Pilotstudie zur Evaluierung eines Impfstoffes mit Salmonella typhi Ty21a als Träger für rekombinante Urease von Helicobacter pylori Oliver Palme I.I.1-2I.2-3I.2-1.i)4ii)iii)5I.3-67618#463I.3-1.8I.3-2.i)910ii)11I.4-12I.4-1.I.4-2.13I.4-3.14I.4-4.15I.5-I.5-1.16I.5-2.I.5-3.17I.6-18I.7-19I.7-1.20I.7-2.21I.7-3.22I.7-4.23I.8-2425II.II.1-II.1-1.i)Native UreaseRekombinante Urease26ii)II.1-2.II.1-3.27II.1-4.28II.1-5.29II.1-6.30II.2-31II.2-1.32i)ii)iii)33iv)34v)35II.2-2.i)36ii)II.2-3.37II.2-4.3839II.2-5.40II.2-6.4142II.2-7.43i)44ii)45III.46III.1-47III.2-III.3-48III.3-1.i)49619#411619#412ii)50III.3-2.i)51619#412619#412ii)52III.4-III.4-1.i)53619#412ii)54619#357619#350III.4-2.55i)56618#384ii)57619#412619#412III.4-3.58i)59619#412ii)60619#41261IV.IV.1-626364IV.2-6566IV.3-67IV.3-1.6869707172IV.3-2.73747576777879IV.3-3.80818283IV.3-4.848586V.87Abkürzungsverzeichnis 1 VI Referenzen888990919293949596979899100101102103104105106 VII Danksagung107 VIII Anhang108109110111112618#463113IX Eidesstattliche Erklärung X Lebenslauf114deInhaltsverzeichnisHilfe Ergebnisse
Wachstumskurve und Anzahl der verabreichten Bakterien

Im Vorfeld der Untersuchung wurde eine Wachstumskurve erstellt, um die OD zu bestimmen, bei der die gewünschte Bakteriendichte zur Verabreichung an die Probanden vorhanden ist, und die Zeit zu ermitteln, die Impf- und Kontrollstamm benötigen um eben diese OD zu erreichen.

Als Impfdosis wurde eine Anzahl zwischen 1x109 und 1x1010 cfu pro Proband sowohl für den Impfstamm S. typhi Ty21a(pDB1) als auch für den Kontrollstamm S. typhi Ty21a angestrebt.

Nach der Auswertung der Wachstumskurven stellte sich heraus, daß bei einer OD (600nm) von 0.96 ca. 3,2 x 108 cfu/ml des Impfstammes S. typhi Ty21a(pDB1)und bei einer OD von 0.97 ca. 7,6 x 109 cfu/ml des Kontrollstammes S. typhi Ty21avorhanden sind.

Berechnet man den Verlust an lebensfähigen Organismen von ca. 40% durch die Zentrifugation (4500rpm, 5min bei 20°C) und die Konzentrierung durch Aufnahme in ein kleineres Volumen, so muß ein Volumen von 1,2ml je Proband der Suspension mit S. typhi Ty21aund ein Volumen von 4ml je Proband der Suspension mit S. typhi Ty21a(pDB1) verabreicht werden. Dies entsprach 7,5 x 109 cfu des Kontrollstammes S. typhi Ty21aund 7,6 x 109 des Impfstammes S. typhi Ty21a.

Der Kontrollstamm Salmonella typhi Ty21a benötigte eine Zeit von ca. 14 Stunden bis zu einer OD von 0.97. Der Impfstamm S. typhi Ty21a(pDB1) benötigte eine Zeit von ca. 15.5 Stunden bis zu einer OD von 0.96.

Die tatsächliche Anzahl der verabreichten Bakterien wurde an jedem Impftag nach Anzucht im Schüttler mittels einer Titrierung bestimmt.

Die Titrierung hatte jeweils den Verdünnungsfaktor 10. Die Bakterien wurden auf LB-Platten (LB Agar, Cat.-No.: 22700-025; Life Technologies) ausgestrichen. Im Brutschrank bei 37°C und einer Luftfeuchtigkeit von 5% für 24 Stunden bebrütet und danach ausgezählt.

Nach der Auszählung der Platten stellte sich heraus, daß an Tag null 6x109, an Tag zwei 7x109, und an Tag vier 9x109 cfu verabreicht wurden.

Die Impfdosis lag also an allen drei Tagen im von uns angestrebten Intervall von 1x109 bis 1x1010 cfu.

Sowohl der Kontrollstamm S. typhi Ty 21a als auch der Impfstamm S. typhi Ty21a(pDB1) bildeten im Ausstrich lebensfähige Kolonien.

Nebenwirkungen

Keiner der Probanden klagte über schwere Nebenwirkungen. In keinem der Fälle konnte Fieber oder eine andere systemische Beeinträchtigung durch den Impfstamm beobachtet werden.

Sonstige Nebenwirkungen:

Proband-Nr.:

Tag der Studie

Art der Nebenwirkung:

4

7

abdominelle Tenesmen und Kopfschmerzen

9

0

abdominelle Tenesmen und leichte Diarrhö

10

4

Kopfschmerzen

12

0 und 2

Kopfschmerzen

Keines der angegebenen Symptome wurden subjektiv von den Probanden als schwerwiegend bezeichnet und keines der Symptome persistierten für länger als 24 Stunden.

Die Probanden-Nr. 9, 10 und 12 sind Frauen, Proband-Nr. 4 ist männlich.

Anamnese und körperliche Untersuchung sowie die Bestimmung hämatologischer (Blutbild) und klinisch-chemischer (Kreatinin, S-GOT, S-GTP) Blutparameter ergaben zu keinem Zeitpunkt pathologische Werte.

Aus den Stuhlproben konnte weder der Impfstamm S. typhi Ty21a(pDB1) noch der Kontrollstamm S. typhi Ty21a angezüchtet werden.

humorale Immunantwort B-Zell- Elispot

Die Ergebnisse des B-Zell-Elispot werden getrennt nach der Antwort auf die spezifischen Antigene dargestellt. Zuerst wird die Immunantwort der B-Zellen auf den Trägerstamm, d.h. gegen Salmonellen-O-Antigen und Salmonellen-LPS, dann die Immunantwort gegen native und rekombinante Urease dargestellt.

Immunreaktion gegen Salmonellen-O-Antigen und Salmonellen-LPS im B-Zell-Elispot

Antikörper sezernierende Zellen (ASZ) gegen Salmonellen-O-Antigen und/oder Salmonellen-LPSwurden in 10 von 12 Probanden gefunden (=83%).

Bei 10 Probanden konnte eine Immunantwort gegen LPS nachgewiesen werden (Proband-Nr.: 1-4, 6-8, 10-12) und bei 9 Probanden gegen Salmonellen-O-Antigen (Proband-Nr.: 2-4, 6-8, 10-12). Proband-Nr. 1 reagierte im B-Zell-Elispot nur auf das LPS von S. typhi nicht jedoch gegen das O-Antigen.

Die mittlere Anzahl detektierter spots an Tag 0, dem Tag vor Verimpfung und damit dem Nullwert, betrug ein spot pro 1 Million PBMZ mit einem Intervall von 0-9 spots/Mio. PBMZ.

Die mittlere Anzahl detektierter spots an Tag 7 entsprach im arithmetischen Mittel 84 spots/Mio. PBMZ mit einem Intervall von 8-352 spots/Mio. PBMZ für Salmonellen LPS und 78 spots/Mio. PBMZ mit einem Intervall von 4-387 für das O-Antigen.

An Tag 14 der Studie waren keine ASZ im peripheren Blut mehr nachweisbar.

In den Negativkontrollen (no coating) waren im Mittel 2 spots/Mio. PBMZ auffindbar mit einem Intervall von 0-6 spots/Mio. PBMZ. In den Positivkontrollen im Mittel 657 spots/Mio. PBMZ mit einem Intervall von 38 – 5025 spots/Mio. PBMZ.

Mehr als 10 spots pro well wurden als positives Ergebnis angesehen. Dies entspricht dem arithmetischen Mittelwert der Negativkontrollen plus der dreifachen Standardabweichung.

Siehe Tabelle 1, Anhang

Abb. 2: B-Zell-Elispot: O-Antigen

Abb. 3: B-Zell-Elispot: LPS

Immunreaktion gegen native und rekombinante Urease im B-Zell-Elispot

Plasmazellen, die spezifische Antikörper gegen native oder rekombinante Urease produzieren, konnten weder an Tag 7 noch an Tag 14 der Studie im B-Zell-Elispot nachgewiesen werden.

Siehe Tabelle 1, Anhang

 Elisa

Zur Auswertung des Elisa wurden Tag 0 und Tag 28 der Studie verglichen.

Als signifikante Erhöhung der Antikörperproduktion (IgG) wurde eine Zunahme der OD bei einer Wellenlänge von 450nm um jeweils den Mittelwert plus drei Standardabweichungen der Negativkontrollen gewertet.

Antikörper im Serum gegen Salmonellen-O-Antigen und Salmonellen LPS

Eine signifikante Erhöhung der OD zwischen Tag 0 und Tag 28 der Studie als Zeichen einer Zunahme spezifischer Antikörper der Subklasse G konnte bei zwei Probanden nachgewiesen werden (Proband-Nr.: 3, 11; =16%).

Beide Probanden hatten einen signifikanten Anstieg der spezifischen Antikörper gegen Salmonellen-O-Antigen und Salmonellen-LPS.

Als Serokonversion wurde eine Erhöhung der OD um 0.2 für Salmonellen-O-Antigen und für Salmonellen-LPS gewertet. Eine OD-Erhöhung um 0,2 entspricht dem Mittelwert der Negativkontrollen plus drei Standardabweichungen.

Proband-Nr.5 hatte an Tag 0 der Studie sowohl für Salmonellen-O-Antigen als auch für Salmonellen-LPS eine OD, die oberhalb von 0.2 (O-Antigen: Proband-Nr.5, Tag 0: OD=0,310; LPS: Proband-Nr.5, Tag 0, OD=0,222) lag und im Verlauf der Studie keine signifikante Erhöhung der OD.

Siehe Tabelle 2, Anhang

Abb. 4: Elisa: O-Antigen

Abb. 5: Elisa: LPS

Antikörper im Serum gegen native und rekombinante Urease

Eine signifikante Erhöhung der OD zwischen Tag 0 und Tag 28 der Studie als Zeichen einer Zunahme spezifischer Antikörper der Subklasse G gegen native oder rekombinante Urease konnte bei keinem der zwölf Probanden nachgewiesen werden.
zelluläre Immunantwort T-Zell-Elispot

Die Ergebnisse des T-Zell-Elispots werden ebenfalls getrennt nach Antigenen dargestellt. Zuerst soll die spezifische Immunantwort auf die Antigene des Trägerstamms, d.h. gegen Salmonellen-H- und Salmonellen-O-Antigen, dargestellt werden, danach die spezifische Immunantwort auf native und rekombinante Urease.

Immunreaktion gegen das Salmonellen-H-Antigen im T-Zell-Elispot

Signifikante IFN-γ Produktion als ein Marker einer spezifischen T-Zell-Stimulierung auf Salmonellen-H-Antigen konnte im T-Zell-Elispot bei zwei von 12 Probanden (Proband-Nr.: 2, 10; =16,7%) nachgewiesen werden.

Vor der Verabreichung des Impfstoffes, also an Tag 0 der Studie waren im Mittel 7 spots/Mio. PBMZ für das Salmonellen-H-Antigen (Intervall. 2-17 spots/Mio. PBMZ) nachweisbar. An Tag 28 der Studie konnten im Mittel 13 spots/Mio. PBMZ für das Salmonellen-H-Antigen (Intervall: 8-21spots/Mio. PBMZ) nachgewiesen werden.

In den Negativkontrollen - den unstimulierten wells - lag die durchschnittliche Zahl der spots bei 7 spots/Mio. PBMZ mit einem Intervall von 1-16 spots/Mio. PBMZ.

Als positive Reaktion auf Salmonellen-H-Antigen wurden mehr als 20 spots/Mio. PBMZ gewertet. 20 spots/Mio. PBMZ entsprechen dem arithmetischen Mittelwert der Negativkontrollen plus drei Standardabweichungen.

Siehe Tabelle 3, Anhang

Abb. 6: T-Zell-Elispot: H-Antigen

Immunreaktion gegen native und rekombinante Urease im T-Zell-Elispot

Eine signifikante IFN-γ Produktion als ein Marker einer spezifischen T-Zell-Stimulierung auf rekombinante Urease konnte bei vier von zwölf Probanden nachgewiesen werden (Proband-Nr.:2, 5, 10, 11; =33,3%). Auf native Urease reagierten im T-Zell-Elispot drei von zwölf Probanden (Proband-Nr.: 2, 4, 7; =25%).

An Tag 0 der Studie waren im Mittel 6 spots/Mio. PBMZ bei Stimulation mit rekombinanter Urease nachweisbar und 3 spots/Mio. PBMZ bei Stimulation mit nativer Urease.

An Tag 28 der Studie lag der arithmetische Mittelwert aller Probanden bei Stimulation mit rekombinanter Urease bei 17 spots/Mio. PBMZ und bei Stimulation mit nativer Urease bei 19 spots/Mio. PBMZ.

Proband-Nr. 10 verzeichnete bei Stimulation mit rekombinanter Urease die größte Zunahme an spots (Tag 0: 7 spots/Mio. PBMZ; Tag 28: 30 spots/Mio. PBMZ).

Proband-Nr. 2 hatte bei Stimulation mit nativer Urease die größte Zunahme (Tag 0: 2 spots/Mio. PBMZ; Tag 28: 45 spots/Mio. PBMZ).

Als positive Reaktion auf rekombinante bzw. native Urease wurden mehr als 20 spots/Mio. PBMZ gewertet. 20spots/Mio. PBMZ entspricht dem arithmetischen Mittelwert der negativ Kontrollen plus drei Standardabweichungen.

Siehe Tabelle 3, Anhang

Abb. 7: T-Zell-Elispot: native Urease

Abb. 8: T-Zell-Elispot: rekombinante Urease

Proliferationsassay Immunreaktion gegen das Salmonellen-H-Antigen im Proliferationsassay

Eine signifikante Erhöhung der Radioaktivität (gemessen in cpm) als Marker einer spezifischen Reaktion auf das Salmonellen-H-Antigen konnte im Proliferatiosassay bei drei von zwölf Probanden nachgewiesen werden (Proband-Nr.: 1, 3, 5; = 25%).

Vor Verabreichung des Impfstoffes, also an Tag 0 der Studie, betrug die Radioaktivität im arithmetischen Mittel 3928,71 cpm (mit einem Intervall von 596,30 – 12943,80 cpm) für das Salmonellen-H-Antigen.

An Tag 28 der Studie betrug die Radioaktivität im arithmetischen Mittel 5104,33 cpm (Intervall: 593 – 12794,90 cpm) für das Salmonellen-H-Antigen.

Eine positive Reaktion wurde als eine Erhöhung der cpm um mindestens das Dreifache im Vergleich zu den Negativkontrollen definiert.

Der Quotient aus cpm bei Stimulation mit dem spezifischen Antigen und cpm ohne Stimulation (Negativkontrollen) ist der sog. Stimulationsindex (=SI).

Ein SI von größer oder gleich drei ist damit eine positive Reaktion.

Proband-Nr. 5 zeigte auf Stimulation mit Salmonellen-H-Antigen (SI=5,6) den höchsten SI.

Zwei Probanden (Proband-Nr.: 1, 5) waren bereits vor der Verimpfung, also an Tag 0 der Studie, positiv für das Salmonellen-H-Antigen (Proband-Nr.: 1, 5).

Siehe Tabelle 4, Anhang

Abb. 9: Proliferationsassay: H-Antigen

Immunreaktion gegen native und rekombinante Urease im Proliferationsassay

Eine signifikante Erhöhung der Radioaktivität, gemessen in cpm als Marker einer spezifischen Reaktion der T-Zellen auf rekombinante und native Urease konnte im Proliferatiosassay bei einem von zwölf Probanden nachgewiesen werden (Proband-Nr.: 5; =8,3% der Probanden).

An Tag 0 der Studie betrug die gemessene Radioaktivität bei Proband-Nr. 5 im arithmetischen Mittel 1733,07 cpm für rekombinante Urease und 2189,57 cpm für native Urease.

An Tag 28 wurde dann eine mittlere Radioaktivität von 2889 cpm für rekombinante Urease und 5637,67 cpm für native Urease gemessen.

Der SI betrug bei Proband-Nr. 5 für rekombinante Urease 3,4 und für native Urease 6,5 und lag damit deutlich über dem von uns festgelegten Schwellenwert.

Siehe Tabelle 4, Anhang

Abb. 10: Proliferationsassay: native Urease

Abb. 11: Proliferationsassay: rekombinante Urease

Elisa

Zur Auswertung des Elisa wurden Tag 0 und Tag 28 der Studie verglichen.

Als signifikante Erhöhung der IFN-γ Produktion in den Überständen der Proliferationsassays wurde eine Zunahme der OD bei einer Wellenlänge von 450nm um jeweils den Mittelwert plus drei Standardabweichungen der Negativkontrollen gewertet.

IFN-γ Produktion bei Stimulation mit Salmonellen-H-Antigen

Die Quantifizierung der IFN-γ Produktion in den Überständen der Proliferationsassays dient als Nachweis einer spezifischen Stimulation das Salmonellen-H-Antigen.

Die Menge an gebildetem IFN-γ an Tag 0 der Studie wurde hierbei mit der an Tag 28 der Studie verglichen.

An Tag 0 der Studie wurde im Mittel 6 pg/ml IFN-γ bei einer Stimulation mit Salmonellen-H- oder Salmonellen-O-Antigen gebildet (Intervall: 0-104 pg/ml).

Bei drei Probanden (= 25%) konnte an Tag 28 ein signifikanter Anstieg bei Stimulation mit Salmonellen-H-Antigen nachgewiesen werden (Proband-Nr.: 3, 5, 11).

Bei Stimulation mit Salmonellen-H-Antigen lag die IFN-γ Produktion an Tag 28 im Mittel bei 325 pg/ml (Intervall: 115-445pg/ml).

Als signifikant wurde ein Anstieg der IFN-γ Produktion von mehr als 100 pg/ml gewertet. Ein Anstieg um mehr als 100 pg/ml entspricht dem Mittelwert der negativ Kontrollen (unstimulierte Zellen) plus vier Standardabweichungen.

Signifikante Unterschiede in der IFN-γ Produktion vor und nach Impfung wurden mittels Wilcoxon Rang Summen Test ermittelt.

Siehe Tabelle 5, Anhang

Abb. 2 2: Elisa: H-Antigen

IFN-γ Produktion bei Stimulation mit nativer oder rekombinanter Urease

Die Quantifizierung der IFN-γ Produktion in den Überständen der Proliferationsassays dient als Nachweis einer spezifischen Stimulation der T-Zellen durch native oder rekombinante Urease.

Bei keinem der Probanden konnte an Tag 28 der Studie im Vergleich zu Tag 0 eine signifikante IFN-γ Produktion bei Stimulation mit rekombinanter Urease festgestellt werden.

Im Durchschnitt betrug die Menge des an Tag 0 gebildeten IFN-γ bei Stimulation mit rekombinanter Urease 3,7 pg (Intervall: 1-26 pg) und 14 pg an Tag 28 der Studie (Intervall: 1-69 pg).

Bei Stimulation mit nativer Urease konnte bei einem (= 8,3%) von 12 Probanden eine signifikante Erhöhung der IFN-γ Produktion nachgewiesen werden (Proband-Nr.: 5). Proband-Nr. 5 hatte an Tag 0 bei Stimulation durch native Urease eine IFN-γ Produktion von 1 pg und an Tag 28 eine IFN-γ Produktion von 581 pg. Dies entspricht einer Erhöhung von 580 pg/ml.

Als signifikante Erhöhung in der IFN-γ Produktion wurde eine Differenz zwischen Tag 0 und Tag 28 der Studie von mindestens 100 pg/ml gewertet. Dies ergab sich aus Berechnungen mit dem Rangsummentest (Wicoxon).

Siehe Tabelle 5, Anhang

Abb. 13: Elisa: native Urease