Papadopoulos, Sarantos: Untersuchungen genomischer Veränderungen von Mammakarzinomzellen mittels Random Amplified Polymorphic DNA

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Kapitel 1. Einführung

Die Rolle der genetischen Veränderungen in der Neoplasie ist schon seit mehr als 100 Jahre Grundlage von Diskussionen. Die erste systematische Studie über die Zellteilung in malignen Tumoren wurde im Jahre 1890 durch von Hansemann durchgeführt, der auf die höhere Frequenz von Mitosen in Krebszellen aufmerksam gemacht hat und dieses Phänomen als Diagnosekriterium von Malignomen vorschlug. Ungefähr 25 Jahre später, im Jahre 1914, veröffentlichte Boveri die Hypothese, gestützt auf Mikroskopuntersuchungen, dass die Eigenschaften der Krebszellen auf Veränderungen der Chromosomen zurückzuführen sind. Im Laufe dieses Jahrhunderts wurde diese Hypothese durch eine Reihe von Beobachtungen gestützt: a) beim Menschen sind eine Reihe von Tumorformen bekannt, die nach den Mendelschen Gesetzen vererbt werden; b) viele Neoplasien weisen ganz spezifische Veränderungen ihres Chromosomensatzes auf; c) Patienten mit einem defekten DNA-Reparatursystem sind zur Tumorentwicklung prädisponiert; und schliesslich d) die meisten Karzinogene induzieren als Mutagene auch Veränderungen der DNA. In den letzten zwei Jahrezehnten konnte dieses Konzept der Tumorgenese mithilfe des Einsatzes von molekularbiologischen Methoden, der Zellgenetik und Zellhybride, einer experimentellen Überprüfung zugänglich gemacht werden, die die Entwicklung von präzisen Modellen der Carcinogenese ermöglichte.

Die Krebsforschung hat zeigen können, dass Mutationen die positiven Regulatoren des Wachstums oder Überlebens aktivieren und die entsprechenden Faktoren mit einer negativen Rolle inaktivieren Bishop, 1995 . Die Untersuchung der Retroviren und der hereditären Krebsformen führten zu Entdeckung zweier Genarten, den Oncogenen und Antioncogenen (auch Tumorsuppressorgene genannt). Die selben Gene spielen aber auch sehr oft eine Rolle bei den "sporadischen" (nicht hereditären) Tumoren des gleichen Typs (z.B. Retinoblastom). Mit der Identifizierung dieser Gene und dem Studium des Ablaufs der Initiation und Progression der menschlichen Tumore konnte die schon etwas ältere Hypothese von Forell aus dem Jahre 1958 bestätigt werden, dass die Tumorgenese ein mehrstufiger Prozess ist. Dazu trug massgeblich das Modell der colorectoralen Tumorgenese von Vogelstein Fearon &Vogelstein, 1990 bei, in dem angenommen wird, dass genetische Veränderungen und deren Akkumulation die stufenweise Umformung des normalen Epithels in proliferatives und später in dysplastisches verursachen. Die Folgen beinhalten die Bildung von Adenomen, Adenokarzinomen und letztlich die Metastasierung.

1.1 Molekularbiologische Methoden

Genetischen Unterschiede können mittels verschiedener Techniken festgestellt werden. Für die Detektion von spezifischen Mutationen wurden Methoden entwickelt wie z.B. die allelspezifische Oligonukleotid Hybrisierung, und für die Suche von Mutationen in kleinen DNA Fragmenten wurden Methoden wie die SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) und die DGGE (Density Gradient Gel Electrophoresis), die auf die Konformationsänderung der mutierten DNA basieren, eingeführt. Für das Untersuchen ganzer Genome gibt es nur wenige etablierte Methoden. Neben den klassischen genetischen Methoden wie Familienuntersuchungen, wurden nun molekularbiologische Verfahren etabliert. Zu diesen zählt das DNA Fingerprinting, das als vergleichende Analyse von eng verwandten Genomen vor allem in der Gerichtsmedizin schon breite Anwendung gefunden hat.

Das konventionelle Fingerprinting besteht aus dem Restriktionsverdau der DNA und die Southernblot Hybridisierung mit multiplen tandem-repetitiven oder hypervariablen Minisatelliten und produziert komplexe Muster. Alternativ, Proben können Locus spezifisch für individual hypervariable Loci sein und einfachere Muster produzieren mittels Detektion von Allelen von einzelnen oder multiplen Loci. Unter Berücksichtigung der VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats Jeffreys, Wilson, &Thein, 1985 ) konnte die Methode zur Feststellung von Polymorphismen bei maligner Transformation Thein, 1987 und für Studien über die Klonalität von primären und metastasierten Tumoren Smitet.al, 1988 verwendet werden.

Durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen von polymorphen Minisatelliten Loci konnte der Verlust der Heterozygotie, auch bekannt als LOH (Loss of Heterzygosity), festgestellt werden. Dieser Verlust wird als Marker für die Abwesenheit von funktionalen Tumorsuppressorgenen


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interpretiert Fearon &Vogelstein, 1990 .

Die Allelotypisierung Vogelstein, 1989 , d.h. die Analyse von Markern auf autosomalen Chromosomen der Tumorzellen, um die Prevalenz der Deletionen von Allelen festzustellen, hat sich als sehr wichtig für die Identifizierung und anschliessende Charakterisierung des RB (Retinoblastom)- und des p53 Gens sowie das Einläuten der Tumorsuppressorgens Ära herausgestellt.

Ein weiterer Fortschritt des DNA-Fingerprintings wurde durch die Einführung der Polymerasekettenreaktion (PCR) erzielt. Hierdurch konnten Mutationen wie z.B. LOH (Verlust der Heterozygotie) durch Amplifikation von hochinformativen Minisatelliten Loci festgestellt werden.

Aber Verluste von genetischem Material machen nur die Hälfte der Veränderungen aus, die man in der Mehrzahl der Tumorzellen findet. Wie vor kurzem gezeigt wurde, ist die Anzahl der moderate Gewinne der chromosomalen Sequenzen genauso häufig wie die der Verluste, zumindest im Colon-Ca Malkhosyanet.al, 1998 . Chromosomale Gewinne können diagnostische Indikatoren der Präsenz von dominanten Onkogenen wie z.B. C-k-ras sein. Die Tatsache, dass moderate Gewinne (z.B. vergleichbar einer Trisomie/Tetrasomie) von chromosomalen Fragmenten mit der Neoplasieentstehung in Verbindung stehen, ist schon seit längerem bekannt Spira, Wiener, Ohno, &Klein, 1979 . Chromosomale Gewinne können auch zur Überexpression von Genen führen, die zur Tumorprogression beitragen. Die Detektion solcher moderater chromosomaler Veränderungen hat sich als eine Herausforderung in der Krebsforschung herausgestellt. Eine Konsequenz ist, dass die "pathogenetische Bedeutung solcher Abnormalitäten total unbekannt ist", wie Mitelman et. al. kürzlich betonte Mitelman, Mertens, &Johansson, 1997 . Mit anderen Worten, die Hälfte der Genomalterationen der Tumorzellen entzieht sich der Entdeckung und der Untersuchung, weil keine adäquaten Techniken bis heute zur Verfügung stehen.

Technische Fortschritte der molekularen Tumorgenetik, wie die Representation Differential Analysis (RDA), eine wirksame Methode für die Identifizierung und Isolierung von über- und unterrepresentierten Sequenzen im Genom Lisitsynet.al, 1995 , oder LOH-Analysen durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen oder Mikroallelotypisierungs-prozeduren Vogelstein, 1989 , sind nicht in der Lage moderate Gewinne eines Genoms nachzuweisen. Verbesserungen, um die PCR quantitativ zu machen, wurden bei der Mikroalleletypisierung eingesetzt, indem man jedoch dessen einfache Praktikabilität opferte. Die RDA auf der anderen Seite ist eine schwer durchzuführende Methode und braucht zwei getrennte Experimente um DNA Verluste und Gewinne zu detektieren. Eine weitere Einschränkung ist die Tatsache, dass diese Veränderungen homozygot sein müssen.

Eine weitere Methode, die die Einschätzung der chromosomalen Aberrationen respektive der Anzahl und der Struktur erlaubt, ist die komparative Genomische Hybrisierung (CGH) Kallioniemiet.al, 1992 . Obwohl Genamplifikationen, Genomgewinne also, hiermit detektierbar sind, werden für die CGH spezielle Instrumente benötigt und ausserdem können nur Alterationen von relativ langen chromosomalen Regionen nachgewiesen werden. Die untere Grenze liegt bei 5-10 Mbp. Der entscheidende Nachteil der komparativen Hybridisierung besteht in der Identifizierung und Clonierung der veränderten Sequenzen, die sich sehr schwierig gestalten können.

Wie schon erwähnt, konnten durch die PCR Mutationen analysiert werden, die mit der Tumorentstehung assoziert sind. Aber auch mit der Hilfe von PCR, erfordert die Darstellung von Fingerprints und die Feststellung von Polymorphismen erheblichen experimentellen Aufwand und Wissen üder die Sequenz der benutzten DNA. Um diese Anforderungen zu umgehen, entwickelten Williams et al. Williams, Kubelik, Livak, Rafalski, &Tingey, 1990 die Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD).

1.2 RAPD

Die Methode basiert auf der Amplifikation von Sequenzen durch einen oder zwei nach Zufallskriterien ausgewählten Primern, die eine durchschnittliche Länge von 10 Nukleotiden aufweisen. Das Andocken/Annealing der Primer ist an vielen Orten (Loci) der DNA möglich und bedingen, wenn diese Primingorte sich in einer Entfernung von bis zu 5kb befinden, dass die dazwischenliegenden Sequenzen amplifiziert werden.


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Der molekulare Mechanismus, der das RAPD-Phänomen steuert, ist zur Zeit nicht genau bekannt. Venugopal et al. Venugopal, 1993 konnten Ende 1993 erstmals zeigen, dass die ca. 10 Nukleotide langen Primer an perfekte oder nicht-perfekte inverted repeat binden. Diese repetetiven Sequenzen flankieren die Genomanteile, die später amplifiziert werden.

Während RFLPs im konventionellen DNA Fingerprinting aus Basenpaarveränderungen resultieren, die die Schnittstellen von Restriktionsendonukleasen alterieren, ist bei der RAPD die DNA Sequenz bei den Primingpositionen diejenige, die verändert werden. Die Konsequenz ist eine Variierung der Anzahl und Länge der Amplifikationsprodukte. Das erneute Auftreten oder das Verschwinden dieser Primingpositionen kann durch Nukleotidsubstitutionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen stattfinden. Auch der Abstand zwischen zwei Primingpositionen kann durch Deletionen oder Insertionen derart verändert sein, dass die Amplifikation unmöglich wird. Aber auch jede zusätzliche Konformationsänderung des DNA Moleküls, die die Effizienz des Primings und somit der Amplifikation beeinflusst, kann die Ursache von Polymorphismen sein. In diesem Fall würde ein Polymorphismus vorgetäuscht werden.

Abb. 1: DNA Mutationen wie Insertionen, Deletionen, Inversionen, Einzelbasensubstitutionen können das RAPD Produktprofil beeinflussen.

RAPD Fingerprints weisen Banden auf, die in zwei Kategorien aufgeteilt werden können: diejenigen, die phylogenetisch konserviert sind und die, die individuell spezifisch sind. Diese Tatsache deutet an, dass die Primingpositionen zufällig im Genom verteilt sind, und dass sie konservierte und hochvariable Regionen flankieren. Da bei der Tumorgenese die oben benannten genetischen Alterationen auftreten, kann die RAPD von grossem Nutzen sein.

Die stattfindende Amplifikation ist zwar willkürlich, da sie von willkürlich ausgewählten Primern dirigiert wird, sie ist aber nicht zufällig. Diese in vitro Klonierung der Sequenzen erfolgt über 35 PCR-Zyklen und ergibt ein Bandenmuster, das nach elektrophoretischer Auftrennung in Agarosegelen mit Ethidiumbromid gefärbt und durch UV-Licht sichtbar gemacht wird.

1990 wurde zusätzlich zur RAPD noch eine Schwestermethode vorgestellt: die Arbitrarily-Primed PCR (AP-PCR) Welsh &McClelland, 1990 . Das Prinzip ähnelt dem der RAPD, jedoch sind die Primer 18 Nukleotide lang oder länger und die Banden


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können auf Polyacrylamidgelen mit Radioaktivität und Autoradiographie sichtbar gemacht werden. Die AP-PCR besteht aus anfänglichen niedrig stringenten Zyklen mit erniedrigte Annealing Temperatur, die DNA von hochstringenten Zyklen gefolgt werden. 1991 beschreiben Caetano-Anolles et. al. Caetano-Anolles, Bassam, &Gresshoff, 1991 eine weitere Abweichung von der anfänglichen Methode, nämlich das DNA-Amplification-Fingerprinting (DAF), das mit 5-6 Nukleotid langen Primern durchgeführt wird und eine Silberfärbung der Muster auf den Polyacrylamidgelen zur Visualisierung benutzt.

Die RAPD weist Vorteile gegenüber ihren Schwestermethoden auf. Der sichtbare Nachweisbereich erstreckt sich bei der RAPD von ca. 0.5 bis 5kb und ist damit grösser als bei den vergleichbaren Methoden der AP-PCR und dem DAF, die einen Bereich von 0.1 bis 1kb abdecken. Durch den Verzicht auf radioaktive Isotope, die bei der AP-PCR benötigt werden und der Densitometrie nach einer Silberfärbung, wie sie für die DAF angegeben wird, werden zum Durchführen der RAPD nur Geräte (UV-Transilluminator) und Materialien (Ethidiumbromidlsg.) benutzt, die in jedem molekularbiologisch eingerichteten Labor ohnehin zur Verfügung stehen.

Ein weiterer Vorteil ist, dass die RAPD Methode interne Kontrollen beinhaltet. Auf den Gelen können Banden beobachten werden, die sowohl bei der Amplifikation des gesunden als auch des tumorösen Gewebes eines Individuums vorkommen, aber nicht bei anderen Personen. Die Banden representieren Polymorphismen, die dazu benutzt werden können, um eventuelle Fehler beim Arbeiten (Handling) mit den Proben zu erkennen, speziell wenn die Anzahl der Proben sehr gross ist.

Im Kontrast zu anderen Klonierungsmethoden brauchen bei der RAPD die Deletionen für ihre Erkennung und Isolation nicht homozygot zu sein. Aber auch wenn die Deletion homozygot ist, was mit dem vollständigen Fehlen einer Bande einhergeht, kann sie dedektiert werden. Wie bei Peinado et al. Peinado, Malkhosyan, Velazquez, &Perucho, 1992 sollte eine homozygote Deletion von 0,1 % des Genoms mit ungefähr 20 unterschiedlichen Primern identifizierbar sein. Diese Kalkulation beruht auf dem Mittelwert von ca. 50 unabhängigen Regionen, die mit einem Primer erfasst werden können. Auf diesem Weg kann die Länge der Deletion durch die Analyse der Banden und die Anzahl der Primer, die zur Identifikation notwendig sind, ermittelt werden. Man kann sich also mit 20-40 Primer eine kurze Übersicht über die Situation des Genoms verschaffen.

Die RAPD weist nicht nur Vorteile gegenüber den bekannten Varianten auf, sondern auch gegenüber anderen molekular-biologischen Methoden. Obwohl die RAPD eine Methode ist, die auf der PCR basiert, werden für die Amplifikation keine Vorkenntnisse über die entsprechende DNA Sequenzen benötigt. Ausserdem benötigt man für die Amplifikation sehr niedrige DNA Mengen, die sich zwischen 10 und 500 ng bewegen.

Ein weiterer wichtiger Punkt ist, dass die Banden, die den Unterschied zwischen den RAPD-Profilen z.B. zwei unterschiedlicher Organismen ausmachen, einfach und direkt kloniert werden können. Die Banden können aus dem Gel einfach ausgeschnitten, aufgereinigt und aufbewahrt werden, um später kloniert zu werden. Im Gegensatz zu den Banden, die beim Fingerprinting von polymorphen Minisatelliten auftreten, da diese Methode auf der Southernblothybridisierung von genomischer DNA basiert.

Die RAPD Methode hat sich in den letzten 9 Jahren als ein effektives molekularbiologisches Werkzeug herausgestellt und Anwendung in vielen Bereichen gefunden hat, wie die Genkartierung Sobral, 1993 , Populations- Russell, Hosein, Johnson, Waugh, &Powell, 1993 und Stammbaumanalyse Dweikat, 1993 . Sie wurden häufig angewandt, um genetische Fingerabdrücke von Bakterien Akopyanz, Bukanov, Westblom, Kresovich, &Berg, 1992 , Pilzen Kersulyte, Woods, Keath, Goldman, &Berg, 1992 , Parasiten Steindel, Dias Neto, de Menezes, Romanha, &Simpson, 1993 , Insekten Kambhampati, Black, &Rai, 1992 , Pflanzen Williams, Kubelik, 1990 und Säugetieren Gwakisa, Kemp, &Teale, 1994 herzustellen und so zwischen den Spezies aber auch intraspezifische Variationen festzustellen. Darüberhinaus wurde das random priming erfolgreich in der Taxonomie Kresovich, 1992 und in


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phylogenetischen Studien Dooleyet.al, 1993 eingesetzt. Im Gegensatz dazu exsistieren nur wenige Daten über humane DNA Riedy, Hamilton, &Aquadro, 1992,goesto="bib141">Sineo, Martini, Borghi, &Failli, 1993 . In letzter Zeit nimmt hier auch die Anzahl der Arbeiten zu, die in unterschiedlichen Richtungen vorgehen. Bei Kindern, die nach dem Disaster von Tschernobyl geboren wurden, konnten in den genetischen Abdrücken, die mittels RAPD angefertigt wurden im Vergleich zu ihren Geschwistern, die vor dem Unglück zur Welt kamen oder zu Kindern von Kontrollfamilien aus derselben Region (Teile der Ukraine, 300-600 Km von Tschernobyl entfernt), die nicht der Radioaktivität ausgesetzt waren, neue Banden detektiert werden Weinberg, 1997 . Das Potential dieser Methode ist bei weitem noch nicht ausgeschöpft, primär weil immer noch Zweifel über die Reproduzierbarkeit bestehen. Ein weiterer Punkt ist die Empfindlichkeit der Methode gegenüber Kontaminationen, die noch ungeklärt ist.

1.3 RAPD und Krebs

Mit Hilfe des Random primings und der folgenden Einschätzung der Bandenverluste oder -gewinne, war man in der Lage einen molekularen Karyotyp der Tumorzelle zu entwickeln, der "Amplotype" (ergibt sich vom Wort Amplifikation) genannt wurde Malkhosyan, Yasuda, 1998 . Die Amplotypisierung ist für die Detektion von Allelenverlusten nicht so sensitiv, weil sie keine Heterozygotieverluste detektieren kann ohne gänzlichen Verlust des genetischen Materials in dem amplifizierten DNA-Abschnitt. Die Methode zeigt z.B. bei Verlust des einen Allels und die Duplikation des anderen, oder nach mitotischer Rekombination, keine Abnormalität des Bandesmusters auf den Gelen an.

Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass fast alle autosomalen Chromosomen durch die AP-PCR einem Screening unterzogen werden, indem man alle Banden des Musters lokalisieren konnte. Es konnte zusätzlich gezeigt werden, dass angebliche Allelenverluste, die mit der Allelotypisierung detektiert wurden, in Wirklichkeit Gewinne des anderen Allels waren. Das normale Allel wurde so fälschlich als deletiert charakterisiert, eine Tatsache, die durch Random priming und Southernblothybridisierung bestätigt wurden.

Das Random Priming kann wegen seiner Fähigkeit alterierte Gene zu detektieren benutzt werden, um das Ausmaß des genomischen Schadens der Tumorzellen zu schätzen. Bei einer Einschätzung der genetischen Schäden mittels AP-PCR und des prognostischen Wertes dieser Methode beim metastasiertem Colon-Ca wurde festgestellt, dass ungefähr 30% der produzierten Banden Intensitätsunterschiede aufweisen Arribas, 1997 . Diese Proportion spiegelt die Fraktion des Tumorzellgenoms wieder, die Veränderungen in der Kopienzahl durchgemacht hat. Verluste, die durch AP-PCR festegestellt wurden, betrafen 13% aller analysierten Banden.

Bei der Allelotypisierung erreichten die Verluste höhere Werte von ungefähr 20 %, eine Differenz, die durch technische Unterschiede erklärbar ist. Chromosomalen Gewinne waren gehäuft und betrafen 16 % der analysierten Banden. Interessant waren auch die Beobachtungen, dass Tumore mit ras Mutationen wenige Intensitätsunterschiede zwischen Banden und Bandengewinne aufweisen, was mit den Tatsachen übereinstimmt, dass ras Mutation-positive Tumoren einen niedrigeren DNA Gehalt haben als ras-negative Tumore Offerhaus, 1992 und dass ras-negative Tumore eine höhere Anzahl von genetischen Alterationen brauchen als ras-positive. Im Gegensatz dazu konnte zwischen p53 und durch AP-PCR detektierbare genetischen Schäden keine Relation hergestellt werden. Als letztes konnte ein aggressives Verhalten von Tumorzellen festgestellt werden, wenn die Bandenverluste, -gewinne und Intensitätsunterschiede ein gewisses Mass übertrafen. Der Grad der genetischen Schäden, die mittels AP-PCR Fingerprinting analysiert wurden, korreliert mit molekularen phenotypischen und prognostischen Variablen.

Die grösste Leistung des Random Priming ist die Entdeckung einer dritten Art der Karzinogenese nach den Protoonkogenen und den Tumorsuppressorgenen, den „Mutator Phenotyps“ oder anders gesagt Mutationen in DNA Reparatursystemen. Die AP-PCR Methode hat die entscheidende Rolle in der Entdeckung des Mikrosatelliten Mutator (MMP) der Karzinogenese in sporadische und familiäre Kolonkarzinome gespielt


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Ionov, Peinado, Malkhosyan, Shibata, &Perucho, 1993 . Die Detektion von Bandenunterschiede führte zur Aufdeckung einer tumorspezifischen Akkumulation von hunderttausenden somatischen klonalen Mutationen. Diese das gesamte Genom charakterisierende Instabilität der repetitiven Sequenzen wird als Grundlage des Mutator Phenotyps für manche sporadischen und familiären Tumorarten des Coloncarcinoms angesehen. Seit der Beobachtung, dass in colorectalen Carcinomen Verluste des Chromosoms 17 häufig sind Peinado, Malkhosyan, 1992 wurde die AP-PCR mehrfach eingesetzt, um unterschiedliche Tumortypen zu studieren. Saitoh et al Saitoh, Bruner, Levin, &Kyritsis, 1998 benutzten die AP-PCR, um genetische Alterationen in Astrozytome zu analysieren und beschrieben eine Region auf dem Chromosom 6p21.1, die häufig homozygot deletiert ist, was auf die Anwesenheit eines Tumorsuppressorgens in dieser Region hinweist. Kohno et al. Kohno, Morishita, Takano, Shapiro, &Yokota, 1994 haben auch mittels AP-PCR eine homozygote Deletion auf dem Chromosom 2q33 einer kleinzelligen Lungenkrebszelllinie entdeckt. Diese Region war auch bei anderen Krebsarten wie colorectalen Carcinomen, Neuroblastomen und nichtkleinzelligen Lungen-Carcinomen betroffen. Eine Tatsache, die auch hier für ein benachbartes bis heute unbekanntes Tumorsuppressorgen spricht.

Achille et al. Achilleet.al, 1996 entdeckten eine homozygote Deletion auf dem Chromosom 7q in Pancreas-Carcinomzellen, die auf 80% d.F. vorkommt. Kawakami et al. Kawakamiet.al, 1998 untersuchten mittels AP-PCR nichtkleinzellige Lungenkrebsproben und fanden die Intensitätsabnahme einer Bande, die dem Chromosom 10 zugeschrieben wird; ein Hinweis darauf, dass in der Nähe ein Tumorsuppressorgen liegen kann.

Die Anwendung der AP-PCR Malkhosyan, Yasuda, 1998 beim metastasierten Colon-Carcinom hat gezeigt, dass Verluste der Chromosome 1, 9, 14 und 18 häufig sind, was schon von der traditionellen Allelotypisierung bekannt war. Es wurde aber auch zum ersten Mal gezeigt, dass Allelenverluste des Chromosoms 4 in Metastasen vorkommen, die auch als schlechter prognotischer Indikator zu werten sind. In der selben Studie wurden Gewinne der Chromosomen 8q und 13q mit einer Häufigkeit von 75% beschrieben. Gewinne des Chromosoms 8 wurden mit einer Frequenz von 20-50% in der Region bisher angegeben, was für die Sensitivität der AP-PCR spricht. Die im Colon-Carcinom amplifizierte 8q Region ist nahe am myc Protoonkogenlocus. Dies impliziert, dass das myc Gen entweder eine wichtigere Rolle in der Coloncarcinomgenese spielt als bisher angenommen, oder das in der Nähe des myc Gens andere Gene liegen, die für die Tumorgenese relevant sind. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Gewinne des Chromosoms 6 metastasenspezifisch sind.

Bei squamösen Kopf- und Halscarcinomen korrelierte eine höhere Rate genomischer Instabilität mit wenig differenzierten Carcinomgruppen Maeda, 1999 . Yokota´s Gruppe Okazaki, Takita, Kohno, Handa, &Yokota, 1996 untersuchte zwei kleinzellige Lungenkrebszelllinien mit mehreren AP-PCR Primern und fand, dass amplifizierte Banden in einer Zelllinie dem Chromosom 8 zuzuordnen sind, während in der anderen Zelllinie die amplifizierten Banden dem Chromosom 2 aufgezeichnet worden sind. Die Region auf dem Chromosom 8 korrespondiert wahrscheinlich mit dem c-myc, während in der Region auf dem Chromosom 2 kein zur Zeit bekanntes krebsrelevantes Gen identifiziert werden konnte. Kuchiki et al Kuchiki, 1999 analysierte die Amplifikation eines Fragments in Proben eines mediastinalen Fibrosarkoms, das dem Chromosom 12q13-q15 zugerechnet werden konnte. Auf dieser Region existieren 2 bekannte Gene, die mit der Carcinomgenese in Verbindung gebracht worden sind, nämlich MDM2 und IFNG. Mittels Southern Blotting konnte gezeigt werden, dass das MDM2 Gen zusammen mit dem Fragment amplifiziert wird. DNA-Unterschiede also, die mit dem AP-PCR Fingerprinting festgestellt werden, können zu einfachen Identifizierungen von Kandidatengenen führen, die in der Carcinogenese involviert sind. De Juan et al de Juan, 1999 benutzten die AP-PCR, um amplifizierte DNA-Fragmente in nichtkleinzelligen Lungenkrebsproben zu charakterisieren. Das Vorhandensein des isolierten DNA-Fragments auf dem Chromosom 6q 12 konnte mit einem kürzeren disease-free Intervall korreliert werden. In Gehirntumoren (7 Meningeomen und 21 von 27 Gliomen) konnten Dil-Afroze et al. Dilet.al, 1998 multiple genomische Alterationen feststellen.

Bei der RAPD ist per Defininition die Primerwahl nicht auf eine bestimmte Sequenz festgelegt. Deshalb werden von einigen Authoren Primer entworfen, die Sequenzen beinhalten, um bestimmte


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Motive zu amplifizieren, z.B. Alu-Sequenzen oder t-DNA Längenpolymorphismen. Solche Primer wurden aber bisher hauptsächlich in der Taxonomie oder Polymorphismusstudie benutzt. Einen Versuch in dieser Richtung hat Yasuda et al Yasudaet.al, 1996 durchgeführt, in dem er einen Primer mit einer Sequenz, die theoretisch eine Region des p53 Gens amplifizieren sollte, entworfen hat. Dieser Primer stellte sich als informativ heraus, aber keine der intensiven Banden, die anschliessend sequenziert wurden, entsprachen p53. Sicherlich wäre hier ein Versuch mit zwei Primern angebracht, so dass sich die Distanz der beiden entgegengesetzten Anlagerungsorte bei erhöhten Chancen einer Amplifikation der gewünschten Sequenz verringern würde. Kohno et al. Kohno, Kawanishi, Inazawa, &Yokota, 1998 führten AP-PCR Experimente nach einem Verdau der DNA mit methylierungssensitiven Restriktionsenzymen durch. Auf diese Art konnten hypermethylierte Bereiche in Lungenkrebszelllinien verschrieben werden, die auch in Lungentumoren hypermethyliert waren. Weitere mögliche Modifikationen der Methode bestehen in der Digestion mit Restriktionsenzymen, z.B. Alu I, der zu amplifizierenden DNA, was zu einer Zunahme der Unterschiede führt Koebner, 1995 . Auf diese Art Sood &Buller, 1996 konnte feststellt werden, dass genomische Instabilität bei ovarialen Tumoren häufiger vorkommt als angenommen (53% anstatt 37%). Abnormale AP-PCR Muster wurden mit höherem Malignitätsgrad und familiären Krebs assoziiert. Deb et al. Deb, 1999 haben 1999 erfolglos versucht retroviral relevante DNA Polymorphismen bei Schizophreniepatienten festzustellen. Sie kommen zu dem Schluss, dass die generelle Abwesenheit von RAPD Polymorphismen ihre Ursache darin hat, dass andere Chromosomumlagerungen als Inversionen mit der Evolution des humanen Genoms assoziiert sind.

Die mögliche Feststellung von heterozygoten oder auch homozygoten Verlusten oder Gewinnen an Genomanteilen in Tumorzellen gegenüber normalen Zellen garantiert nicht, dass diese Sequenzen an Gene gekoppelt sind, die in der Tumorgenese eine aktive Rolle spielen. Auf der anderen Seite sind diese Sequenzbereiche den selben genetischen Veränderungen unterworfen, wie z.B. Tumorsuppressor-Gene. Nach Vogelstein et al. Kinzler &Vogelstein, 1996 kommt ein Verlust der Heterozygotie (LOH-loss of heterocygosity) bei ca. 20% der genomischen Sequenzen in colorectalen Carcinomen vor. Dabei kommt es zum Verlust von chromosomalen Sequenzen, die mit einer Inaktivierung von Tumor-suppressorgenen einhergehen. Damit ist statistisch die Möglichkeit verringert, DNA-Fragmente zu isolieren, in denen rein zufällige Alterationen während der Tumorgenese stattgefunden haben.

Die Detektion und Isolierung von überrepräsentierten Genomanteilen sollte mit einer vernünftigen Anzahl von Primern möglich sein.

1.4 Ziele der Arbeit

Mit Hilfe der Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) sollte ein Einblick auf DNA Ebene gewonnen werden. Das Anliegen dieser Arbeit bestand in der Erarbeitung und Etablierung einer sensitiven Methode zur Aufdeckung von Unterschieden zwischen DNA von Tumorzellen und von Blutzellen. Diese Unterschiede zwischen den entsprechenden Genomen können qualitative (bezogen auf die Struktur der Chromosome: Deletion und Amplifikation von Genbereiche) und quantitative (bezogen auf die Aneuploidie: Veränderung des Chromosomensatzes) sein.


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Abb. 2: N und T stehen für die entsprechende RAPD Produkte von DNA aus gesundem und Tumorgewebe. Quantitative Unterschiede machen sich als Intensitätsveränderungen bemerkbar, während qualitative als Positionsveränderungen der Fragmente auf den Gelen zu verstehen sind.

Vor dem Gewebevergleich musste die Optimierung der Methode erfolgen. Unter Optimierung der Methode ist hier die Verstärkung des Signals der einzelnen Amplimere (Fragmente) und die Erweiterung des Bandenspektrums gemeint. Mit der Vergrösserung der Spanne des genetischen Abdrucks, d.h. mit der Produzierung von DNA-Fragmenten, kann ein breiteres Screening des Genoms erfolgen und somit erhöhen sich die Chancen für eine Unterschiedmanifestation. Ein wichtiger Aspekt dieser Vorarbeiten war das Erreichen der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Die Reproduzierbarkeit bezieht sich sowohl auf die hintereinander folgenden Experimente als auch auf die zwischen unterschiedlichen Laboratorien.

Weiteres Ziel war die Charakterisierung der veränderten Genomabschnitte. Diese Unterschiede, als Banden auf den Agarosegelen sichtbar, sollten cloniert, sequenziert und mit den bekannten Genomabschnitten in den Genbanken verglichen werden.


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Wed Sep 5 16:50:29 2001