Pilotstudie zur Evaluierung eines Impfstoffes mit Salmonella typhi Ty21a als Träger für rekombinante Urease von Helicobacter pylori Oliver Palme I.I.1-2I.2-3I.2-1.i)4ii)iii)5I.3-67618#463I.3-1.8I.3-2.i)910ii)11I.4-12I.4-1.I.4-2.13I.4-3.14I.4-4.15I.5-I.5-1.16I.5-2.I.5-3.17I.6-18I.7-19I.7-1.20I.7-2.21I.7-3.22I.7-4.23I.8-2425II.II.1-II.1-1.i)Native UreaseRekombinante Urease26ii)II.1-2.II.1-3.27II.1-4.28II.1-5.29II.1-6.30II.2-31II.2-1.32i)ii)iii)33iv)34v)35II.2-2.i)36ii)II.2-3.37II.2-4.3839II.2-5.40II.2-6.4142II.2-7.43i)44ii)45III.46III.1-47III.2-III.3-48III.3-1.i)49619#411619#412ii)50III.3-2.i)51619#412619#412ii)52III.4-III.4-1.i)53619#412ii)54619#357619#350III.4-2.55i)56618#384ii)57619#412619#412III.4-3.58i)59619#412ii)60619#41261IV.IV.1-626364IV.2-6566IV.3-67IV.3-1.6869707172IV.3-2.73747576777879IV.3-3.80818283IV.3-4.848586V.87Abkürzungsverzeichnis 1 VI Referenzen888990919293949596979899100101102103104105106 VII Danksagung107 VIII Anhang108109110111112618#463113IX Eidesstattliche Erklärung X Lebenslauf114deInhaltsverzeichnisHilfe Aus dem Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie
und der Medizinischen Klinik
mit Schwerpunkt Hepatologie und Gastroenterologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu BerlinDissertationPilotstudie zur Evaluierung eines Impfstoffes mit <em>Salmonella typhi</em> Ty21a als Träger für rekombinante Urease von<br/> <em>Helicobacter pylori</em> Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae (Dr. med.)vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlinvon
Oliver Palme aus Esslingen am Neckar Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen Gutachter:1. Prof. Dr. med. B. Wiedenmann 2. Prof. Dr. med. R. von Baehr 3. Prof. Dr. Th. F. Meyer

Datum der Promotion:

17.07.200321.06.2004 Abstakt

Das Gen für die Expression von Helicobacter pylori Urease wurde in das Genom von Salmonella typhi Ty21a (Typhoral®) integriert. Der resultierende Stamm erhielt die Bezeichnung Salmonella typhi Ty21a(pDB1). Neun gesunden Probanden wurde Salmonella typhi Ty21a(pDB1) verabreicht. In der Kontrollgruppe erhielten drei gesunde Probanden Salmonella typhi Ty21a. Schwerwiegende Nebenwirkungen wurden bei keinem der Probanden beobachtet. Zehn von 12 Probanden zeigten eine humorale Immunantwort gegen Antigene von Salmonella typhi, nachgewiesen über die Detektion spezifischer Antikörper produzierender Zellen, aber bei nur zwei Probanden ließ sich eine Serokonversion nachweisen. Eine zelluläre Immunantwort gegen das H-Antigen von Salmonella typhi konnte bei insgesamt fünf Probanden nachgewiesen werden. Insgesamt sechs Probanden zeigten eine zelluläre Immunantwort gegen Urease von Helicobacter pylori in zumindest einem von drei der zur Anwendung gebrachten Testsysteme (Proliferation, T-cell-Elispot, IFN-γ Elisa). Eine humorale Immunantwort gegen Urease von Helicobacter pylori konnte bei keinem der Probanden nachgewiesen werden. Ty21a(pDB1) ist somit ein geeigneter Prototyp zur Optimierung einer Salmonella basierte Impfung zur Induktion einer zellulären Immunantwort, die zu einer protektiven Immunität gegenüber Helicobacter pylori führen könnte.

 Helicobacter pylori Impfstoff zelluläre Immunität Salmonella typhi Abstract

Helicobacter pylori urease was expressed in the common live typhoid vaccine Salmonella typhi Ty21a (Typhoral®) yielding Salmonella typhi Ty21a(pDB1). Nine volunteers received Salmonella typhi Ty21a(pDB1) and three control volunteers received Salmonella typhi Ty21a. No serious adverse effects were observed in any of the volunteers. Ten out of 12 volunteers developed humoral immune responses to the Salmonella carrier as detected by antigen-specific antibody-secreting cells but only two volunteers seroconverted. A total of five volunteers showed cellular responses to the carrier. Six out of nine volunteers that had received Salmonella typhi Ty21a(pDB1) showed a T-cell response to Helicobacter urease in at least one of the three assays for detection of cellular response (Proliferation, T-cell-Elispot, IFN-γ Elisa). No volunteer had detectable humoral responses to urease. Salmonella typhi Ty21a(pDB1) is a suitable prototype to optimize Salmonella-based vaccination for efficient cellular responses that could mediate protective immunity against Helicobacter.

Helicobacter pylori Vaccine Cellular immune responses Salmonella typhiInhaltsverzeichnis

  • I. Einleitung

    • I.1- Epidemiologie

    • I.2- Mikrobiologie von Helicobacter pylori

      • I.2-1.  Virulenzfaktoren von Helicobacter pylori

        • i) Urease

        • ii) Vakuolisierendes Zytotoxin VacA

        • iii)  Zytotoxin-assoziiertes Gen A: CagA

    • I.3- Pathogenese und immunologische Reaktion einer Helicobacter pylori Infektion

      • I.3-1. Die unspezifische Immunreaktion

      • I.3-2. Die spezifische Immunreaktion

        • i) Humorale Immunantwort gegen Helicobacter pylori

        • ii) zelluläre Immunantwort gegen Helicobacter pylori

    • I.4-  Helicobacter pylori assoziierte Krankheiten

      • I.4-1. Gastritis

      • I.4-2.  Ulkuskrankheit

      • I.4-3. Magenlymphom

      • I.4-4. Magenkarzinom

    • I.5- Therapie einer Helicobacter pylori Infektion

      • I.5-1.  Indikation zur Therapie einer Helicobacter pylori Infektion

      • I.5-2. Therapieregime

      • I.5-3.  Resistenzen

    • I.6-  Ökonomische Aspekte einer Helicobacter pylori Therapie

    • I.7- Impfstoff

      • I.7-1. Impfstudien an Tieren

      • I.7-2. humane Impfstudien

      • I.7-3. Urease als Antigen

      • I.7-4. Salmonella typhi als Adjuvans

    • I.8-  Fragestellung

  • II. Material und Methoden

    • II.1- Material

      • II.1-1. Antigene

        • i) Urease

          • Native Urease

          • Rekombinante Urease

        • ii) andere Antigene und Reagenzien

      • II.1-2. Antikörper

      • II.1-3.  Lösungen

      • II.1-4.  weitere Materialien und Reagenzien

      • II.1-5.  Charakterisierung des Kontrollstammes Salmonella typhi Ty21a

      • II.1-6.  Charakterisierung des Impfstammes Salmonella typhi Ty21a( pDB1 )

    • II.2-  Methoden

      • II.2-1.  Aufbau der klinischen Studie zur Untersuchung eines rekombinanten Impfstoffes gegen Helicobacter pylori am Menschen

        • i) Einschlußkriterien:

        • ii) Ausschlußkriterien

        • iii) Studienmedikation und Gruppeneinteilung

        • iv) immunologische und mikrobiologische Untersuchungen

        • v) Beobachtung der Verträglichkeit des Impfstoffes

      • II.2-2.  Anzucht des Impfstammes Salmonella typhi Ty21a (pDB1) und des Kontrollstammes Salmonella typhi Ty21a

        • i) Vorversuche zur Bestimmung der Wachstumskurve

        • ii) Anzucht und Vorbereitung am Impftag

      • II.2-3. Gewinnung der mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut (PBMZ)

      • II.2-4. Proliferationsassay

      • II.2-5. B-Zell-Elispot

      • II.2-6.  T-Zell-Elispot

      • II.2-7. Enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa)

        • i) Messung der spezifischen Antikörper im Serum

        • ii) Messung der Zytokine in den Überständen

  • III.  Ergebnisse

    • III.1- Wachstumskurve und Anzahl der verabreichten Bakterien

    • III.2- Nebenwirkungen

    • III.3-  humorale Immunantwort

      • III.3-1. B-Zell- Elispot

        • i) Immunreaktion gegen Salmonellen-O-Antigen und Salmonellen-LPS im B-Zell-Elispot

        • ii)  Immunreaktion gegen native und rekombinante Urease im B-Zell-Elispot

      • III.3-2. Elisa

        • i) Antikörper im Serum gegen Salmonellen-O-Antigen und Salmonellen LPS

        • ii)  Antikörper im Serum gegen native und rekombinante Urease

    • III.4- zelluläre Immunantwort

      • III.4-1. T-Zell-Elispot

        • i) Immunreaktion gegen das Salmonellen-H-Antigen im T-Zell-Elispot

        • ii) Immunreaktion gegen native und rekombinante Urease im T-Zell-Elispot

      • III.4-2.  Proliferationsassay

        • i) Immunreaktion gegen das Salmonellen-H-Antigen im Proliferationsassay

        • ii) Immunreaktion gegen native und rekombinante Urease im Proliferationsassay

      • III.4-3.  Elisa

        • i) IFN-γ Produktion bei Stimulation mit Salmonellen-H-Antigen

        • ii) IFN-γ Produktion bei Stimulation mit nativer oder rekombinanter Urease

  • IV. Diskussion

    • IV.1- Klinische Verträglichkeit und Nebenwirkungsprofil

    • IV.2- Immunogenität des Impfstammes Salmonella typhi Ty21a(pDB1)

    • IV.3-  Diskussion der einzelnen immunologischen Testergebnisse

      • IV.3-1.  Humorale Immunantwort gegen den Vektor Salmonella typhi Ty21a

      • IV.3-2.  Zelluläre Immunantwort gegen den Vektor Salmonella typhi Ty21a

      • IV.3-3.  Humorale Immunantwort gegen das Antigen Urease von Helicobacter pylori

      • IV.3-4.  Zelluläre Immunantwort gegen das Antigen Urease von Helicobacter pylori

  • V.  Zusammenfassung

  • Abkürzungsverzeichnis
  • VI Referenzen
  • VII Danksagung

  • VIII Anhang

  • IX Eidesstattliche Erklärung
  • X Lebenslauf
Bilder

  • Abb. 1 : Pathogenese einer H. pylori Infektion

  • Abb. 2: B-Zell-Elispot: O-Antigen

  • Abb. 3: B-Zell-Elispot: LPS

  • Abb. 4: Elisa: O-Antigen

  • Abb. 5: Elisa: LPS

  • Abb. 6: T-Zell-Elispot: H-Antigen

  • Abb. 7: T-Zell-Elispot: native Urease

  • Abb. 8: T-Zell-Elispot: rekombinante Urease

  • Abb. 9: Proliferationsassay: H-Antigen

  • Abb. 10: Proliferationsassay: native Urease

  • Abb. 11: Proliferationsassay: rekombinante Urease

  • Abb. 2 2: Elisa: H-Antigen

  • Abb. 13: Elisa: native Urease

  • Abb. 13: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Studie