des Magenkarzinoms kommen kann.

Therapie einer Helicobacter pylori Infektion Indikation zur Therapie einer Helicobacter pylori Infektion

Die Indikation zur Therapie einer H. pylori Infektion ist gegenwärtig in Teilbereichen noch Gegenstand der Diskussion. Sowohl in Amerika (National Institutes of Health Guidelines 1997) als auch in Europa (The European Helicobacter Study Group, 2000) gilt es jedoch als unstrittig, daß bei folgenden Erkrankungen, bei Nachweis von H. pylori, die Indikation zur Eradikationstherapie gegeben ist:

  1. Ulkuskrankheit (aktiv oder in der Anamnese)

  2. MALT Lymphom

Darüber hinaus empfiehlt die European Helicobacter Study Group eine Eradikationstherapie bei atrophischer Gastritis sowie bei Verwandten ersten Grades von Patienten mit Magenkarzinom und H. pylori Nachweis. Auch nach der Operation eines Magenkarzinoms wird eine Therapie empfohlen (The European Helicobacter Study Group, 2000).

 Therapieregime

Eine Vielzahl von Therapieregimen zur Eradikation einer H. pylori Infektion stehen zur Verfügung. Neben einer Monotherapie (Wismutsalz oder Antibiotikum), einer Dualtherapie (Wismutsalz und Antibiotikum) und einer Quadrupeltherapie (Wismutsalz plus Protonen-Pumpen-Inhibitor (PPI) plus zwei Antibiotika), gibt es unterschiedliche Tripeltherapien. Bei einer Tripeltherapie wird ein PPI, wie z.B. Omeprazol, mit zwei Antibiotika kombiniert. Folgende Kombinationen stehen zur Verfügung:

Italian-Tripel-Therapie:PPI plus Clarithromycin plus Metronidazol

French-Tripel-Therapie:PPI plus Clarithromycin plus Amoxicillin

English-Tripel-Therapie:PPI plus Amoxicillin plus Metronidazol

Die Methode erster Wahl ist die Frech-Tripeltherapie aus Clarithromycin plus Amoxicillin plus einem Protonenpumpeninhibitor über sieben Tage (The European Helicobacter Study Group, 2000). Alternativ zu Clarithromycin kann auch Metronidazol verabreicht werden (English-Tripel-Therapie).

Mit diesem Therapieregime werden abhängig von der Dosierung der einzelnen Antibiotika Eradikationsraten zwischen 80 und 91% erreicht (Lind, T. et al. 1996; MACH-1-Studie; (Metronidazol, Amoxicillin, Clarithromycin, H. pylori)).

Dabei hat sich in der Therapie der Ulkuskrankheit gezeigt, daß eine erfolgreiche Eradikation von H. pylori neben einer beschleunigten Heilung v.a. zu einer signifikanten Senkung der Rezidivrate geführt hat (Axon, A.T. et al. 1997).

Auch bei der Therapie niedrigmaligner MALT-Lymphome hat die Eradikation einer H. pylori Infektion zum Teil sogar zur kompletten und längerfristigen Remission des Lymphoms geführt (Bayerdorffer, E. et al. 1995).

 Resistenzen

Neben einer erhöhten Anzahl von Nebenwirkungen (im Vergleich zu einer Therapie mit nur einem Antibiotikum plus Protonenpumpeninhibitor) (Bell, G.D. et al. 1992) und der damit verbundenen verminderten Patientencompliance stellt v.a. die Entwicklung von Resistenzen von H. pylori gegen Antibiotika ein Problem dar. In einer Untersuchung zur Resistenzlage von H. pylori bei 188 Patienten wurde bei 2,1% der untersuchten Stämme eine Resistenz gegen Clarithromycin und bei 32% der Stämme eine Resistenz gegen Metronidazol ermittelt (Kist, M. 1991).

Bei primären Therapieversagern erhöhte sich allerdings die Resistenzlage gegenüber Clarithromycin bei einer Untersuchung 58% bzw. 49% und gegenüber Metronidazol auf 75% bzw. 66% (Heep, M. et al. 2000).

Für den klinischen Alltag von Bedeutung ist dabei v.a. die Resistenz gegen das Antibiotikum Clarithromycin. So sinkt die Eradikationsrate bei Clarithromycinresistenz von H. pylori auf insgesamt 55% (Dore, M. P. et al. 2000), was einer Verminderung der Therapieeffizienz um ungefähr 30-40% entsprechen würde.

Houben, M.H. et al. gehen in einer Metaanalyse verschiedener Studien sogar von einer durchschnittlichen Verminderung des Therapieerfolgs um 56% bei Clarithromycin-resistenz aus (Houben, M.H. et al. 1999).

Clancy R. et al. konnten in einer Analyse verschiedener Studien zeigen, daß es zu einer deutlichen Zunahme der Resistenz gegenüber Clarithromycin gekommen ist. So wurden im Zeitraum zwischen 1985 und 1990 durchschnittlich 0-2% primäre Resistenzen gefunden, während es im Zeitraum zwischen 1995 und 2000 bereits zwischen 8 und 15% primäre Resistenzen von H. pylori gegenüber Clarithromycin waren. Besorgniserregend war auch die Zunahme sekundärer Resistenzen (Resistenzen, die unter Therapie entstanden sind) auf bis zu 25% in einer amerikanischen Studie in einem Zeitraum von nur drei Jahren (Clancy R. et al. 2000).

Bei einer alleinigen Metronidazol-Resistenz kann mit der beschriebenen Tripeltherapie immerhin noch eine Eradikationsrate von 75% erreicht werden (Megraud, F. et al. 1998).

Liegt allerdings eine Resistenz sowohl gegen Clarithromycin als auch gegen Metronidazol vor, so scheint eine erfolgreiche Eradikationstherapie schwierig bis unmöglich zu sein (De Boer, W. A. 2000).
Ökonomische Aspekte einer Helicobacter pylori Therapie

Die Kosten einer Eradikationstherapie liegen etwa im Bereich von 135 DM und 265DM.

Im Vergleich dazu kostet eine Schluckimpfung mit Typhoral®, dem Vektor des hier beschriebenen Impfstammes 38.23DM. Durch eine Impfung zur Eradikation einer H. pylori Therapie könnten also die Kosten um das 3.5 bis 6.9 fache reduziert werden. Ein protektiver Impfstoff könnte zusätzlich Kosten vermeiden, indem die Inzidenzen und damit die direkten und indirekten Kosten H. pylori assoziierter Krankheiten vermindert werden könnten.

Rupnow et al. gehen sogar davon aus, daß die Entwicklung und der Gebrauch eines Impfstoffes gegen H. pylori mehr Vorteile für das Gesundheitswesen bringen würde als herkömmliche Impfstoffe wie z.B. der Impfstoff gegen Hepatitis B (Rupnow, M. F. et al. 1999).

Die Schwierigkeiten bei primärem Versagen der Eradikationstherapie, die in den meisten Ländern zunehmenden Antibiotikaresistenzen von H. pylori (Graham, D. Y 1998), der hohe Verbreitungsgrad von H. pylori, der eine flächendeckende Therapie mit Antibiotika unmöglich macht und die zu erwartenden Einsparungen durch den Einsatz einer Vakzine haben bereits früh zu Bemühungen um die Entwicklung eines Impfstoffes geführt. Zusätzlich bietet die Entwicklung eines effizienten Impfsystems nicht nur eine alternative Therapie gegen H. pylori, sondern gegen Infektionen im Gastrointestinaltrakt allgemein.

Impfstoff

Bei den gebräuchlichen Impfstoffen zur aktiven Immunisierung lassen sich hauptsächlich zwei Prinzipien unterscheiden. Erstens die aktive Immunisierung mit einem attenuierten oder inaktivierten bakteriellen oder viralen Impfstoff. Beispiele hierfür sind die Impfstoffe gegen Masern, Mumps, Röteln oder Tuberkulose. Zweitens die Verwendung von Impfstoffen aus gereinigten oder synthetischen Antigenen, wie z.B. der Kombinations-Impfstoff gegen Diphtherie, Pertussis, Tetanus.

H. pylori gelingt es allerdings, trotz nachgewiesener Stimulation der Immunantwort des Wirtes, im Magen zu persistieren. Ein Impfstoff gegen H. pylori hat damit die Aufgabe, die Immunantwort so zu modifizieren, daß ein wirksamerer Schutz gegenüber einer Infektion mit H. pylori entsteht (prophylaktische Impfung), bzw., daß es dem menschlichen Immunsystem gelingt eine bereits bestehende H. pylori Infektion zu eliminieren (therapeutische Impfung).

Die meisten Studien zur Entwicklung von therapeutischen oder prophylaktischen Impfstoffen gegen H. pylori wurden in Tiermodellen durchgeführt. Als die hier beschriebene Studie stattfand, gab es erst zwei Publikationen von Humanstudien (s. u.), zwei weitere Humanstudien wurden nach Abschluß der hier beschriebenen Studie veröffentlicht (s. Diskussion).

Impfstudien an Tieren

Helicobacter-Impfstudien wurden an unterschiedlichen Tieren unter Verwendung unterschiedlicher Impfantigene durchgeführt. Das meistgebrauchte Tiermodell ist dabei die Maus.

Impfungen wurden mit einem Impfantigen allein (Michetti, P. et al. 1994), mit Impfantigen in Kombination mit einem stimulierendem Adjuvans (Ferrero, R. L.. et al. 1995) und mit H. pylori-Antigene exprimierenden, attenuierten Salmonellen durchgeführt (Gòmez-Duarte, O. G.et al. 1998). Alternativ wurde auch eine DNA Vakzinierung unternommen (Miyashita, M. et al. 2002).

Als Impfantigen wurden z.B. Urease (Michetti, P. et al. 1994), Katalase (Radcliff, F. J. et al. 1997), Hitzeschockproteine (Ferrero, R. L et al. 1995), VacA (Marchetti, M. et al. 1995) u.a. verwendet.

Das Cholera Toxin, das Hitze labile Enterotoxin von E. coli aber auch Aluminium Hydroxid dienten u.a. als Adjuvans (Del Giudice, G. et al. 2001).

Die Arbeit von Michetti et al., Ferrero et al. und Gòmez-Duarte et al. sollen exemplarisch für die Vielzahl von Untersuchungen im Tiemodell vorgestellt werden. Alle drei Autoren führten Ihre Studien an Mäusen durch und verwendeten als Impfantigen Urease von H. pylori.

Michetti et al. immunisierten BALB/c Mäuse mit Urease (rekombinant und nativ). Nach der Impfung wurden die Mäuse mit Helicobacter felis infiziert.

Es konnte gezeigt werden, daß, im Vergleich zur ungeimpften Kontrollgruppe, signifikant weniger geimpfte Mäuse eine Kolonisation des Magens mit Helicobacter felis aufwiesen. Dies zeigte, daß Mäuse durch die orale Immunisierung mit Urease von H. pylorigegenüber einer Infektion mit Helicobacter felis geschützt werden, und daß beide Urease- Untereinheiten (A und B) protektive Epitope enthalten. Allerdings war die Rate der Protektion relativ gering (60% Protektion nach 70 Tagen bei Impfung mit Ureaseuntereinheit A und 80% Protektion bei Impfung mit Ureaseuntereinheit B) (Michetti, P. et al. 1994).

Ferrero et al. verabreichten als Impfstoff eine Kombination aus Hitzeschockprotein und Urease. Das Hitzeschockprotein diente hierbei als Adjuvans, das die Immunreaktion gegen die Urease verstärken sollte. Mit diesem Modell wurde eine hundertprozentige Protektion gegenüber einer anschließenden Infektion der Mäuse mit Helicobacter felis erzielt (Ferrero, R. L. et al. 1995).

Ebenfalls eine hundertprozentige Protektion gegenüber einer Infektion mit H. pylori erreichten Gòmez-Duarte et al. durch Impfung von Balb/c Mäusen mit einem Salmonella typhimurium Stamm, der dieUrease Untereinheiten A und B exprimierte.

(Gòmez-Duarte, O. G.et al. 1998). Salmonella typhimurium wurde dabei als Vektor oder Adjuvans verwendet, um die Immunantwort gegen Urease zu verstärken. Basierend auf der Arbeit von Gòmez-Duarte et al. wurde das Impfmodell am Menschen entwickelt, das in dieser Arbeit vorgestellt wird.

humane Impfstudien

Die Arbeiten von Kreiss et al. und Michetti et al. waren die einzigen humanen Impfstudien, die zum Zeitpunkt der Entwicklung unseres Impfstoffes veröffentlicht waren. Während der Auswertung unserer Ergebnisse wurden zwei weitere Studien (Di Petrillio et al. und Angelakopoulos et al.) publiziert, die in der Diskussion zu dieser Arbeit besprochen werden.

Kreiss et al. führten eine klinische Phase I Studie mit Verabreichung von rekombinanter Urease an Erwachsenen mit asymptomatischer H. pylori Infektion durch (Kreiss, C. et al. 1996). Eine Wirksamkeit dieses Impfstoffes gegenüber der H. pylori Infektion konnte nicht festgestellt werden. Die Ursache hierfür liegt sicherlich darin, daß die Immunantwort des Wirtes auf die Urease nicht mit Hilfe eines Adjuvans so verstärkt bzw. modifiziert wurde, daß die Elimination der H. pylori Infektion möglich wurde.

Michetti et al. verabreichten in einer Plazebo kontrollierten Studie Urease von H. pylori zusammen mit hitzelabiles Enterotoxin (LT) von Escherichia colian insgesamt 26 Probanden. LTwurde dabei als Adjuvans verwendet. In dieser Studie sollte die Wirksamkeit einer therapeutischen Vakzinierung evaluiert werden. Deshalb waren alle Probanden zum Zeitpunkt der Studie H. pylori positiv, allerdings zeigten sie keine klinischen Symptome. Bei allen Probanden der Verum-Gruppe konnte eine dosisabhängige Zunahme der anti-Urease Serum IgA (Elisa-Test) und der IgA-produzierenden B-Zellen (B-Zell-Elispot) festgestellt werden, was zu einem signifikanten Abfall der Bakteriendichte im Magen der Probanden führte. Eine Eradikation der H. pylori Infektion konnte bei keinem der Probanden festgestellt werden und bei 62,5% der Probanden wurde als Nebenwirkung Diarrhö beobachtet (Michetti, P et al. 1999).

In den vorgestellten Studien gelang es also nicht, einen wirksamen und nebenwirkungsarmen Impfstoff gegen H. pylori zu entwickeln. Basierend auf diesen Daten entschied sich unserer Gruppe für die Entwicklung eines Impfstoffes der die beiden Prinzipien bisheriger Impfmodelle –attenuierter Organismus und aufgereinigtes Antigen- vereinigt. Dazu wurde ein attenuierter Organismus verwendet, der als Vektor dient. Dieser Organismus exprimiert ein Fremdantigen gegen das die Immunantwort induziert, modifiziert oder verstärkt werden soll.

Die Vorteile dieses Systems sind:

  1. Antigen und Adjuvans sind aneinander gekoppelt

  2. durch den Vektor wird das Fremdantigen dem Immunsystems des Wirtes zugänglicher gemacht

  3. durch die Antigenstrukturen des Vektors wird die Immunantwort gegen das Fremdantigen verstärkt. Der Vektor dient dabei als Adjuvans.

  4. durch die spezifischen Eigenschaften des Vektors kann die Immunantwort gegen das Fremdantigen modifiziert werden.

Als Antigen wurde Urease von H. pylori benutzt, als Vektor Salmonella typhi (S. typhi) Ty21a.

Urease als Antigen

Es gibt mehrere Punkte, die für das von H. pylori produzierte Enzym Urease als Antigen zur Impfstoffentwicklung sprechen.

  1. Das Enzym Urease ist hoch konserviert, d.h. Urease liegt sowohl in verschiedenen Stämmen von H. pylori als auch in verschiedenen Spezies von Helicobacter stets in derselben Form vor und muß somit für die Spezies Helicobacter eine wichtige Rolle spielen (Dunn, B. E et al. 1990; Hu, L. T. et al. 1990).

  2. Das Enzym Urease befindet sich an der Oberfläche des Bakteriums oder wird von diesem sezerniert und ist damit der Immunantwort des Wirtes zugänglich (Mobley, H. T. L. et al. 1995).

  3. Wie oben bereits beschrieben, ermöglicht die Urease H. pylori die Kolonisation im sauren Milieu des Magens und ist damit als wichtiger Virulenzfaktor für H. pylori anzusehen (Solnick, J. V. et al. 1995; Segal, E. D. et al. 1992).

  4. Eine Protektion gegen eine H. pylori Infektion durch Immunisierung mit Urease im Mausmodell konnte bereits 1994 nachgewiesen werden (Michetti, P. et al. 1994).

Eine Immunisierung gegen Urease als Antigen könnte somit einen effektiven Schutz gegen eine Infektion mit H. pylori darstellen bzw. eine alternative Therapiemöglichkeit gegen eine bereits bestehende H. pylori Infektion sein.

Salmonella typhi als Adjuvans

Als Adjuvans für die Impfung beim Menschen bietet sich der Salmonellenstamm Ty21a an. Ty21a wird weltweit als Impfstoff gegen Typhus eingesetzt. Es handelt sich dabei um S. typhi, Stamm Ty21a Berna, der von der Firma Chiron BehringGmbH&Co unter dem Handelsnamen Typhoral L vertrieben wird.

Die Verwendung von Ty21a als Adjuvans und Vektor für Fremdantigene hat dabei folgende Vorteile:

  1. Die orale Verabreichung ermöglicht eine leichte Handhabung des Impfstoffes

  2. Die breite Immunantwort, die durch diesen Impfstamm induziert wird, beinhaltet sowohl humorale (sekretorisches IgA, Serum IgM/A/G) als auch die zellvermittelte (spezifische T-Zellen) Bestandteile (Viret, J. F. et al. 1999).

  3. Die langjährigen Erfahrungen mit dem Impfstamm sind in einer Vielzahl von Untersuchungen über Immunogenität und Toxizität dokumentiert. Eine Metaanalyse von insgesamt 17 Studien über Effektivität und Toxizität dieser Vakzine bei insgesamt 1866951 Personen ergab, daß im Anschluß an die Impfung als Nebenwirkungen v.a. leichter Durchfall (5,1% der Personen), Erbrechen (2.1% der Personen) und erhöhte Temperatur (2% der Personen) auftraten (Engels, A. et al. 1998). Die kumulative drei-Jahres Effektivität betrug 51% für S. typhi Ty21a.

  4. Schwere Nebenwirkungen wurden selbst bei Verabreichung von 1011 Lebendorganismen nicht verzeichnet (Gilman, R. H. et al. 1977).

  5. Die Methoden zur genetischen Manipulation von S. typhi sind bekannt und erprobt. So können Plasmid-Vektoren, die für den Gebrauch in Escherichia coli entwickelt wurden, generell auch für Salmonellen benutzt werden (Levine, M. M. et al. 1990). Es existieren Methoden um diese Plasmide zu stabilisieren (Nakayama, K. et al. 1988) und Techniken, um fremde DNA in das Chromosom von Salmonella typhi zu integrieren, sind verfügbar (Hone, D. et al. 1988)

  6. Der Einsatz von S. typhi Ty21a als Adjuvans und „carrier“ für Fremdproteine wurde bereits in mehreren Studien evaluiert. S. typhi Ty21a diente hierbei als Carrier und Adjuvans für Antigene von Vibrio cholerae, Steptococcus mutans, Shigella sonnei, Escherichia coli, Mycobacterium leprae, Plasmodium falciparum, Francisella tularensis, Schistosoma mansoni und Hepatitis-B-Virus (Levine, M. M. et al. 1990; Herrington, D. A. et al. 1990; Tacket, C. O. et al. 1997).

Die relativ geringe Wirksamkeit, die sich in der oben erwähnten Metaanalyse ergab, hängt v.a. damit zusammen, daß unterschiedliche Verabreichungsschemata benutzt wurden. So wurde bei Verwendung von in Bikarbonat suspendierten Lebend-organismen als Impfstoff eine Wirksamkeit von 96% ermittelt (Untersuchung in Ägypten 1982 an 16 486 Personen) während bei der Verwendung von sog. „enteric coated capsule“ nur eine Wirksamkeit von 16% erreicht wurde (Untersuchung in Chile 1990 an 27 618 Personen) (Engels, A. et al. 1998). In einem direkten Vergleich in einer Untersuchung in Chile konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Hier konnte mit der Suspension eine Protektion von 77% erreicht werden, während die von sog. „enteric coated capsule“ nur eine Protektion von 33% erzielten (Levine, M. M. et al. 1990)

Trotz der in der Metaanalyse ermittelten geringen Wirksamkeit dieses Lebend-impfstoffes wird eine Verwendung im Rahmen des Public Health Programms zur Kontrolle des Typhus diskutiert (Ivanoff, B. et al. 1994).
Fragestellung

Aufbauend auf den Ergebnissen von Gomez und Duarte et al. (Gòmez-Duarte, O. G. et al. 1998) war der nächste Schritt die Erprobung dieses Impfstoffes aus S. typhi Ty21a alsVektor und Urease von H. pylori als Antigen am Menschen. Die von uns konzipierte Untersuchung hatte dabei zum Ziel, die Verträglichkeit und Immunogenität des Impfstoffes S. typhi Ty21a(pDB1) zu beurteilen. Dazu wurde der Impfstoff an 12 gesunde Probanden verabreicht und mittels immunologischer Untersuchungen die Immunantwort des menschlichen Organismus auf diesen Impfstoff überprüft und durch klinische Beobachtung und hämatologischer Untersuchungen die Nebenwirkungen beobachtet.

Im einzelnen sollten durch diese Untersuchung folgende Fragestellungen gelöst werden:

  1. Führt die Verabreichung des rekombinanten Impfstoffes zu qualitativ oder quantitativ veränderten Nebenwirkungen im Vergleich zum Nebenwirkungsprofil des Vektors?

  2. Kommt es durch den Kontakt zwischen Impfstoff und Organismus des Wirtes zu Veränderungen des Impfstoffes, kommt es also im Kontakt mit der Mucosa oder dem Immunsystems des Menschen zu Veränderungen der Plasmidstabilität?

  3. Läßt sich durch diesen Impfstoff eine meßbare Stimulation des Immunsystems als Reaktion sowohl auf den Vektor als auch auf das Fremdantigen detektieren, lassen sich also die Ergebnisse der Studien im Tiermodell (Gòmez-Duarte et al.) auf das humane System übertragen?

  4. Wie sieht das Profil der Immunantwort aus? Läßt sich durch die Verwendung des Impfstoffes eine zelluläre Immunantwort gegen Urease induzieren?